MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav fyziologie a anatomie rostlin Protistresová reakce rostlin: role glutathionu Bakalářská práce Rok: 2008/09 Autor: Kateřina Balarinová Vedoucí bakalářské práce: prof. Ing. Miloš Barták, CSc

Prohlašuji, že jsem tuto práci zpracovala samostatně s použitím uvedené literatury. Brno, 15. 4. 2009 Kateřina Balarinová

Děkuji prof. Ing. Miloši Bartákovi, CSc za odborné vedeni při psaní mé bakalářské práce. Dále děkuji své rodině za podporu a zázemí při psaní této práce a svým spolužákům, kteří mi ve slabších chvílích dokazovali, že v tom nejsem sama.

Abstrakt Přírodní tripeptid glutathion ( -glu-cys-gly) se vyskytuje v buňkách rostlin i živočichů. Má v metabolismu buňky mnoho různých funkcí. Je hlavní zásobárnou síry a také hlavní transportní formou redukované síry. Je také prekurzorem fytochelatinů. V antioxidativním obranném systému funguje jako substrát pro antioxidativní enzymy a může také s reaktivními formami kyslíku reagovat přímo. Existuje v buňce ve dvou formách, redukované (GSH) a oxidované (GSSG). Ve své redukované formě se účastní odstraňování reaktivních forem kyslíku nebo regenerace askorbátu v askorbát-glutathionovém cyklu. V této práci jsem zpracovala pět stresových faktorů vzdušné polutanty, sluneční záření, vysokou teplotu, sucho a salinitu, a roli glutathionu při jejich působení.

Abstract The natural tripeptide glutathione ( -glu-cys-gly) is found in plant and animal cells. It has multiple functions in the cellular metabolism. It is a major reservoir of sulphur and the main transport form of reduced sulphur. It is also a precursor of phytochelatins. It is involved in the antioxidative defence system as a substrate for the antioxidant enzymes or it can react directly vith the reactive oxygen species (ROS). It exists in the cell in two forms reduced (GSH) and oxidized (GSSG). In the reduced form it is involved in scavenging of ROS or in the regeneration of the ascorbate in the ascorbate-glutathione cycle. In this work I wrote about five different stress conditions air pollutants, high irradiance, high temperature, drought and salinity, and about a role of glutathione.

1 I. Obsah I. OBSAH... 1 II. POUŢITÉ ZKRATKY... 2 III. ÚVOD... 3 IV. OBECNÁ CHARAKTERISTIKA GLUTATHIONU... 5 V. BIOSYNTÉZA A DEGRADACE... 7 1. Biosyntéza... 7 2. Degradace... 8 VI. FUNKCE GLUTATHIONU... 9 1. Antioxidativní obranný systém... 10 1.1. Tvorba ROS... 10 1.2. Role glutathionu... 13 VII. TYPY ENVIRONMENTÁLNÍCH STRESŮ, ROLE GLUTATHIONU... 16 1. Vzdušné znečištění... 16 1.1. Vliv fytotoxických sloučenin síry na metabolismus a glutathion... 17 1.2. Ozon... 20 2. Nedostatek vody... 23 3. Salinita... 27 4. Vysoké hodnoty záření... 29 5. Vysoká teplota... 32 VIII. ZÁVĚR... 37 IX. POUŢITÁ LITERATURA... 40

2 II. Pouţité zkratky GSH glutathion redukovaná forma GSSG oxidovaná forma glutathionu -EC - -glutamylcystein -ECS - -glutamylcysteinsyntethasa GS glutathionsyntethasa GR glutathionreduktasa GPX - glutathionperoxidasa ROS reaktivní formy kyslíku NADPH nikotinamidadenindinukleotidfosfát redukovaná forma NADP nikotinamidadenindinukleotidfosfát oxidovaná forma Glu glutamát Cys cystein Gly glycin Asc askorbát APX - askorbátperoxidasa DHAsc dehydroaskorbát MDHA monodehydroaskorbát MDHAR monodehydroaskorbátreduktasa DHAR dehydroaskorbátreduktasa PSII fotosystém II PSI fotosystém I CAT katalasa GST glutathion-s-transferasa HSPs proteiny teplotního šoku

3 III. Úvod Všechny živé organismy žijící v aerobní atmosféře jsou trvale vystaveny působení nepříznivých stresových podmínek. Díky životu v aerobní atmosféře jsou také trvale -. vystaveny tvorbě reaktivních sloučenin kyslíku, jako jsou O 2 - superoxidový anion, 1 O 2 singletový kyslík, OH. - hydroxylový radikál nebo H 2 O 2 peroxid vodíku, v buňkách. Organismy mohou být vystaveny mnoha typům abiotických stresových faktorů, které vyvolávají zvýšenou tvorbu nebezpečných volných radikálů. K těmto stresovým podmínkám patří například nedostatek vody nebo naopak zaplavení přílišným množstvím vody, vzdušné znečištění, vysoká intenzita světla a s tím spojené UV záření, působení toxinů, xenobiotik, těžkých kovů či patogenů, nízkých nebo vysokých teplot, zasolení půdního roztoku. Uvažujeme-li proces evoluce, pak od přechodu organismů na souš trvá nutnost adaptace na tyto stresové podmínky. Je také potřeba účinně předcházet tvorbě reaktivních forem kyslíku a mít funkční systém obrany, pokud nějaké toxické sloučeniny v buňce vzniknou. Proto se během evoluce vyvinul antioxidativní obranný systém zahrnující množství obranných enzymů a jiných nízkomolekulárních organických sloučenin fungujících jako substrát pro tyto enzymy. Mezi nejdůležitější obranné enzymy patří superoxiddismutasa (SOD), katalasa (CAT), glutathionperoxidasa (GPX), askorbátperoxidasa (APX), glutathionreduktasa (GR) a dehydroaskorbátreduktasa (DHAR). Mohou reagovat přímo s reaktivními formami kyslíku (ROS) (SOD, katalasy a peroxidasy) nebo se účastní regenerace antioxidantů (reduktasy). K těmto antioxidantům patří sloučeniny jako askorbát, -tokoferol, karotenoidy či xantofyly a v neposlední řadě také glutathion. Glutathion ( -glutamyl-cysteil-glycin) je nízkomolekulární tripeptid vyskytující se výlučně intracelulárně. Je složen z aminokyselin glutamátu, cysteinu a glycinu spojených peptidovými vazbami. Je obsažen v cytosolu i různých buněčných organelách. V buňkách má velké množství funkcí, mezi jinými je zásobní sloučeninou síry, chrání thiolové skupiny proteinů před oxidací, je důležitý pro udržení redoxního stavu v buňce a také se účastní antioxidativní obrany před vnějšími stresy. Spolu s askorbátem se účastní přeměny peroxidu vodíku na vodu v askorbát-glutathionovém cyklu. Je i sám schopen reagovat s nebezpečnými ROS, a tím bránit peroxidaci lipidů a nukleových kyselin a jiným poškozením rostlinné buňky. Důležitý je poměr jeho redukované a oxidované formy GSH:GSSG, který může ukazovat na míru oxidativního stresu v rostlině.

4 Při působení oxidativního stresu reaguje glutathion podle intenzity a doby trvání stresu, podle typu stresoru a také podle tolerance daného druhu rostliny vůči stresu. Obvykle dochází v počátcích působení stresu k oxidaci GSH a k poklesu poměru GSH:GSSG. Také se zvyšují aktivity antioxidativních enzymů. Pokud stres trvá dlouhou dobu nebo je příliš intenzivní, dojde k vyčerpání antioxidativní kapacity buňky a k buněčné smrti. Po ukončení působení stresu nebo při aklimatizačních procesech se zvyšuje aktivita glutathionreduktasy, která zajišťuje zpětnou přeměnu GSSG na 2 molekuly GSH za současného spotřebovávání NADPH. Funkčně je glutathion v rostlinách nenahraditelný, nelze ho zaměnit za jinou sloučeninu (Noctor et al., 2002). V této práci jsem se zaměřila na popis antioxidativních vlastností glutathionu a na jeho funkci v antioxidativním systému při působení vybraných abiotických stresových faktorů.

5 IV. Obecná charakteristika glutathionu Glutathion ( -glutamyl-cysteil-glycin) je jedním z nejčastěji se vyskytujících přírodních nízkomolekulárních thiolů v buňkách rostlinných i živočišných organismů (Tausz et al., 2000). Je to tripeptid skládající se ze tří aminokyselin glutaminu, glycinu a cysteinu spojených peptidickými vazbami. Jeho stabilita a také nízký redoxní potenciál jsou zajištěny neobvyklou vazbou mezi glutamátem a cysteinem, díky které může v buňce existovat v relativně vysokých koncentracích (Ganguli et al., 2007). Díky své thiolové skupině může glutathion tvořit disulfidické můstky, což je důležitá vlastnost pro jeho redoxní funkce. Je také rozpustný ve vodě. Právě díky reaktivitě své thiolové skupiny spolu s relativní stabilitou molekuly a vysokou rozpustností ve vodě je glutathion významnou sloučeninou v obraně rostlin proti oxidativnímu stresu (Shao et al., 2008). Obrázek 1- Redukovaná a oxidovaná forma glutathionu; ChemSketch GSH ROS GSSG

6 V buňkách se vyskytuje jednak ve své redukované formě (GSH), jednak ve formě oxidované (GSSG), která vzniká spojením dvou molekul glutathionu pomocí jejich thiolových skupin disulfidickým můstkem. GSH přechází na svou oxidovanou formu působením vznikajících volných radikálů a jiných reaktivních forem kyslíku (ROS). Vzájemný poměr těchto dvou forem (GSH/GSSG) je numericky obvykle větší než 0,9 pokud ovšem není rostlina pod působením stresových faktorů (Tausz et al., 2004). V běžných fyziologických podmínkách je tento poměr obvykle konstantní, nezávisle na změnách koncentrace celkového glutathionu v buňce (Noctor et al., 2002). Ke změnám v poměru redukované a oxidované formy může docházet při různých reakcích, například při odstraňování peroxidu vodíku. Tento poměr je důležitým ukazatelem míry stresu u rostlin, jeho změny mohou také indikovat stupeň využití některých signálních drah v buňce (Shao et al., 2008). Ke zpětné redukci GSSG na 2 GSH je potřeba 1 molekula NADPH a enzym glutathionreduktasa (GR). U některých rostlinných druhů se vyskytují homology GSH obsahující místo glycinu jinou aminokyselinu, např. -EC-ala (homoglutathion), -EC-ser (hydroxymethylglutathion) a -EC-glu. Všechny vznikají z -EC. U rostlin syntetizujících -EC-ala (např. pšenice) je důležitým enzymem homoglutathionsyntethasa má výrazně vyšší afinitu k -alaninu než ke glycinu (Noctor, Foyer, 1998). Tyto homology pravděpodobně hrají stejnou roli jako GSH (Noctor et al., 1998).

