Hmotnostní spektrometrie Podstatou hmotnostní spektrometrie je studium iontů v plynném stavu. Tato metoda v sobě zahrnuje tři hlavní části:! generování iontů sledovaných atomů nebo molekul! separace iontů podle poměru jejich hmotnosti k náboji (m/z)! měření zastoupení jednotlivých druhů separovaných iontů Z těchto bodů vyplývá, že jde o metodu destrukční. Generování iontů sledovaných atomů nebo molekul K produkci iontů (ionizace) se používá v hmotnostní spektrometrii několik způsobů, závislých na skupenství studované látky a dalších faktorech, jako je např. stupeň fragmentace molekuly. Z nejdůležitějších lze jmenovat:! termální ionizace! jiskrová ionizace! ionizace elektronovým paprskem! chemická ionizace! ionizace polem! desorpce polem! desorpce laserem nebo plasmou! ionizace rychlými atomy a ionty Pro molekuly, které se za podmínek analýzy nacházejí v plynném stavu je stále nejpoužívanějším způsobem ionizace elektronovým paprskem. V závislosti na energii elektronů může dojít k řadě procesů od excitace molekuly až po její rozštěpení. Z hlediska hmotnostní spektrometrie je však nejdůležitější oblast vzniku negativních iontů (velmi nízké energie) a pozitivních iontů. Nejběžnější metodou je metoda pozitivních iontů. Metoda negativních iontů má výhodu, že ionty nepodléhají prakticky vůbec přesmykům, čímž lze například rozlišit strukturní izomery, ale metoda je dosud mnohem méně prostudována než metoda pozitivních iontů. K odtržení elektronu z molekuly a vzniku pozitivního iontu dojde, když je energie bombardujících elektronů rovna nebo vyšší než její ionizační potenciál. Hmotnostní spektrometrie je tedy také jednou z metod, kterými jsou měřeny ionizační potenciály. Protože pro většinu anorganických a organických molekul dosahuje pravděpodobnost ionizace maximální hodnoty kolem energie elektronů 70eV, mají vzniklé ionty značný přebytek energie a jen některé z nich jsou stabilní dostatečně dlouhou dobu. Dochází proto následnými pochody k fragmentaci (rozštěpení molekuly na nabité a nenabité části) a přesmykům (přeskládání struktury fragmentovaných částí). Kromě ion-radikálů jsou tedy po ionizaci přítomny také kationty, radikály a neutrální molekuly. Energie 70 ev zajišťuje také konstantní stupeň fragmentace a získání tabelovaného spektra. Tento způsob ionizace nazývaný též elektron impact (EI) je proto tvrdou ionizační metodou. Pokud chceme omezit fragmentaci na minimum, je vhodné použít metodu zvanou chemická ionizace, která využívá nepřímé ionizace molekul látky ionizovanými molekulami reakčního plynu. Reakčním plynem může být metan, amoniak ap. Jeho zastoupení při ionizaci je až 1000 krát vyšší než sledované látky. Z tohoto důvodu je přednostně ionizován reakční plyn. Vzniklé ionty se mohou chovat jako Brönstedovy nebo Lewisovy kyseliny, molekuly vzorku mohou reagovat s těmito ionty podle schematu AH + + M MH + + A + H, a vzniklé ionty vzorku mají pak energii závislou na hodnotě reakčního tepla H. Stupeň fragmentace proto závisí na druhu použitého plynu.
Ionizace elektronovým paprskem (EI) - iontový zdroj Tento způsob ionizace je stále nejrozšířenějším u analýzy organických sloučenin, postupem času byly vytvořeny touto metodou největší světové hmotnostně spektrometrické databanky. Komůrka, ve které je generován elektronový paprsek a kde dochází k tvorbě iontů se nazývá iontový zdroj (IZ). Molekuly vzorku jsou vystaveny účinkům kolimovaného paprsku elektronů, který je emitován z jemného vlákna (např. wolfram), zahřívaného stejnosměrným proudem. Tento drát je katodou a elektrony jsou k anodě přitahovány přes kolimační magnetické pole. Je nutné, aby byl elektronový paprsek přesně definován a natolik úzký, aby byly ionty jakoby tvořeny z bodového zdroje před štěrbinou do iontové optiky. Iontový paprsek, který je kolmý k elektronovému paprsku prochází akcelerační sekcí přes urychlující elektrické pole tj. iontovou optikou (soustava clon) do analyzátoru. Separace iontů podle poměru jejich hmotnosti k náboji (m/z) K separaci iontů podle m/z dochází v analyzátorech, kterých je opět velká řada, ale obecně je lze rozdělit do dvou hlavních tříd. Klasickým typem a zároveň představitelem první třídy je analyzátor magnetický, v kterém jsou ionty separovány podle zákona působení síly na nabitou částici v magnetickém poli. Na částici s nábojem z, která se pohybuje rychlostí v kolmo na směr magnetického pole o indukci B, působí síla F, která je kolmá na vektor rychlosti a magnetické indukce. Pokud je zaručeno, že také rychlost a magnetická indukce jsou na sebe kolmé, lze směr síly F znázornit pravidlem levé ruky a částice se bude pohybovat po kruhové dráze s poloměrem r. V obecném případě, kdy vektory v a B mezi sebou svírají úhel γ, platí pro velikost síly obecný výraz F = z B v sinγ a tudíž velikost síly je úměrná složce rychlosti, která je kolmá na směr magnetického pole. Dráha částice bude v tomto případě šroubovice. Pokud je splněna podmínka, že do analyzátoru vchází monoenergetický paprsek, tedy že všechny ionty mají stejnou kinetickou energii, získáme hmotnostní spektrum buď kontinuální změnou magnetické indukce nebo urychlovacího napětí, kdy na štěrbinu detektoru zaměřujeme ionty s různým poměrem m/z. Při rozvoji spektra od nižších k vyšším hmotnostem má závislost hmoty na čase exponenciální charakter. Je proto nutné stupnici linearizovat. Další nevýhodou analyzátoru je, že patří k nízkorozlišovacím. Vysokého rozlišení lze dosáhnout tzv. dvojitým zostřením, kdy před analyzátor předřadíme elektrostatický analyzátor, čímž získáme monoenergetický kolimovaný paprsek.
