Sexualita vyšších rostlin Sexualita vyšších rostlin 5000 B.C. Asyrští kněží znali pohlavnost rostlin, egyptský Bůh opyluje palmu datlovou Přesný popis pohlavního rozmnožování rostlin (Giovanni Battista Amici) C: 1824 voskový model řezu bliznou a čnělkou Cucurbita pepo D: 1847 proces oplození Orchis morio Reprodukční orgány Reprodukční orgány Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Vývoj pestíku Vývoj samičího gametofytu Oplození rostliny Sexualita = projev finální diferenciace eukaryot savci změna vnějšího prostředí ---(fixace místa) fyziologická, morfogenní pohyb fyziologická, sezonní sexualita vyšších rostlin jako životní strategie 1
Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Savci meiose: vajíčko, spermie Fixní uspořádání těla Diplodní organismus meiose haploidní gameta Oplození = nový zygotický genom - organogeneze striktně vymezena v embryu - rané uspořádání zárodečné linie - predeterminované gamety mechanismy eliminující účinek vnějšího prostředí Plasticita buněk a orgánů nepřenosná Chybí mechanismus eliminující nevhodné recesivní alely v průběhu ontogenese akumulace genetické zátěže Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Rostliny- meiose: megaspora-megagametogeneze SAMIČÍ GAMETOFYT = zárodečný váček --vaječná buňka mikrospora- mikrogametogeneze SAMČÍ GAMETOFYT = pylové zrno -- 2 spermatické buňky 1) průběžně probíhající organogeneze = možnost vzniku serie fenotypů z jediného genotypu: A) změna vnějšího prostředí B) vysoká specifita a kontrola vývoje A xxx B = iniciace orgánů a jejich tvarování: růst a diferenciace (změna struktury jako adaptace a jako ochrana) Plasticita finální podoby orgánů: projev potřeby dynamického kompromisu mezi optimální funkcí za daných podmínek 2. plasticita jednotlivých orgánů 3. žádná determinace zárodečných linií, genetické změny snadno eliminovány či přenášeny Balanční mechanismus: plasticita buněk + střídání generací 2n xxx n (diploidní rostlina meiose haploidní buňka haploidní organismus - diferenciace gamet oplození) 4. fenotyp gametofytu závisí na genotypu jistá autonomie vývoje gametofytu prověřuje jeho životaschopnost 2
Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Rostliny xxx vnější prostředí Riziko poškození vlastní struktura genů (Živočišné geny velké introny až 1200 bazí regulační elementy lokalizovány i mnoho kb od transkripční jednotky) Rostlinné geny velmi kompaktní, menší introny promotor blízko iniciace transkripce vyšší odolnost vůči zlomům a translokacím Genom vyšších rostlin: 10 4 10 5 strukturních genů, 5-10% exprimováno v dospělé rostlině časté přestavby chromosomů polyploidie aktivita a redukce transponovatelných elementů Organizace rostlinného těla: morfologická anatomická molekulární každá buňka, každý organ = rezervoár genů Diferenciace determinace buněk flexibilita buněk TOTIPOTENCE Finální diferenciace vývoj reprodukčních orgánů Premeiotické buňky = změna programu v oblasti apikálních meristemů Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Reprodukční orgány I Podněty řada signálů integrována meristémem vnější cukry, rostlinné hormony, Ca ionty, vnitřní struktura meristému spoluvytvařena biofyzikálními silami zbrázďování buněk, jejich rozvolňování, stlačování Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Vývoj pestíku Vývoj samičího gametofytu Oplození exprese genů xxx buněčná struktura receptory napětí xxx stav cytoskeketu Změny v prostoru a čase 3
