ELEKTROFORETICKÉ METODY ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE AMINOKYSELIN NA PAPÍROVÉM NOSIČI Aminokyseliny lze rozdělit elektroforézou na papíře. Protože molekulová hmotnost jednotlivých aminokyselin není příliš odlišná, je hlavním důvodem jejich různé pohyblivosti v elektrickém poli odlišnost jejich náboje v použitém pufru. V neutrálním prostředí bude celkový náboj aminokyseliny, a tím i směr pohybu jejích molekul v elektrickém poli, záviset na přítomnosti disociovatelných skupin v postranním řetězci. Schématické znázornění elektroforézy na papíře. Po rozdělení ve stejnosměrném elektrickém poli na chromatografickém papíře se aminokyseliny detekují pomocí ninhydrinu, který při reakci s volnými aminoskupinami za tepla vytváří většinou fialově zbarvené produkty. Pouze iminokyselina Pro poskytuje žlutý produkt. Materiál a chemikálie: elektroforetická aparatura zdroj stejnosměrného napětí vysoušeč vlasů kapiláry k nanášení vzorků filtrační papír, nastříhaný na pásy 12,5 46 cm elektrodový pufr 0,1M fosfátový ph 6,8 0,2% ethanolový roztok ninhydrinu vzorky aminokyselin o koncentraci 1,6 mg/ml (Gly, Glu, Lys, Pro) Pracovní postup: Do obou elektrodových prostorů nalijte odměrným válcem cca 600 ml fosfátového pufru ph 6,8 tak, aby roztok přetékal přes ozubené přepážky dna elektrodových nádob. Na pásu filtračního papíru naznačte lehce měkkou tužkou středovou startovní čáru a na ní si označte 5 bodů, kam nanesete 4 standardy a 1 vzorek (směs dvou nebo tří aminokyselin). Vzorky (asi 20 l) nanášejte ve vzdálenosti asi 20 mm od sebe tak, aby skvrna vzorku byla co nejmenší. Jednotlivé kapky nanášeného vzorku vysoušejte vysoušečem vlasů. Při nanášení vzorků se nedotýkejte prsty papírového nosiče, zejména ne v oblasti, kde bude probíhat dělení.
Chromatografický papír s nanesenými a vysušenými vzorky vložte do elektroforetické aparatury tak, aby startovní linie se vzorky ležela právě nad středovou podpěrkou. Oba konce papíru ponořte do prostoru s elektrodovým pufrem. Filtační papír navlhčete pomocí Pasteurových pipet elektrodovým pufrem až 1 cm před startovní linii (aby nedošlo k rozmytí vzorků). Po té vyčkejte, až bude vzlínajícím pufrem navlhčena i startovní linie. Po kontrole správného zapojení přiklopte víkem a asistent zapne přístroj (napětí 300-350 V, proud cca 5-10 ma na jeden elektroforeogram nebo 15-20 ma na dva elektoroforeogramy). Elektroforetický experiment nechte probíhat po dobu 1,5 hod. Během této doby se věnujte druhé části této laboratorní úlohy ( Stanovení molekulové hmotnosti bílkovin elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného ) za občasného kontrolování chodu přístroje. Po skončení elektroforézy a vypnutí zdroje sejměte víko aparatury, vyjměte elektroforeogram a usušte jej ve vodorovné poloze na připravených stojáncích pomocí vysoušeče vlasů. Detekci aminokyselin proveďte protažením elektroforeogramu 0,2% ethanolovým roztokem ninhydrinu a vysušením proudem teplého vzduchu z vysoušeče. Vyhodnocení výsledků: Viditelné skvrny označte tužkou, porovnejte polohy skvrn jednotlivých standardů a vzorku na elektroforeogramu a určete složení vzorku. Výsledky uveďte v protokolu, k němuž též přiložíte elektroforeogram. Kontrolní otázky: 1. Nevýhodou klasické volné elektroforézy je rozmývání zón separovaných látek působením konvekčních proudů vznikajících Joulovým teplem. Jak lze tomuto rozmývání zón předejít? 