Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu peroxidáz v hlízách brambor (Solanum tuberosum L.) Vypracovaná jako výstup projektu 1B 44011 VÝVOJ A TESTOVÁNÍ SYSTÉMU ANALYTICKÝCH METOD PRO PRAKTICKOU CHARAKTERIZACI ODRŮD BRAMBOR REGISTROVANÝCH V ČR Autoři: Mgr. Světlana Sýkorová, CSc. & kol. Srpen 2006

OPTIMALIZOVANÁ METODIKA PAGE PRO ANALÝZU PEROXIDÁZ V HLÍZÁCH BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM L.) Vypracovaná jako výstup projektu 1B 44011 VÝVOJ A TESTOVÁNÍ SYSTÉMU ANALYTICKÝCH METOD PRO PRAKTICKOU CHARAKTERIZACI ODRŮD BRAMBOR REGISTROVANÝCH V ČR Světlana Sýkorová a kol. sykorova@vurv.vz Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 2006 http://www.vurv.cz Text: 2006 S. Sýkorová, E. Matějová, M. Berová Foto: 2006 S. Sýkorová, J. Bradová Grafická úprava: 2006 M. Sýkora, L. Štočková Vydáno bez jazykové úpravy ISBN: 80-86555-91-7

Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu peroxidáz v hlízách brambor (UPOV 2002) obsahující vlastní modifikace řešitelů Obsah: 1. Počet hlíz na test. 4 2. Přístroje a zařízení. 4 3. Chemikálie.. 4 3. 1. Chemikálie pro extrakci proteinů 3. 2. Chemikálie pro elektroforézu 3. 3. Chemikálie pro detekci peroxidáz 4. Roztoky.... 5 4. 1. Extrakční roztoky 4. 2. Zásobní roztoky 4. 2. 1. Pufry a roztoky pro PAGE ph 8,9 pro peroxidázy 4. 3. Barvicí roztoky pro peroxidázy 5. Pracovní postup. 6 5. 1. Příprava vzorků 5. 2. Příprava gelů 5. 2. 1. Příprava gelů pro PAGE ph 8,9 pro peroxidázy 5. 3. Nanášení vzorků 5. 4. Elektroforéza 5. 4. 1. Podmínky PAGE ph 8,9 pro peroxidázy 5. 5. Barvení 5. 5. 1. Barvení peroxidáz 6. Identifikace alel peroxidázových isoenzymů... 8 S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha

Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu peroxidáz v hlízách brambor (UPOV 2002) obsahující vlastní modifikace řešitelů 1. Počet hlíz na test: - pro DUS ( odlišnost, uniformitu a stálost) : 10 hlíz - pro kontrolu identity: 4 hlízy Hlízy by měly být zralé, přednostně sklizené po zaschnutí listů. Hlízy skladované v rozmezí teplot 4 10 C mohou být použity nezávisle na sezóně, dokud nezačnou klíčit. 2. Přístroj a zařízení: centrifuga kryostat zdroj stejnosměrného proudu alespoň na 400 V a 150 ma třepačka (kývačka) na ploché gely vertikální elektroforetický přístroj pro 2 gely Může být použit jakýkoli vhodný přístroj pro elfo, jestliže umožňuje udržování konstantní teploty gelů. Tloušťka gelu by neměla být vyšší než 1,5 mm. Zdroj proudu by měl mít možnost nastavení konstantního proudu nebo konstantního napětí. 3. Chemikálie: Všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší 3. 1. Chemikálie pro extrakci proteinů Amidočerň 10 B Siřičitan sodný Na 2 SO 3 Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 Sacharóza 3. 2. Chemikálie pro elektroforézu 40% Akrylamid roztok (velmi toxický!!) (AA) Persíran amonný (APS) 2% Bisakrylamid roztok (BIS) Bromfenolová modř (BPB) Glycin Sacharóza N,N,N N - Tetramethylethylenediamine (TEMED) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) Terc. amylalkohol (převrstvení gelu) S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 4

