MASARYKVA UIVERZITA PŘÍRDVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CEMIE Bakalářská práce Brno 214 Dominika Motlová
MASARYKVA UIVERZITA PŘÍRDVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CEMIE Aplikace elektroanalytických metod ve studiu purinových derivátů Bakalářská práce Dominika Motlová Vedoucí práce: Mgr. Rudolf avrátil Brno 214-2 -
Bibliografický záznam Autor: ázev práce: Studijní program: Dominika Motlová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Chemie Aplikace elektroanalytických metod ve studiu purinových derivátů Chemie Studijní obor: Biofyzikální chemie Vedoucí práce: Mgr. Rudolf avrátil Akademický rok: 213/214 Počet stran: 52 Klíčová slova: purinové deriváty, xanthin, methylxanthin, pencil grafitové elektrody (PeGE), cyklická voltametrie (CV), eliminační voltametrická procedura (EVP) - 3 -
Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Dominika Motlová Faculty of Science, Masaryk University Department of Chemistry Application of electroanalytical methods in the study of purine derivatives Chemistry Field of Study: Biophysical chemistry Supervisor: Mgr. Rudolf avrátil Academic Year: 213/214 umber of Pages: 52 Keywords: purine derivatives, xanthine, methylxanthine, pencil graphite electrodes (PeGE), cyclic voltammetry (CV), elimination voltammetric procedure (EVP) - 4 -
Abstrakt Purinové deriváty představují v přírodě se vyskytující biologicky aktivní látky, které ve formě kovových komplexů s mědí hrají klíčovou roli v oxidativních procesech v lidském organismu. lavní myšlenkou bakalářské práce je elektrochemické studium oxidačního a komplexačního chování vybraných purinových derivátů na pevných grafitových elektrodách, zejména pencil grafitové elektrodě (PeGE). Abstract Purine derivatives represent naturally occurring biologically active substances, which in the form of metal complexes with copper play a key role in oxidative processes in the human organism. The main idea of the bachelor thesis is the electrochemical study of the oxidation and complexation behavior of selected purine derivatives on solid graphite electrodes, especially on a pencil graphite electrode (PeGE). - 5 -
- 6 -
Poděkování a tomto místě bych chtěla poděkovat mým rodičům za morální podporu při studiu, panu Mgr. Rudolfovi avrátilovi za vedení při vypracování bakalářské práce, a také mé odborné konzultantce doc. RDr. Libuši Trnkové, CSc. za cenné rady a postřehy. Tento výzkum byl podporován těmito projekty: L 1353 KTAKT II, MUI/A/972/213 MŠMT ČR a CEITEC Central European Institute of Technology Project CZ. 1.5/1.1./2.68. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno květen 214 Jméno Příjmení - 7 -
bsah 1. ÚVD... - 9-2. TERETICKÁ ČÁST... - 1-2.1. Elektroanalytické metody... - 1-2.1.1. Rozdělení elektroanalytických metod... - 1-2.1.2. Elektrody... - 1-2.1.3. Voltametrie... - 14-2.2. Purinové deriváty... - 17-2.3. Měď... - 2-2.3.1. Měď jako prvek... - 2-2.3.2. Biologický význam mědi... - 21-3. EXPERIMETÁLÍ ČÁST... - 22-3.1. Aparatura... - 22-3.2. Chemikálie a procedura... - 23-3.3. Pracovní postup... - 24-3.3.1. Příprava vzorků... - 24-3.3.2. Příprava pufrů... - 24-3.3.3. Příprava aparatury k měření, postup měření a vyhodnocení výsledků... - 25-3.4. Výsledky a diskuze... - 25-3.4.1. ptimalizace metody, reprodukovatelnost... - 26-3.4.2. LSV vs. EVP... - 28-3.4.3. Stanovení vlivu p na detekci methylovaných xanthinů... - 33-3.4.4. Titrační stanovení komplexu Cu(I)-mXan... - 44-4. ZÁVĚR... - 48-5. LITERATURA... - 48 - - 8 -
1. ÚVD Purinové deriváty představují v přírodě se vyskytující biologicky aktivní látky, které ve formě kovových komplexů s mědí hrají klíčovou roli v oxidativních procesech v lidském organismu. apříklad oxidace xanthinu a jeho methyl derivátů, hraje důležitou roli v degradaci adeninu a guaninu, ale ovlivňují i další fyziologické a patologické aspekty v lidském těle, jako je například kardiovaskulární systém nebo CS a díky svým vlastnostem mohou methylované xantiny inhibovat mnoho dalších farmakologických a fyziologických efektů adenosinu jako je hypotenze, kardiodeprese, antidiuretický a antilipolitický efekt. Zároveň však nabízí mnohé možnosti v koordinační chemii kovů při tvorbě stabilních komplexů. Elektrochemické studium redoxního chování těchto látek nám poskytuje unikátní možnost sledování redoxních dějů odehrávajících se v biologických systémech a také příležitost nahlédnout blíže do procesu tvorby jejich komplexů. Za tímto účelem bylo využito elektroanalytických metod jako je cyklická voltametrie (CV) nebo voltametrie s lineárním scanem (LSV), které v kombinaci s adsorpčními technikami a eliminační voltametrickou procedurou (EVP) nachází uplatnění jako vhodný nástroj ke kvalitativní a kvantitativní elektrochemické analýze vybraných látek, a to i ve stopových množstvích. Pro sledování tvorby komplexů bylo v naší práci využito iontů mědi Cu(II), které se redukují na povrchu pentelkové (pencil) grafitové elektrody (PeGE) na Cu(I) a tvoří s xanthiny komplexy ve formě Cu(I)- xanthin. Využití iontů mědi při detekci navíc umožňuje zvýšení citlivosti dané metody. lavní myšlenkou bakalářské práce tedy bylo elektrochemické studium oxidačního a komplexačního chování vybraných purinových derivátů na pevných grafitových elektrodách, zejména na grafitové elektrodě (PeGE). Pro sledování komplexace xanthinů, jako ligandů, s měďnými ionty byl výzkum orientován na sledování oxidačních signálů vybraných derivátů xanthinů v přítomnosti mědi. - 9 -
2. TERETICKÁ ČÁST 2.1. Elektroanalytické metody V současné době patří elektroanalytické metody k nejpoužívanějším postupům pro kvantitativní i kvalitativní analýzu látek. Skupina elektroanalytických metod vychází z poznatků odvětví fyzikální chemie. Podstatou těchto metod je studium závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci [1,2]. 2.1.1. Rozdělení elektroanalytických metod a) Metody založené na elektrodovém ději bvykle se jedná o oxidačně redukční reakci, která probíhá na elektrodě. Zapisujeme ji rovnicí: (1) Elektrochemický článek je v rovnovážném stavu (potenciometrie). Elektrochemickým článkem prochází elektrický proud (metody elektrolytické). o Při elektrolýze se koncentrace látky prakticky nemění (voltametrie). o Při elektrolýze dojde k úplné přeměně látky (elektrogravimetrie, coulometrie). b) Metody založené na měření elektrických vlastností roztoků Měření vodivosti roztoků (konduktometrie). Měření kapacity (dielektrimetrie). Do elektroanalytických metod můžeme zařadit i metody separační, jejichž princip je založen na rozdílné rychlosti migrace nabitých částic v elektrickém poli (elektroforéza, izotachoforéza) [1-3]. 2.1.2. Elektrody Elektroda je definována podle Faradaye jako heterogenní elektrochemický systém tvořený alespoň dvěma fázemi. Jedna fáze je tvořena vodičem první třídy, který vede proud prostřednictvím elektronů a druhá fáze, která je tvořena vodičem druhé třídy, kde je elektrický proud veden prostřednictvím iontů [1-3]. 2.1.2.1. Elektrodový děj Elektrodový děj je oxidačně-redukční reakce umožňující přenos náboje mezi fázemi elektrody. Přechází-li záporný náboj z elektrody (katody) do roztoku, jde o redukci látky - 1 -
