Základy hmotnostní spektrometrie Lenka Hernychová e-mail: hernychova@pmfhk.cz Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové
Historie Koichi Tanaka vyvinul MALDI techniku Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida T.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151 Tanaka K. JB Fenn vyvinul ionizaci elektrosprejem Fenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64 Fenn J.B. Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie
Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, která určuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty. Přístroj se nazývá hmotnostní spektrometr.
Princip MS vypovídá o primární struktuře analyzované látky Neposkytuje informace o sekundární či terciální struktuře proteinu Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace.) a může určit i místo modifikace Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13 C/ 12 C, 34 S/ 32 S, 18 O/ 16 O - kvantifikace
Princip Umožňuje analýzu komplexních směsí Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality Identifikaci proteinů Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby Možnost analýzy nekovalentních komplexů
Vlastnosti hmotnostní spektrometrie Citlivá Specifická Rychlá Jednoduchá interpretace dat
Popis přístroje Experimentální uspořádání 1. Iontový zdroj 2. Hmotnostní analyzátor 3. Detektor 4. Řídící počítač
Součásti MS systému Atmosphere Vacuum System Sample Inlet Ionisation Method Mass Analyser Detector Data System
MALDI-TOF hmotnostní spektrometry MALDI-TOF Voyager (Applied Biosystems) 4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems) Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)
Princip Ionizace 1.Měkké techniky ionizace Energetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá. 2. Tvrdé techniky ionizace Dodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.
Typy ionizace - nárazem elektronů (EI) -působením elektrostatického pole (FI, FD) - chemickou ionizací (CI) - nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB) - ionizací fotony - ionizací 252 Cf - elektrosprejem, termosprejem (ESI) - ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)
Hmotnostní analyzátory Umožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech. Typy analyzátorů Kvadrupolový analyzátor (jednoduché, trojnásobné) Iontová past Průletový analyzátor (TOF) Hybridní (Q-TOF, Q-trap, TOF-TOF, trap-tof, trap-icr, ) FT-MS (ICR-MS)
Detektor Poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Dělí se do dvou skupin 1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů (měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin) 2. Násobičové detektory využívají efekt násobení elektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)
MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Metoda využívá ionizace laserem pulsní technika -------- UV (N 2 ) IR (CO 2 ) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns) dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých) jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)
MALDI-TOF MS - ionizace MALDI destička Laser 1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) ausušen (vykrystalizován) na MALDI destičce + AH + 2. Laserový výstřel ionizuje molekuly matrice. 3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice: MH + + A M + AH + +20 kv Ground Variable Grid Grid
Proces MALDI ionizace Měkká ionizace Malá nebo žádná fragmentace Jednou nabité ionty [M+H] + ; [M-H] - Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery Analýza komplexních sloučenin Rychlá příprava vzorku & analýza Tolerantní k detergentům a solím Jednoduchá interpretace dat Spojený s TOF analyzátorem
TOF analyzátor Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu mají rychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu t = k ( m 1 /z - m 2 /z)
TOF analyzátor Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovém a PSD módu Lineární mód měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m) Reflektronový mód měření peptidů (dráha letu je prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m) Post-Source Decay (PSD) kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)
Průletový analyzátor (TOF) 15-25 kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů
Průletový analyzátor (TOF) 15-25 kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.
Lineární mód Reflektronový mód
Charakteristika reflektronový mód Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm) Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol) Teoreticky neomezené rozmezí m/z Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra vjednom ionizačním pulsu
Příprava vzorků pro MS Předseparační techniky rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, caplc, MudPIT HPLC.) Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí
Separace proteinů 1D elektroforézou
+ 2-Dimensionální PolyAkrylamidová Gelová Elektroforéza 2D-PAGE První dimenze pi 3 -- + + - + - - -- - ++ - - - - - + ++ + -- - + - + + + - + + ++ + + + -- - + - - + - - - -- - - + + ++ - - pi 10 + _ - + + -- Druhá dimenze - - Polyakrylamid rylamidový gel + + ++ - - +
Separace proteinů 2D elektroforézou ph 3-10
Separace proteinů 2D elektroforézou ph 6-11
Chromatogram separace acetonitrilového extraktu (proteiny) Brucella melitensis získaný z HPLC Alliance. ACN extrakt Brucella melitensis Modrými šipkami je označena oblast, ve které byly jímány frakce, a šipky zelené označují konkrétně najímané frakce.