Vývoj pestíku Pestík je tvořen: Bliznou zaniká Čnělkou zaniká Semeníkem s vajíčky ---- plod (bliznové papily + vodící pletiva=specializované struktury sekrečního charakteru) Vajíčko: Komplexní orgán s přesnou strukturou zárodečný vak =samičí gametofyt embryo + endosperm 1-2 integumenty obal semena stopka blizna čnělka semeník vajíčko zárodečný vak Arabidopsis thaliana mikropyle prašník pylová zrna poutko 4
příčný řez květem lilie Vývoj pestíku Pestík Tvořen srostlými plodolisty Zaujímá vnitřní pozici ve spirálovém uspořádání květu Začátek vývoje plodolistů: specifická primordia ve střední části květního meristému Fáze splývání plodolistů: Ihned po vytvoření primordií (fylogenetická fuze = kongenitální typ) Až po přímém kontaktu plodolistů ( ontogenetická fuze = poistgenitální) Arabidopsis thaliana: Obě fuze Vytvoření dutého cylindru v apexu, plodolisty splývají jen na basi Dělení buněk vnitřní plochy cylyndru do centra a zde se setkávají Tím vzniká přehrádka (septum) a tím 2 části semeníku??? Úloha molekulárních signálů při postgenitálním splývání listů??? Rod Caninus: až 400 buněk v kontaktu navzájem, rediferenciace, odstraněníjednoho plodolistu Vsunutí neprůchodné vrstvy v místech splývání = zastavení rediferenciace Každý plodolist svůj signal? Po splynutí 2 plodolistů 2 signály? Vývoj pestíku Vývoj pestíku Tvorba čnělky: Po dotvoření semeníku začne tkáň na vrcholu semeníku tvořit čnělku (kombinace dělení + prodlužování buněk) Postgenitální fuze může být signálem k tvorbě jediné čnělky z apikální oblasti několika plodolistů (Nicotiana) Každý plodolist má vlastní čnělku, i když plodolisty splynuly do jednoho semeníku (Hybiscus, Malus) Druhová variabilita různé typy opylení Čnělka: Plná pylové láčky rostou v mezibuněčných prostorách mezi sloupky buněk Vodící tkáně zvlhčené sekretem Dutá pylové láčky rostou na povrchu vnitřních buněk čnělky - ve čnělkovém sekretu Tkáňová diferenciace uvnitř pestíku: probíhá současně s morfologickým vývojem semeníku a čnělky Pestík: Má tkáně shodné s vegetativní částí rostliny - vaskulární (výživa)+ epidermis (ochrana) Tkáně jedinečné - stigmatická (příjem a rozpoznání pylu)+ vodící (prorůstání láčky) Vodící tkáň: Z vnitřní epidermis Z vnitřního povrchu plodolistu je uspořádána do vertikálních proužků z prodloužených buněk, spojených plasmodesmaty buňky mají sekreční charakter, produkují čnělkový sekret stylar matrix Pokračuje do semeníku Není jen cestou pro pylové láčky Je metabolickou zásobárnou jejich prodlužování 5
Vývoj pestíku Placenta tkáň semeníku s vajíčky Diferencovaná z vnitřní části stěny semeníku Zdá se být méně diferencovaná než vodící pletivo čnělky Cesta pylové láčky placentou = nezbytná konečná fáze růstu láček před vnikáním do mikropyle Vajíčka Tvoří se z vnitřních vrstev povrchu semeníku,z L2 či L2+L3 Lokalozace + uspořádání placentální oblasti druhově specifické Primordium vajíčka iniciuje 1-2 integumenty a tím oddělení a překrytí vajíčka až na 1 por = mikropyle Nektária (medníky) vylučování roztoku cukru a dalších organických látek0 perigoniální kolem květních obalů (Alcea, Pelargonium, Ranunculus) torální na květním lůžku (Citrus, Prunus, Robinia, Prunus, Campanulaceae) staminální na nitkách (Colchicum, Dianthus, Viola) ovariální na semeníku(gentiana, Iridaceae, Liliaceae, Musaceae) stylární na bázi čnělky (Callendula, Helianthus, Senecio) Pletivo tvořící nektar: tenkostěnné epidermální buňky bez kutikuly, exkrece nektaru difúzí na povrch tenkostěnné papilární buňky, exkrece difúzí na povrch jednobuněčné nebo vícebuněčné trichomy, exkrece pod kutikulu prasknutí modifikované stomatální buňky trvale otevřené typy nektárií Nektária (medníky) nektária nektária nektária Capparis Cistus Citrus nektárium Colchicium Garidella 6