v roztoku. Přechází-li kladný náboj z elektrody (anody) do roztoku, jde o oxidaci. a základě dohody zapisujeme elektrodový děj chemickou rovnicí ve směru redukce [1-3]. ernstova-petersova rovnice Rovnice je odvozena ze vztahu mezi potenciálem elektrody a aktivitou jejich iontů v roztoku. Byla odvozena na základě úvahy o ustavení termodynamické rovnováhy. Mezi elektrodou a ionty se v roztoku vytvoří elektrodová dvojvrstva. Tento jev je způsobený přitažlivými silami mezi elektrodou a ionty v roztoku a na elektrodě dochází ke vzniku potenciálu E. Pro stanovení velikosti potenciálu slouží ernstova rovnice [1-4]. ln, (2) kde R molární plynová konstanta (8,314 J.K -1.mol -1 ), T termodynamická teplota, F Faradayova konstanta (9,6481.1 4 C.mol 1 ), a aktivita oxidované nebo redukované formy, E standardní elektrodový potenciál. 2.1.2.2. Rozdělení elektrod Podle použití dělíme elektrody na indikační (měrné) a referenční (srovnávací). Indikační elektrody indikují změnu koncentrace zkoumaného ionu. Referenční elektrody mají potenciál konstantní a nezávislý na složení zkoumaného roztoku. ejznámější referenční elektrody jsou: kalomelová, argentchloridová, merkurosulfátová a vodíková. Poslední, ale neméně důležitou skupinou jsou elektrody pomocné. Ty zabraňují polarizaci referenční elektrody. Jako další kritérium pro rozdělení elektrod je jejich typ. Dělíme je na elektrody prvního a druhého druhu, redoxní a iontově selektivní [5]. 2.1.2.2.1. Elektrody prvního druhu Elektrody prvního druhu jsou tvořeny prvkem, který je ve styku s roztokem svých iontů. Dělíme na kationtové a aniontové, podle toho zda je iont prvku kationt nebo aniont. Ty se mezi sebou liší v principu stanovení dynamické rovnováhy. U kationtových elektrod dochází k ustavení rovnováhy mezi atomy nebo molekulami látky a jejich příslušných kationtů. Když se ustanoví rovnováha mezi molekulami látky a aniony jedná se o aniontovou elektrodu. Mezi kationtové elektrody prvního druhu řadíme např. vodíkovou plynovou elektrodu. Vodíková elektroda je v potenciometrii základní elektrodou. Protože její standardní potenciál je dohodou roven nule, využíváme ji k porovnávání - 11 -
elektrod. Je tvořena platinovým plíškem, který je elektrolyticky pokryt povlakem platinové černě. Tím elektroda získá velký aktivní povrch a díky svým adsorpčním schopnostem zachycuje vodík a katalyticky urychluje ustanovení rovnováhy v elektrodovém ději [1-2, 6-7]. 2.1.2.2.2. Elektrody druhého druhu Elektrody druhého druhu mají dvě fázová rozhraní. Jsou tvořeny kovem elektrody a roztokem. Mezi nimi je málo rozpustná sůl, tvořená kationtem kovu a aniontem v roztoku. Do této skupiny řadíme např. elektrodu argentchloridovou, merkurosulfátovou a kalomelovou [1-4]. 2.1.2.2.2.1. Argentchloridové elektroda Potenciál argentochloridové elektrody závisí na koncentraci chloridových iontů. Pokud je tato koncentrace konstantní, bude konstantní i elektrodový potenciál. Díky konstantnímu potenciálu využíváme argentchloridovou elektrodu jako elektrodu srovnávací v potenciometrických měřeních. Často se v kombinaci s vodíkovou elektrodou užívá ve článcích pro standardizaci tlumivých roztoků [1,6]. Schéma: Elektrodový děj: Potenciál elektrody: (3), (4) /, (5) kde R molární plynová konstanta (8,314 J.K -1.mol -1 ), T termodynamická teplota, F Faradayova konstanta (9,6481.1 4 C.mol 1 ), E standardní elektrodový potenciál argentchloridové elektrody, a aktivita chloridových iontů. 2.1.2.2.3. Iontově selektivní elektrody Iontově selektivní elektrody (ISE) vychází ze studia membránových potenciálů a využívají vzniku potenciálu na membráně. Čidlem ISE je elektrochemická membrána, která je propustná pouze pro určité ionty. Tyto ionty, které prostoupí membránou, způsobí vznik potenciálového rozdílu mezi povrchem elektrody a roztokem. Velikost - 12 -
potenciálového rozdílu závisí převážně na aktivitě iontů v roztoku. Mezi iontově selektivní elektrody patří například elektroda skleněná. [1-3]. 2.1.2.2.4. Redoxní elektrody Redoxní elektrody jsou tvořeny inertním kovem (Pt, Au, g) a roztokem s obsahem oxidované a redukované formy redoxního systému. Kov je ponořen do roztoku, kde umožňuje výměnu elektronů mezi formami redoxního systému, ale sám se chemických reakcí neúčastní.[1-3]. 2.1.2.2.4.1. Grafitové elektrody Díky nutnosti vylepšení elektroanalytických vlastností elektrod pro kvalitativní a kvantitativní účely, jsou vyhledávány a vyvíjeny nové typy materiálů, které by byly vhodné k jejich využití jako senzorů pro detekci látek při elektrochemických stanoveních. Mezi tyto látky patří i grafitové elektrody a elektrody na základu grafitu, nejen díky jejich struktuře a mechanickým vlastnostem, ale i díky jejich jedinečným elektrickým vlastnostem, zahrnujícím například citlivost k redoxním reakcím látek. Umožňují stanovit i velmi nízké koncentrace analytu v roztoku (například v medicíně), ale jsou široce využívány i jako základní prvek pro výrobu nejrůzněji povrchově modifikovaných uhlíkových superkapacitorů v energetickém průmyslu [8-12]. Elektrochemické vlastnosti uhlíkových materiálů pro analýzu jsou podřízeny hlavně velikosti aktivního povrchu a struktuře povrchu. ejdůležitějšími aspekty ovlivňujícími rychlost reakce a adsorpci na elektrodě jsou redoxní mechanismus reakce, elektronová hustota na povrchu elektrody a přítomnost EDGE plane částí na povrchu elektrody. Proto se využívá modifikací či aktivací povrchu s využitím adsorpce látek obsahujících určitou funkční skupinu (např. -, -, kov, derivát), jež se naváží na povrch elektrody a vytvoří vnější vrstvu, jež brání nebo přispívá průběhu elektrodové reakce v závislosti na reakčním mechanismu. Tyto elektrody nalézají uplatnění zejména jako potenciální senzory pro citlivou a selektivní detekci v analytické chemii, ve farmacii nebo medicíně k analýze biologicky důležitých látek [13-2]. 2.1.2.2.4.1.1. PeGE Tento typ grafitových elektrod v posledních letech nachází stále častější uplatnění v elektroanalytické chemii. PeGE je využívána jako měrná (pracovní) elektroda ve voltametrických stanoveních hlavně díky jejím specifickým mechanickým a elektrickým - 13 -