3. 3. Chemikálie pro barvení peroxidáz Dianisidin-2HCl (extrémně toxický!!) Glycerol 30% H 2 O 2 Dihydrogenfosforečnan sodný monohydrát (NaH 2 PO 4. 1 H 2 O) 4. Roztoky 4. 1. Extrakční roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka Siřičitan sodný Na 2 SO 3 5,00 g lze skladovat při 4.1.1. Extrakční roztok A Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 3,75 g 6 C 100 ml 4.1.2. Extrakční roztok B 4.1.3 Extrakční roztok C Sacharóza Amidočerň 10B Extrakční roztok A Extrakční roztok B 500 g 0,3 g do 1000 ml 10 ml 100 ml lze skladovat při 6 C denně čerstvý 4. 2. Zásobní roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka 4.2.1.2 40% roztok AA AA 40 g do 100 ml Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok 4.2.1.3 2 % roztok BIS BIS 2 g do 100 ml Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok 4.2.1.4 2 % roztok APS APS 1 g do 50 ml Denně čerstvý S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 5

4. 2. 1. Pufry a roztoky pro PAGE ph 8,9 pro peroxidázy č. Roztok Složky Množství Poznámka Pufr na dělicí TRIS 75,4 g Upravit ph na 8,9 4.2.2.1 (spodní) gel do 1000 ml přidáním HCl 4.2.2.2 Pufr na zaostřovací (horní) gel 4.2.2.3 Zaostřovací gel 4.2.2.4 Elektrodový pufr TRIS Bromfenolová modř Pufr 4.2.2.2 40% AA 2 % BIS Sacharóza TRIS Glycin 16 g 100 mg do 1000 ml 280 ml 45 ml 73 ml 150 ml 80 g 5,2 g 3,5 g do 1000 ml Upravit ph na 6,7 přidáním HCl použít jako elektrodový, dále neředit! 4. 3. Barvicí roztoky pro peroxidázy č. Roztok Složky Množství Poznámka Barvicí pufr pro NaH 4.3.4. 2 PO 4 x 1 H 2 O 20,7 g do peroxidázy deionizovaná voda 1000 ml 4.3.5. 1% Dianisidinový roztok 4.3.6. 2% glycerin Dianisidin-2HCl deionizovaná voda Glycerol deionizovaná voda 1 g do 100 ml 20 g do 1000 ml může být skladován při 6 C 1 týden 5. Pracovní postup 5. 1. Příprava vzorků Hlízy důkladně zmrazit na -20 C a pak nechat rozmrazit při pokojové teplotě. Pro analýzu každé hlízy je potřebná 2 ml centrifugační kyveta obsahující 0,4 ml extrakčního roztoku C (4.1.3). Rozmrzlé hlízy se rozříznou a vymáčknou. 1,5 ml šťávy se zachytí do výše uvedené kyvety a promíchá s extrakčním roztokem C (třepání). Dále se centrifuguje 15 minut při 3 000 ot.min -1 a 10 C. Supernatanty se přenesou do nové prázdné centrifugační kyvety a zmrazí se pro pozdější provedení elfo. S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 6

5. 2. Příprava gelů 5. 2. 1. Příprava gelů pro PAGE ph 8,9 pro peroxidázy - Sestavit suché a čisté gelové kazety - Každý gel se skládá z dělicího a zaostřovacího gelu Příprava cca 100 ml dělicího gelu (T: 5,5%; C: 4,4%) - Za pomalého míchání jsou přidávány jednotlivé složky (pro 2 plotny OWL): 30 ml gel. pufru 4.2.2.1 7 ml deionizované vody 7 ml 4.2.1.2. (40 % AA) 6,5 ml 4.2.1.3. (2% BIS) Polymerace se nastartuje přidáním: 50 μl TEMED 3 ml 4.2.1.4. (2% APS) - Gely se pečlivě nalijí tak, aby se netvořily bublinky vzduchu a polymerace probíhá alespoň 15 minut při pokojové teplotě. Gelové kazety se naplní 30 mm pod okraj (prostor pro 30mm vrstvu zaostřovacího gelu), povrch gelu se pečlivě opatrně převrství terc. amylalkoholem pomocí injekční stříkačky. Po skončení polymerace se povrch gelu omyje deionizovanou vodou a osuší filtračním papírem a kazety se až po okraj naplní zaostřovacím gelem. - Příprava zaostřovacího gelu: Přidávat a pomalu míchat: 15 ml roztoku 4.2.2.3 (obsahuje 4.2.1.2, 40% AA, 2% BIS,. deion. voda, sacharoza) 60 μl TEMED 375 μl 4.2.1.4. (2% APS) - Gely se pečlivě nalijí tak, aby se nevytvořily vzduchové bublinky, vloží se hřebeny pro tvorbu jamek a polymerace probíhá alespoň 15 minut. Potom se hřebeny opatrně vyjmou a jamky v gelu se promyjí a naplní elektrodovým pufrem. 5. 3. Nanášení vzorků - Pro elektroforézu peroxidáz je nanášeno do každé jamky 7 μl extraktu S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 7