7 V. Biosyntéza a degradace 1. Biosyntéza Sled reakcí vedoucích ke vzniku jedné molekuly glutathionu se nazývá -glutamylový cyklus. Je stejný u živočichů, rostlin i mikroorganismů (Noctor et al., 2002). Syntéza glutathionu probíhá v chloroplastech i v jiných částech buňky, ve fotosynteticky aktivních i neaktivních pletivech (Noctor, Foyer, 1998). Pro samotnou syntézu je důležitá aktivita enzymu -glutamylcysteinsyntethasy ( -ECS) a přítomnost cysteinu sloužícího jako substrát. Obrázek 2 - -glutamylový cyklus; syntéza a degradace GSH; http://www.linkos.cz/vzdelavani/zvl2_00/04.php Katalyzátory: 1 - -glutamylcysteinsyntethasa, 2 - glutathionsyntethasa, 3 - -glutamyltranspeptidasa, 4 - -glutamylcyklotransferasa, 5 - oxoprolinasa, 6 - vnitrobuněčná proteinasa.

8 V prvním, časově nejdelším kroku vzniká -glutamylcystein ( -EC) z L-glutamátu a L-cysteinu za spotřeby dvou molekul ATP. Je zajímavé, že kyselina glutamová váže cystein přes svou karboxylovou skupinu, nikoliv přes skupinu. Poté následuje vznik kompletní molekuly glutationu (GSH), a to připojením glycinu na C-konec dipeptidu. Při této reakci se opět spotřebují 2 molekuly ATP. Tento proces je katalyzován enzymem glutathionsyntethasou (GS) (Noctor et al., 1998). Byly naklonovány geny pro oba enzymy účastnící se biosyntézy (gsh1 pro -ECS a gsh2 pro GS) s využitím mutantů E. coli a rostliny Arabidopsis thaliana. Povedlo se prokázat, že opravdu kódují tyto enzymy (Noctor et al., 2002). Regulace biosyntézy glutathionu může probíhat několika způsoby. Primárně je rychlost syntézy glutathionu podmíněna dostupností cysteinu a aktivitou -ECS, důležitá je i dostupnost dalších aminokyselin a enzymů. 2. Degradace Probíhá v cytosolu buňky (Noctor, Foyer, 1998) nebo ve vakuolách (degradace GSHkonjugátů a GSSG, Noctor et al., 2002). Při degradaci molekuly glutathionu dochází nejdříve k rozštěpení vazby glutamátu a cysteinu za katalýzy glutamyltranspeptidasou. Zbytek aminokyseliny glutamátu je přenesen na akceptorovou aminokyselinu, případně přesunut směrem k biosyntéze další nové molekuly GSH. Další krok není tak specificky charakterizován jako krok první, neboť vazba cys-gly může být štěpena více enzymy. Ke štěpení dochází například enzymem dipeptidasou nebo aminopeptidasou M. Enzymy zajistí degradaci zbývající části původní molekuly glutathionu. Nakonec je degradován i glutamát spolu s akceptorovou aminokyselinou. Je přeměněn za katalýzy enzymem -glutamylcyklotransferasou na 5-oxoprolin. Ten je za účasti 5-oxoprolinasy přeměněn na glutamát, který se začlení do biosyntézy, nebo může být použit na syntézu jiných proteinů (Noctor et al., 2002). Jinou možnou cestou degradace je odštěpení glycinu v prvním kroku za katalýzy karboxypeptidasou, a následné využití fragmentu -EC. Tento enzym byl objeven v cytosolu i ve vakuolách, kde odštěpuje glycin z GSH-konjugátů i z GSSG (Noctor et al., 2002).

9 VI. Funkce glutathionu Glutathion je chemická sloučenina s mnoha různorodými funkcemi. Jednou z jeho základních funkcí je uskladnění a transport redukované síry obsažené v jeho thiolové skupině. Je zásobárnou největšího množství redukované síry v buňce vázané mimo proteiny. Glutathion funguje také jako regulátor rozložení síry v jednotlivých orgánech rostlin (Noctor et al., 1998). Je schopen procházet membránami organel. Tohoto přenosu se pravděpodobně účastní dva transportní systémy při přenosu z chloroplastu do cytosolu. Do vakuoly se dostává ve formě glutathion-s-konjugátů také pomocí specifického přenašeče (Noctor et al., 2002). Množství a rozložení glutathionu signalizuje celkový stav síry v rostlině. Jeho další důležitou funkcí je ochrana proti oxidativnímu stresu např. reakcí s aktivními formami kyslíku. Funguje také jako prekurzor fytochelatinů, čímž zajišťuje rostlině ochranu proti zvýšeným koncentracím těžkých kovů, a je substrátem pro GSH S-transferasy (GST), které katalyzují konjugaci GSH s různými xenobiotiky (např. herbicidy). Je také důležitý při ochraně při ochraně proti patogenům. V reakci na napadení patogenem dochází ke zrychlení biosyntézy glutathionu a k jeho akumulaci, což je reakce specifická pouze pro glutathion (Noctor et al., 2002). Účastní se také regulace buněčného cyklu (je potřebný pro umožnění vstupu buňky do fáze G 1, Noctor et al., 2002) a chrání proteiny před denaturací způsobenou oxidací jejich thiolových skupin při stresu. Všechny výše zmíněné funkce glutathionu využívají oxidaci jeho SH skupiny a následný vznik GSSG. GSSG je oproti GSH sloučenina stabilní. Může regulovat expresi GR. Také spouští spontánní oxidaci thiolových skupin u proteinů a tím je pravděpodobně chrání před nevratným poškozením při oxidativním stresu. Spolu s GSH tvoří pár, který díky svému redoxnímu potenciálu může fungovat v rostlinných buňkách jako pufr. Poměr GSH/GSSG má důležitou signální funkci při kontrole genové exprese a funkce proteinů. GSSG je významnější než celkové množství glutathionu v buňce (Noctor et al., 2002). Rostliny udržují thiolové skupiny sirných sloučenin v cytoplazmě obvykle v redukovaném stavu. Přechodně sice mohou existovat disulfidické vazby vznikající při katalytických cyklech některých enzymů, nicméně stabilní existence těchto vazeb u proteinů je poměrně vzácná. Vyskytují se například u klidových stádií rostlin (semena).

10 1. Antioxidativní obranný systém Vzhledem k trvalému životu rostlin v kyslíkaté atmosféře je přítomnost a tvorba ROS v buňkách nutným důsledkem. ROS mají na rostlinnou buňku a její součásti negativní účinky. Pro rostliny je tedy důležité mít ochranný mechanismus, který zabraňuje reakci ROS s důležitými molekulami. Rostliny si proto vyvinuly množství obranných systémů, kterými brání zejména své fotosystémy proti účinkům ROS. Přebytečná excitační energie může být z chloroplastu neškodně vyzářena ve formě tepla, nebo mohou rostliny regulovat transport elektronů na alternativní akceptory na přijatelnou úroveň. ROS, které přesto vzniknou, jsou odstraňovány pomocí antioxidativních obranných systémů (Tausz et al., 2004), ve kterých mají hlavní funkci nízkomolekulární enzymy a antioxidanty, které slouží jako náhradní či kompetitivní cíle pro ROS (Bartosz, 1997). Obranné systémy u rostlin zastávají mnoho různých funkcí. Chrání rostlinu proti přílišné absorpci excitační energie, zajišťují alternativní způsoby regenerace elektronového akceptoru při omezené funkci Calvinova cyklu, obstarávají odstranění ROS, opravu oxidativně poškozených struktur i množství regulačních procesů. Nicméně pokud je oxidativní stres příliš intenzivní nebo trvá příliš dlouho, může dojít k vyčerpání kapacity obranného systému a k buněčné smrti (Bartosz, 1997). Tyto obranné systémy jsou dvojího druhu. Mohou s ROS reagovat přímo nebo mohou regenerovat oxidované antioxidanty. K systémům reagujícím přímo s ROS patří například superoxiddismutasa, katalasy, peroxidasy nebo askorbát. K regenerujícím systémům řadíme glutathion, glutathionreduktasy, askorbát a askorbátreduktasy (Smirnoff, 1993). V těchto systémech hraje glutathion jednu z nejdůležitějších rolí. 1.1. Tvorba ROS Pokud se metabolismus rostlinné buňky nachází ve stresu, vzrůstá v ní množství volných radikálů a jiných reaktivních forem kyslíku ( 1 -. O 2 singletový kyslík, O 2 - superoxidový anion, OH. - hydroxylový radikál, H 2 O 2 peroxid vodíku) vznikajících v buňkách i jednotlivých buněčných organelách například v chloroplastech, peroxizomech nebo mitochondriích. Vzrůstající produkce ROS je typická pro účinky většiny environmentálních stresů. Z biochemického hlediska lze stresové situace charakterizovat jako přechod od dvouelektronových (iontových) reakcí k reakcím jednoelektronovým (radikálovým). Tyto radikálové reakce se snadno vymknou buněčné kontrole a dochází k rychlému vzniku nekontrolovatelných řetězových reakcí, následně pak k poškození buňky a tím k poškození rostliny.

11 ROS vznikají různými mechanismy, například přenosem elektronu na molekulový kyslík, který je v chloroplastech přítomen vždy ve vysokých koncentracích (Bartosz, 1997). Vzniká stav nazývaný jako oxidativní stres při velkém množství světelné energie dochází ve fotosystémech chloroplastů k akumulaci excitační energie. Nejjednodušší mechanismus stresem vyvolané produkce ROS je založen na nerovnováze mezi spotřebou reduktantu (NADPH) v uhlíkové fixaci a potřebou regenerovaného elektronového akceptoru (NADP - ) v elektronovém transportním řetězci ve fotosystému I. Množství vnějších stresových faktorů (fixace CO 2, spotřebování NADPH, ATP) narušuje a zpomaluje funkci Calvinova cyklu (Tausz et al., 2004), zatímco světlem řízený elektronový transport zůstává plně aktivní. Sucho, salinita, teplota Halliwell-Asadova metabolická dráha Teplota, salinita, velké množství vody Tvorba hydroxylových radikálů Stabilizace lipidů Peroxidace lipidů hydroxylovými radikály Obrázek 3 - mechanismus vzniku ROS (Sairam et al., 2004); SOD - superoxiddismutasa; ASC - askorbát; APX - askorbátperoxidasa; MDHA - monodehydroaskorbát; DHA - dehydroaskorbát; DHAR - dehydroaskorbátreduktasa; GSH - redukovaný glutathion; GSSG - oxidovaný glutathion; GR - glutathionreduktasa; LH - lipidový řetězec; Dochází k redukci elektronového transportního řetězce a k transportu elektronů na jiné akceptory, přednostně na molekulový kyslík. Univalentní redukce molekulového kyslíku poskytuje superoxidový anion, který je pro buňku velmi nebezpečný. Místem jeho vzniku je membrána tylakoidů, ale může vznikat i v peroxizomech spolu s peroxidem vodíku (Bartosz, 1997). Má destruktivní účinky na proteiny, lipidy, nukleové kyseliny i pigmenty. Může iniciovat radikálové reakce v membránových lipidech. Produktem těchto reakcí jsou buďto lipidové peroxidy nebo hyperoxidy, obojí velmi toxické. Superoxidový anion je přeměněn enzymem superoxiddismutasou (SOD) na peroxid vodíku H 2 O 2. Může vznikat též Mehlerovou reakci (fotoredukce molekulárního kyslíku) (Bartosz, 1997).

