Green Fluorescent Protein 1
GFP Aneb od zeleného fluoreskujícího proteinu jedné medúzy k pokročilým aplikacím v molekulární biologii a neurovědám. cestou přes krystalografii, biochemii, spektroskopii, genové inženýrství, bakteriofágy, palindromy k Nobelově ceně a Googlu. Varování: vzděláním jsem fyzik, nikoli biolog či chemik O GFP jsem poprvé slyšel, když jsem infiltroval přednášku biologie buňky na PřF UK (1999). 2
GFP Úvod Zeleně fluoreskující protein. Vyskutuje se např. u pacifické medúzy Aequoria victoria. Nativní funkce GFP je převod modrého chemiluminiscenčního světla jiného proteinu (aequorin) na zelené fluoreskující světlo (Förster resonance energy transfer, FRET). Jde o nezářivý proces přenosu energie mezi dvěma molekulami v těsné blízkosti, které mají doplňkové emisní a absorpční fluorescenční spektra. 3
GFP Izolace proteinu 1962: Extrakce z lyzátu z několika tisíců (10k) jedinců pacifické medúzy, Osamu Shimomura. I v současnosti je výzkum dalších fluorescenčních proteinů u divokých druhů (koráli) omezen náročnostíči financováním podobného základního výzkumu. GFP svítí jasně zeleně v UV, v měkkém světle slabě nažloutlý, ve slunečním světle lehce zelený. Pojmenován GFP 1969. Proč je důležotější GFP než modrý aequorin? Aequorin svítí pouze za přítomnosti Ca++. V následujících letech studována struktura, spektra a chování GFP. 4
GFP příprava genu Klonování: 1992, Douglas Prasher získal cdna (complementary DNA, vytvořená dle mrna, podle které se protein vyrábí na ribosomech), byť s drobnou chybou (několik aminokyselin chybělo). Financování projektu skončilo, ale vzorek poslán jiným laboratořím. Martin Chalfie: ukázal, že GFP lze exprimovat jako funkční transgen v bakteriích a vyšších organismech (1994). Nebylo vůbec samozřejmé, že GFP bude svítit bez pomoci jiných proteinů z medúzy! Skutečný průlom, který umožnil aplikace v molekulární biologii. 5
GFP Přenos genu Gen nejprve přenesen do bakterie Escherischia coli (1994). Nebylo vůbec zřejmé, zda protein bude svítit i v jiném organismu, zda není zapotřebí pomocných proteinů z medúzy či specifických posttranslačních modifikací. Následně přenos do vyšších organismů a jako přídavek ke genům kódujícím protein, jehož lokalizaci, expresi, funkci, interakce či kinetiku chceme zkoumat (proteinová značka), Chimeric proteins. Exploze aplikací a nových možností zkoumání buněčných struktur in vivo. Příklad: Průhledný červ cenorhabditis elegans. Již dlouho používaný genetický model. Snadné značení a pozorování struktur pomocí GFP: např. záměna genu GFP za hmatové receptory či připojení za jiný protein: GFP toleruje připojení a neztrácí schopnost svítit, a sledovaný protein si také často zachovává funkci. 6
GFP Struktura I V krystalu dimer, každá jednotka má 238 aminokyselin. Absorbuje v oblasti kolem 395 nm (modrá). Vyzařuje na 508 nm (zelená). Uprostřed soudkovitého útvaru 30 Å x 40 Å spontánně cyklizací vzniká funkční jednotka chromofor, chráněný před radikály uprostřed soudku. Unikátní v tom, že se sám vytvoří z proteinů, nejsou potřeba jiné faktory či pomocné sloučeniny. 7
GFP Struktura II Fluorophore originates from an internal Ser-Tyr- Gly sequence which is post-translationally modified to a 4-(p-hydroxybenzylidene)- imidazolidin-5-one structure Shimomura (1979)částečně rozložil denaturovaný GFP a analyzoval zbytek, který ještě svítil. Nutná oxidace Tyr66 kyslíkem. Kyslík pak však nesmí být přitomen pro funkci flourescence. Struktura odhalena pomocí rtg. difrakční analýzy krystalu purifikovaného wild type GFP. 8