Druhově specifická nektária Nektária (medníky) modifikace průduchů u nektária Echinacea květní lůžko Reprodukční orgány I megagametogeneze Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Vývoj pestíku Vývoj samičího gametofytu Oplození Vývoj samičího gametofytu: Meiose - 4 x n-megaspory Většinou jedna z nich tvoří megasporofyt = zárodečný vak 7
příčný řez semeníkem megasporogeneze - synkarpní gyneceum Lilium megasporocyt (diploidní) megasporocyt (2n) meióza 4 megaspory (n) megasporogeneze 1 haploidní megaspora: mitotická dělení = zárodečný vak Vývoj váčku je druhově specifický: - variabilita v cytokinesi během meiose -počtem mitos -vytvářením stěny váčku Nejčastější je typ monoporický- Polygonum Po každém stadiu meiose zaujímá vakuola cetrální posici, jádra migrují k polu buňky Po 3. mitose: celularizace, ukončuje se uspořádání zárodečného vaku Polarita: chalazální-mikropylární oblast vajíčka Buněčné stěny chybí v chalazální oblasti a v synergidách kontakty plasmatických membrán Polarita samičího gametofytu: asymetrií vrstev obklopujících vajíčka (pod sporofytickou kontrolou) 8
fáze megasporogeneze tvorba megaspory (2n) megasporocyt ----meióza----> megaspora (n) megaspora (n) megasporocyt (2n) B - E: vývoj zárodečného vaku B: semeník je členěn placentou C,D: dělící se buňka nucelu a vzniká MMC=zárodečná mateřská buňka- meiosa E: tetrády-zárodečný vak E-H: vývoj vajíček 5,6,7 meióza fáze megagametogeneze tvorba gamet (n) megaspora ----mitózy----> gameta + ostatní buňky ZV zárodečný vak = samičí gametofyt vývoj samičího gametofytu krytosemenných rostlin Druhová specifita megagametogeneze orientace vajíčka: ortotropní (6) anatropní (7) kampylotropní (8) hemianatropní (9) amfitropní (10) circinotropní (11) 9
Úloha cytoskeletu v zárodečném vaku gametogenese studium gametogenese: gametofytické mutatnty U mutantních rostlin se neprojevují žádné změny na sporofytických částech vajíčka Problémy s vlastním vývojem gametofytu: Mitosy Tvorba vauol Jaderná fúze Celularizace Smrt buňky Reprodukční orgány I Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Vývoj pestíku Vývoj samičího gametofytu Oplození I: kompatibilní opylení II: prorůstání láčky III. úloha funikulárních a mikropylárních signálů 10
oplození oplození Cesta pylové láčky do vajíčka: zaváděcí signály pro prorůstání pylových láček do zárodečného vaku (mutantní rostliny s nefunkčním zárodečným vakem) chemotropické reakce vodícího pletiva úloha vajíček naváděcí systémy, působení do 100 um funikulární signalizace, 50-100 um mikropylární signalizace průnik pylové láčky Synergidy: zdroj difundujícího signálu (100-200um), stačí jediná sinergida Vaječná buňka, centrální buňka = 0 efekt?? Neutralizace atrakčního signálu (vyloučení polyembryonie)?? Cesta pylové láčky do vajíčka Gradient vzniklý na základě difuzního faktoru až na 100 um vzdálenost:? Ca ionty? Plynná molekula ( působení NO známé ze živočišných systémů, ) -by mohla změnit směr růstu láček - NO je produkován peroxisomy pylových láček - NO z externího zdroje dočasné zastavení růstu a reorientace směru růstu (in vitro pokusy) složky