vlastnostem. Velkou výhodou PeGE oproti ostatním typům uhlíkových elektrod je její elektrochemická reaktivita, mechanická tuhost, komerční dostupnost, nízké pořizovací náklady, nízký proudový šum a možnost uplatnění širokého potenciálového rozsahu pro voltametrická stanovení. a základě těchto vlastností lze PeGE využít jako velmi levný a citlivý senzor například pro stopovou detekci biologicky významných látek [21,22]. 2.1.3. Voltametrie Voltametrické metody jsou založené na měření proudu, který protéká elektrolytickým článkem, po vložení měnícího se napětí do systému. Měření proudu poskytuje informace o kvalitativním a kvantitativním složení elektrolyzovaného roztoku, o rychlosti elektrodových procesů, rovnováhách a rychlostech chemických reakcí, které jsou spojené s elektrodovým procesem. Charakteristický rys voltametrie je, že elektrolýza nezasahuje celý roztok, neboli koncentrace složek v dostatečné vzdálenosti od elektrody zůstávají nezměněné. Pro zamezení nežádoucích jevů (např. polarizace referenční elektrody) využíváme tříelektrodové zapojení s pomocnou elektrodou. Při této metodě sledujeme závislost intenzity proudu na proměnlivém vloženém napětí. Tuto závislost charakterizujeme pomocí voltametrické I-E křivky. V přítomnosti látek, které podléhají elektrolýze, roste proud při určitém napětí, které charakterizuje kvalitu elektroaktivní látky. Výška voltametrického signálu je mírou kvantity. Udává koncentraci elektroaktivní látky ve zkoumaném roztoku. V typickém voltametrickém uspořádání elektrod je pracovní elektroda dokonale polarizovatelná a elektroda srovnávací je naopak dokonale nepolarizovatelná. Po vložení napětí tomuto páru elektrod vzniká tzv. polarizační napětí E p [1-3,5] kde E a potenciál anody, E k potenciál katody. Protékající proud je dán vztahem: kde E vložené napětí, E p polarizační napětí, R odpor., (6), (7) 2.1.3.1. Cyklická voltametrie (CV) Cyklická voltametrie (CV) je jednou z několika metod odvozených od polarografie. Řadíme ji do skupiny tzv. potenciodynamických experimentálních metod. proti klasické polarografii však využíváme pro stanovení analytů hlavně tuhých (solid) - 14 -
pracovních elektrod. Průběh CV je charakterizována plynulým nárůstem potenciálu pracovní elektrody z jedné mezní hodnoty do druhé a zpět do výchozího bodu, proto je důležité nastavit základní parametry, což jsou meze potenciálu a rychlost polarizace (scan rate), při které se mění potenciál. V CV hraje důležitou roli koncentrace elektroaktivní látky v analytu a také její teplota, tyto hodnoty můžeme ovlivňovat vzhledem ke konkrétnímu experimentu. Díky tomu, že reakce se odehrává především na povrchu elektrody a jejím blízkém okolí, není nutné používat velké množství analytu pro stanovení, což je velmi výhodné u látek, u nichž se snažíme pracovat s co nejmenšími objemy (např. oligonukleotidy) [1-3,5-6,23]. Záznamem cyklo-voltametrického měření je voltametrická I-E křivka, která se skládá z anodické (oxidační reakce) a katodické části (redukční reakce) a udává závislost proudu, který protéká elektrodou, na jejím potenciálu. Metoda je hlavně využívána při studiu elektrodových reakcí. Každé elektrodové reakci odpovídá na voltametrické křivce právě jeden signál, jímž je proudový pík. Intenzita proudu (velikost píku) závisí na rychlosti časové změny potenciálu a na koncentraci analytu. Reversibilní děje se řídí Randles-Ševčíkovou rovnicí: 2,686 1 5 3 2 1 2 1 2, (8) kde I p maximální výška vlny, n počet elektronů potřebných pro redoxní děj, A povrch elektrody, D difúzní koeficient, c koncentrace analytu, v rychlost polarizace. Potenciál píku odpovídá oxidačnímu potenciálu stanovované látky. Ze závislosti proudu na napětí tedy stanovujeme druh a obsah analytu, kde potenciál určuje kvalitativní a proud kvantitativní analytické vlastnosti. Z průběhu katodických a anodických křivek jsou získávány informace o tom, zda je děj reverzibilní či ireverzibilní. Jednotlivé děje jsou přitom závislé na vzdálenosti a intenzitě oxidačních a redukčních signálů. Při reverzibilní, tedy vratné reakci, je potenciál píku nezávislý na rychlosti polarizace a naopak při plně ireverzibilní reakci je potenciál píku funkcí polarizační rychlosti [1-3]. 2.1.3.2. Eliminační voltametrická procedura (EVP) Eliminační voltametrická procedura (EVP) se vyvíjela společně s eliminační polarografií (EP). proti EP je metoda EVP rychlejší, pracuje na jednodušším základě a lze pracovat i s pevnými elektrodami. V EVP není na rozdíl od eliminační polarografie nezávisle proměnnou čas, ale rychlost polarizace elektrody (scan rate). Jedná se o matematickou metodu, jež umožňuje eliminovat nebo zachovat některé z dílčích proudů vytvořením - 15 -
eliminační proudové funkce. Aby bylo dosaženo vytvoření eliminační funkce, je třeba vytvořit lineární kombinace celkových proudů měřených při různých rychlostech polarizace (scan rate). Z těchto naměřených celkových voltametrických proudů je poté vytvořena eliminační proudová funkce [48]. V případě EVP se měří proud protékající mezi pracovní a pomocnou elektrodou, zatímco se elektrodový potenciál mění lineárně s časem podle rovnice:, (9) kde v je rychlost změny potenciálu v závislosti na čase t, E 1 počáteční potenciál [5]. Základem tohoto matematického modelu jsou dvě důležité podmínky: a) První podmínkou EVP je, že eliminovaný parciální proud I j je možné vyjádřit jako součin dvou na sobě nezávislých funkcí, funkce rychlosti polarizace a funkce potenciálu.., (1) kde W j funkce rychlosti polarizace, Y j funkce potenciálu. Abychom zjistily, zda proudy tuto podmínku splňují, je třeba definovat rychlostní koeficient:, (11) kde rychlostní koeficient. b) Celková proudová odezva systému zaznamenaná během voltametrického měření je sumou parciálních proudů odpovídajících sub-procesů:, (12) kde I d odpovídá difúzní, I c nabíjecí a I k kinetické proudové složce. Parciální procesy jsou rozděleny v závislosti na tom, který ze sub-procesů je procesem hlavním. Pokud je proces řízen přenosem látky k elektrodě (difúzí), je hlavní složkou difúzní proud (I d ), v případě procesu kontrolovaného nabíjením elektrodové dvojvrstvy nebo oxidací/redukcí adsorbovaného depolarizátoru, jedná se o kapacitní proud (I c ) a pokud je proces řízen předřazenou chemickou reakcí v oblasti blízko elektrody (např. deprotonací, protonací, hydrolýzou, dimerizací, disproporcionací ) jde o kinetický proud (I k ). Proudy splňující tyto dvě podmínky jsou difúzní proud (I d ) s rychlostním koeficientem x =,5, kapacitní proud (I c ) s x = 1 a kinetický proud (I k ), kde x =, což může být vyjádřeno takto: - 16 -