Iontový záznam v podobě BPI (base peak intensity) tryptického digestu acetonitrilového extraktu Francisella tularensis LVS separovaný na CapLC a detekovaný na hmotnostním spektrometru Q-TOF Ultima API. ACN_FT_101204_2MS 100 34.78 TOF MS ES+ BPI 3.28e3 23.76 26.16 18.82 19.89 22.09 28.95 % 18.99 18.65 21.58 25.21 21.28 23.43 28.08 18.40 20.31 22.47 24.17 27.57 30.92 27.33 13.86 34.07 0 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 Time
2D-PAGE a MALDI-TOF Postup přípravy vzorků Separovaný Protein Proteasa Proteolytické peptidy MALDI-TOF MS spektrum proteolyt. peptidů
Enzymatické štěpení vzorku Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidové vazby u kladně nabitých zbytků. Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin. -Phe-Trp -Met -Gly-Ala -Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys - Trypsin
Matrice Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N 2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpací rychlostí vakuového systému) Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, které zajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH 3 CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci
MALDI-TOF MS Výběr matrice α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sinapinic Acid Peptidy < 10kDa Proteiny > 10kDa 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) Super DHB 3-Hydroxypicolinic acid Neutrální karbohydráty, Syntetické polymery Proteiny, Glycosylované proteiny Oligonukleotidy HABA Proteiny, Oligosaccharidy
Krystalizace matrice α cyano Zakulacené Sinapinic acid Kosodélníky
Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541
Interpretace spekter Metoda peptidového mapování (PMF) Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593] 100 1112.57 4.0E+ 90 80 70 1508.83 60 % Intensity 50 40 1337.66 1806.97 30 721.40 1032.59 20 1278.70 1718.91 2007.11 2299.22 10 874.52 1204.64 1381.70 1851.91 1095.54 1530.83 2310.25 0 0 700 1260 1820 2380 2940 3500 Mass (m/z)
Selekce monoizotopického píku Pro přesnost měření je důležitá kalibrace přístroje Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593] 100 1032.59 1.0E+ 90 80 70 % Intensity 60 50 40 1033.59 30 20 1034.59 10 0 0 1025.0 1028.8 1032.6 1036.4 1040.2 1044.0 Mass (m/z)
100 Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717] 1032.59 7.7E 90 80 70 % Intensity 60 50 40 30 20 10 0 1025.0 1028.8 1032.6 1036.4 1040.2 0 1044.0 Mass (m/z)
MALDI-TOF http://prospector.ucsf.edu/ % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 721.40 1112.57 1337.66 1508.83 Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717] 1806.97 1718.91 1032.59 1702.91 2006.11 2298.25 1278.70 1154.53 1381.70 1851.91 2211.11 1134.56 1530.83 1707.80 1979.99 721.404125 3.3E+ 1032.590346 1112.570270 1113.045597 1134.559599 1154.533896 1204.639320 1278.698938 1337.658894 1381.701498 1507.822994 1635.907888 1702.911439 1718.915257 1806.968592 1829.902719 1851.915847 1869.037522 2006.110677 2298.243916 2301.201154 0 0 699.0 1359.2 2019.4 2679.6 3339.8 4000.0 Mass (m/z)
Hodnocení spekter pomocí databáze - identifikace proteinu Primární struktura DNA Primární struktura proteinu Spektrum z MS Štěpící místa proteinu (Arg, Lys) Experimentálně zjištěné m/z proteolytických peptidů vs. Teoreticky vypočtené m/z proteolytických peptidů Metoda peptidového mapování - Peptide Mass Fingerprinting
Interpretace spekter Databáze přístupné na Internetu
Interpretace spekter Hodnocení v databázích
Interpretace spekter Výsledek
