Fyziologie buněčných systémů (proliferace, diferenciace) A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů) Brno
Diferenciace
Differences in mrna expression patterns among different types of human cancer cells
Differences in the proteins expressed by two human tissues
Polyklonální charakter kostních buněk Přirovnání kmenové buňky ke stromu: a kmenová buňka v embryonální podobě b kmenová buňka v dospělosti a b b
Buněčné komponenty hematopoetického mikroprostředí (H.I.M.) v kostní dřeni (podle Knospe 1978) Buněčný typ Endotelie sinusoidů Fibroblasty Tukové buňky Retikuloendotelové buňky, monocyty Endostální buňky Kost předpokládaná funkce zachycování kmenových buněk, výměna metabolitů uvolňování zralých buněk do cirkulace, část mikroprostředí umožňující buněčnou proliferaci tvorba kolagenu, mukopolysacharid ů, indukce diferenciace? vyplění prostoru po zaniklé kostní dřeni, proliferace pluripotentních kmenových buněk fagocytóza, tvorba CSF a jiných hemokininů indukce diferenciace? tvorba CSF a jiných hemokininů kmenové buňky stromatu? mechanická ochrana, tvorba hemokininů?
LYMFOPOÉZA Kostní dřeň PRIMÁRNÍ L.O. Thymus thymové hormony Primární imunitní odpověď SEKUNDÁRNÍ L.O. (Lymfatické uzliny a slezina) Sekundární imunitní odpověď Recirkulující paměťové buňky s dlouhou dobou života T- lymfocyty Buněčná imunita Plazmatická buňka B lymfocyty Humorální (IG) imunita
Hematopoetické buňky kostní dřeně Přestup do krve Pluripotentní buňka již neschopná vytvořit slezinnou kolonii 1 100 % - BFU-E - CFU-E - CFU-C - CFU-eozinofilů - CFU-Meg - CFU-makrofágů 2 - CFU-BL 3 - CFU-TL 3 erytroblasty - myelocyty - megakaryocyty 50 % CFU-S 0 % Pluripotentní buňky Morfologicky rozpoznatelné buňky Proliferující buňky Neproliferující buňky Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzorů krevních buněk v krvetvorné tkáni. 1 Podle Gregorové a Henkelmana (1977); 2 podle MacVittieho a Porvaznika (1978); 3 nejsou odvozeny od CFU-S.
BFU-E CFU-E Progenitorové erytroidní kmenové bunky Obr. 23. Na obrázku je znázorněna zvýšená proliferace při erytropoetickém stresu, která může vést k značné expanzi kompartmentu progenitorových erytroidních kmenových buněk. Citlivost k erytropoetinu (EP) se objevuje až v pozdějších stádiích. Upraveno podle Schofielda a Lajthy (1977). Citlivost na erytropoetin Zvýšená proliferace za erytropoetického stresu EP stimulace
CFU-E Kmenová buňka BFU-E citlivé na erytropoetin CFU-C citlivé na CSF citlivé na IL 3 Obr.27. Model humorálního řízení hemopoézy. Nejnezralejší buňky obsahují receptory k faktorům nezávislým na diferenciaci jednotlivých řad, jako je IL 3. Při maturaci se postupně tyto receptory ztrácejí a objevují se specifické receptory pro humorální faktory jednotlivých řad [pro erytropoetin ( ) a pro CSF ( ) ]. Podle Iscova (1978)
Polyklonální charakter kostních buněk - Přirovnání kmenové buňky ke stromu: a kmenová buňka v embryonální podobě b kmenová buňka v dospělosti a b b
Attractor cílový pohyb
Attractor cílový pohyb Některé pojmy Limita je matematická konstrukce, vyjadřující, že se hodnoty zadané posloupnosti nebo funkce blíží libovolně blízko k nějakému bodu. Právě tento bod je pak označován jako limita. Trajektorie souvislá čára, kterou hmotný bod při svém pohybu opisuje, se nazývá trajektorie hmotného bodu.