/ /, /, (13) kde referenční rychlost polarizace, rychlost polarizace. a základě těchto výpočtů bylo odvozeno celkem šest typů lineárních kombinací, které ve výsledku poskytují šest proudových funkcí (eliminací), ve kterých jsou eliminovány, zachovány nebo zkresleny zvolené parciální proudy [48-51]. Tab.1. Eliminační funkce E1-E6 (koeficienty odvozené pro I(ref), I(1/2ref) a I(2ref)) f(i) Charakteristika EVP rovnice E1 I d ; I k = (I c zkreslené 1,77) f(i) = -3,4142 I 1/2 + 3,4142 I E2 I d ; I c = (I k zkreslené 2,414) f(i) = 4,8284 I 1/2 2,4142 I E3 I k ; I d = (I c zkreslené -,77) f(i) = 3,4142 I 1/2 2,4142 I E4 I d ; I k =; I c = f(i) = -11,657 I 1/2 + 17,485 I 5,8284 I 2 E5 I k ; I d =; I c = f(i) = 6,8284 I 1/2 8,2426 I + 2,4142 I 2 E6 I c ; I d =; I k = f(i) = 4,8284 I 1/2 8,2426 I + 3,4142 I 2 Mezi největší výhody EVP patří jednoduchost, časová nenáročnost a cenová dostupnost, možnost rozšíření potenciálového okna zvětšením rozsahu měřitelných potenciálů, zvýšení citlivosti není limitováno experimentálním uspořádáním (druh elektrody) či studovaným typem reakce (oxidace či redukce), umožňuje separaci blízkých signálů a důkladnější zkoumání elektrodového procesu odkrytím minoritního procesu v procesu majoritním a má význam pro analýzu adsorbované částice, která v eliminaci poskytuje signál (pík protipík). evýhodou však je horší reprodukovatelnost signálů na pevných elektrodách (problém zachování stejných vlastností povrchu), vzájemná interakce eliminovaných dílčích proudů v původním signálu, proudový drift a z důvodu vysoké citlivosti eliminačních funkcí je třeba naměřené křivky předem vyhlazovat. Při vhodné kombinaci technik tedy nachází EVP velmi dobré uplatnění zejména pro studování redoxních reakcí, elektrodových reakcí a také citlivé analýze látek [48-51]. 2.2. Purinové deriváty Puriny jsou přirozeně se vyskytující biologicky významné látky. Jedná se o dusíkaté heterocyklické sloučeniny složené z pyrimidinového a imidazolového kruhu. V čistém stavu jsou to většinou krystalické látky, které se dobře rozpouštějí ve vodě. Purin se jako samostatná látka v přírodě nevyskytuje. Existuje však velká řada jeho derivátů. ejvýznamnějšími deriváty purinového typu jsou adenin (6-aminopurin) a guanin (2- - 17 -
amino-6-hydroxypurin), jež jsou základním stavebním kamenem všech organismů. Společně s pyrimidinovými bázemi totiž tvoří řetězce DA a RA [24,25]. Další velkou skupinu látek jsou xanthiny. Ty mají v přírodě velké zastoupení v běžných potravinách, a to v podobě methyl derivátů. K nejznámějším a nejvýznamnějším z této skupiny látek patří theofylin, theobromin a zejména kofein. Tyto látky jsou obsaženy nejčastěji v čaji, čokoládě nebo kávě. Mají velký význam hlavně z farmakologického hlediska. Jejich účinků se využívá zejména při respiračních onemocněních pro uvolnění hladkého svalstva v průduškách, pro stimulaci centrální nervové soustavy a srdeční činnosti, například ke zvýšení krevního tlaku a zvýšení srdečního tepu. C 3 C 3 C 3 C 3 C 3 3 C 3 C Kofein Theobromin Theofylin Schéma 1. Významné methyl deriváty xanthinu Xanthiny mají však své zastoupení i v organismu. Běžně se vyskytují například v krvi moči a dalších fyziologických tekutinách. Jsou produktem katabolismu purinů, kdy dochází k postupnému odbourávání purinových bází přes xanthin, až na kyselinu močovou. áslednou degradací vzniká močovina jako výsledný produkt. - 18 -
2 C C C C C 2 Ribóza-5-fosfát AMP 2 ukleotidasa P i Adenosin AMP deamináza 4 + Adenosindeaminasa + 2 4 C C C C C C Ribóza-5-fosfát IMP 2 ukleotidasa P i P i Inosin C C C XMP 2 P i Xanthosin P i C 2 Ribóza-5-fosfát ukleotidasa C C C C GMP 2 P i Guanosin P i C Ribóza-5-fosfát ukleotidasa Ribosa-1-P ypoxanthin Purinnukleosidfosforylasa (PP) Xanthinoxidasa 2 + 2 2 2 Ribosa-1-P 2 + 2 PP Xanthin 4 + Xanthinoxidasa Guanindeaminasa 2 Ribosa-1-P PP Guanin Další savci 2 C C C C Urátoxidasa C 2 + 2 2 2 + 2 2 2 2 C C C C C Vylučováno: Primáti Ptáci Plazi myz Kostnaté ryby 2 2 C Allantoin C Allantionasa C 2 C Allantoová kyselina 2 Allantiokasa C-C Glyoxylová kyselina Kyselina močová Chrupavčité ryby bojživelníci 2 2 C Močovina 2 Ureasa Schéma 2. Katabolismus purinů [24,25] Mořští bezobratlí + 4 4 2 2 2C 2 Zejména komplexy xanthinu a jeho methylovaných derivátů s mědí hrají významnou roli při oxidačních procesech v lidském organismu a nabízí mnohé možnosti v koordinační chemii kovů při tvorbě stabilních komplexů. xidace xanthinu a jeho methyl derivátů, hraje důležitou roli v degradaci adeninu a guaninu, ale ovlivňují i další fyziologické a patologické aspekty v lidském těle, jako je například kardiovaskulární systém nebo CS a díky svým vlastnostem mohou methylované xanthiny inhibovat mnoho dalších farmakologických a fyziologických efektů adenosinu jako je hypotenze, kardiodeprese, antidiuretický a antilipolytický efekt [3-4]. Elektrochemické studium redoxního chování těchto látek nám poskytuje unikátní možnost sledování dějů odehrávajících se v biologických systémech při tvorbě jejich komplexů s ionty kovů, zejména s mědí. Měď v redukované formě Cu(I) může v přítomnosti látek, jako jsou methylxanthiny reagovat za vzniku nerozpustných nebo málo rozpustných komplexů a hromadit se na elektrodě. Redoxní rovnováhy mohou být ovlivněny díky disproporcionaci Cu(I) na Cu() a Cu(II), které snižují stabilitu komplexu s purinem. - 19 -