Další třída je tvořena tzv. dynamickými analyzátory, z nichž nejznámější je kvadrupólový analyzátor. Tento analyzátor je tvořen čtyřmi paralelními kovovými tyčemi, které jsou prostorově umístěny v rozích čtverce. Podstatou funkce je hyperbolické radiofrekvenční pole. Na elektrody (tyče) je vkládáno napětí složené ze stejnosměrné složky U a vysokofrekvenční střídavé složky V 0 cos ω t. Ionty vstupují do filtru jako široký, mírně divergující svazek ve směru podél osy. Při průchodu vykonávají složité kmity kolmo na podélnou osu. Pohybové rovnice (" Mathieuovy rovnice ") poskytují řešení, podle kterého velikost a forma kmitů závisí na hmotnosti iontů m. Tímto filtrem mohou projít pouze ionty se stabilní dráhou, ostatní skončí na povrchu elektrod nebo na stěnách vakuového obalu. Současnou změnou V 0 a U se dociluje rozvoje škály hmot pro záznam spektra. Tento typ analyzátoru má výhodu v tom, že signály mají při lineárním časovém rozvoji stejnou šířku, vzdálenost a analogický tvar (lineární hmotnostní stupnice). Další výhodou je rychlost produkce celého hmotnostního spektra (ms) a schopnost pracovat kvalitně i při vyšších tlacích než u ostatních analyzátorů. Tyto vlastnosti jsou zejména vhodné pro jeho spojení s počítačem a s plynovým případně kapalinovým chromatografem. Nevýhodou tohoto analyzátoru je, že propouští více iontů, protože je méně ovlivněn rozptylem energie iontového paprsku a že vykazuje tzv. hmotnostní diskriminaci, tj. čím větší m/z, tím menší relativní intenzita iontu. Tímto analyzátorem nelze také pozorovat metastabilní ionty. Dále je vhodné se zmínit o několika dalších typech:! analyzátor letový (TOF)! analyzátory s dvojitým zaostřením! analyzátor na principu cyklotronové rezonance iontů Měření zastoupení jednotlivých druhů separovaných iontů Z detektorů používaných ke stanovení jednotlivých druhů iontů se nejběžněji používají detektory elektrické. Elektronový násobič pracuje na principu sekundární emise elektronů za neustálého zesilování primárního signálu. Lze jím dosáhnout 10 3 až 10 8 násobné zesílení proudu s malým podílem šumu. Tento detektor musí být odstíněn od magnetického pole a udržován neustále ve vakuu. K jeho výhodám patří rychlost odezvy, nevýhodou je hmotnostní diskriminace. Z dalších lze zmínit např. fotografickou detekci. Výsledkem metody je záznam iontů vzniklých ze zkoumaného vzorku, tzv. hmotnostní spektrum, na kterém je v závislosti na rostoucí hodnotě m/z vynášeno absolutní nebo relativní zastoupení iontů. Ion odpovídající molekulové hmotnosti měřené látky nazýváme molekulární ion (parent ion) a nejintenzivnější ion ve spektru označujeme jako základní ion (base ion). Při použití chemické ionizace je spektrum narozdíl od spektra z ionizace elektronovým paprskem podstatně jednodušší s intenzivním M+1 molekulárním ionem. Protože podoba spektra je dána specifickými podmínkami v daném přístroji, neexistuje pro tento druh ionizace obecná hmotnostně spektrometrická databanka, jako tomu je u metody EI.