extracelulární matrix vodících pletiv čnělky - SCA (stylar cysteine-rich adhesin) -pektiny porogamie: vstup pylové láčky přes otvor klový fylogeneticky původnější, nahosemenné aporogamie: vstup jinými místy -mezogamie(vstup přes poutko a integumenty) Cucumis, Betula, Alnus, Juglans, Coryllus - chalazogamie (vstup chalazou) fylogeneticky nejpokročilejší funikulární vedení mikropylární vedení chemická signalizace, navigace Tisíce láček proniká čnělkou neorganizovaně, ale při vstupu do placenty tvořené 3 oddíly, láčky se uspořádávají do 6 svazků podél přihrádek ( Ophrys lutea) doba mezi opylením a oplozením <1 hod Crepis, Hordeum 24-48 hod většina druhů týdny měsíce Betulaceae, Fagaceae, Orchideaceae 11
Prorůstání láček vodícím pletivem čnělky k vajíčkům (Eucalyptus globulus) degenerace synergidy, vstup pylové láčky do zárodečného vaku, uvolnění 2 spermatických buněk dvojité oplození: objevil Navašin, 1898 n spermatická buňka + n vaječná buňka = 2n zygota 2n embryo n spermatická buňka + 2n centr. jádro zárodeč. vaku = 3n endosperm (nebo polyploidní) jednoduché oplození: vyskytuje se pravidelně (dědičně) nebo sporadicky Orchideaceae druhá spermatická buňka degeneruje, nevzniká sek. endosperm syngamie = plazmogamie + karyogamie účinné mechanismy k zabránění heterospermie nebo polyspermie oplození Dvojí oplození: původ v podmínkách prapůvodních krytosemenných, více jak 1 vajíčko bylo oplozeno v samičím gametofytu Dvojí oplození: genetická výhoda druhé oplození vznik endospermu = zásobárna živin pro vývoj embrya Úspěch oplození: Synchronizace receptivity ve všech orgánech zahrnutých do procesu Opylení je signálem pro biochemické změny v čnělkovém a placentálním vodícím pletivu, v zárodečném vaku Podíl filiformního aparátu a synergid Perisperm - zbytek nucelu (diploidní sporofytické pletivo) pokud není spotřebován během vývoje zárodečného vaku nebo embrya, Piperaceae, Amaranthaceae, Cannaceae, Portulacaceae 12
oplození oplození Špička láčky praská, spermatické buňky se uvolňují, male germ unit disociuje Synergidy apoptoza (někdy i před průnikem láčky) 2 agregáty aktinových filament se organizují během apoptozy synergid - rozprostřou se do blízkosti vakečné buňky - rozprostřou se mezi vaječnou buňkou a centrílní buňkou zárodečného vaku až k antipodám Předpoklad: aktinová vlákna usnadňují cestu spermatickým buňkám Úspěch dvojího oplození: synchronizace obou gametofytů s ohledem na mitotický cyklus Zobrazovací technika + vibrační sonda: Vysoká hladina influxu Ca iontů v blízkosti místa průniku spermatické buňky Ca influx se šíří postupně po celé plasmatické membráně vajíčka jako vlnění a to odpovídá cytologickým změnám indukovaným oplozením Inhibice Ca influxu: Spermatická buńka splynula s buńkou vaječnou Spermatická buńka nebyla iánkorporována Aktivace vajíčka pokračovala Nedošlo ke karyogamii Dynamika Ca 2+ iontů během aktivace vajíčka Oplození in vitro u kukuřice: A,B: proměnlivost hladiny Ca iontů během 40 minut od fuze gamet C: důsledky fuze sledované DIC technikou D: kontrola barvení Dynamika Ca2+ iontů během aktivace vajíčka - model navržený pro kukuřici po oplození in vitro: 1:fuze spermatické buňky a vajíčka 2: indukce lokalizovaného influxu Ca iontů 3: influx probíhá ve vlnách 4: změna Ca 2+ nezbytná pro karyogamii 5: po 1-3 min se zvyšuje hladina Ca iontů v cytosolu 6: tím indukce komplexu reakcí aktivace vajíčka a zygoty 7: obě cesty (2-4) i (5-6) vedou k dalšímu vývoji 13