Ke studiu redoxního chování xanthinu a jeho methylovaných derivátů bylo dříve využíváno rtuťových elektrod. Tato metoda ovšem nebyla dostačující pro účely analytické bioelektrochemie, proto se k těmto účelům začalo využívat grafitových elektrod, které nabízejí větší potenciálový rozsah pro měření. Redoxní reakce biologicky významných purinů, zahrnující elektronovou výměnu mezi elektrodou a purinovým jádrem při vyšších oxidačních potenciálech, byla později studována voltametrickými metodami ve spojení s nejrůznějšími typy grafitových elektrod, ať už pyrolytickými grafitovými elektrodami (PGE), uhlíkovými pastovými elektrodami (CPE) nebo s využitím uhlíkových mikroelektrod či borem dotovaných diamantových elektrod. Bylo prokázáno, že mechanismus oxidace na různých typech grafitových elektrod je stejný a zároveň bylo navrženo schéma oxidace těchto purinových látek [26-42]. 2.3. Měď 2.3.1. Měď jako prvek Měď patří mezi prvky 11. skupiny periodické soustavy prvků společně se stříbrem a zlatem. Chemická podobnost těchto prvků je malá a jejich reaktivita v rámci skupiny klesá od mědi ke zlatu. bsah mědi v zemské kůře je poměrně vzácný a odhaduje se na 55 7 ppm. Její výskyt v ryzím stavu je velmi výjimečný. Je obsažena ve formě nejrůznějších oxidů a hydroxid-uhličitanů (např. kuprit Cu 2, azurit 2CuC 3.Cu() 2 ), ale hlavně se nachází ve sloučeninách síry (např. kovelin CuS, chalkosin Cu 2 S, chalkopyrit CuFeS 2 ). avíc je díky své schopnosti tvořit slitiny kovů základní součástí řady těchto materiálů, např. bronzů. Měď má velmi dobrou elektrickou a tepelnou vodivost, mechanicky se dobře zpracovává a je odolná vůči atmosférické korozi. S vodíkem přímo nereaguje, pouze při reakci se vzdušnou vlhkostí se pokrývá zelenou vrstvičkou hydroxid-uhličitanu, neboli měděnkou. Vzhledem k těmto vlastnostem je měď mimořádně důležitá v elektrotechnice. Měď má malou tendenci rozpouštět se ve rtuti na amalgam a snadno tvoří intermetalické sloučeniny. Rozpouští se v roztocích alkalických kyanidů za tvorby dikyanoměďnanů a vývoje vodíku. V roztocích se měď vyskytuje pouze ve formě komplexů. Typickým oxidačním stavem mědi je Cu(II), vyskytuje se však i v oxidačním stavu Cu(I). Pro měďné sloučeniny jsou typická koordinační čísla dvě (lineární řetězce) a čtyři (tetraedrická koordinace). Vazby mají převážně kovalentní charakter a uplatňují se π- i σ-vazebné interakce [43-44]. - 2 -
2.3.2. Biologický význam mědi Zdrojem mědi pro lidské tělo jsou především potraviny bohaté na měď, například to jsou játra, kakao a houby. Z biologického hlediska je měď jedním z prvků, který významně ovlivňuje lidský organismus. raje roli v mnoha enzymatických cyklech důležitých pro správnou funkci organismu, například metabolismus sacharidů.. lavní funkce mědi je však v oblasti krvetvorby. Dále měď ovlivňuje metabolismus cukrů, podílí se na imunitních reakcích a přispívá k ochraně buněk před volnými radikály. Při nedostatku mědi jsou tyto pochody narušeny a může dojít až k poškození organismu či duševního vývoje. Měď je také centrálním kovem v hemocyaninu. emocyanin jako organokovová sloučenina funguje u členovců jako přenašeč kyslíku. všem u nižších organismů může působit jako jed. Struktura bílkovin také umožňuje tvorbu komplexů s kovy, které jsou v organismu velmi důležité. Tyto komplexy jsou však v určitých případech podstatou toxicity iontů těžkých kovů. Iont těžkého kovu se naváže na povrch molekuly a blokuje funkční skupinu, která je nezbytná pro její správnou funkci. Pro pochopení tvorby komplexů a studia redoxního chování mědi s biologicky významnými látkami se velmi často využívá elektroanalytických metod. Studium těchto procesů umožňují například voltametrické metody, jež jsou založeny na změně vloženého potenciálu na pracovní elektrodu k detekci látek. K těmto účelům jsou využívány hlavně grafitové pracovní elektrody z důvodu jejich širokého potenciálového rozsahu. Měď ve formě Cu(I) v přítomnosti purinů, jako je například xanthin, může při určitém potenciálu (asi,5 V) reagovat za vzniku nerozpustných nebo velmi málo rozpustných Cu(I)-purinových komplexů, jimž odpovídá oxidační signál ve formě píku na voltametrické proudonapěťové křivce. Tento komplex se změnou elektrodové polarizace k pozitivnějším potenciálům rozpouští. Dochází k rozpadu komplexu a oxidaci mědi na Cu(II). V oblasti pozitivnějších potenciálů pak dostáváme charakteristický oxidační pík purinu, a to i v případech velmi nízkých koncentrací purinů v roztoku (obecně v subnanomolárních oblastech). Tyto metody tedy lze tedy využít nejen pro sledování oxidačních mechanismů mědi ale i pro stopovou detekci mědi v roztocích [37-42,45-46]. - 21 -
3. EXPERIMETÁLÍ ČÁST 3.1. Aparatura Všechna měření byla provedena na potenciostatu Autolab PGSTAT3 (Metrohm Czech Republic) spojeného s PC s nainstalovaným softwarem GPES 4.9. Experimenty byly provedeny při pokojové teplotě (23 o C) s využitím tříelektrodového systému s pomocnou platinovou elektrodou, referenční Ag/AgCl/KCl (3 M) elektrodou a pencil grafitovou elektrodou (PeGE, průměr,5 mm, plocha povrchu 16 mm 2 ) od firmy Tombow (Japan) jako pracovní elektrodou. p pufrů bylo stanoveno amilton Single Pore Glass elektrodou spojenou s p metrem CyberScan PC55 (Eutech Instruments). Ke kalibraci p elektrody bylo použito amilton Duracal pufrů (4,1±.1 a 7,±.1) firmy amilton Bonaduz AG, Switzerland. Koncentrace látek byla měřena na spektrometru UICAM UV4 (Chromspec, Czech republic). Schéma 3. Potenciostat Autolab PGSTAT3 (Metrohm Czech Republic) spojený s PC a měrnou celou určený k voltametrickým experimentům Schéma 4. Spektrometr UICAM UV4 (Chromspec, Czech republic) propojený s PC pro spektrální měření - 22 -