Atraktory - vizualizace Jedním způsobem vizualizace chaotického pohybu, nebo opravdu libovolného typu pohybu, je vytvoření fázového diagramu pohybu. Jiný příklad někdo kreslí pozici kyvadla vůči jeho rychlosti. Kyvadlo v klidu bude zobrazeno jako bod a kyvadlo v periodickém pohybu bude nakresleno jako jednoduchá uzavřená křivka. Když takový graf vytváří, uzavřenou křivku, křivka se nazývá orbita.
Příklady takových systémů zahrnují atmosféru, solární systém, tektoniku zemských desek, turbulenci tekutin, ekonomii, vývoj populace. Lorenzův atraktor popisuje pohyb systému ve stavovém prostoru. V matematice a fyzice se teorie chaosu zabývá chováním jistých nelineárních dynamických systémů, které (za jistých podmínek) vykazují jev známý jako deterministický chaos, nejvýznamněji charakterizovaný citlivostí na počáteční podmínky (viz motýlí efekt). Malá změna v počátečních podmínkách vede po čase k velmi odlišnému výsledku. V důsledku této citlivosti se chování těchto fyzikálních systémů, vykazujících chaos, jeví jako náhodné, i když model systému je deterministický v tom smyslu, že je dobře definovaný a neobsahuje žádné náhodné parametry.
Systémy, které vykazují deterministický chaos, jsou v jistém smyslu složitě uspořádané. Tím je význam slova v matematice a fyzice v jistém nesouladu s obvyklým chápáním slova chaos jako totálního nepořádku. Původ tohoto slova lze najít v řecké mytologii - viz chaos. Chaotický pohyb Abychom mohli klasifikovat chování systému jako chaotické musí systém vykazovat následující vlastnosti: musí být citlivý na počáteční podmínky musí být topologicky tranzitivní jeho periodické orbity musí být husté
Citlivost k počátečním podmínkám znamená, že dvě blízké trajektorie ve fázovém prostoru se s rostoucím časem rozbíhají (exponenciálně). Systém se chová identicky pouze když jeho počáteční konfigurace je úplně stejná. Již při malých diferencích toto neplatí. Příkladem takové citlivosti je tzv. které ale v průběhu času mohou vést až k tak dramatickým změnám, jako je výskyt tornáda. Mávnutí křídel motýla zde představuje malou změnu počátečních podmínek systému, která ale způsobí řetěz událostí vedoucí k rozsáhlým jevům, jako jsou tornáda. Kdyby motýl nemávl svými křídly, trajektorie systému by mohla být zcela odlišná.
3D model Attractor cílový pohyb 1 attractor (malá miokroheterogenita) 2 oddělené attractory Atraktor většina stavových trajektorií (drah hmotného bodu) se přibližuje a obmotává nějakou obecnou limitu. Systém končí ve stejném pohybu pro všechny počáteční stavy v oblasti okolo tohoto pohybu, téměř jako by byl systém k tomuto pohybu (trajektorii fázového prostoru) přitahován (anglicky 'attracted').