12 Peroxid vodíku je pro buňku také toxický, je sice méně reaktivní než superoxidový anion, ale na rozdíl od ostatních typů ROS je schopen procházet membránami pomocí akvaporinů, a tím šířit stres do dalších buněk. Tímto způsobem je také schopen fungovat jako signální molekula (Chaves et al., 2004). Může být detoxikován pomocí peroxidas nebo katalas, ale u rostlin je odstraňován hlavně askorbátem v askorbátovém cyklu. Produktem reakce s katalasami je O 2 a H 2 O. Při stresu nemusí být transportovány jen nadbytečné elektrony z PSI, ale také přebytečná excitační energie z PSII. Přenosem přebývající excitační energie z fotosystému II na molekulový kyslík vzniká další velmi reaktivní forma kyslíku singletový kyslík. Stejně jako peroxid vodíku, ani singletový kyslík není radikál, přesto je velmi reaktivní a nebezpečný pro fotosystémy. Řetězovými radikálovými reakcemi pak může vznikat hydroxylový radikál, který je ze všech druhů ROS nejvíce reaktivní. Jakmile vzniká, reaguje s tou organickou molekulou, která je v dosahu. Navíc rostliny nemají systém na jeho odstraňování, ale spíše na předcházení jeho vzniku. To se děje izolací kovových iontů (hlavně Fe 2+, případně ionty mědi) pomocí ferritinu a jiných sloučenin, čímž je zabráněno tomu, aby reagovaly s H 2 O 2 (Fentonova reakce), případně aby katalyzovaly reakci peroxidu se superoxidovým aniontem (Haber- Weissova reakce) (Bartosz, 1997). Nebezpečnost peroxidu vodíku a superoxidového aniontu je pravděpodobně dána spíše tím, že mohou potenciálně iniciovat tvorbu hydroxylového radikálu, nežli jejich vlastní reaktivitou (Ledford, Niyogi, 2005). Dalším potenciálním místem vzniku řetězových reakcí produkujících ROS jsou elektronové transportní řetězce mitochondrií, ale tyto reakce jsou výrazně pomalejší než v chloroplastech (Tausz, 2001). Hlavními místy účinku ROS vznikajících v chloroplastech jsou proteiny/enzymy Calvinova cyklu, obsahující thiolovou skupinu (Bartosz, 1997).

13 1.2. Role glutathionu Glutathion se účastní obrany buňky mnoha způsoby. Díky své thiolové skupině má GSH silné antioxidační účinky, může proto odbourávat ROS buďto přímou reakcí s nimi nebo reakcí s oxidovanými substráty, které opět zredukuje. Samotný glutathion se pak mění na svou oxidovanou formu GSSG. Glutathion ale není hlavní antioxidativní sloučeninou v rostlinné buňce. V porovnání s askorbátem má sice srovnatelné rychlostní konstanty reakcí se superoxidem a singletovým kyslíkem, ale jeho koncentrace v chloroplastu i v pletivech jsou 10-50krát menší než koncentrace askorbátu. Jelikož antioxidativní účinky v rostlinné buňce závisí na rychlostních konstantách i na koncentracích antioxidantů, význam glutathionu jako antioxidantu lze považovat za nižší, nikoliv však zanedbatelný. Odhadované Antioxidant koncentrace Rychlostní konstanta K Oxidant v chloroplastech [L mol -1 s -1 ] [mmol L -1 ] Glutathion 0,2 2,4 Singletový kyslík 2,4 * 10 6 7 * 10 7 Askorbát 12-25 Singletový kyslík 1 * 10 7 2 * 10 7 Tabulka 1 - Koncentrace a rychlostní konstanty askorbátu a glutathionu (převzato z Tausz, 2001) Glutathion má také velmi důležitou funkci v askorbátovém cyklu. Ve formě GSH má roli donoru elektronu potřebného pro regeneraci askorbátu (Asc) z jeho oxidované formy dehydroaskorbátu (DHAsc). Askorbátový cyklus (také Foyer Halliwellův nebo Asadův cyklus) je považován za hlavní cestu odstranění toxického H 2 O 2 a superoxidů z chloroplastů, kde jsou nebezpečné pro fotosyntetické pigmenty. Zároveň probíhá regenerace NADP - redukcí monodehydroaskorbátu (MDHA) pomocí monodehydroaskorbátreduktasy (MDHAR) na askorbát. Kapacita cyklu závisí na koncentraci obou antioxidantů a na aktivitě potřebných enzymů, též na poměrech GSH/GSSG a Asc/DHAsc. Glutathion zde funguje také jako substrát pro glutathionperoxidázové reakce a pro glutathion-s-transferasy, které slouží pro přesun ROS a jiných reakčních produktů (Tausz et al., 2004). Důležitá je také jeho funkce v metabolismu síry (viz kapitola 4 Funkce glutathionu).

14 1.2.1. Askorbátový cyklus Askorbátperoxidasa využívá dvou molekul askorbátu k redukci H 2 O 2 na vodu. Ze dvou molekul Asc pak vznikají dvě molekuly MDHA. MDHA je radikál, který pokud není rychle redukován, disproporcionuje na askorbát a dehydroaskorbát. V buňkách (např. na plazmalemě nebo na thylakoidní membráně) může být zredukován přímo na Asc. Donorem elektronu pro tuto redukci může být například redukovaný ferredoxin nebo NADPH. Reakce s NADPH je katalyzována MDHAR nacházejícími se v některých buněčných kompartmentech. Obrázek 4 - Askorbátový cyklus, IsisDraw, podle Tausz, 2001 Rozklad MDHA je tak rychlý, že i přes možnosti enzymatické i neenzymatické regenerace askorbátu z MDHA vždy v listech a jiných pletivech při stresu vzniká nějaký DHAsc. Ten je redukován na askorbát účinkem dehydroaskorbátreduktasy (DHAR), která využívá GSH jako substrát. Z této reakce vzniká GSSG, který je zpětně redukován na GSH pomocí NADPH za katalýzy GR. Askorbát a glutathion tedy nejsou v těchto reakcích spotřebovávány, ale účastní se cyklických přesunů ve formě různých ekvivalentů spolu se čtyřmi enzymy, což umožňuje redukci H 2 O 2 na vodu s využitím elektronů z NADPH (Noctor, Foyer, 1998). Díky svým antioxidativním schopnostem může glutathion stabilizovat buněčné membrány. Membránové lipidy jsou častým cílem pro negativní působení ROS. Vznikající acylperoxidy pak mohou být z membrán odstraněny pomocí GSH. Nejdůležitější sloučenina v rostlinné buňce, která tuto funkci plní, ale není GSH, nýbrž anioxidativní sloučenina -tokoferol. Po reakci s peroxidy je regenerován askorbátem (Tausz, 2001). Dalšími látkami chránícími membrány před oxidací a ztrátou integrity jsou karotenoidy a xanthofyly.

15 Jak již bylo výše řečeno, glutathion funguje jako substrát pro některé enzymy, např. GPX a GST. U zvířat je GPX dobře znám (selenoprotein, detoxifikuje H 2 O 2 ), u rostlin byl charakterizován teprve nedávno. Neobsahuje selen a substrátem pro něj není peroxid vodíku jako u zvířat, ale GSH, případně fosfolipidhydroperoxidy (např. u Citrus sinesnis, Tausz, 2001). Redukci peroxidu vodíku katalyzuje, u rostlin má ale v porovnání s živočichy nižší specifickou aktivitu. Nejdůležitějšími detoxifikanty peroxidu vodíku v rostlinách jsou askorbátperoxidasa a katalasa. GPX se účastní hlavně odstraňování lipidových a alkylových peroxidů, vznikajících působením ROS (Noctor et al., 2002). GST využívá GSH jako substrát při redukci peroxidů. Tyto transferasy tvoří poměrně velkou skupinu heterogenních proteinů, které mají společnou pouze reakci s GSH (nukleofilní atak atomu síry na jejich elektrofilní centra). Zodpovídají za přesun cytotoxických a genotoxických sloučenin, které by mohly reagovat s elektrofilními místy na DNA, RNA nebo proteinech (Noctor et al., 2002). GSH nelze v rostlinné buňce funkčně nahradit jinou sloučeninou kromě jeho homologů. Popisuje to např. Noctor et al, (2002) v pokusu s mutantem Arabidopsis thaliana, který byl -ECS deficientní. Neobsahoval žádný měřitelný obsah GSH, měl značně pozměněný fenotyp (absence kořenového vývoje, celkové zpomalení růstu) a byl schopen přežívat pouze při pěstování na kultuře obsahující GSH.