2. Směs tří dipeptidů (struktura naznačena v obrázku) byla nanesena na proužek filtračního papíru (na startovní linii, svislá čárka uprostřed), který byl poté zvlhčen pufrem o ph 6,0. Pak na něj bylo vloženo stejnosměrné napětí (polarita vyznačena). Po hodině byl proužek vysušen a skvrny jednotlivých peptidů identifikovány reakcí s ninhydrinem. Vysvětlete rozložení skvrn. 3. Směs aminokyselin histidinu, kyseliny asparagové a glutaminu byla dělena elektroforézou na papíře. Vzorek byl nanesen na startovací čáru uprostřed papírového nosiče a dělení probíhalo v 0,1M acetátovém pufru ph 4,5. Načrtněte polohu skvrn jednotlivých aminokyselin po detekci ninhydrinem. 4. Po elektroforetickém dělení směsi aminokyselin lysinu a glycinu (1:1) byla detekována jediná skvrna v prostoru mezi startovní linií a anodou. V jakém ph elektroforéza probíhala?
STANOVENÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI BÍLKOVIN ELEKTROFORÉZOU V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU V PŘÍTOMNOSTI DODECYLSÍRANU SODNÉHO (SDS-PAGE) Při elektroforéze se bílkoviny dělí podle náboje a velikosti svých molekul. Aniontový detergent dodecylsíran sodný (SDS) se váže na povrch proteinů, čímž je denaturuje a uděluje jim jednotný záporný náboj; proteiny tak získávají podobný tvar a analogickou hustotu náboje. Pomocí SDS - PAGE lze určit molekulovou hmotnost bílkovin srovnáním se bílkovinnými standardy o známých molekulových hmotnostech. Přidá-li se ke vzorku bílkovin merkaptoethanol nebo dithiothreitol, který redukuje disulfidové vazby, je možno stanovit molekulovou hmotnost jednotlivých polypeptidových řetězců. Detekci separovaných bílkovin v této úloze provedeme pomocí barvícího roztoku Coomassie Blue R-250. Vaším úkolem bude stanovit molekulovou hmotnost neznámých bílkovin ve vzorcích A, B a C podle standardu molekulových hmotností a následně podle přiložené tabulky určit, o jakou bílkovinu se v jednotlivých vzorcích jedná. Nákres aparatury pro diskontinuální polyakrylamidovou elektroforézu Materiál a chemikálie: aparatura pro diskontinuální elektroforézu mikropipety, pipety roztoky pro přípravu dělicího a zaostřovacího gelu: 30% směs akrylamidu a bisakrylamidu 1,5M Tris - HCl pufr ph 8,8 0,5M Tris - HCl pufr ph 6,8 10% roztok SDS v H 2 O 10% roztok peroxodisíranu amonného (připravuje se vždy čerstvý těsně před použitím) v H 2 O TEMED (N,N,N,N - tetramethylendiamin) elektrodový pufr: 0,025M Tris, 0,192M glycin s 0,1% SDS standardy molekulových hmotností (broad range) roztok na barvení gelu: 0,25% Coomassie Blue R-250, 45% methanol, 10% kys. octová vzorky A, B, C v redukujícím vzorkovém pufru