Six steps at which eucaryotic gene expression can be controlled
early 1. 2. Děje v buněčné diferenciaci growth factors receptor 9. 10. later cell 3. kinases/2nd messengers 11. nucleus 4. regulators genes 12. 16. replitase 5. hnrna 13. S G2 6. 7. mrna proteins 14. 15. (enzymes) 17. M 8. amino acids 18. cytokinesis
Spolupůsobení regulátorů růstu rozdílné chemické povahy a regulace PROLIFERACE (příklady)
The four important families of small organic molecules in cells
Cytokiny
SPOLEČNÉ CHARAKTERISTIKY CYTOKINŮ Přestoţe cytokiny představují velmi heterogenní skupinu proteinů, lze uvést některé jejich společné charakteristiky: 1) Nízká MW (< 80 kda), často bývají glykosylovány (glykoproteiny) 2) účastní se imunity a zánětu, kde regulují intenzitu a délku trvání odpovědi 3) jsou produkovány - lokálně, po přechodnou dobu 4) působí spíše autokrinně a parakrinně 5) jsou vysoce účinné (pm) 6) interagují vysoce specificky s povrchovými receptory 7) po vazbě na receptory indukují syntézu mrna a receptorových proteinů 8) působí v síti, kde - svoje efekty vzájemně ovlivňují (zejm. svoji produkci) - indukují transmodulaci povrchových receptorů - mohou působit na buněčné funkce aditivně, synergicky anebo antagonisticky
PŘEHLED NEJDŮLEŢITĚJŠÍCH CYTOKINŮ - 2. cytokin zdroj působení IFN a 1 IFN a 2 dvojitě negativní lymfocyty, monocyty, makrofágy zvyšuje rezistenci proti virům; inhibuje proliferaci normálních i nádorových buněk; indukuje syntézu MHC I, receptoru pro Ig; aktivuje NK-buňky stejně jako u IFN a stejně jako u IFN a IFN b 1 fibroblasty, buňky epitelu IFN b 2 fibroblasty, monocyty IFN g T buňky, NK-buňky podobná jako u IFN a a b, navíc má větší schopnost aktivovat makrofágy, zvyšovat odolnost vůči parazitům; indukuje syntézu MHCI i MHCII;stimuluje syntézu IgG2 a inhibuje syntézu IgG2 a IgE B-buňkami TNF a makrofágy, T-buňky, thymocyty, B-buňky, NK-buňky působí nekrózu různých typů buněk, převáţně nádorových; pleiotropní účinky na široké spektrum buněk, např. reguluje proliferační a funkční odpověď B- a T-buněk; stimuluje diferenciaci prekurzorů myeloidní řady; stimuluje expresi cytokin, MHC a prostaglandinů TNF b T buňky má stejné účinky jako TNF a G-CSF monocyty, makrofágy, T-buňky, fibroblasty, buňky endotelu stimuluje proliferaci kolonií granulocytů; aktivuje granulocyty GM-CSF T-buňky, monocyty, makrofágy, fibroblasty, stimuluje proliferaci prekurzorů granulocytů, makrofágů; aktivuje makrofágy, neutrofly, eozinofiy buňky endotelu M-CSF monocyty, makrofágy, stimuluje růst kolonií monocytů a makrofágů; aktivuje monocyty fibroblasty EPO ledviny stimuluje růst kolonií erytrocytů a megakaryocytů TGF b krevní destičky, kosti - matrix, placenta, ledviny, některé nádory reguluje růst buněk (většinou inhibuje proliferaci vyvolanou působením hematopoietických cytokinů)
PŘEHLED NEJDŮLEŢITĚJŠÍCH CYTOKINŮ - 1. cytokin zdroj působení IL - 1 monocyty (+ téměř všechny buňky s jádrem) pyrogen, komitogenní faktor T-buněk; stimuluje uvolnění lymfokinů T-buňkami; aktivuje NK-buňky;stimuluje diferenciaci B-buněk IL 2 T buňky růstový faktor T-buněk a thymocytů, zvyšuje cytotoxicitu, aktivuje NK-buňky, stimuluje diferenciaci B-buněk IL - 3 T-buňky (+ ţírné buňky) stimuluje proliferaci prekurzorů granulocytů, erytrocytů, megakaryocytů, makrofágů; aktivuje monocyty a makrofágy IL - 4 T buňky stimuluje syntézu IgG1 a IgE B-buňkami, proliferaci makrofágů, NK-buněk, T-buněk IL - 5 T buňky stimuluje diferenciaci a růst eozinofilů, proliferaci T- a B-buněk IL - 6 T buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty, buňky endotelu stimuluje syntézu Ig B-buňkami; stimuluje proliferaci thymocytů, prekurzorů neutrofilů, makrofágů, megakaryocytů, myelomu, plazmacytomu, B-lymfomu IL - 7 buňky kostní dřeně stimuluje proliferaci prekurzorů B- a T-buněk a T-buněk IL - 8 monocyty, makrofágy, stimuluje chemotaxi neutrofilů a dalších leukocytů lymfocyty, fibroblasty, buňky endotelu IL - 9 T-buňky stimuluje proliferaci T-buněk bez přítomnosti antigenu a APC IL - 10 T-buňky (+ ţírné buňky) Inhibuje syntézu některých cytokinů (IFN g) IL - 11 buňky kostní dřeně stimuluje proliferaci multipotentních prekurzorů leukocytů (synergie s IFN g) a prekurzorů megakaryocytů (synergie s IL 3) IL - 12 B-buňky stimulace NK-buněk, cytolyticých T-buněk, T-buněk aktivovaných lymfokiny
cytokiny jsou polyfunkční (a) (b) (c) (d) G-CSF G-CSF G-CSF G-CSF multi-csf GM-CSF M-CSF SCF GM progenitor cell IL-6 GM progenitor cell myeloblast mature granulocyte superoxide ++ + phagocytosis (d) stimulation of functional activity mature granulocytes mature granulocytes mature macrophages mature granulocyte (c) initiation of maturation (a) cell production is dependent on regulator stimulation (b) induction of commitment to form cells in a restricted lineage
Úloha IL 1 v hematopoéze 1. monocyte production and activation 2. proliferation of committed progenitor cells (BFU-E, CFU-GM) 1. neutrophil activation 2. neutrophil production 3. stem cell activation IL-1 clonal expansion of differentiated B - cells GM - CSF IL - 6 T-cells endothelial cells fibroblasts epithelial cells IL - 2 1. T - cell growth 2. Ig secretion G - CSF ELAM - 1 ICAM - 1 adhesion of leukocytes to other cells ELAM - endothelial leukocyte adhesive molecule ICAM - intercellular adhesive molecule
Network interakcí cytokinů IL - 4 IL - 2 T cell B cell Antibody IFN - g IL - 1 IL - 1 GM - CSF IL - 3 macrophage LPS TNF (-)TNF G - CSF Bone marrow
Autoregulace uvnitř systému granulocytů - makrofágů CFU - C (GM - CFC) CFU - C CFU - C CFU - C CSF CSF PGE 2 CSF - + CSF G M G M G inhi- bitor M A různé koncentrace CSF B zpětnovazebná stimulace a inhibice PGE C produkce inhibitoru tvorby CSF G - granulocyty M - makrofágy
Oncogenes Tyrosine kinase abl met erb ret B2/neu sea fes/fps src fgr trk fyn yes kit lck Nuclear fos jun myb myc ski Growth factor fgf-5 sis hst int-2 Receptor bek erb B fkg fms mas ros G protein rab ras ral Serine kinase mil/raf pks mos raf pim-1 rel Growth factor Receptor Transducer Effector 2nd messenger Target Regulatory proteins RNA/protein synthesis DNA synthesis Receptor Receptor Receptor Receptor Receptor tyrosine kinase G protein PLCg DG IP 3 G protein PLA 2 Na + /H - antiport Arachidonate [Ca 2+ ] i PKC PK (?) PG TX Calmodulin [ph] i? G protein Adenylylcyclase camp PKA MEMBRANE CYTOSOL NUCLEUS According to: G.Powis: TiPS; 12: 188-194, 1991
Mitogens Growth Factors Hormones Serum Cytokines SPL GPL Caspases Apoptosis Nutrient/GF Deprivation? Heat PKC ras ROS Raf-1 NFkB bax MEK1 ERK1/2 c-myc Bcl-2 MEKK1 SEK1 JNK/SAPK c-jun, ATF2 NFkB c-jun, c-fos antioxidants HSP GADD45 RbE2F G1 Arrest DNA damage p21 AT p53 Rb-Pi c-abl ROS Environmental Stress UV light Ionizing Radiation Chemotherapy Xenobiotics O2, TM, Heat DNA-PK c-abl PCNA replication E2F Ku MDM2 S phase Replication Cytokines Fas-ligand TNF-alpha? Ceramide Apoptosis According to: Rizzieri: Drug Resistance Updates; 1: 359-376, 1998
An example of interactions of two factors (data from Eur. J. Pharmacol. 316, 349-357, 1996, see Publications.)