16 VII. Typy environmentálních stresů, role glutathionu 1. Vzdušné znečištění Vzdušných polutantů je v současné atmosféře velké množství a do rostlin se obvykle dostávají pomocí přímé depozice na listy. Dovnitř pak pronikají buďto přímou difúzí přes průduchy nebo absorpcí mezofylovými buňkami. Odpor mezofylu vůči tomuto pronikání závisí na množství fyzikálních a biochemických faktorů, jako jsou např. rozpustnost, rychlost disociace či reaktivita daného plynu. Možný je i transport přes kutikulu, ten je ale vzhledem ke špatné propustnosti kutikuly pro plyny zanedbatelný (Tausz, 2001). Mezi vzdušné polutanty patří oxid siřičitý SO 2, sulfan H 2 S a ozon O 3, dále plynné sloučeniny dusíku a některé organické látky jako je methan. Rostliny jsou na vzdušné znečištění různě citlivé. I přes množství informací o účincích polutantů na rostlinný metabolismus dosud neznáme přesný fyziologický základ rozdílů v citlivosti na polutanty a v odpovědi na jejich působení. Jak polutant v rostlině reaguje a jaká je fyziologická odpověď na toto působení, závisí především na chemických a fyzikálních charakteristikách polutantu (Tausz, 2001). Poškození rostlin působením vzdušných stresorů lze rozlišit na akutní a chronické. Akutní poškození nastává při krátkodobém působení vysokých hodnot daného polutantu a projevuje se okamžitým viditelným poškozením listů rostliny dochází k vadnutí nebo úplnému opadání listů (Tausz, 2001). Naopak chronické poškození se projeví až po delším působení polutantu a pro vznik negativního účinku postačují i jeho nízké koncentrace. U rostlin se poškození projeví snížením produkce biomasy, změnou jejich vývoje a morfologie a vyšší vnímavostí vůči stresům. Viditelné poškození obvykle chybí nebo se objeví až za delší časový úsek (Tausz, 2001). U fotochemicky aktivních vzdušných polutantů, jako je třeba ozon, se možné poškození odvíjí od vysokého oxidačního potenciálu tohoto plynu a rozdíl mezi akutním a chronickým působením není tak viditelný. Naopak u sloučenin síry a dusíku jsou rozdíly mezi působením krátkodobě vysokých koncentrací a delším působením nízkých hodnot výrazné. Tyto sloučeniny mohou být rostlinami využity i jako živiny při jejich růstu. Jejich působení na rostlinu může být tedy za různých podmínek různé (Tausz, 2001).

17 U rostlin jsou nejvýznamnějšími stresovými faktory sloučeniny síry a ozon. Ze sloučenin síry jsou to hlavně SO 2, H 2 S, dále některé organické sloučeniny (sirouhlík, merkaptany). Jejich vyšší koncentrace jsou hlavně v okolí průmyslově aktivních zón továrny, spalovny, uhelné elektrárny nebo v okolí vulkanicky aktivních míst. 1.1. Vliv fytotoxických sloučenin síry na metabolismus a glutathion Síra je pro rostliny nepostradatelným prvkem při růstu. Za normálních podmínek prostředí se množství přijaté síry rovná množství potřebnému pro růst rostliny. Jak už bylo řečeno výše, někdy mohou být polutanty absorbované povrchem listů využity jako zdroje síry užitečné pro jejich růst. Například u zemědělských plodin pěstovaných v blízkosti průmyslových oblastí nahrazuje depozice atmosférických polutantů hnojení rostlin (Tausz, De Kok, 2001). Fytotoxickými pro rostliny jsou ze sloučenin síry hlavně SO 2 a H 2 S. Oba tyto plyny jsou emitovány do ovzduší při intenzivním spalování fosilních paliv, zpracování ropy a minerálních zdrojů síry (pyrit). Vyskytují se ve vysokých koncentracích nejen přímo na místech vypouštění do atmosféry. Jejich devastující účinky se projevily i ve vysokých nadmořských výškách v horských lesích. Například v Krušných horách byly koncentrace SO 2 v době intenzivního spalování hnědého uhlí (padesátá léta 20. století) asi 7-8krát vyšší v porovnání s regiony s relativně čistým vzduchem. Došlo k akumulaci SO 2 v jehlicích a k těžkému poškození velkých ploch horských lesů. Toto poškození se projevilo například tím, že na stromech sice vyrůstaly nové jehlice, ale vzhledem k vysokým koncentracím SO2 v okolní atmosféře byly okamžitě nevratně poškozeny, došlo ke zpomalení rychlosti fotosyntézy a na podzim téhož roku k jejímu úplnému zastavení. Na jaře dalšího roku tyto jehlice zčervenaly a opadaly. Stromy byly sice živé, ale jejich jehličí mělo pouze jednoletý cyklus, došlo ke zpomalení růstu stromů a vypadaly v podstatě jako kostry bez jehličí (Grill et al., 2005). Rychlost příjmu SO 2 u rostlin závisí přímo na koncentraci tohoto plynu v atmosféře. Závislost rychlosti příjmu na koncentraci je tedy lineární. Vnitřní odolnost vůči SO 2 je u rostlin zanedbatelná, plyn je totiž velmi dobře rozpustný ve vodě vyskytující se v apoplastu. V roztoku dochází k disociaci molekuly na hydrogensiřičitan (HSO - 3 ) a siřičitan (SO 2-3 ). SO 2-3 se zařadí do metabolismu síry a vzniká sulfan H 2 S. Ten je zainkorporován do cysteinu a následně do dalších sloučenin síry, jako je například glutathion (Tausz, De Kok, 2001).

18 Mimoto může být oxidován na síran. To se děje buďto pomocí peroxidas (extra- i intracelulárně), nebo pomocí specifických oxidas (pouze vnitrobuněčně). Reakce může být katalyzována také jinými látkami než enzymy, např. kovovými ionty nebo superoxidovými radikály. Vzniklý síran (SO 2-4 ) je později v buňce asimilován. Pokud je síranu v buňce velké množství a buňka jej momentálně nevyužívá, je jeho přebytek uložen do vakuol. Získat jej z vakuol zpět je obtížné, a je tedy znemožněno následné využití uložených přebytků v metabolismu. Vzrůstající množství síranů v nadzemních částech rostlin je charakteristické pro rostliny vystavené vlivu SO 2 (Tausz, De Kok, 2001). Způsob přijímání H 2 S do rostliny se od způsobu příjmu SO 2 jednoznačně liší. Rychlost jeho příjmu je přímo závislá na rychlosti asimilace této sloučeniny do molekuly cysteinu. Křivka závislosti odpovídá saturační křivce. (Tausz, De Kok, 2001). Z dalších sloučenin síry v atmosféře může rostlina metabolizovat i COS po jeho hydrolýze na H 2 S a CO 2, nicméně koncentrace tohoto polutantu v atmosféře jsou natolik nízké, že nemá větší význam jako zdroj síry (Tausz, De Kok, 2001). Absorbovaná síra je za normálních podmínek zpracována v chloroplastu. Při stresu může být metabolizována i mimo chloroplasty, např. v cytosolu. Zde ale může být nedostatek substrátu potřebného pro tvorbu glutathionu z cysteinu. Expozice rostliny atmosférickým SO 2 a H 2 S se projevuje obecně zvýšenými hodnotami thiolů v kořenech i nadzemních částech rostlin. Jelikož je ve zpracování těchto dvou polutantů určitý rozdíl, dochází při expozici H 2 S k rychlejší akumulaci thiolů než při expozici SO 2 při shodných koncentracích plynů v atmosféře. Množství a skladba thiolů v rostlině je také silně ovlivněna nejen polutanty, ale také různými fyziologickými a environmentálními faktory, jako jsou třeba účinky dalších stresorů a jejich kombinací. Změny v koncentracích thiolů v rostlině jsou způsobeny hlavně změnou koncentrace glutathionu, protože ten je nejdůležitějším thiolem v rostlinných pletivech (více než 90 % celkového množství thiolů v buňce je tvořeno GSH). Při expozici těmito dvěma plyny dochází v rostlinách také k akumulaci cysteinu díky fotorespiraci (nebo za tmy k akumulaci -EC) v nadzemní části (Noctor, Foyer, 1998), v kořenech stoupá koncentrace glutathionu. Fyziologické pozadí těchto koncentračních změn je dosud neobjasněno.

19 Vzrůstající koncentrace GSH a GR v rostlině při expozici SO 2 má význam jednak signální ukazuje, že rostlina se nachází ve stresu, jednak obrannou. Určité množství absorbovaného plynu vyvolává v chloroplastech řetězec oxidačních reakci vedoucích k tvorbě ROS. To je základem toxického účinku SO 2 (Tausz, De Kok, 2001). Jedním z důsledků působení SO 2 je také trvalé zvýšení hladiny GSH v rostlině. Dochází k interakci GSH s proteiny a k deregulaci buněčného metabolismu. Pokud metabolismus buňky funguje normálně (za normálních podmínek), má zvýšený obsah GSH nepříznivé účinky na antioxidativní systém, neboť podporuje oxidativní stres v chloroplastech (Tausz, De Kok, 2001). Koncentrace glutathionu v rostlinách vystavených působení SO 2 prokazatelně vzrůstá. Je to způsobeno mimo jiné tím, že GSH je hlavní sloučeninou metabolismu síry v buňce. Studie na jehličnanech (Tausz, Grill, 2000) ukázaly, že koncentrace GSH je vyšší v jehličí těch stromů, které rostou v oblastech s vyšším obsahem SO 2 ve vzduchu. Vystavením rostlin působení SO 2 i H 2 S najednou došlo také ke vzrůstu koncentrace GSH v listech. Nicméně, i když je SO 2 stresovým faktorem vyvolávajícím oxidativní stres v chloroplastech, je role glutathionu spekulativní. Pravděpodobně má spíše funkci pufru organické síry než funkci ochrannou (Tausz, Grill, 2000). Při pokusech in vitro za působení světla došlo k tvorbě superoxidů. Vznikají světlem vyvolanou oxidací siřičitanů. Významně se to projevilo pouze u poškozených chloroplastů. Za normálních podmínek je vysoké množství siřičitanů v chloroplastech nepravděpodobné, jelikož rostlina je spotřebovává jako substrát v metabolismu síry. I při větším množství 2- aniontů SO 3 v chloroplastech je vznik superoxidů na světle nepravděpodobný, jelikož chloroplasty mají obvykle dostatečnou schopnost odstraňovat vzniklé ROS a předcházet jejich vzniku. Tato reakce vedoucí k superoxidům má význam nejspíš při krátkodobě vysokých hodnotách polutantu v ovzduší. V takovém případě přesahuje příjem schopnosti rostliny metabolizovat přijatou síru. Sloučeniny síry v buňce (jako je GSH) mají tedy pravděpodobně signální funkci v regulaci příjmu síry a jejího metabolismu.