3.2. Chemikálie a procedura Použité chemikálie, včetně xanthinu (Xan) a jeho methyl derivátů (1-mXan, 3-mXan, 7- mxan, 9-mXan) - zobrazeny na Schéma 5., dále CuS 4 5 2 a všechny komponenty pro acetátový (C 3 C a C 3 Ca) respektive acetát-fosfátový pufr (C 3 C, a, 3 P 4 ), byly poskytnuty firmou Sigma-Aldrich. a přípravu roztoků bylo využito ultračisté MILLI Q vody (18,2 MΩ.cm). Před měřením byly všechny tuhy aktivovány (pre-treatment) po ponoření do roztoku základního elektrolytu,1 M acetátového pufru p 5,1. Parametry aktivace s využitím diferenční pulzní techniky byly tyto: conditioning potential: 1,4 V, duration: 3 s, deposition potential: V, accumulation time: s, equilibration time: 2 s, modulation time:,5 s, interval time:,5 s, step potential:,495 V, modulation amplitude:,4995, stand by potential: V. Aktivace byla provedena pod inertní argonovou atmosférou (99,999%). LSV křivky byly zaznamenány pro.1 M acetátový pufr p 5,1. Pro závislost p bylo využito acetátfosfátového pufru v rozmezí hodnot p od 2,2 9,3. Pro voltametrická měření byl nastaven potenciálový rozsah od -,1 V do 1,4 V proti referenční argentchloridové elektrodě při rychlostech polarizace 2, 4 a 8 mv/s. Akumulační potenciál a akumulační čas pro adsorptivní stripping proceduru založenou na redukci Cu(II) na Cu(I) byl -,15 V a 12 s. Změna parametrů byla provedena pouze u titračních měření, a to jen rozšířením potenciálového okna od -,4 V do 1,4 V. aměřené křivky byly vyhlazeny Savitzky-Golay filtrem (level 2), který je součástí GPES 4.9. Poté byla LSV data exportována a zpracována s využitím programu Microsoft Excel. Po zpracování a vyhodnocení voltametrických křivek byla provedena eliminační procedura, konkrétně výpočet a vyhodnocení eliminační funkce E4, jenž eliminuje kinetickou a kapacitní (nabíjecí) proudovou složku a zachovává složku difúzní. K jejímu zpracování bylo využito třech různých rychlostí polarizace elektrody (scan rate) a koeficienty rovnice dosazeny podle teorie. Základní rovnice E4 funkce je znovu vyjádřena rovnicí (14): 11,657 17,485 5,8284 (14) - 23 -
3 C 3 C Xanthine 1-methylxanthine C 3 3-methylxanthine C 3 7-methylxanthine 9-methylxanthine Schéma 5. Xanthin a jeho methyl-deriváty 3.3. Pracovní postup 3.3.1. Příprava vzorků Zásobní roztoky vzorků byly připraveny z navážky, která byla rozpuštěna v ultračisté MILLI Q vodě na požadovaný objem. avážky byly počítány na 1 mm koncentraci výsledného objemu podle rovnice (15). Jejich přesná koncentrace byla ověřena na UV/VIS spektrometru UICAM UV4 (Chromspec, Czech republic) a vypočítána podle rovnice (16). Rovnice pro výpočet navážky, (15) kde c koncentrace stanovované látky [M], V výsledný objem [l], M molární hmotnost látky (hodnota uvedena výrobcem na produktu) [g/mol]. Rovnice pro výpočet koncentrace roztoku ze spektometrických měření, (16) kde c koncentrace stanovované látky [M], A absorbance, λ extinkční (molární absorpční) koeficient (známe z tabulek) [M - 1 cm -1 ], l délka kyvety [cm]. 3.3.2. Příprava pufrů Acetátový pufr (,1 M) o požadovaném p byl připraven z,1 M roztoku octanu sodného a,1 M kyseliny octové v daném tabelovaného poměru. Přesná hodnota p byla ověřena na p metru CyberScan PC55 (Eutech Instruments). - 24 -
Acetát-fosfátový pufr byl připraven pomocí dvou roztoků. První roztok (A) byl připraven z ledové kyseliny octové a koncentrované kyseliny fosforečné (zastoupení každé z látek v roztoku,4 M). Druhým roztokem (B) byl 2 M a. K roztoku A byl postupně přidáván roztok B až na požadovanou hodnotu p, která byla opět měřena na p metru CyberScan PC55 (Eutech Instruments). 3.3.3. Příprava aparatury k měření, postup měření a vyhodnocení výsledků Měření byla provedena při laboratorní teplotě (asi 23 C). Měrná cela s referenční a pomocnou elektrodou byla vždy před každým měřením opláchnuta kyselinou dusičnou a omyta ultračistou MILLI Q vodou. Do měrné cely byl napipetován roztok pufru, který byl promíchán a probublán argonem kvůli odstranění kyslíku z aparatury (probublávání bylo prováděno před každým měřením). ásledně byla provedena aktivace PeGE elektrod pomocí diferenční pulzní techniky. Voltametrická měření byla realizována pomocí metody cyklické voltametrie v 1 ml roztoku pufru. Koncentrace jednotlivých analytů v celkovém objemu byly 2 µm, pokud stanovení nevyžadovalo koncentraci jinou. Rovnice pro výpočet potřebného objemu vzorku ze zásobního roztoku:, (17) kde c 1 koncentrace zásobního roztoku stanovované látky [M], c 2 výsledná koncentrace stanovované látky [M], V 1 neznámý objem stanovované látky [l], V 2 výsledný objem roztoku [l]. Po naměření voltametrických křivek vzorku pro tři různé rychlosti polarizace byla přidána měď v poměru 1:1 (pokud nebylo vyžadováno jiné) ke stanovované látce a opět byly změřeny voltametrické křivky pro tři rychlosti polarizace (scan rate). Získaná data byla zpracována v programu Microsoft Excel a využita pro výpočet eliminační funkce E4. 3.4. Výsledky a diskuze lavním cílem této práce bylo studium oxidačního chování methylxanthinů (mxan) pomocí vybraných voltametrických metod. Za tímto účelem bylo využito kombinace adsorpčních technik s elektroanalytickými metodami, kterými byly cyklická voltametrie (CV) nebo voltametrie s lineárním scanem (LSV) a následné využití eliminační voltametrické procedury (EVP) pro podrobnější charakteristiku elektrodových procesů odehrávajících se na povrchu pencil grafitové elektrody (PeGE). Xanthiny tvoří s mědí - 25 -
na povrchu elektrody komplexy Cu(I)-mXan. Již dříve bylo navrženo schéma průběhu této reakce v následující podobě: Předpokládaný průběh elektrodové reakce mxan v přítomnosti Cu(II) [21] 1. Cu II + e - Cu I (při depozičním potenciálu -.15 V) 2. Cu I + purin [Cu I -purin] (v reakční vrstvě na povrchu elektrody) 3. [Cu I -purin] [Cu I -purin] ads (adsorpce komplexu) 4. [Cu I -purin] ads e - [Cu II -purin] ads (oxidační rozpouštění) 5. [Cu II -purin] ads e - purin ox + Cu II (oxidační rozpouštění) Redoxní chemie mědi [21]: Cu 2+ + e - Cu + Cu + + e - Cu Cu 2+ + 2e - Cu 2Cu + Cu 2+ + Cu E=.15V E=.52V E=.34V E=.37 V 3.4.1. ptimalizace metody, reprodukovatelnost Pravděpodobně jedním z nejdůležitějších kroků naší práce bylo určení optimální procedury pro měření a nastavení optimálních parametrů elektrochemické analýzy. Za tímto účelem bylo provedeno měření, jež mělo určit, jestli jsou oxidační signály ovlivněny přítomností kyslíku v aparatuře a hlavně, jaký vliv má na samotné měření provedení tzv. pre-treatementu (aktivace elektrody - procedura popsaná na str.23). I(µA) 12 1 8 6 2 µm Xan -porovnání metody 4mV/s aktivovaná bez bublání aktivovaná s bubláním neaktivovaná bez bublání neaktivovaná s bubláním 4 2 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 1. LSV signály Xan pro porovnání metody s využitím a bez použití inertní atmosféry pro měření s aktivovanými a neaktivovanými elektrodami (viz. pretreatement); acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm, referenční rychlost scanu 4 mv/s - 26 -