Ovlivnění metabolismu eikosanoidů I. dodáním exogenní kyselimy arachidonové (AA) II. ovlivněním produkce eikosanoidů s vyuţitím inhibitorů: LPO nebo CO nebo P450 TGF- b 1 TGF- b 1 TNFa TGF-b 1 / TNFa TNFa TGF-b 1 / TNFa diferenciace (+) po indukci do: granulocytů nebo monocytů - makrofágů + - Vytvoření souboru dat detekcí proliferace, diferenciace a apoptózy u buněk v definovaných časových intervalech Zhodnocení dat: vymezení významných interakcí pomocí matematické analýzy dat upřesnění modelových exp. podmínek pro detailnější studium mechanismů
STRUKTURNÍ ÚLOHA FOSFOLIPIDŮ V BUŇKÁCH MEMBRÁNOVÉ SYSTÉMY a buněčné kompartmenty protientropické důsledky NEODDĚLITELNÁ OD BUNĚČNÝCH FUNKCÍ
Kompartmenty funk čně nebo prostorově oddělené soubory prvků (složek). D ůsledek kompartmentace : (existence jednotlivých kompartment ů) prvky (např. látky nebo bu ňky) jsou nerovnoměrně rozděleny. P říklady: všechny membránami ohrani čené struktury mají (z hlediska rozdělení látek) své vnitřní prost ředí a selektivn ě akumulují nebo zadržují určité látky proti koncentra čnímu spádu. U ž tímto prostým faktem jsou některé reakce umožněny, jiným může být zabráněno. Tato protientropická distribuce molekul v bu ňce směřující proti neuspořádanosti má velký význam pro bun ěčný metabolismus a regulace. Umo žňuje ji právě existence bun ěčných membrán jeden ze základ ů biologických systémů Bude rozvedeno později
Přirozené funkce membránových lipidů STRUKTURNÍ FUNKČNÍ (REGULAČNÍ)
růstové signály receptory cykliny CDKs regulátory transkripce molekuly signálové transdukce p27 p21 p16 p15 molekuly zesilovací kaskády
SIGNAL (e.g. cytokines) signal cascade intracellular functions secretion membrane fluidity proteins membrane phospholipids nuclear receptors transcription factors (NFkB, PPAR, AP-1...) RE mrna insertion PUFAs ROS gene expression DNA eicosanoids lipid peroxidation LOXs P450s COXs inhibition (NSAIDs) n-3 PUFAs dietary n-6 PUFAs (AA, LA) membrane phospholipids arachidonic acid extracellular stimuli (cytokines, hormones, pollutants, irradiation)
MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS PLA 2 COOH CYCLOOXYGENASE S PGG 2 EPOXYGENASES (P450) LIPOXYGENASE S LTA 4 PGH 2 EPOXYACIDS, DIOLS, etc. OH LTB 4 LTC 4 TXA 2 PGI 2 PGD 2 PGE 2 TXB 2 O PGE 2 : COOH C 5 H 11 LTC 4 : S COOH CH 2 CH CO NH CH 2 COOH NH COCH 2 CH 2 CHCOOH NH 2 LTD 4 LTE 4 LTF 4 OH OH
Signal transmission systems R R G G AC PLC PKC PLA2 ATP camp PI IP3 DAG arachidonic acid (AA) R receptor prostaglandins (PG) G G-protein leukotrienes
positive effect on cell proliferation an example Ca 2+ Ca 2+ EGF Ca 2+ EGF AA 5HETE LTA4 LTC4 DAG PIP2 Tyr-K PLA2 5-LOX Ca 2+ PKC PLC Tyr-K + Nuclear responses