Pracovní postup: Sestavení aparatury Velké i malé sklo nejprve omyjte jarem, opláchněte destilovanou vodou a ethanolem a otřete buničinou. Menší sklo položte na větší tak, aby mezi skly vznikla mezera. Takto připravená skla vložte do zeleného stojánku, upevněte a vložte do nástavce na nalévání gelů. Příprava polyakrylamidových gelů: Dělící gel: Podle tabulky připravte 12% dělící gel do Erlenmeyerovy baňky (25 ml). Směs připravujte podle pořadí uvedeném v tabulce a důkladně promíchejte. S roztoky obsahujícími akrylamid pracujte opatrně, vyvarujte se jejich styku s pokožkou. POZOR! Akrylamid je neurotoxin! Pracujte v rukavicích a roztoky v žádném případě nepipetujte ústy! Připravenou směs napipetujte do prostoru mezi dvě skla cca 1,5-2 cm pod okraj kratšího skla a opatrně převrstvěte destilovanou vodou; pracujte rychle, neboť po přidání peroxodisíranu a TEMEDu směs začíná polymerovat. Během 20-30 min dělicí gel zpolymeruje. Vytvoří se ostré rozhraní mezi gelem a vrstvou vody. Po skončené polymeraci destilovanou vodu slijte a nakonec odsajte proužkem filtračního papíru. Zaostřovací gel: Podle tabulky připravte 5% zaostřovací gel do Erlenmeyerovy baňky (25 ml). Směs připravujte podle pořadí uvedeném v tabulce a důkladně promíchejte. Směs napipetujte na vysušený dělící gel a zasuňte do něj zelený hřeben s 10 jamkami (pozor na bubliny). Zaostřovací gel polymeruje asi 15 minut. Po skončení polymerace vysuňte hřeben a vytvořené jamky propláchněte elektrodovým pufrem, jamky jím nechte naplněné. Příprava polyakrylamidových gelů pro SDS-PAGE 12% dělicí gel [ml] 5% zaostřovací gel [ml] Destilovaná voda 1,6 1,4 30% akrylamid/bisakrylamid 2,0 0,33 1,5M Tris/HCl (ph 8,8) 1,3-0,5M Tris/HCl (ph 6,8) - 0,25 10% SDS 0,05 0,02 10% APS 0,05 0,02 TEMED 0,004 0,004 Aplikace vzorků při diskontinuální SDS - PAGE Nejprve je třeba skla s připravenými zpolymerovanými gely uvolnit ze stojánku a vložit do elektroforetické aparatury. Pozor, skla musí být umístěna tak, aby krátké sklo bylo blíže ke středu, jamky zaostřovacího gelu byly uvnitř aparatury. Do spodního elektrodového prostoru nalijte cca 3 cm elektrodového pufru tak, aby byla zakryta spodní elektroda. Horní elektrodový prostor naplňte po okraj elektrodovým pufrem. Do jamky napipetujte pomocí pipety s dlouhými tenkými špičkami 10 l připravených vzorků nebo 5 l standardu molekulových hmotností. Vzorky nanášejte v pořadí dle pokynů asistenta. Vlastní elektroforetické dělení Elektrodovou nádobu zavřete víkem tak, aby anoda na elektroforetické aparatuře (označena červeně) byla spojena s červeným výstupem ze zdroje. Na zdroji nastavte konstantní napětí na hodnotu 180 V. Elektroforetické dělení nechte probíhat tak dlouho, až bromfenolová modř (čelo dělících se látek) doputuje téměř na úroveň dolního okraje skel (cca 45 min). Po skončení elektroforetického dělení vypněte zdroj napětí. Teprve potom sundejte víko, vylijte pufr a vyndejte aparaturu z nádoby. Barvení gelu
Vyjměte skla z aparatury a skla opatrně oddělte od sebe. Gel přeneste do připravené Petriho misky s barvícím roztokem. Nechte barvit 20 minut. Potom barvící roztok slijte a odbarvěte v horké vodě (cca 3x10 minut). Po odbarvení gelu uvidíte modře obarvené proužky bílkovin. Vyhodnocení výsledků: Stanovte, jaký protein je obsažen ve vzorku A, B a C. K dispozici máte molekulové hmotnosti možných proteinů a molekulové hmotnosti standardů. Broad range standard Proteiny ve vzorcích protein molekulová hmotnost / kda hovězí sérový albumin 66,2 chymotrypsinogen 25,0 peroxidasa 41,0