20 1.2. Ozon Oxidativní vzdušné polutanty, z nichž nejznámější je právě ozon, vznikají v atmosféře interakcí jiných plynných sloučenin, jako jsou uhlovodíky, oxidy dusíku a O 2. Je to většinou směs mnoha více či méně toxických sloučenin, např. aldehydů, peroxidů a jiných, kterou obecně nazýváme fotochemický smog (Tausz, De Kok, 2001). Nejvyšší koncentrace ozonu nalézáme obvykle na místech s velkou zástavbou, množstvím továren a jiného průmyslu produkujícího emise a s vysokým množstvím slunečního záření. Nicméně zvýšené koncentrace ozonu se mohou objevovat i v odlehlých oblastech daleko od zdroje znečištění, jako jsou třeba alpské oblasti. Toto zvýšení je způsobeno transportem emisí, které jsou v podstatě prekurzory ozonu a jiných oxidativních polutantů (Tausz, De Kok, 2001). Je prokázáno, že ozon je pro své silné oxidační účinky fytotoxický, ale přesný mechanismus účinku na rostliny je dosud nejasný. Ozon způsobuje u rostlin buďto akutní viditelné poškození nebo poškození skryté, chronické. Akutní poškození se projevuje nekrotickými skvrnami na listech, zatímco projevem skrytého poškození je pokles rychlosti fotosyntézy, rychlosti fixace uhlíku a nakonec pokles rychlosti růstu rostliny. Je silným oxidačním činidlem, vyvolává tedy v rostlinných buňkách oxidativní stres. Je vysoce reaktivní jak ve vodním prostředí, tak v prostředí lipidovém. Ve vodném prostředí reaguje spontánně, přičemž vzniká celá řada různých produktů, hlavně peroxid vodíku, hydroxylové radikály a superoxidový aniont. Díky své reaktivitě je schopen oxidovat řadu sloučenin v buňce, mimo jiné SH skupiny, jejichž oxidací vznikají disulfidy. Dále oxiduje dvojné vazby mastných kyselin v lipidech. Tato reakce poskytuje karbonylové skupiny a nebezpečné hydroperoxidy. Jeho silné oxidační účinky využívají i antioxidanty (Tausz, De Kok, 2001). Stejně jako sirné polutanty způsobuje i ozon poškození chromozomů v meristému kořenů rostlin. K tomuto poškození dochází často dříve, než se projeví nějaké symptomy na nadzemní části rostliny. Nicméně způsob přenosu signálu z listů do kořenů je neznámý stejně jako u sloučenin síry (Tausz, De Kok, 2001).

21 Ozon vstupuje do rostliny přes průduchy na listech. Hlavním místem jeho účinku je vodný roztok v apoplastu a lipidy a proteiny obsažené v buněčné stěně. Způsobuje snížení příjmu oxidu uhličitého, zvyšuje akumulaci škrobu a způsobuje odbarvení fotosyntetických pigmentů (Bartosz, 1997). Buněčná stěna má svůj vlastní membránový antioxidativní obranný systém, který zahrnuje sloučeniny schopné likvidovat ROS. Hlavními sloučeninami jsou zde peroxidasy a askorbát. Naopak glutathion se v apoplastu nevyskytuje, je pouze vedlejším účastníkem. Askorbát oxidovaný v apoplastu je transportován do cytoplazmy a regenerován v askorbát-glutathionovém cyklu. Regenerace askorbátu je proces vyžadující určitý čas, proto se změny v redoxním stavu glutathionu v cytoplazmě projeví až s jistým zpožděním po úderu ozonu na rostlinu. Při působení ozonu na rostliny také stoupá koncentrace glutathionu spolu s koncentracemi dalších antioxidantů (askorbátu a -tokoferolu) (Tausz, De Kok, 2001). Různé studie ale udávají různé výsledky. Někdy koncentrace antioxidantů vzrůstá, jindy se nic neděje. Studie v terénu na druhu Pinus ponderosa (Tausz, Grill, 2000) citlivém na ozon ukázala změny v poměru GSH/GSSG jako reakci na působení ozonu spíše než vzrůst celkové koncentrace. Při porovnávání kultivarů různých rostlin citlivých na ozon a kultivarů tolerantních se ukázalo, že ke zvýšení množství glutathionu dochází pouze u některých rostlin. Například u geneticky transformovaného tabáku se změna množství GSH shoduje s mírným vzrůstem ozonové tolerance, ale tatáž studie u stejně transformovaných rostlin topolu tento výsledek nepotvrdila (Tausz, Grill, 2000). Byly použity topoly se zvýšenou koncentrací glutathionu v listech a topoly se zvýšenou aktivitou GR. U rostlin s vyšším obsahem glutathionu se po expozici vysokou koncentrací ozonu ukázalo, že uměle zvýšené množství glutathionu v rostlině nezajistí zvýšenou odolnost vůči oxidativnímu stresu. Totéž se projevilo i u rostlin se zvýšenou aktivitou GR (Tausz, De Kok, 2001). U výzkumu působení ozonu na sazenice a 60 let staré stromy Fagus sylvatica (Herbinger et al., 2005) bylo zjištěno zvýšení celkové koncentrace glutathionu u obou věkových skupin. U zastíněných listů byly zjištěny vyšší koncentrace než u listů vystavených plnému osvitu. Došlo i ke zvýšení redoxního stavu glutathionu. To bylo způsobeno zvýšením efektivity regenerace oxidovaného glutathionu. Zvýšení celkové koncentrace GSH stejně jako zvýšení redoxního stavu je pravděpodobně adaptací na stresové podmínky (Herbinger et al., 2005).

22 Vysvětlení těchto různorodých výsledků je možné hledat ve velkém množství funkcí, které glutathion zastává v buňce a v rostlině. Specifické vnější podmínky vyžadují přizpůsobení obranného systému. Glutathion funguje jednak jako přímý antioxidant schopný reagovat s ROS. V případě ozonu je ale pravděpodobně důležitější jeho funkce při signalizování stresové situace. Při signalizaci se uplatňují hlavně změny v redoxním poměru GSH/GSSG. Tyto změny pak pravděpodobně vyvolají další obranné reakce systému (Tausz, 2001). Obrázek 5 - změny koncentrace glutathionu u Fagus sylvatica; Herbinger et al., 2005

23 2. Nedostatek vody Vysušení je jednou z nejtěžších fyziologických změn, které mohou v buňce nastat a které je buňka za určitých okolností schopna vydržet. Tato schopnost přežít velké nedostatky vody je ovšem omezena na malou část organismů a na některé typy buněk. Například vegetativní rostlinné buňky jsou vůči vysychání zcela netolerantní, zatímco spory, semena a pylová zrna mnoha druhů rostlin jsou vysoce tolerantní. Mohou být vysušena a znovu rehydratována. U fotosyntetických pletiv je schopnost přežít omezena pouze na malou část vyšších rostlin. Častější je tento jev u řas, mechů a lišejníků (Smirnoff, 1993). Vyšší rostliny při nedostatku vody brání jejím ztrátám uzavřením průduchů (Tausz, Grill, 2000). K uzavření průduchů dochází ve chvíli, kdy ještě nemůžeme změřit změny ve vodním potenciálu v listech rostliny. Je tedy vyvoláno signálem vyslaným z kořenů. Jako signální molekula funguje pravděpodobně kyselina abscisová (Smirnoff, 1993). Uzavřením průduchů sice rostlina primárně zabrání odpařování vody z listů, ale zamezí tím také výměně plynů a v rostlině nastane nedostatek CO 2 potřebného pro správnou funkci fotosyntézy. Při menším deficitu vody je rychlost a účinnost fotosyntézy limitována právě příjmem CO 2 pomocí průduchů (Smirnoff, 1993). Pokud je vodní deficit vyšší, dochází k vadnutí listů, zmenšení objemu buňky a chloroplastů a tím k limitování rychlosti fotosyntézy a také k napětí na membránách, které se pak při rehydrataci mohou stát dočasně propustnými (Chaves et al., 2004). Navíc intenzivní zmenšování objemu buňky vede ke zvyšování koncentrací látek rozpuštěných v cytosolu, čímž se mohou stát toxickými pro některé enzymy a zhoršit tak účinky stresu na buňku. Obsah buňky se stává viskózním a tím se zvyšuje možnost interakce molekul obsažených v cytosolu, což může vést k denaturaci proteinů a jinému poškození (Chaves et al., 2004). Vystavení velkému nedostatku vody způsobí zpomalení fotosyntézy a po delším působení poškození fotosyntetického aparátu. Při dlouhodobém působení těžkého stresu může nastat i buněčná smrt. Nicméně při dlouhodobějším pomalém vysychání má rostlina možnost zapojit aklimatizační procesy a tím zabránit většímu poškození (Smirnoff, 1993). Důležitou roli při nedostatku vody hraje i množství slunečního svitu. Jestliže rostlina, která na obranu proti ztrátám vody uzavřela průduchy, je vystavena velkému množství světelné energie, dochází ke vzrůstu tvorby ROS. Calvinův cyklus není dostatečně funkční, tudíž nedochází k regeneraci akceptoru elektronů z fotosystémů a je nutné přesouvat elektrony na jiné akceptory, přednostně na kyslík tím vzniká jako první superoxid. Také je potřeba odstraňovat velké množství excitační energie například pomocí tepelného vyzařování.

24 Za světla probíhá hlavně u C3 rostlin proces zvaný fotorespirace. Je to v podstatě opačný proces k fotosyntéze. Dochází při něm ke spotřebě kyslíku, ATP a jiných meziproduktů fotosyntézy. Hlavní funkce fotorespirace není známa, jde pravděpodobně o alternativní cestu přesunu elektronů. Rostlina může navíc tímto procesem přicházet o velké množství CO 2 potřebného pro Calvinův cyklus. Fotorespirace také spotřebovává množství energie, čímž snižuje využití světla pro fotosyntézu. Toto může být výhodou právě za nedostatku vody, kdy rostlina uzavřením průduchů snižuje množství CO 2 vstupujícího do Calvinova cyklu. Při nedostatku vody fotorespirace zrychluje (oproti fotosyntéze) a dochází k přesunu většího množství energie směrem k tomuto procesu. Tím se mohou omezit škodlivé účinky, například fotoinhibice, ke které dochází na fotosystémech, protože metabolismus může využívat různé meziprodukty z fotosyntetického elektronového transportu a z fotorespirace (Noctor et al., 2002). Na druhou stranu, fotorespirace nemá jen pozitivní funkce, jako je třeba snížení pravděpodobnosti fotoinhibice nebo zmírnění produkce ROS v chloroplastech. Jedním z produktů tohoto procesu je i peroxid vodíku. Ten vzniká v peroxizomech při oxidaci glykolátu na glyoxalát pomocí enzymu glykolátoxidasy. Je poté štěpen katalasou na oxid uhličitý a vodu. Nicméně při zvýšení rychlosti fotorespirace za nedostatku vody může značně zvyšovat oxidativní zatížení rostlinné buňky (Noctor et al., 2002). Peroxid vodíku vznikající v buňkách při vysychání má pravděpodobně i signální funkci. Je signálem například pro uzavření průduchů (Chaves et al., 2004). Jak už bylo dříve řečeno, nejvyšší potenciál pro tvorbu ROS je u rostlinné buňky v chloroplastech. Jako jeden z prvních vzniká superoxid. Ten se může například adovat na nenasycené mastné kyseliny membránových lipidů a způsobí tak deesterifikaci. Dochází také k produkci malonyldialdehydu, což je koncový produkt peroxidace membránových lipidů. Tuto peroxidaci má na svědomí vznikající H 2 O 2. Množství malonyldialdehydu naznačuje existenci oxidativního stresu v rostlině a také jeho intenzitu. Vodní deficit má tedy vliv na složení membrán například v tylakoidech chloroplastů (Smirnoff, 1993). Membrány jsou považovány za část buňky nejcitlivější na vysychání. Například polopropustné membrány, jako je plazmalema nebo tonoplast, za normálních podmínek zadržují rozpuštěné látky v buňce. Pokud dojde k vysušení, tyto membrány ztrácí svou integritu, což značně snižuje jejich schopnost zadržovat látky v buňce při rehydrataci buňky, zvláště v počátcích rehydratace. Při vysušení totiž dochází k fázovému přechodu, kdy fosfolipidová složka membrány přechází na gel. Při rehydrataci se přeměňuje zpět na tekutou

