Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Podobné dokumenty
Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Metody studia exprese mrna. jádro a genová exprese 2007

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Mikročipy v mikrobiologii

Centrum aplikované genomiky, Ústav dědičných metabolických poruch, 1.LFUK

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

Hybridizace nukleových kyselin

AUG STOP AAAA S S. eukaryontní gen v genomové DNA. promotor exon 1 exon 2 exon 3 exon 4. kódující oblast. introny

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

Sekvenování nové generace. Radka Reifová

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

NGS analýza dat. kroužek, Alena Musilová

Charakterizace hybridních trav pomocí cytogenetických a molekulárních metod

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Klonování DNA a fyzikální mapování genomu

Genové knihovny a analýza genomu

studium množství určitého transkriptu v daném vzorku a v množství dané molekuly mrna v dané buňce a v daném

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Mgr. Veronika Peňásová Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Referenční lidský genom. Rozdíly v genomové DNA v lidské populaci. Odchylky od referenčního genomu. Referenční lidský genom.

co to je genový čip (DNA microarray)? DNA šikování

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Molekulární základy dědičnosti. Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Amplifikační metody umožňují detekovat. k dispozici minimálně kopií DNA,

Metody studia genové exprese

PŘEHLED SEKVENAČNÍCH METOD

Na rozdíl od genomiky se funkční genomika zaměřuje na dynamické procesy, jako je transkripce, translace, interakce protein - protein.

6. Kde v DNA nalézáme rozdíly, zodpovědné za obrovskou diverzitu života?

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Sekvenování nové generace. Radka Reifová

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Polymorfizmy detekované. polymorfizmů (Single Nucleotide

Genetický polymorfismus jako nástroj identifikace osob v kriminalistické a soudnělékařské. doc. RNDr. Ivan Mazura, CSc.

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin

genové čipy co to je genový čip (DNA microarray)? DNA šikování 15/03/2010

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

DNA mikročip je mikročip složen z krátkých DNA sekvencí (oligonukleotidů)

2 Inkompatibilita v systému Rhesus. Upraveno z A.D.A.M.'s health encyclopedia

VÝVOJ DNA ČIPŮ PRO DETEKCI GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ORGANISMŮ

KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Exprese genetického kódu Centrální dogma molekulární biologie DNA RNA proteinu transkripce DNA mrna translace proteosyntéza

Metody detekce poškození DNA

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE, 1. LÉKAŘSKÁ FAKULTA ZDRAVOTNICKÁ TECHNIKA SOUČASNÉ METODICKÉ PŘÍSTUPY A APLIKACE TECHNOLOGIE DNA ČIPŮ

Molekulárn. rní. biologie Struktura DNA a RNA

Ústav experimentální medicíny AV ČR úspěšně rozšířil přístrojové vybavení pro vědce z peněz evropských fondů

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

Masivně paralelní sekvenování

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR

Sekvenování příští generace (Next Generation Sequencing, NGS)

Molekulární genetika

Metody molekulární biologie

Genetické markery, markery DNA

Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely

RIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

Hybridizace. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.

Moderní metody analýzy genomu

Laboratoř molekulární patologie

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Masivně paralelní sekvenování

Elektroforéza Sekvenování

Moderní metody analýzy genomu

Genotypování: Využití ve šlechtění a určení identity odrůd

SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 12. Shrnutí,

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN

Písemná zpráva zadavatele

"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Mendelova genetika v příkladech. Genetické markery

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 11. Next generation sequencing (NGS)

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně

Exprese genetické informace

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

velké fragmenty střední fragmenty malé fragmenty

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 10. Další metody

MTS spol. s r.o. NEJLEPŠÍ GENETIKA NEJLEPŠÍ KNOW-HOW Už více jak 20 let

Modifikace PCR, sekvenování. Molekulární biologie v hygieně potravin Molekulárně biologická analýza potravin Přednáška 5, 2017/18, Ivo Papoušek

Bioscience Imaging Centre

Transkript:

Investice do rozvoje vzdělávání Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Investice do rozvoje vzdělávání Genomika (KBB/GENOM) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Investice do rozvoje vzdělávání Analýza transkriptomu Ing. Hana Šimková, CSc. Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Investice do rozvoje vzdělávání Cíl přednášky - seznámení s moderními metodami komplexní analýzy transkriptomu Klíčová slova - Transkriptom, cdna microarraye, oligonukleotidové arraye, profilování exprese pomocí kuliček, SAGE, masivně paralelní sekvenování Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE Transkriptom úplný soubor transkriptů v jejich reálném relativním zastoupení v určitém typu buněk nebo tkáně za definovaných podmínek Transkriptomika srovnávací studie transkriptů Metody pro studium transkripce: A) metody stanovující transkripční aktivitu spojenou s daným genem B) metody analyzující množství určitého transkriptu Metody studující hladiny exprese všech genů v organismu A) Paralelní analýza genové exprese - pro porovnání hladin exprese mezi tkáněmi cdna microarraye a za určitých podmínek oligonukleotidové arraye - nedávají informace o konkrétní hladině exprese B) Sériová analýza genové exprese SAGE - ke stanovení absolutních hladin transkripce