I(µA) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 2 µm Xan 2 µm Cu(II) -porovnání metody 4mV/s aktivovaná bez bublání aktivovaná s bubláním neaktivovaná bez bublání neaktivovaná s bubláním 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 2. LSV signály Xan s ionty Cu(II) pro porovnání metody s využitím a bez použití inertní atmosféry pro měření s aktivovanými a neaktivovanými elektrodami (viz. pretreatement); acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm, c Cu = 2 µm, referenční rychlost scanu 4 mv/s Z uvedených obrázků (br. 1. a 2.) vyplývá, že pro samotné měření není podstatné, jestli je aparatura s roztokem probublána za účelem odstranění kyslíku. Velmi důležitou roli však hraje aktivace elektrody. Díky ní můžeme dosáhnou zvýšení intenzity oxidačních signálů jak samotných mxan, tak i při měřeních s přídavky iontů mědi. Velmi důležité také bylo, do jaké míry jsou naměřené výsledky reprodukovatelné. K tomuto účelu je zde zobrazena tabulka Tab. 2. Pro výpočet jednotlivých hodnot bylo provedeno statistické vyhodnocení chyby měření na základě serie šesti naměřených křivek. Tab. 2. Statistické vyhodnocení měření Xan bez iontů Cu(II) v acetátovém pufru p 5,1, referenční scan rate 4 mv/s a c Xan = 2 µm I x /µa rel nsb I = 63,1 ± 1,3 2,1 % nbb I = 62,9 ± 2,6 4,1 % asb I = 93,2 ± 3,3 3,6 % abb I = 97,8 ± 6,2 6,3 % nsb neaktivovaná s bubláním, nbb neaktivovaná bez bublání, asb aktivovaná s bubláním, abb aktivovaná bez bublání - 27 -
Z výsledků lze vyčíst, že naměřené hodnoty oxidačních signálů bez aktivace elektrody dosahují nižších hodnot, avšak bez bublání i s probubláním soustavy se tolik neliší. Snad jen v tom, že bez bublání je chyba měření o něco vyšší. Podobně tomu je i u měření s aktivací, kde dosahují proudové intenzity oxidačních signálů vyšších hodnot než bez aktivace. 3.4.2. LSV vs. EVP Součástí práce bylo využití eliminační voltametrické procedury jako citlivé metody pro sledování procesů odehrávajících se na povrchu elektrody. V této části jsou tedy porovnány výsledky získané z voltametrických měření s eliminační procedurou. Pro porovnání bylo opět využito stanovení bez iontů a s ionty mědi Cu(II) pro neaktivovanou a aktivovanou elektrodu. a) eaktivované elektrody I(µA) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 LSV 2 µm Xan bez Cu(II) neaktivovaná PeGE 2 mv/s 4 mv/s 8 mv/s 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 3. LSV signály Xan bez přídavku Cu(II) iontů při měření s neaktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm a obrázku 3. Jsou znázorněny LSV křivky xanthinu bez Cu(II) iontů pro neaktivovanou elektrodu. Měření bylo provedeno pro 3 rychlosti scanu. Konkrétně se jednalo o 2, 4 a 8 mv/s. Jak je z obrázku patrné, při zvyšující se rychlosti scanu dochází i ke zvýšení oxidačního signálu, což je v souladu s teorií. a dalším obrázku (br. 4.) je provedena transformace těchto křivek na eliminační funkce. Pro porovnání - 28 -
signálů je třeba vzít referenční rychlost scanu, což je v našem případě 4 mv/s. Velmi důležitou eliminační funkcí je E4. Tato funkce má tvar dobře čitelného signálu píkprotipík, který vypovídá o tom, že výměny elektronu na povrchu elektrody se účastní částice v adsorbovaném stavu. avíc eliminační procedura zvyšuje citlivost celé detekce, protože dochází k pěti až sedminásobnému zvýšení oxidačních signálů. 5 4 3 2 EVP 2 µm Xan bez Cu(II) neaktivovaná PeGE E1 E2 E3 E4 E5 E6 f(i) 1-1 2 4 6 8 1, 1,2 1,4-2 -3 br. 4. EVP signály Xan bez přídavku Cu(II) iontů při měření s neaktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm I(µA) 3 25 2 15 LSV 2 µm Xan a 2 µm Cu(II) neaktivovaná PeGE 2 mv/s 4 mv/s 8 mv/s 1 5 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 5. LSV signály Xan s přídavkem Cu(II) iontů při měření s neaktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm - 29 -
Přídavkem iontů Cu(II) (br. 5.) dochází ke vzniku komplexu Cu(I)-Xan v oblasti potenciálu 5 mv. Vznik a rozpad tohoto komplexu je popsán výše. Předpokládáme, že postupnou oxidací tohoto komplexu dochází k jeho rozpadu na ionty Cu(II) a Xan. V oblasti asi 9 mv můžeme pozorovat odpovídající signál Xan. proti oxidačnímu signálu Xan bez Cu(II) iontů dochází k malému posunu jeho oxidačního signálu do pozitivnějších potenciálů (asi 1mV). avíc lze pozorovat druhý oxidační pík v oblasti asi 1 mv. Tento druhý pík pravděpodobně souvisí s následnou oxidační reakcí Xan na elektrodě, která je relativně rychlá, neboť tento signál je lépe rozlišitelný až při vyšší rychlosti polarizace elektrody. V případě eliminační procedury (br. 6.) je však tento proces mnohem lépe rozlišitelný. Eliminační procedura je totiž schopná lépe odhalit minoritní procesy v procesech majoritní a lépe rozlišit překrývající se signály. Zde dochází díky eliminaci k navýšení signálu až 8x. f(i) 1, 8 6 4 2-2 EVP 2 µm Xan a 2 µm Cu(II) neaktivovaná PeGE E1 E2 E3 E4 E5 E6 2 4 6 8 1, 1,2 1,4-4 -6 br. 6. EVP signály Xan s přídavkem Cu(II) iontů při měření s neaktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm b) Aktivované elektrody Velmi podobný průběh stanovení i vyhodnocení eliminační procedury lze zaznamenat i pro měření s aktivací elektrody. Jak již bylo dříve řečeno, po aktivaci elektrody dochází ke zvýšení oxidačních signálů methylxanthinů. Pravděpodobně k tomu dochází proto, že se aktivací na povrchu elektrody vytvoří náboj, a díky tomu jsou molekuly stanovované - 3 -
látky lépe adsorbovány na povrch elektrody. To se projeví zvýšením oxidačního signálu, protože se zvýší koncentrace látky na povrchu elektrody. I(µA) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 LSV 2 µm Xan bez Cu(II) aktivovaná PeGE 2 mv/s 4 mv/s 8 mv/s 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 7. LSV signály Xan bez přídavku Cu(II) iontů při měření s aktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm 8 EVP 2 µm Xan bez Cu(II) aktivovaná PeGE 6 4 E1 E3 E5 E2 E4 E6 f(i) 2-2 2 4 6 8 1, 1,2 1,4-4 br. 8. EVP signály Xan bez přídavku Cu(II) iontů při měření s aktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm a obrázku 7. a 8. jsou porovnány oxidační signály xanthinu na aktivované elektrodě. proti signálům na neaktivované elektrodě došlo ke zvýšení oxidační odezvy, jak při LSV (asi 3 µa), tak i pro EVP (desítky až stovky µa v závislosti na eliminační funkci). - 31 -