5. 4. Elektroforéza 5. 4. 1. Podmínky PAGE ph 8,9 pro peroxidázy za začátku 40 ma*, potom 80 Elektrodový pufr 4.2.2.8. Proud /1 gel (11 cm šířka, 1 mm tloušťka)/ tj. ze začátku 0,36 ma/mm 2, potom 0,72 ma/ mm 2 ma** Napětí max. 300 V Teplota 5 C Směr migrace od katody (-) k anodě (+) Doba dělení: Zaostření cca 30 minut*, další dělení 120 minut** 5. 5. Barvení: 5. 5. 1. Barvení peroxidáz: Gely z PAGE ph 8,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky naplněné 150 ml barvicího pufru (4.3.4.), který má pokojovou teplotu a těsně před vložením gelu k němu bylo přidáno 7,5 ml 1 % vodného roztoku dianisidinu (4.3.5.). Po 30 sec se reakce nastartuje přidáním 200 μl 30% H 2 O 2. Gely se inkubují na kývací třepačce cca 15 minut (pozorovat vývoj oranžového zabarvení pruhů). Doba barvení se pohybuje mezi 10 a 20 minutami optimálně 15 minut. Pro odbarvení se gely inkubují na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále se inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu. 6. Identifikace alel peroxidázových isoenzymů Peroxidázové isoenzymy hlíz brambor jsou monomerické enzymy. Pozice jednotlivých isoenzymů mají být kalibrovány odrůdou Amigo. Odrůda Amigo má vykazovat dva pruhy 59 + 68. Vzhledem k tomu, že odrůda Amigo nebyla k dispozici, prováděli jsme kalibraci na odrůdy Hansa, Jetta, Corine a Tomensa. Genotyp Příklad Znač. Genotyp Příklad Znač. a Hansa 1 f Diana 7 b Corine 2 g Thomana 6 c Tomensa 3 h Kanjer 8 d Amigo 4 j 1 e Jetta 5 S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 8

Obrázek genotypů peroxidáz a h Genotypy označené hvězdičkou vykazují snižující se genovou dávku v jednotlivých peroxidázách. Mohou být interpretovány jako kombinace mezi aktivními alelami a nullalelou. Takové genotypy jsou považovány za genotypy s plnou genovou dávkou. Genotyp j dává zymogramy blízké ke genotypu a; takže genotypy a a j nejsou označeny jako rozdílné. Oba genotypy mají tutéž značku :1 Jako etalony jsme zařadili odrůdy: Hansa - typ a, Jetta typ e, Corine typ b,tomensa typ c Odrůda Diana (vzorek, který jsme měli k dispozici) neměla typ f nebyla tedy použitelná jako etalon. Elektroforetické mobility sledovaných alel byly však podstatně jiné, než je uváděno v původní metodice. Uvádíme námi zjištěné mobility spolu se zástupci odrůd, u nichž byly nalezeny: Alela Odrůda REM a Hansa 95,5 j Bionta 95,5 b Corine 91,1;95,5 b* Vineta 91,1;95,5 c Tomensa 87,6;95,5 c* Kornelie 87,6;95,5 d Inova 85,3;95,5 d* Krasa 85,3;95,5 e Jetta 82,5;95,5 e* Rosara 82,5;95,5 f nezastoupeno g Sante 84,5;91,0;95,5 h Vital 84,5;88,2;95,5 Alely označené hvězdičkou se od původních liší pouze intenzitou vyšší intenzita pruhu je označena tučně (viz obrázek 1) S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 9

Obrázek 2: Ukázka spektra peroxidáz vybraných odrůd brambor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 Red Scarlett (b); 2,10,12 Corine (b); 3 Amylex (j); 4,6,8,15 Tomensa (c); 5 Delikat (d*); 7 Krumlov (j); 9 Tegal (j); 11 Amylon (j); 13 Hansa (a);14 - Bettina (a) Obrázek 3: Ukázka spektra peroxidáz vybraných odrůd brambor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 Fresco (d); 2, 10 Tomensa (c); 3,6 Jetta (e); 4 Sante (g); 5 Provento (a); 7 Vital (h); 8 Vitesse (b); 9 Corine (b); 11 Hansa (a); 12 Rosara (e*); 13 Inova (d); 14 Magda (d); 15 Lenka (d) S. Sýkorová & kol. VÚRV Praha 10