GFP Formace fluoroforu I Roger R. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 1998 67: 509-44 9
GFP Formace fluoroforu II Roger R. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 1998 67: 509-44 10
GFP Exprese s jiným proteinem Inserce genu pro GFP mezi gen kódující určitý protein a jeho stop kodon. 11
GFP Cílené mutace GFP divokého typu (wild-type, wt-gfp) nefunguje dobře při vyšší teplotě (obtížné protein dobře složit). Medúze v chladné vodě to nečiní problém, biologickým aplikacím ano :-) Proto vyvinuty cíleně zmutované varianty: stabilnější při 37 o C. Např. mutace S65T GFP (R. Tsien): 4x rychlejší folding (poskládání). Jiný, teplotně stabilnější: (enhanced) EGFP. Navíc různé barevné modifikace: Red fluorescence protein, blue, yellow, cyan (κυανoῦς, modrý), red (2008) (EGFP, EBFP, EYFP ) 12
GFP Spektra Různé spektrální charakteristiky (absorpční plnou čarou, emisní čárkovaně). (a) Wild type (b) Emerald (c) H9-40 (d) Topaz (e) W1B (f) P4-3 13
Fúze GFP s různými proteiny GFP připojitelné (v rámci fůze genů) k N i C koncům polypeptidů. (A) EBFP2-mito-N-7 (human cytochrome C oxidase subunit VIII; mitochondria); (B)mCerulean-paxillin-N-22 (chicken; focal adhesions); (C) mtfp1-actin-c-7 (humanβ-actin; filamentous actin); (D)mEmerald-keratin-N-17 (human cytokeratin 18; intermediate filaments); (E) superfolder GFP-lamin B1-C-10 (human lamin B1; nuclear envelope); (F)mVenus-Cx43-N-7 (rat -1 connexin- 43; gap junctions); (G) YPet-EB3-N-7 (human microtubule-associated protein; RP/EB family); (H) mko-golgi-n-7 (N-terminal 81 amino acids of human β-1,4- glactosyltransferase; Golgi complex); (I) tdtomato-zyxin-n-7 (human zyxin; focal adhesions); (J) TagRFP-tubulin-C-6 (human - tubulin; microtubules); (K) mcherry-vimentin-n-7 (human vimentin; intermediate filaments); (L) mplum- -actinin-n-19 (human nonmuscle; cytoskeleton). (M-Q) Fusion of megfp with human histone H2B (megfp-h2b-n-6). 14
Fúze GFP s různými proteiny Dělení buňky: Fusion of megfp with human histone H2B (megfp-h2b-n-6), jedna ze stavebních součástí buněčného chromatinu (buněčná jaderná hmota). (M) interphase; (N)prophase; (O) prometaphase; (P)metaphase; (Q) anaphase. 15
Aplikace FP Vizualizace buněčných struktur. Studium exprese proteinů (zda a kde je v daných a jakých buňkách produkován, za jakých podmínek, v jaké fázi, v jakém množství). Studium interakcí proteinů pomocí rezonančího přenosu energie (FRET) mezi CFP a YFP. CFP je donor, po excitaci může energii nezářivě předat YFP. Jsou-li oba v roztoku volné, převažuje v UV fluorescence CFP. Pokud se přiblíží (např. jako přívěšky membránového proteiny a protilátky), je vidět spíše fluorescence akceptoru CFP. Zdroj: Wiki. 16
Interakce proteinů FRET (nezářivý přenos energie) mezi dvěma různými GFP. Každý GFP vázán na jiný protein. Studium proteinových interakcí: změna fluorescence, když jsou blízko. Zde dokonce fúzovaný protein se dvěma GFP, studium změny konformace v závislosti na koncentraci Ca++ iontů: efektivně lze měřit koncentraci vápníku uvnitř buňky: Ca++ velice významný posel. 17
Interakce proteinů Calmodulin (Calcium modulated protein) se v přítomnosti Ca++ iontů váže na jiné protein, např. na tzv. M13, který je jinak bez tvaru. Přivěšením GFP na Calmodulin a M13 lze studovat, zda a jak se proteiny k sobě přiblíží. Následně lze vytvořit chimérický protein, který jako celek slouží k měření koncentrace Ca++. Tento Cameleon lze modifikovat: přidat signál pro transport do jádra etc. 18