Přístroj V této laboratoři je přístroj od firmy Finnigan MAT. Základ tvoří multifunkční kvadrupólový hmotnostní spektrometr TRIO 1000 serie II, systém schopný provádět nejen GC/MS *) a LC/MS *) analýzy, ale také analýzy pevných vzorků. Nejdůležitější části přístroje jsou:! vakuová sekce - jedná se o dvoustupňový systém vývěv tvořený v prvním stupni olejovou vývěvou, ve druhém turbomolekulárními vývěvami Pozn.: V každém hmotnostním spektrometru musí být udržováno vysoké vakuum. Důvodů je několik, ale nejdůležitějším je, že střední volná dráha iontů musí být podstatně delší než dráha z iontového zdroje k detektoru, aby byly prakticky vyloučeny srážky mezi ionty a mezi ionty a molekulami. Tato podmínka je většinou splněna, když je vnitřní tlak nižší než 5.10-5 torr, a je tím zároveň vyhověno i všem dalším.! plynový chromatograf - jedná se o přístroj série GC 8000, který je vybaven ovládací klávesnicí a který umožňuje nástřik ve splitovém a splitless módu! interface GC - MS - termostatovaná část, přes kterou vede konec kolony z GC do MS! hmotnostní spektrometr - standardně je používána ionizace elektronovým paprskem (EI), lze provádět chemickou ionizaci metanem; analyzátor je kvadrupólový, detektorem je fotonásobič Schema spojení GC - MS Schema přímého vstupu! přímý vstup - interface pro zavedení málo těkavých pevných nebo kapalných vzorků, vzorků nevhodných pro GC analýzu nebo termicky labilních do IZ; vzorek je zaveden pomocí sondy do iontového zdroje a zplyněn! počítač - ovládání sestavy, ukládání a zpracování dat se děje přes počítač Přístroj je schopen detekovat ionty v rozmezí hmot 2-1000, svojí konstrukcí patří mezi nízko rozlišovací s mezí detekce na polovinu hmotnostní jednotky. *) zkratky: GC = plynový chromatograf LC = kapalinový chromatograf MS = hmotnostní spektrometr
Pracovní postup: Před každou úlohou, která je určena pro samostatnou práci studentů, bude studentům nejdříve vysvětlen a předveden postup. Studenti budou pod dohledem asistenta nebo technika postup opakovat. Při chromatografické analýze bude do injektoru dávkováno množství 1µl. Úkol: pod dohledem asistenta nebo technika proveďte! nastavení parametrů pro hmotnostní spektrometr kontrolou na hmotách referenčního roztoku heptakosy! kalibraci hmotnostní stupnice! kontrolu těsnosti sestavy GC - MS změřením spektra zbytkové atmosféry! nastavení teplotního režimu pro plynovou chromatografii! chromatografickou analýzou testovací látky a) ověření citlivosti metody (meze detekce) b) posouzení vlivu ionizační energie na charakter hmotnostního spektra Doplňující úloha: asistent provede! seznámení studentů s technikou přímého vstupu! analýzu neznámého vzorku technikou přímého vstupu Potřeby: - 3 roztoky o různých koncentracích testovací látky vzniklé ředěním zásobního roztoku obsahujícího 5 mg látky/50ml hexanu 1 roztok: zásobní roztok zředěn 1:10 2 roztok: roztok 1 zředěn 1:10 3 roztok: roztok 2 zředěn 1:10 - neznámý vzorek (pevná látka) - mikrolitrová injekční stříkačka pro splitless mód - sonda pro přímý vstup se skleněnou nádobkou na vzorek na hrotu Pozn.: Na konci cvičení budou studenti seznámeni s knihovnou spekter a bude provedena identifikace testovací látky Zpracování výsledků: - výsledky budou zpracovány formou dvou protokolů V prvním protokolu budou zpracována měření prováděná studenty. Protokol bude odevzdán vyučujícímu v následujícím týdnu a bude obsahovat: 1. Osobní údaje: jméno, datum, studijní obor 2. Název úlohy 3. Stručný princip metody: maximálně 1/2 stránky 4. Údaj o citlivosti metody (mez detekce testovací látky v ppm) 5. Specifikaci vztahu mezi ionizační energií a charakterem hmotnostního spektra 6. Závěr - posouzení výsledků 7. k protokolu přiložit naměřené záznamy opatřené popisem (název látky, její koncentrace, u spekter také hodnotu ionizační energie) pozn. k bodům 4 a 5 - napsat stručný postup, jaká testovací látka byla použita a její koncentrace
Druhý protokol se bude týkat identifikace neznámého vzorku. Protože tento vzorek bude studován v průběhu semestru také dalšími metodami (NMR, IČ ap.), je jeho souhrnné vyhodnocení limitováno do zápočtového týdne. Protokol bude odevzdán před zápočtovým týdnem Doc. Trnkové (katedra Fyzikální chemie) a bude obsahovat: 1. Osobní údaje: jméno, datum odevzdání, studijní obor 2. Název úlohy: Určení struktury neznámé organické sloučeniny aplikací moderních fyzikálně chemických metod 3. Ke každé metodě: - název metody (např. Hmotnostní spektrometrie) - přiložit naměřený záznam opatřený popisem (název metody, koncentrace látky ap.) - metodou zjištěné charakteristické rysy sloučeniny (nasycenost, funkční skupiny ap.) a zdůvodnění výsledků - na jakou sloučeninu lze z výsledků usuzovat 4. Určení struktury ze vzájemné korelace výsledků jednotlivých metod 5. Název a strukturní vzorec sloučeniny 6. Závěr - posouzení výsledků