In vitro a semi-in vitro techniky studia oplození A:vajíčko výjmuté z placenty B, C, D: zárodečný vak In vitro a semi-in vitro techniky studia oplození A,B: vajíčko kultivavované s pylovými láčkami C:D: vajíčka kultivovaná s opylenou čnělkou CC = centrální buňka EC = vaječná buňka ES = zárodečný vak FA = filiformní aparát OV = vajíčko SY = synergidy Měřítko: A = 50um, D = 10 um In vitro a semi-in vitro techniky studia oplození E,F,G: pylová láčka dorazila do mikropyle H: pylová láčka v kontaktu s filiforním aparátem synergid I: pylová láčka v kontaktu s centrální oblastí filiformního aparátu mezi 2 synergidami Porucha condensin complexu porucha kondensace a rozvolňování chromatinu během mitotického dělení A: šešule divokého typu Columbie B,C: šešule E1 -/- E2 +/+ D: šešule E1 +/- E2 -/- E: normální embryo v torpedovitém stadiu F: E1 +/- E2 -/- embryo uvězněné v globulárním stadiu G,H: defekty suspensoru a embrya 14
Mutace swa1 (Slow walker), zasahuje do megagametogenese, do průběhu mitotického cyklu Vývoj vajíčka u divokého typu Vývoj vajíčka v pestíku swa1 rostliny A:vajíčko s degenerovaným zárodečným vakem, B-F: různá stádia vývoje zárodečného vaku (7 buněčný zárodečný vak D), (fuze polárních buněk E), (degenerace antipod) Vývoj vajíčka v pestíku swa1 rostliny G: 2buněčný zárodečný vak, H: 4tyřbuněčný zárodečný vak, I: 8buněčný zárodečný vak, K: oplozené vajíčko s degenerovanými synergidami, L: vajíčko s prvním dělením endospermu 15
Exprese SWA1 v Arabidopsis thaliana v transgenních rostlinách (GUS aktivity) a RNA in situ hybridizace A: kořenová špička B: prašníky a vajíčka C: Pylová zrna D: tetrády E-H: zárodečný vak I: archespory J: megaspora K-N: zárodečný vak pylová embryogeneze (androgeneze) embrya vznikají z pylových zrn buď abnormálním zmnožením vegetativní nebo generativní buňky anebo cestou symetrického dělení mikrospory za vzniku dvou rovnocenných jader, která vstupují do další mitózy embrya jsou haploidní technologie prašníkových kultur, využití při šlechtění rostlin somatická embryogeneze různé části rostlin rostlinné explantáty vytvářejí v kulturách in vitro (agar, živiny, fytohormony) kalus dediferenciací trvalých pletiv, za určitých podmínek se v kalusu zakládají somatická embrya, která jsou morfologicky i funkčně shodná s embryi zygotickými apomixie vznik embrya nepohlavní cestou semena s redukovaným endospermem a embryem často u rostlin parazitických, poloparazitických, u orchidejí Monotropa Burmannia Spathoglothi Striga zygota zvětšování buněk nucelu vznik embryí Poncirus vznik embrya z nucelu, adventivní embryonie 16
zygota Arabidopsis - mutace ABA k dělení zygoty dochází v různou dobu po opylení (Oryza, Crepis několik hodin, Pistacia 2 měsíce), dělení zygoty zpravidla následuje po dělení endospermu, výrazná polarizace zygoty (apikální část jádro, bazální část vakuola) umožňuje její asymetrické dělení na menší buňku apikální (ca) a větší buňku bazální (cb) aktin, tubulin jádro zygoty genová exprese během embryogeneze vakuola Quercus zachovalá degenerovaná synergida synergida Zea Dilleniaceae zygota s haustoriálními výběžky do endospermu mutace ve fázi raného (i) a pozdního (j) srdcovitého embrya, chaotické buněčné dělení embryonální mutace průběh embryogeneze u Capsella Reprodukční orgány I Sexualita vyšších rostlin = projev finální diferenciace Vývoj pestíku Vývoj samičího gametofytu Oplození DĚKUJI ZA POZORNOST 17