25 formu, přičemž se membrána stává přechodně propustnou dochází k fázovému přechodu (Burritt et al., 2002). Bylo zjištěno, že membrány tylakoidů ztrácí integritu dříve než plazmatická membrána (Chaves et al., 2004). Aby buňka zabránila tomuto fázovému přechodu, a tím i následnému úniku látek z buňky, obsahuje určité látky, např. sukrózu, které se mohou vázat na fosfolipidy v membráně a tím brání jejich přeměně na gel (Smirnoff, 1993). Tyto neredukující cukry jsou obsaženy ve vysokých koncentracích u tolerantních buněk. Díky výskytu těchto sacharidů v cytoplazmě je buňka chráněna před denaturací proteinů a krystalizací enzymů. Dalším obranným mechanismem může být akumulace hydrofilních proteinů. Důsledkem oxidativního působení ROS vznikajících ve vysušených pletivech je poškození různých částí buňky. Schopnost omezit tvorbu ROS a tím se vyhnout poškození, případně už vzniklá poškození opravit je důležitá pro odolnost buňky proti vysušení. K produkci ROS a k oxidativnímu poškození dochází při vysychání, při rehydrataci i při přechodech mezi plně hydratovanou formou a formou vysušenou (Smirnoff, 1993). Hlavními antioxidanty, které se účastní obrany rostliny při vodním deficitu, jsou askorbát a glutathion. Hladina glutathionu se ukázala jako méně citlivá vůči nedostatku vody oproti askorbátu, nereaguje vždy stejně. Může docházet ke vzrůstu i k poklesu koncentrace. Askorbát se účastní přímo odstraňování H 2 O 2 a regenerace -tokoferolu a tvorby zeaxanthinu (Smirnoff, 1993). Celkový obsah glutathionu, jeho redoxní stav a také aktivita enzymů jsou ovlivněny mírou vodního deficitu a také tolerancí dané rostliny k nedostatku vody. U rostlin netolerujících sucho je změna oxidačního stavu GSH nebo poměru GSH/GSSG obvykle známkou poškození pletiv rostliny při velmi nízkém relativním obsahu vody. Oxidace GSH se projevila například při pokusech s rostlinami ječmene vystavenými různému stupni vysušení (Tausz et al., 2004). Při mírné světelné intenzitě obsahoval ječmen pouze 10 % GSSG z celkového množství glutathionu v rostlině. Tento stav trval do dosažení 40 % relativního obsahu vody v listech. Při poklesu množství vody v listech ke 30 % došlo ke zvýšení množství GSSG až na 50 % celkového obsahu glutathionu. Při tomto množství vody došlo také k vážnému poškození fotosyntetického aparátu a ke krystalizaci enzymů (Smirnoff, 1993). Jiné studie u jehličnanů ukázaly zvýšení poměru GSH/GSSG. Někdy došlo k opětovné změně za tmy (Tausz, Grill, 2000).

26 Burritt et al. (2002) prováděl výzkum vlivu periodického opakování dehydratace a rehydratace na metabolismus antioxidantů u chaluhy Stictosiphonia arbuscula. Tato chaluha roste na útesech a díky tomu je vystavena opakujícímu se přílivu a odlivu. Musí být tedy dobře adaptována na pravidelně se opakující stresové podmínky. Při výzkumu byly použity vzorky chaluhy z horních a dolních partií útesu. Byly vystaveny středně těžkému vodnímu deficitu (70-80 % relativního obsahu vody) a vážnému nedostatku vody (40-50 % relativního obsahu vody) v časových úsecích 12, 24 a 48 hodin. Na začátku experimentu obsahovaly oba typy vzorků obdobné množství askorbátu a glutathionu. U kontrolních vzorků (plně hydratované) byl prvních 24 hodin konstantní poměr GSH/GSSG, po 48 hodinách došlo k poklesu o 50 %. Totéž bylo patrno u vzorků z horních částí útesu, naopak u vzorků z úpatí došlo ke značnému poklesu už po 24 hodinách. Tento trend se projevil u středního i silného zatížení. U vzorků chaluh z horní části útesu se tedy ukázalo, že produkují při stresu méně H 2 O 2 a méně lipidových hydroperoxidů než vzorky z dolní části. Populace žijící na vrcholech útesů je pravděpodobně schopna účinně snižovat produkci H 2 O 2, zmírňovat peroxidaci lipidů v počátcích rehydratace a také snižovat poškození membrán a tedy i únik rozpuštěných látek. Tato schopnost předcházet tvorbě ROS či vzniklé ROS rychle odstraňovat je dána pravděpodobně zvýšenou aktivitou enzymů regenerujících askorbát a glutathion. Moran et al. (1994) zkoumal projevy stresu vyvolaného nedostatkem vody u rostlin hrachu (Pisum sativum). Došlo u nich k velké redukci fotosyntézy i transpirace a k poklesu aktivity enzymu glykolátoxidasy. Další pokles se projevil u enzymů katalasy, DHAR a GR, askorbátperoxidasy a MDHAR. Tyto enzymy se účastní přímo odstraňování vzniklého peroxidu vodíku z listů. Přes pokles jejich aktivity nedocházelo k akumulaci H 2 O 2 ve stresovaných listech. Po celou dobu působení stresu se udržel vysoký celkový obsah glutathionu a také vysoké množství GSH (více než 85 % celkového množství). Rostlina pravděpodobně kompenzovala ztráty glutathionu syntézou nových molekul GSH hlavně v chloroplastech.

27 3. Salinita Nadbytek soli v půdním roztoku je jedním ze základních stresových faktorů působících na rostliny (Kattab, 2007, Tausz, 2001). Uvádí se, že asi polovina zavlažovaných ploch na Zemi je zasažena zvýšenou koncentrací solí v půdě. Rostliny jsou klasifikovány podle své tolerance k zasolení na glykofyty a halofyty. Halofyty tolerují větší zasolení, naopak glykofyty nejsou schopny na slaných půdách růst a žít (Sairam et al., 2004). Zvýšené množství soli nepříznivě ovlivňuje klíčení semen, růst rostlin, tvorbu květů i plodů. Zasolení zemědělsky využívaných ploch tedy způsobuje nižší produkci a nižší výnosy ze sklizně (Sairam et al., 2004). Zasolení může rostlinu ovlivňovat různým způsobem. Vysoká koncentrace solí způsobuje ztráty vody a vyvolává tedy v rostlině stres vyvolaný vodním deficitem. Sodné ionty jsou pro rostliny toxické, pokud nejsou rychle uloženy do vakuol. Salinita způsobuje i nerovnováhu v minerální výživě rostlin. Může dojít k inhibici enzymů Calvinova cyklu, čímž je vyvolán v rostlinné buňce oxidativní stres, nebo může způsobit změny v osmotickém potenciálu vodního roztoku (Tausz, 2001). Všechny tyto škodlivé účinky mohou vést k zastavení růstu nebo ke smrti rostliny (Sairam et al., 2004). Rostliny v reakci na změnu vnějšího osmotického potenciálu akumulují látky zvané osmolyty. Patří mezi ně například cukerné alkoholy (polyoly), sacharidy nebo polární metabolity (Desingh et al., 2007). Hlavními osmolyty jsou prolin a u CAM rostlin například malát a oxalát. Pokud při působení vysoké koncentrace solí dojde k redukci fotosyntézy (salinita omezuje výměnu plynů a tedy přísun CO 2 do listů a do Calvinova cyklu), okamžitě narůstá produkce ROS. Jejich množství je omezeno rychlostí jejich tvorby, rychlostí reakce s lipidy, proteiny a jinými makromolekulami, rychlostí jejich degradace a také rychlostí reakce antioxidativního systému buňky (Kattab, 2007). Odstraňování ROS vzniklých působením vysokých koncentrací solí se účastní velké množství enzymů. SOD přeměňuje superoxid na peroxid vodíku, ten je dále odstraněn peroxidasami nebo katalasou (Sairam et al., 2004). Mezi tolerancí vůči NaCl a kapacitou antioxidativního systému buňky je úzký vztah, který byl demonstrován na množství různých druhů rostlin. U citlivých druhů dochází působením salinity k poklesu aktivity enzymů SOD i CAT (Bartosz, 1997). Samotná reakce antioxidativního systému na stres může být různá podle druhu rostliny.

c GSH M/g váhy 28 Glutathion se účastní reakce na salinitu jednak v askorbát-glutathionovém cyklu, jednak jako substrát pro množství antioxidativních enzymů. Například při porovnání dvou typů rajčete (Lycopersicum esculentum kultivované, Lycopersicum pennellii divoce rostoucí) se ukázalo, že existují rozdíly v metabolismu glutathionu mezi tolerantními a netolerantními rostlinami. Druhy tolerující zasolení (v tomto případě divoce rostoucí druh rajčete) jsou schopny při působení stresu zvýšit biosyntézu glutathionu během dvou týdnů působení, naopak citlivé druhy (např. zemědělské plodiny) toho nejsou schopny. U tolerantních druhů je také vysoký poměr GSH/GSSG způsobený patrně intenzivní recyklací glutathionu, a tedy obnovou jeho aktivní redukované formy (Tausz et al., 2004). U Arabidopsis thaliana došlo působením salinity k výraznému zvýšení syntézy cysteinu a glutathionu (Tausz, 2001). Výzkum u dvou různě citlivých kultivarů Brassica napus ukázal pokles obsahu askorbátu a GSH u obou typů při zvyšující se koncentraci NaCl (Kattab, 2007). 30 25 20 15 10 Kultivar 1 Kultivar 2 5 0 0 100 200 c NaOH (mm) Obrázek 6 - změny koncentrace GSH u dvou různě citlivých kultivarů Brassica napus, podle Kattab, 2007 Desingh et al. (2007) prováděl výzkum reakce fotosyntézy a antioxidativního systému na různé koncentrace soli u dvou variet bavlny. Při zvyšování koncentrace NaCl došlo ke snížení rychlosti fotosyntézy a aktivit enzymů RuBPkarboxylasy a sukrózafosfátsyntasy, naopak aktivity enzymů antioxidativního systému (hlavně SOD, APX a GR) se zvýšily. Tyto účinky se projevily u obou variet, nicméně u tolerantní bylo zvýšení aktivity antioxidativních enzymů vyšší. Rozdíly byly i v množství akumulovaných osmolytů, kdy tolerantní varieta obsahovala po působení stresu více těchto látek oproti netolerantní rostlině.