Negative effect on cell proliferation an example Phorbol esters CSF-1 GM - CSF IL- 3 PGE 2 PKC GM - CSF R adenylyl cyclase PKC CSF-1R (c- fms) IL- 3R camp tyr-p EFFECTOR e.g. G protein, kinase RESPONSE +? - PKA DNA synthesis cell cycle phases G0 G1 S
SIGNAL Ca 2+ Protein kinázy a fosphatázy PtdIns(4,5)P 2 PC Phospholipase C Phospholipase A 2 Phospholipase D Ins(1,4,5)P 3 DAG FFA LysoPC DAG Ca 2+ Transient PKC activation Sustained PKC activation Early responses e.g. Secretion Release reaction Late responses e.g. Proliferation Differentiation
Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations INDOMETHACIN DICLOPHENAC MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS ARACHIDONIC ACID ETYA abbreviations: ETYA = 5,8,11,14 -eicosatetraynoic acid ESC = esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE = 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525A = proadifen CYCLOOXYGENASES SKF525A, 9-HE NDGA ESC 12-LIPOXYGENASE 12-HETEs 12-HPETEs PROSTAGLANDINS THROMBOXANE S PROSTACYCLIN S 5-LIPOXYGENASE P450-MONOOXYGENASES FLAP EETs HETEs DIOLS MK - 886 (15-LIPOXYGENASE) LEUKOTRIENES Figure 1
% kontroly % kontroly % kontroly % kontroly PRODUKTY LIPOXYGENÁZ A CYKLOOXYGENÁZ VORE et al., J. Immunol. : 11, 435-442, 1989 Esculetin Indomethacin 90 70 50 30 10-10 -30-50 -70-90 1 3 10 30 100 90 70 50 30 10-10 -30-50 -70-90 0,3 1 3 10 30 koncentrace (mm) koncentrace (mm) Ibuprofen NDGA 90 70 50 30 10-10 -30-50 -70-90 1 3 10 30 100 90 70 50 30 10-10 -30-50 -70-90 0,3 1 3 10 30 koncentrace (mm) koncentrace (mm)
TGF-b1 TGF-b1 receptor serin - threonin kinase P450 + effect lipoxygenase inhibitors (MK886, esculetin) arachidonic acid cyclooxygenases lipoxygenases + differentiation agents (TPA, RA, DMSO) cell membrane cytosol some interactions of TGF-b1 and AA metabolism with other regulatory molecules which should be studied (unknown effects) nucleus (G1 cyclins) G1 p27 p27 EETs HETEs diols? cyclin E? cdk2 DNA synthesis cell cycle turnover p21 Rb unknown prostaglandins thromboxanes? c-myc?? cyclin E Rb P S c-fos cdk2? P leukotrienes induction of differentiation inhibition of proliferation well documented
MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS? ARACHIDONIC ACID? CYCLOOXYGENASES P450 12 - LIPOXYGENASE 12 HPETs 12 HETEs? ESC PROSTAGLANDINS THROMBOXANES PROSTACYCLINS EETs HETEs diols 5 - LIPOXYGENASE LEUKOTRIENES FLAP MK-886 (15 - LIPOXYGENASE)
growth factors hormones receptor PLA 2 + PLA 2 P AA According to: A. Sellmayer et al.: Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids ; 57: 353-357, 1997. cyclooxygenases lipoxygenases CP450 monooxygenases eicosanoids -ion channel activity - guanylate cyclase - adenylate cyclase - protein kinase C - protein kinase A - tyrosine kinase - MAP kinase - G-proteins transcription factors gene expression cell growth