I(µA) 3 25 2 15 LSV 2 µm Xan a 2 µm Cu(II) aktivovaná PeGE 2 mv/s 4 mv/s 8 mv/s 1 5 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 9. LSV signály Xan s přídavkem Cu(II) iontů při měření s aktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm 1, 8 6 4 EVP 2 µm Xan a 2 µm Cu(II) aktivovaná PeGE E1 E2 E3 E4 E5 E6 f(i) 2-2 2 4 6 8 1, 1,2 1,4-4 -6 br. 1. EVP signály Xan s přídavkem Cu(II) iontů při měření s aktivovanými elektrodami; acetátový pufr p 5,1, c Xan = 2 µm Po přídavku mědi ke Xan opět pozorujeme vznik komplexu Cu(I)-Xan, stejně jako v předchozím případě na neaktivované elektrodě. Dále lze pozorovat druhý oxidační pík v oblasti Xan (asi 1 mv). I v tomto případě dochází při využití eliminační procedury ke zvýšení citlivosti stanovení, a protože pozorujeme signál ve formě pík-protipík, jedná se i v tomto případě o přenos náboje u částice v adsorbovaném stavu. - 32 -
3.4.3. Stanovení vlivu p na detekci methylovaných xanthinů Byly změřeny voltametrické křivky pro sledování závislosti xanthinu a jeho methyl derivátů na p, a to v rozsahu p od 2,2 do 9,3. Z publikací a podle hodnot pk a vyplývá, že stanovované xanthiny v daném p rozsahu přechází v roztoku mezi neutrální a monoaniontovou částicí (Schéma 7.) [33,47]. + Kation pka=.8 >5% <5% eutralní pka=7.7 - - + >5% <5% Anion Xanthin (Xan) Schéma 6. Struktura neutrální a monoanintové částice Z naměřených dat lze konstatovat, že vlivem změny potenciálu od nižších hodnot p k vyšším hodnotám, mají látky tendenci poskytovat oxidační pík v negativnějších potenciálech. Jinak řečeno, látky snáze podléhají oxidaci. a uvedených grafech a tabulkách si můžeme tento fakt ověřit. I(µA) 14 12 1 8 6 4 2 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 2 µm mxan p 2,2 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 11. LSV křivky závislosti mxan bez Cu(II) iontů - p 2,2, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, acetát-fosfátový pufr - 33 -
a obrázku 11. je znázorněn průběh LSV křivek mxan bez přídavku Cu(II) iontů. Při p 2,2 poskytují všechny látky s výjimkou 9-mXan, který naznačuje tvorbu dvou píků, oxidační pík. xidační signály Xan a 1-mXan jsou si velmi podobné (viz. hodnoty Ep/p v tabulce 2.) a to platí i pro dvojici 3-mXan a 7-mXan, které se dokonce překrývají. Z toho vyplývá, že pokud bychom stanovovali všechny tyto látky vedle sebe v roztoku, nebylo by je možné při tomto p od sebe dostatečně rozlišit. Po přidání Cu(II) iontů do roztoku dojde ke vzniku komplexu Cu(I)-mXan, který lze pozorovat v oblasti,4 V. Cu(I) vzniká v roztoku redukcí Cu(II) iontů při potenciálu -,1 V a tvoří zmíněný komplex. Tento komplex se změnou potenciálu k pozitivnějším hodnotám začíná rozpadat v důsledku opětovné přeměny Cu(I) na Cu(II). Změna se projeví zvýšením odpovídajícího signálu mxan v pozitivnějších potenciálech a zároveň malým posunem potenciálu píku (řádově jednotky až desítky mv viz. Tab. 3.). I(µA) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 2 µm mxan a 2 µm Cu(II) p 2,2 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 12. LSV křivky závislosti mxan s Cu(II) ionty p 2,2, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, c Cu =2 µm, acetát-fosfátový pufr a obrázku 12. vidíme signál nově vzniklého komplexu Cu(I)-mXan jako zdvojený signál u všech metylovaných xanthinů.. Jak již bylo řečeno, následnou oxidací se tento komplex s největší pravděpodobností rozpadá, a zároveň dochází ke zvýšení signálu odpovídajícího purinu. Podobně jako v předchozím případě, i zde jsou si podobné signály Xan s 1-mXan a 3-mXan s 7-mXan. ejméně čitelný je signál 9-mXan a dá se předpokládat, že mechanismus jeho oxidace se bude odlišovat od všech dalších mxan. - 34 -
I(µA) 14 12 1 8 6 4 2 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 2 µm mxan p 3,6 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 13. LSV křivky závislosti mxan bez Cu(II) iontů - p 3,6, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, acetát-fosfátový pufr I(µA) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 2 µm mxan a 2 µm Cu(II) p 3,6 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 14. LSV křivky závislosti mxan s Cu(II) ionty p 3,6, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, c Cu =2 µm, acetát-fosfátový pufr a obrázku 13. a 14. jsou opět znázorněny LSV křivky stanovovaných látek. V tomto případě však při jiném p. Zvýšením p na 3,6 došlo k posunu oxidačních signálů mxan do negativnějších potenciálů. Znamená to tedy, že oxidace všech látek probíhá snáze než v předchozím případě (p 2,2). Dochází ke změně intenzit signálů (viz. Tab. 4. a 5.) Zároveň pozorujeme změnu signálu v oblasti tvorby komplexu oproti p 2,2. - 35 -
Zdvojené píky se začínají více překrývat, což pravděpodobně souvisí se změnou rychlosti oxidačního kroku při tvorbě komplexu. I(µA) 14 12 1 8 6 4 2 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 2 µm mxan p 4,1 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 15. LSV křivky závislosti mxan bez Cu(II) iontů - p 4,1, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, acetát-fosfátový pufr I(µA) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 2 µm mxan a 2 µm Cu(II) p 4,1 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 16. LSV křivky závislosti mxan s Cu(II) ionty p 4,1, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, c Cu =2 µm, acetát-fosfátový pufr Pro p 4,1 nastává zajímavá situace v případě hodnot potenciálů jednotlivých mxan. Při předchozích dvou p došlo k posunu signálů jednotlivých látek směrem k negativnějším potenciálům. V tomto případě to ovšem neplatí, protože posun potenciálu píků byl - 36 -
k pozitivnějším hodnotám, zatímco odezva komplexu zůstává prakticky nezměněna. Tento jev bude dále diskutován. I(µA) 14 12 1 8 6 4 2 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 2 µm mxan p 4,5 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 17. LSV křivky závislosti mxan bez Cu(II) iontů - p 4,5, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, acetát-fosfátový pufr I(µA) 25 2 15 1 2 µm mxan a 2 µm Cu(II) p 4,5 Xan 1-mXan 3-mXan 7-mXan 9-mXan 5 2 4 6 8 1, 1,2 1,4 br. 18. LSV křivky závislosti mxan s Cu(II) ionty p 4,5, referenční scan rate 4 mv/s, c mxan =2 µm, c Cu =2 µm, acetát-fosfátový pufr a obrázku 17. a 18. jsou zobrazeny LSV křivky mxan pro p 4,5. a rozdíl od předchozího případu jsou potenciálové hodnoty jednotlivých látek znovu posunuty k negativnějším hodnotám v porovnání s prvníma dvěma p. Další důležitou informací je, že zdvojený signál komplexu lez pozorovat v podstatě už jen u 9-mXan. statní zdvojené píky komplexů Cu(I)-mXan jsou překryté v jeden větší pík. Vrátíme-li se ještě - 37 -