29 Sumithra et al. (2006) zkoumal reakci antioxidativních sloučenin u dvou kultivarů rostliny Vigna radiata. Uvádí u obou kultivarů pokles váhy i obsahu vody, také vyšší poměr iontů sodíku k iontům draslíku, nižší aktivitu enzymů a nižší koncentraci GSH, naopak zvýšení koncentrace GSSG. U tolerantní rostliny byly tyto projevy mírnější než u citlivého kultivaru. U méně tolerantního kultivaru bylo zaznamenáno vyšší množství lipidových hydroperoxidů oproti méně citlivému kultivaru. Méně tolerantní kultivar obsahoval také méně prolinu než tolerantní kultivar. Ukazuje to na lepší schopnost tolerantních odrůd odolávat oxidativnímu stresu a poškození buňky. 4. Vysoké hodnoty záření Sluneční svit je pro veškeré živé organismy nezbytnou podmínkou k životu. Živočichové i rostliny mohou řídit své životní cykly podle intenzity světla. Některé organismy preferují velké množství světla (například organismy žijící na nezalesněných plochách), jiné naopak lépe rostou ve stínu. Zatímco většina živočichů je schopná vyhnout se přílišné intenzitě světla aktivním pohybem a vyhledáváním skrýší, rostliny se takto pohybovat z místa na místo nemohou. Mohou například změnit orientaci listů nebo chloroplastů tak, aby zmenšily množství absorbované světelné energie, případně mohou zmenšit plochu světlosběrných antén v PSII (Ledford, Niyogi, 2005), ale nemohou se účinkům záření aktivně vyhnout přesunem na výhodnější místo. Jsou tedy ohroženy fotooxidativními účinky světla (Feierabend et al., 1992). Pokud buňky absorbují více fotosynteticky aktivního záření, než je nezbytné pro asimilaci CO 2 v Calvinově cyklu, může dojít k vyčerpání kapacity přenašeče elektronů NADPH a v rostlině může dojít ke vzniku oxidativního stresu a k akumulaci ROS. Při delším působení může dojít i k fotoinhibici na fotosystémech, hlavně u fotosystému II(Burritt et al., 2003, Feierabend et al, 1992). Příliš intenzivní záření může způsobit inaktivaci některých funkčních proteinů, například enzymu CAT (Bartosz, 1997), který je vysoce světlocitlivý a při vysokém osvitu může dojít i k jeho degradaci. Rostliny proto musí nahrazovat tyto ztráty resyntézou (Feierabend et al., 1992).

30 Tyto projevy stresu způsobeného vysokým zářením se objevují obvykle u fotosystému II (PSII), ačkoli i fotosystém I může být poškozen účinky velkého množství světelné energie, hlavně za nízkých teplot (Vass et al., 2007). V PSI může díky jeho vysokému redoxnímu potenciálu docházet ke tvorbě superoxidu na akceptorové straně systému (Ledford, Niyogi, 2005). V PSII probíhá světlem řízená oxidace vody, jejímiž produkty jsou jedna molekula O 2 a čtyři protony na dvě molekuly vody. Tento kyslík pak může tvořit ROS interakcí s excitovanými fotosyntetickými pigmenty či redoxními součástmi fotosyntetického aparátu (Vass et al., 2007). Proces fotoinhibice ve PSII začíná modifikacemi na akceptorové straně systému. Tím může dojít k inhibici elektronového transportu elektronů z fotolýzy vody do reakčního centra PSII. Následuje vznik excitovaných chlorofylových pigmentů v singletovém a tripletovém stavu 1 P * 680 a 3 P * 680. Ovšem pigment 1 * P 680 je schopen přecházet na tripletový stav 3 P * 680. Pigment 3 P * 680 má delší dobu života a je pravděpodobnější, že bude reagovat s molekulovým kyslíkem za vzniku singletového kyslíku (Ledford, Niyogi, 2005). Ten, díky své vysoké reaktivitě, může nevratně poškodit místo svého vzniku, tedy PSII. Později dochází k nevratnému poškození proteinu D1 v reakčním centru PSII, protože vysoká koncentrace singletového kyslíku brání jeho opravení (Ledford, Niyogi, 2005). K obnově správných funkcí fotosyntézy je tedy nutná jeho resyntéza (Feierabend et al., 1992). Pokud dojde k fotoinhibici na donorové straně PSII, nastává množství reakcí vedoucích přes tvorbu superoxidového aniontu a peroxidu vodíku k produkci hydroxylového radikálu (Vass et al., 2007). Aby rostliny přežily, musí být schopné přizpůsobit se měnícím se světelným podmínkám (Vass et al., 2007). Ochrana PSII může být zajištěna například vyzařováním přebytečné excitační energie ve formě tepla (nefotochemické zhášení) na světlosběrných anténách (Vass et al., 2007). Rostliny se mohou dlouhodobě adaptovat na vysoké záření také změnou struktury a funkce svých chloroplastů, tedy přeměnou chloroplastů na tzv. sluneční typ (Lichtenthaler, Burkart, 1999). Krátkodobě mohou snížit rychlost fotosyntézy například při uzavření průduchů. Dlouhé působení vysokých intenzit světelného záření vede k poklesu množství chlorofylu a také k poklesu množství tylakoidů v chloroplastech tedy ke vzniku slunečního typu chloroplastu, který je lépe přizpůsobený podmínkám vysoké rychlosti absorpce světelné energie a vysoké rychlosti přeměny energie a asimilace. Nicméně i přes tyto adaptace fotosyntetického aparátu na vysoký osvit může dojít k fotoinhibici hlavně ve svrchních vrstvách buněk palisádového parenchymu listů vystavených vysoké intenzitě světla (Lichtenthaler, Burkart, 1999).

31 Důležitým enzymem pro obranu chloroplastů před účinky ROS je SOD. Reaguje na tvorbu superoxidu na akceptorové straně PSI nebo na donorové straně PSII a rychle katalyzuje jeho přeměnu na peroxid vodíku (Ledford, Niyogi, 2005). Glutathion, jeho obsah a poměr GSH/GSSG jsou světelnými podmínkami silně ovlivněny. Koncentrace glutathionu ve smrkových jehlicích je závislá na denním průběhu světelné intenzity s maximem v poledne. Může to být způsobeno biosyntézou GSH, která je na množství světla závislá, případně transportními procesy odvádějícími glutathion z jehlic, nebo se mohou tyto faktory vzájemně kombinovat. Jehlice smrku rostoucí na světle obsahovaly více glutathionu nežli jehlice rostoucí ve stínu (Tausz, Grill, 2000). Totéž se projevilo u listů dubu Quercus ilex. U listů hrachu se objevila vyšší aktivita GR u těch, co rostly na světle, oproti listům rostoucím ve stínu (Tausz, 2001). Burritt et al. (2003) prováděl výzkum na rostlině Begonia x erythrophylla. Zkoumal rozdíly v účinku záření na množství pigmentů, ROS, antioxidantů a antioxidavních enzymů u listů rostlin pěstovaných ve stínu, listů rostlin přesunutých ze stínu na slunce a u nových listů vyrůstajících na přesunutých rostlinách. Vysoké hodnoty záření způsobily nejdříve fotoinhibici fotosyntézy, později došlo ke ztrátě fotosyntetických pigmentů. Po přesunu na plné světlo také došlo k okamžitému vzrůstu produkce peroxidu vodíku a dalších ROS. U nově rostoucích listů došlo ke zvýšení obsahu askorbátu proti listům zastíněným i proti listům na přesunutých rostlinách. Naopak množství glutathionu v listech přesunutých rostlin poměrně rychle pokleslo o 50%, později se zase zvýšilo. Poměr GSH:GSSG sleduje změny celkového obsahu glutathionu. Nově rostoucí listy obsahují celkově více glutathionu a je u nich vyšší poměr GSH:GSSG oproti zastíněným. Co se týče enzymů, došlo téměř u všech (kromě katalasy) k vzrůstu aktivity ihned po přesunu. U katalasy aktivita nejdříve klesala, teprve později se začala zvyšovat. To je způsobeno citlivostí CAT na intenzitu osvitu. U listů rostoucích nově na světle byly aktivity všech enzymů vyšší. Vzrůst aktivit enzymů ukazují i jiné studie, například Ali et al. (2005) u Phalaenopsis. Vzrůst aktivity SOD je pravděpodobně přímou reakcí na vzrůst produkce superoxidu při světlem vyvolaném oxidativním stresu. Jako další enzymy zkoumal MDHAR a DHAR, jejichž aktivita se také zvýšila pravděpodobně díky reakci na tvorbu MDHA a DHA při odstraňování peroxidu vodíku. Naopak GR ukázala pokles aktivity. Reakcí Phalaenopsis na stres způsobený vyšší intenzitou světla bylo celkové zvýšení proteinů v listech, což umožnilo rostlinám lépe se bránit oxidativnímu stresu.

32 Stres způsobený vysokou intenzitou slunečního světla obvykle nepůsobí na rostliny sám, ale většinou se objevuje v kombinaci se stresem vyvolaným nedostatkem vody a s teplotním stresem (Lichtenthaler, Burkart, 1992). 5. Vysoká teplota Teplotní stres je pravděpodobně jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících rostlinný růst a vývoj (Chaitanya et al., 2001, Yin et al., 2008). V dnešní době je problémem hlavně díky postupnému globálnímu oteplování Země. Je u rostlin vyvolán náhlým zvýšením teploty nad určitou prahovou hodnotu (obvykle asi 10-15 C nad teplotu okolí). Prahová hodnota teploty se liší podle druhu rostliny i podle jednotlivých růstových stadií. Rostliny mají dvě prahové teploty, teplotní minimum a maximum. Teplotní minimum je teplota, pod kterou je růst rostliny redukován a dochází k zastavení vývoje. Teplotní maximum je podobné, je to hodnota, nad níž se zastavuje růst a vývoj rostliny. Překročení prahové hodnoty u rostliny vede k mnohdy nevratnému poškození buněk, při velmi vysokých teplotách nastává během několika minut působení buněčná smrt. Rozsah kolísání teplot závisí na dané klimatické zóně, ve které rostlina roste, na denní či noční periodě teplotních změn a také na ročním období (Wahid et al., 2007). Poškození způsobené vysokými okolními teplotami může být buďto přímé nebo nepřímé. Důležitá je intenzita, délka působení a také rychlost zvýšení teploty. Při přímém poškození dochází k denaturaci proteinů a peroxidaci lipidů obsažených v membránách (Yin et al., 2008). Nepřímé poškození se projevuje inaktivací enzymů v chloroplastech a mitochondriích, zastavením proteosyntézy, degradací buněčných proteinů a ztrátou membránové integrity. V buňce dochází ke štěpení nebo prodlužování mikrotubulů a také ke tvorbě mikrotubulárních hvězdic v mitochondriích. Všechny tyto změny mohou vést ke zpomalení nebo inhibici růstu rostliny, k narušení homeostázy, k redukci toku iontů, k tvorbě toxických sloučenin a ROS (Wahid et al., 2007).