Crazy GFP 19
Pokročilé aplikace Myší mozek: brainbow, konfokální fluorescenční mikroskopie. Náhodné kombinace barev v jednotlivých neuronech pomocí náhodné exprese několika fluorescenčních proteinů. Vizualizace individuálních neuronů, synapsí, propojení. 20
Brainbow Cíl: Zobrazit jednotlivé neurony různými barvami. Důvod: poznat lépe strukturu a propojení neuronů. Doposud použito: Zkřížení dvou linií myší s různě barevnými XFP. Použití chimérických exemplářů (jedno embryo splynutím kmenových buněk více jedinců). Využití crossing-overu. Ale nevýhody: obtížné, omezený počet barev. Ingredience pro pochopení brainbow konstrukce: DNA, genové inženýrství. Cre/lox, sekvenčně specifická rekombináza z bakteriofága. Palindrom, promotor. Model, křížení 21
DNA Deoxyribonukleonová kyselina: ribóza (cukr) + báze + fosfát. 22
Cre-lox systém Objeven u bakteriofága (bakteriální virus) zvaného P1. Základní ingredience: Enzym (protein) zvaný Cre (Causes Recombination), a specifický úsek DNA LoxP. LoxP DNA sekvence: 13bp 8bp 13bp ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT TATTGAAGCATAT CGTATGTA ATATGCTTCAATA Jde o částečný palindrom: modrá sekvence čtená pozpátku je komplementární k červené na daném vlákně (A-T, G-C). Sekvenci umí rozpoznat enzym Cre, a umí vystřihnout DNA mezi dvěma páry LoxP: http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/creloxp.html 23
Palindromy Palindromy: slova/věty, které jsou stejné čteny oběma směry: nezasazen, nepochopen Dne moto: Palindrom i spáchá psí mord, Nil a potom End. Chemie i mech. Jáva horko má, mokro Havaj. Tele velí mile velet. Šok v ph = HP v koš. Telecí v separé si žere režisér a pes více let. Eva, can I see bees in a cave? Was it Eliot's toilet I saw? Swap God for a janitor, rot in a jar of dog paws. Red rum, sir, is murder. Hudební palindromy, obrazové, zvukové Zdroj: Wiki 24
Hudební Palindromy - skladba pro dva nástroje, hraná jednou klasicky a jednou vzhůru nohama. d g d h g g d g h d d h g d g g h d g d - párování podobně jako u DNA palindromů! - jakási grafická verze palindromu. 25
DNA Palindromy DNA palindromy jsou časté a významné. Proč je důležitý palindrom? Možnost opravy podle druhé kopie sekvence (lidský Y chromozom). Možnost vystřižení úseku mezi palindromickými sekvencemi po spárování palindromické sekvence. Velice specifické místo, rozeznáváno proteiny vázajícími se na DNA, ty jsou často dimery, proto dvě stejné sekvence. 26
Brainbow 1.0 Geny pro tři různé FP proteiny (RedFP, YellowFP, CyanFP), s inzercemi dvou různých Lox sekvencí: možnost vystřižení přidáním enzymu Cre. LoxP a Lox22272 jsou různé sekvence, Cre stříhá jen mezi stejnými. Dva různé způsoby sestřihu vedoucí k jinému výsledku, další sestřih znemožněn. Expromován vždy jen jeden FP v těsné blízkosti Promotoru. Speciální konstrukt Brainbow vložen do DNA buněk v kultuře. Buňky nejprve svítí červeně. Po aktivaci Cre změna barvy. 27
Aktivace Cre Jak podat či dodat enzym Cre? Zkřížením Brainbow myši s linií myší, která nese gen pro fúzní protein Cre-ERT2. ER: estrogen receptor, není v membráně (estrogen jí prochází). LBD: ligand binding domain ERT2: je zmutovaný vazebná doména ER, aby jej neaktivoval přirozený estrogen. Působení Cre je indukovatelné podáním hormonu tamoxifenu: navázáním na receptor, tamoxifen indukuje změnu receptoru, z něhož se část disociuje a je transportována do jádra. Cre je přivěšen k této jednotce, a dostane se tedy přesně tam, kde je potřeba. 28