Anotace 2D-PAGE proteinové mapy http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/menu_frame.cgi
Kalibrace přístroje
Voyager Spec #1[BP = 1298.0, 17155] 100 1298.0050 1.7E 90 80 1047.6398 70 % Intensity 60 50 40 1674.5700 2096.0804 30 20 2468.4231 10 1771.6809 1069.6449 1312.0479 1678.6340 2112.0808 2482.4645 0 699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 0 4001.0 Mass (m/z)
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 1298.0, 16995] 100 1298.0050 1.7E 90 80 1047.6397 70 % Intensity 60 50 40 1674.5696 2096.0800 30 20 2468.4233 10 1771.6816 1069.6447 1302.0003 1678.6244 2112.0699 2482.4588 0 699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 0 4001.0 Mass (m/z)
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>MC[BP = 1296.7, 16 100 90 80 70 1046.5400 1296.6862 Angiotensin I Angiotensin II Neurotensin ACTH (1-17) ACTH (18-39) 1.7E % Intensity 60 50 40 1672.9278 2094.0833 30 20 2466.1173 10 1769.9575 1068.5256 1300.6780 1676.9791 2110.0598 2480.1411 0 699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 0 4001.0 Mass (m/z)
MS/MS spektra
Schéma fragmentace
Schéma fragmentace b 1 b 2 b 3 R 1 R 2 R 3 R 4 NH 2 -CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO 2 H N-terminus C-terminus y 3 y 2 y 1
Hmotnosti aminokyselin
Hledání y-iontové série 100 95 90 85 Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00] 584.9 968.2 80 75 E X T X D S A F 70 65 Relative Abundance 60 55 50 45 653.2 969.2 40 35 30 25 20 15 10 5 190.9 218.8 129 113 101 113 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 m/z 766.2 115 654.1 881.2 87 71 475.9 534.0 310.1 439.1 552.1 877.2 585.8 635.1 970.2 420.9 516.0 748.1 767.2 859.0 1039.2 220.0 730.3 305.9 617.1 950.2 403.1 882.2 1021.1 261.1 292.0 341.1 385.7 462.9 694.1 714.2 822.3 841.1 894.1 1042.2
Hledání y-iontové série 100 95 90 85 Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00] 584.9 968.2 80 75 K, Y E X T X D S A F 70 65 Relative Abundance 60 55 50 45 40 35 30 653.2 969.2 25 20 218.8 766.2 15 10 5 190.9 654.1 881.2 475.9 534.0 310.1 439.1 552.1 877.2 585.8 635.1 970.2 420.9 516.0 748.1 767.2 859.0 1039.2 220.0 730.3 305.9 617.1 950.2 403.1 882.2 1021.1 261.1 292.0 341.1 385.7 462.9 694.1 714.2 822.3 841.1 894.1 1042.2 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 m/z
Hledání b-iontové série 100 95 90 85 Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00] 584.9 968.2 80 75 K, Y E X T X D S A F 70 65 Relative Abundance 60 55 50 45 40 969.2 F A S D X T 653.2 X E Y K 35 30 25 20 218.8 766.2 15 10 5 190.9 654.1 881.2 475.9 534.0 310.1 439.1 552.1 877.2 585.8 635.1 970.2 420.9 516.0 748.1 767.2 859.0 1039.2 220.0 730.3 305.9 617.1 950.2 403.1 882.2 1021.1 261.1 292.0 341.1 385.7 462.9 694.1 714.2 822.3 841.1 894.1 1042.2 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 m/z
Kontrola hmotnosti prekurzorového píku (součet hmotností všech aminokyselin) Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5 T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00] 100 95 90 85 80 584.9 1186.6 968.2 75 70 65 K, Y E X T X D S A F Relative Abundance 60 55 50 45 40 969.2 F A S D X T 653.2 X E Y K 35 30 25 20 218.8 766.2 15 10 5 190.9 654.1 881.2 475.9 534.0 310.1 439.1 552.1 877.2 585.8 635.1 970.2 420.9 516.0 748.1 767.2 859.0 1039.2 220.0 730.3 305.9 617.1 950.2 403.1 882.2 1021.1 261.1 292.0 341.1 385.7 462.9 694.1 714.2 822.3 841.1 894.1 1042.2 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 m/z