33 Teplotní stres se projevuje také vnějšími změnami morfologie rostlin. Vysoké teploty způsobují vážné poškození listů i větévek tím, že je popálí, způsobují rychlejší stárnutí listů, inhibici růstu celé rostliny (včetně kořenů), ztrátu fotosyntetických pigmentů nebo odbarvení ovoce. Je to tedy jeden z nejdůležitějších faktorů limitujících výnosy zemědělských plodin na celém světě. Působení vysokých teplot také ovlivňuje tvorbu zrn u obilovin, prodlužuje dobu jejich tvorby a zároveň snižuje celkový růst zrn. Například u pšenice způsobuje teplotní stres ztráty až 7 %. K obdobným účinkům dochází u kukuřičných zrn, kde je redukován obsah škrobu, proteinů i olejů (Wahid et al., 2007). Vysoké teploty jsou obvykle doprovázeny snížením relativního obsahu vody v rostlině. Dochází také k akumulaci nízkomolekulárních organických sloučenin, tzv. kompatibilních osmolytů, které se za normálních podmínek neúčastní metabolismu v rostlinné buňce. Jsou to různé sacharidy, polyoly, prolin, terciární a kvartérní amoniové sloučeniny nebo třeba kyselina -aminomáselná. Tvorba a nahromadění těchto látek je považováno za klíčový prvek v adaptaci na působení vysokých teplot a také sucha a salinity (Wahid et al., 2007). Teplotním stresem jsou zasaženy chloroplasty i fotosyntéza. Změny ve fotosyntetickém aparátu vyvolané působením vysokých teplot lze považovat za dobré indikátory míry termotolerance u daného rostlinného druhu či růstového stadia. Jako první jsou narušeny fotochemické reakce a vzápětí asimilace uhlíku v Calvinově cyklu, neboť enzymy Calvinova cyklu jsou na vyšší teplotu velmi citlivé (Chaitanya et al., 2001). Fotosystém PSII je také velmi citlivý na vyšší teploty. Při působení teplotního stresu dochází k částečnému pozastavení jeho funkcí. Vysokou teplotou mohou být poškozeny, podobně jako při fotoinhibičním stresu, například proteiny D1 a/nebo D2 v reakčním centru PSII. Pokud dojde k nevratnému poškození PSII, je nutná jeho resyntéza (Wahid et al., 2007). Dojde k narušení elektronového transportního řetězce a elektrony jsou přesouvány směrem na molekulový kyslík za vzniku ROS (Chaitanya et al., 2001). Při působení vysokých teplot může být narušena integrita buněčných membrán zvýšením fluidity. To může být způsobeno denaturací proteinů nebo nasycením dvojných vazeb mastných kyselin vázaných v membránových lipidech. Vysoké teploty také způsobují rozpojení chemických vazeb membránových sloučenin s molekulami pohybujícími se skrz membrány, takže se membrána stává propustnější (Wahid et al., 2007).

34 Vysoké teploty také vyvolávají tvorbu ROS v rostlinných buňkách. V chloroplastech, nejohroženějším místě rostlinné buňky, je vytvořeno několik specifických obranných mechanismů působících ve stromatu i na tylakoidních membránách (Chaitanya et al., 2001). Rostliny se brání pomocí svých antioxidativních obranných systémů, zahrnujících enzymy (SOD, CAT, APX, GR) a antioxidanty (GSH, Asc). Studie u tolerantních a netolerantních druhů trav ukázala, že u tolerantních je méně ROS, což je důsledek zvýšeného množství Asc a GSH (Wahid et al, 2007). U lilie velkokvěté vystavené působení teplotního stresu bylo zaznamenáno zvýšení aktivit antioxidativních enzymů (Yin et al., 2008). Rostliny mají velké množství odlišných reakcí na zvýšenou teplotu. Teplotní stres u nich vyvolává velké množství různých odpovědí, které jim pomáhají adaptovat se na vnější podmínky prostředí a přežít (Chaitanya et al., 2001). Mohou to být dlouhodobé evoluční morfologické adaptace na zvýšenou teplotu, případně krátkodobé aklimatizační nebo únikové mechanismy. Rostliny samozřejmě nemohou přímo utéct, ale mohou měnit orientaci listů podobně jako při reakci na vysoký osvit. Tímto způsobem dokážou zmenšit plochu přístupnou k ohřátí. Mohou se také ochlazovat transpirací, ale to je omezeno množstvím vody v rostlině (Wahid et al., 2007). Další důležitou formou zvýšení termotolerance je syntéza tzv. stresových proteinů (HSPs). Jejich zvýšená syntéza a akumulace v rostlinné buňce nastává při náhlém nebo postupném zvyšování teploty. Biosyntéza těchto proteinů je při působení stresu velmi rychlá. Jsou tedy klíčovým faktorem umožňujícím rostlinám adaptaci a přežití při působení teplotního stresu. Nicméně, jejich syntéza není omezena pouze na rostliny. Tvorba HSPs je velmi obecnou reakcí na zvýšenou teplotu u velkého množství organismů včetně člověka. U rostlin může být jejich tvorba někdy omezena pouze na určitá stadia vývoje, například na vývoj pylu nebo zrání ovoce, ale obvykle se tvoří ve všech vývojových stadiích vyšších rostlin. Přítomnost HSPs v buňce může bránit denaturaci jiných potřebných proteinů, jejich akumulace v citlivých pletivech či organelách brání metabolické aparáty před inhibicí. Způsob, jakým HSPs pomáhají rostlinám tolerovat teplotní stres, není dosud plně objasněn. Jsou jim připisovány funkce chaperonů, tedy proteinů schopných udržovat konfiguraci a funkčnost jiných důležitých buněčných proteinů při teplotním stresu. Zajišťují také svinutí nově syntetizovaných nebo deformovaných proteinů do jejich správné struktury. Bylo dokázáno, že mezi vzrůstem termotolerance a syntézou a akumulaci HSPs je přímý vztah (Wahid et al., 2007).

35 Existují i další proteiny, jejichž tvorba je vyvolána teplotním stresem. Patří sem například ubiquitin, Cu/Zn-SOD, vyskytující se v cytosolu, nebo Mn-peroxidasa, důležitá v minimalizaci oxidativního poškození při teplotním stresu (Wahid et al., 2007). Například u rajčete dochází u tolerantních forem k poklesu poměru chlorofyly:karotenoidy a ke vzrůstu poměru chlorofyl a:b, což pravděpodobně indikuje toleranci vůči vyšší teplotě. V reakci na tvorbu ROS rostliny zvyšují aktivity antioxidativních enzymů SOD, Cat, APX i GR. Toto potvrzuje výzkum na třech kultivarech moruše, kdy ve všech případech došlo ke vzrůstu aktivit (Chaitanya et al., 2001). Výzkum tolerance extrémně vysokých teplot působících na semena Nelumbo nucifera ukázal naopak pokles aktivit, což bude způsobeno pravděpodobně vystavením semen teplotě 100 C, tedy teplotě, kterou většina rostlin není schopna déle přežít. Obvykle došlo v počáteční fázi ke vzrůstu aktivit, a poté k poklesu (Ding et al., 2008). Zvýšení enzymových aktivit potvrzuje i studie na Phalaenopsis. Při 30 C došlo u všech měřených enzymů (SOD, CAT, MDHAR, DHAR, GR) ke zvýšení aktivit. U některých došlo po 48 hodinách k inhibici. Došlo i ke zvýšení koncentrace metabolitů (včetně GSH). Tím rostliny pravděpodobně redukovaly možné oxidativní poškození. Při 40 C došlo naopak k poklesu množství GSH, který byl pravděpodobně zapříčiněn zvýšenou oxidací glutathionu při aktivitě GPX a GST (Ali et al., 2005). Yin et al. (2008) zkoumal účinky krátkodobého působení teplotního stresu na antioxidativní systém rostliny Lilium longiflorum. Nejlepší teploty pro růst této květiny jsou 18-22 C. Byla podrobena působení vyšších teplot (37 C, 42 C a 48 C) po dobu 10 hodin. Jak je vidět v grafu (Obrázek 7), v počátku působení teplotního stresu došlo ke vzrůstu koncentrací GSH při teplotách 37 a 42 C. Toto zvýšení odpovídalo i vyšší aktivitě enzymu GR, což ukazuje na důležitou roli GSH v askorbát-glutathionovém cyklu, který je důležitý pro odstraňování vznikajících ROS. S pokračující expozicí v těchto teplotách došlo v listech k poklesu koncentrace glutathionu, způsobené pravděpodobně jeho zapojením do odstraňování ROS pomocí enzymů GPX a GST, pro které je GSH oxidujícím se substrátem. Při teplotě 37 C byla výsledná koncentrace glutathionu o 38 % vyšší než koncentrace u kontrolního vzorku, při teplotě 42 C už to bylo jen o 12 % více. Při 47 C došlo v první hodině působení k rychlému nárůstu koncentrace, která pak už trvale klesala na hodnotu o 8 % nižší než u kontroly. Tento pokles se projevil i u askorbátu a byl pravděpodobně způsoben inhibicí askorbát-glutathionového cyklu působením teplotního stresu. Došlo i ke změnám v aktivitách důležitých antioxidativních enzymů. Při 37 C a 42 C došlo u SOD, CAT, APX a GR ke vzrůstu, při 47 C došlo v počátku k rychlému vzrůstu, poté k poklesu.

36 Obrázek 7 - změny v koncentraci GSH v listech lilie (Lilium longiflorum) při vystavení různým teplotám, c kontrola, Yin et al., 2008 Aktivity všech enzymů kromě CAT byly po skončení působení vysoké teploty (47 C) srovnatelné s kontrolou, pouze aktivita CAT byla o 19 % nižší. Poklesy v koncentracích askorbátu a glutathionu a poklesy aktivit enzymů při 47 C pravděpodobně ukazují na velké oxidativní poškození buňky a na nevratnou destrukci buněčných membrán.