Brainbow 1.0 Snímek pořízen třikrát s různými vlnovými délkami laseru, aby byl vždy excitován pouze jeden specifický XFP. Celkový obrázek je složenina snímků z různých emisních oblastí Vzorek zamražen na -20 o C, poté proskenován laserovým paprskem, fluorescence nastává vždy jen v rovině fokusace laseru, a na stejnou rovinu je zaostřeno hledí mikroskopu (dvě stejná ohniska, konfokální mikroskopie). 29
Konfokální mikroskopie http://www.zhanpingliu.org/research/biovis/biovis.htm http://scienceblogs.com/retrospectacle/2007/11/confocal_image_of_cochlea_wins.php 30
Brainbow 1.1 Složitější konstrukt s celkem třemi různými Lox páry rozmístěnými podél speciálně navrženého úseku DNA. V kultuře se po aktivaci Cre enzymu opět objeví nové barvy. 31
Brainbow 2.0 Rekombináza Cre ale umí i invertovat (obrátit) sekvenci. Další možnost, jak zvýšit počet barev. Ale nejprve jednoduchý test: 32
Brainbow 2.1 Čtyři možné výsledky (a tedy i barvy) po indukci Cre. Kombinace vyštěpění a transpozice části Brainbow konstrukce. Další navýšení barev: jednoduše vpravením více Brainbow konstruktů do genomu. 33
Brainbow 2.1 Až 90 různých barev, zde zobrazení kůry a hippocampu. 34
Brainbow 2.1 Konce motorických neuronů (axony). 35
Nobelova cena za chemii 2008 1/3 1/3 1/3 Osamu Shimomura - extrakce GFP, struktura. Martin Chalfie - Transgenní přenos GFP Roger Y. Tsien - vylepšení GFP 36
Závěr GFP je unikátní proteinová značka pro studie in vivo. Obrovské množství aplikací přesahující prosté stopování lokalizace: možnost studia interakcí, měření koncentrace, vzájemné orientace proteinů Nezbytná je kombinace mnoha oborů a podoborů: Objev medúzy, extrakce proteinu, porozumění spektroskopii, mechanismu vzniku a struktuře chromoforu a vlastností fluorescence. Klonování, přenos, transgenní druhy, modifikace pro biologické aplikace. Google a Wikipedia nestačí! (J. Grygar) Internet, knihovny, přístup ke kvalitním placeným časopisům Pdf/html jsou fajn, ale vytištěný článek, do kterého se dáčmárat u kafe nebo jej číst v autobuse je něco jiného:) A nestačí jen konzumovat informace, je třeba klást si otázky a hledat odpovědi! 37
Otázky Toxicita GFP? http://www.nature.com/nm/journal/v6/n5/full/nm0500_483b.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10403831 Odbourávání (metabolizace)? Proč je u medúzy jeho funkce spřažena s jiným modře fluoreskujícím proteinem? Jak je to evolučně výhodné? K zamyšlení: problém škodlivosti UV záření (nutné pro aktivaci fluorescence GFP) a přesné vizualizace buněčných struktur (konfokální mikroskopie). 38
Zdroje NC Shaner, GH Patterson, MW Davidson: Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120 (2007) 4247-60: http://jcs.biologists.org (volně přístupný!:) Disertace Frank Thomas Wunderlich: http://deposit.ddb.de/cgibin/dokserv?idn=97557230x&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=97557230x.pdf Placené / přístupné z knihoven: http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/gfp-ww/timeline.html Roger R. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 1998 67: 509-44 Nature 450, 56-62 (1 November 2007): Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Letters to Nature, Nature 388, 882-887 (28 August 1997): Fluorescent indicators for Ca2+based on green fluorescent proteins and calmodulin Web: http://hvd.ens-lyon.fr/human_virology_dpt http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/mouse/ http://www.shcc.org/growth_plate.htm http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/index.html http://en.wikipedia.org/wiki/green_fluorescent_protein 39