MICROARRAYE (MA) Využití: - k nalezení genů diferenciálně exprimovaných za různých podmínek k nalezení kandidátních genů ů (např. ř souvisejících jííhs chorobami) k anotaci funkce genu k definování genetických drah ke kvantifikaci transkripční variability např. v evolučních studiích Důležité navržení designu experimentu: - formulace biologické otázky - navržení platformy - konzultace se statistikem kolik opakování je potřeba (rozumné 6-10 hybridizací) Opakování a) jednotlivých kroků, spotů b) použitých biologických vzorků (např. různých jedinců)

Princip: cdna microarray - na mikroskopické sklíčko se kovalentně navážou malá množství DNA, reprezentující tisíce genů (= sondy, probes) a ta jsou hybridizována s cílovými molekulami (= target) ) cdna, mrna, které byly označeny fluorescenčními barvičkami. Intenzita fluorescenčního signálu (odpovídá četnosti transkriptu ve vzorku) se měří a) ve vztahu ke kontrolnímu referenčnímu vzorku (např. zdravý jedinec) poměr (ratio) intenzity fluorescence červené (Cy5) a zelené barvičky (Cy3) - spolehlivější b) ve vztahu k signálům z jiných sond relativní intenzita referenční vzorek studovaný vzorek mrna cdna Gibson a Muse, 2004

cdna microarraye Fragmenty cdna amplifikované pomocí PCR (ESTy) jsou naneseny s vysokou hustotou (10-50 teček/mm 2 ) na mikroskopické sklíčko nebo nylonovou membránu a hybridizovány s radioaktivně nebo fluorescenčně značenou cílovou molekulou (cdna, RNA). Místo ESTů mohou být produkty PCR na genomické DNA s primery specifickými pro jednotlivé geny. Ideálně každý nanesený EST by měl reprezentovat 1 gen nebo 1 variantu sestřihu. Taková sbírka ESTů se nazývá unigene set. Jednotlivé kroky: 1. Amplifikace souboru ESTů nejdražší 2. Nanesení na sklíčko nebo membránu - po cca 10 ng - speciálně upravený povrch DNA se na něj kovalentně váže Gibson a Muse, 2004

- vyráběny na zakázku - neprovádí se PCR amplifikace Microarraye dlouhých oligonukleotidů (50-70 bází) Princip: - na sklíčko nanášen 1 řetězec DNA o stejné délce a obdobném zastoupení jednotlivých bází umožňuje jednotné podmínky hybridizace. Lepší kontrola jednotlivých vzorků. K navrhování oligonukleotidů např. program OligoArray eliminuje křížovou hybridizaci. Nanášení vzorků: a) jako u cdna b) syntéza oligonukleotidů přímo na sklíčku Agilent Technologies až 44 000 oligonukleotidů na sklíčku

- Affymetrix Gene Chip Genové čipy s krátkými oligonukleotidy Princip: Sondy série 25-bázových oligonukleotidů navržených počítačem tak, aby reprezentovaly všechny dostupné ORF. Každý gen reprezentován 10-20 různými oligonukleotidy. Hybridizace za velmi přísných podmínek. Pro kontrolu vedle vlastní sondy nanesena sonda s 1 zaměněnou bází (= mismatch reference) vlastní intenzita signálu se vypočítá na základě rozdílu intenzity pro perfect match a mismatch. Vypočítá se průměr pro všechna oliga příslušející 1 genu. Gibson a Muse, 2004

Genové čipy s krátkými oligonukleotidy Konstrukce: - na silikonovém čipu a za použití kombinatoriální chemie (cyklické přidávání A, T, G, C, na syntézu 25-merů 100 reakcí) Srovnání oligoarrayí s cdna arrayemi: větší hustota genů, i pro geny, které nejsou v cdna knihovně, menší variabilita mezi čipy, obsahuje kontroly pro mismatch, možnost porovnávat výsledky ýldk mezi ilb laboratořemi, tř komerčně č ě dostupné nejsou dostupné pro všechny organismy, drahé, nemůžeme si je upravit dle svých potřeb. Můžou vést snadněji ke křížovým hybridizacím, více ovlivněny polymorfismem. Gibson a Muse, 2004

Značení a hybridizace cílových molekul A) Přímé značení: cdna připravená z mrna reverzní transkripcí obvykle z polyt primeru. Nejčastěji se inkorporují barvičky Cy3 a Cy5 navázané na nukleotidu. Případně nukleotidy s aminoallylovou skupinou, na kterou se po reakci naváže barvička účinnější. Nevýhoda vyžaduje velké množství mrna. B) Značení přes amplifikovanou a ou RNA cdna připravena z mrna za pomoci primeru skládajícího se z polyt+ T7 promotoru - z něho syntéza arna in vitro transkripcí (T7 RNA polymerázou). Zabudovávají se nukleotidy, které mají připojenu aminoallylovou skupinu nebo biotin. Na ten se po hybridizaci naváže streptavidin nesoucí barvičku. Stačí 100 ng RNA. mrna cdna sonda na sklíčku arna Gibson a Muse, 2004

C) Nepřímé značení - primer pro syntézu cdna (polyt) má připojený tzv. substrát (3DNA). Ten je po hybridizaci rozeznán protilátkou s navázanými fluorofory (barvičkami). cdna Gibson a Muse, 2004 D) Radioaktivní značení - pro microarraye na membránách. Sonda se dá odmýt 1 membrána se dá použít až 6x. Levnější. Hybridizace a odmývání za přísných podmínek

Detekce Vizualizace hybridizované cílové sekvence (target) na MA: - snímání fluorescence indukované laserem - konfokální laserový skenr - CCD kamera Gibson a Muse, 2004 Následuje počítačové vyhodnocení získaných fluorescenčních signálů.

Využití oligonukleotidových microarrayí pro genetické mapování - genomický nástroj pro mapování (vysoko-kapacitní metoda) - nový typ molekulárního markeru: single feature polymorphism (SFP, polymorfismus v jednom znaku) - hybridizací genomické DNA s oligonukleotidovými arrayemi na základě rozdílu v intenzitě signálu detekovány sekvenční polymorfismy (porovnáním signálu pro perfect match a mismatch) zejména SNP a inzerce/delece - použity pro genotyping g a sestavení genetických map Arabidopsis Affymetrix expresní array 103 860 perfect match (PM) oligonukleotidů dávajících jeden signál (PM features) 4 000 SFP markerů v rámci jedné mapovací populace

Profilování exprese s použitím mikrokuliček - místo sklíček použity 3 µm kuličky Systém BADGE na různobarevných kuličkách ( unikátní barevný kód) navázány oligonukleotidové sondy. Po hybridizaci s fluorescenčně značenými cílovými cdna se provede analýza pomocí dvoulaserového průtokového cytometru. Vyhodnocuje se jednak barevný kód, jednak intenzita fluorescence navázané cdna. Mikrokuličky mohou být navázány také na optických vláknech systém Illumina Bead Array. Gibson a Muse, 2004

SAGE (serial analysis of gene expression) - metoda pro určení absolutní četnosti každého transkriptu exprimovaného v populaci buněk. NlaIII -bio -bio -bio -bio Pro každý gen se odvodí unikátní 15-bp sekvenční visačka (tag). Visačky pro řadu genů se napojí za sebe (konkatenace) a sekvenují se naráz. V 1 sekvenační reakci až 50 visaček. Pro každý vzorek je potřeba minimálně 50 000 tagů, abychom dosáhli saturace saturovaná kolekce každý exprimovaný gen je v kolekci zastoupen min. 2x. Hodně drahé (saturovaná kolekce min. 2000 $) vhodné jen pro menší počet opakování. Spolehlivé, nejsou hybridizační artefakty, možno porovnávat mezi laboratořemi. -bio bio- -bio bio- Kuličky pokryté streptavidinem Ligace adaptéru Štěpení RE II. typu Dnes se používá hlavně v kombinaci se sekvenačními technologiemi nové generace bez konkatenace. Gibson a Muse, 2004

Analýza transkriptomu pomocí masivně paralelního sekvenování Vhodné zejména systémy Illumina a Solid - levnější -krátká čtení tolik nevadí, pokud existuje předloha pro sestavení - zvláště vhodné pro sekvenování smrna (velikost 20-30 nukleotidů) - poskytují informaci i o hladině exprese (četnosti transkriptů) 454 ke skládání transkribovaných sekvencí de novo větší dynamický rozsah - více než 5 řádů (MA 2-3 řády), lepší schopnost rozlišit alelickou expresi. Ve srovnání s konvenčním sekvenováním mnohem větší objem dat, levnější, dovoluje detekovat i poměrně vzácné transkripty. ve srovnání s MA dosud vyšší cena, některé postupy py nejsou ještě zcela optimalizované. Shoda výsledků z arrayí a sekvenování jen asi 30% - zatím nutno obě metody kombinovat.