Diferencované zrání bovinních oocytů využitelných pro reprodukční biotechnologie

UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 39 Diferencované zrání bovinních oocytů využitelných pro reprodukční biotechnologie Autoři Ing. Marie Machatková, CSc Ing. Michal Ješeta, Ph.D. MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová Mgr. Kateřina Hanzalová ISBN 978-80-86895-32-1. 2013

Uplatněná certifikovaná metodika Diferencované zrání bovinních oocytů využitelných pro reprodukční biotechnologie Autoři Ing. Marie Machatková, CSc Ing. Michal Ješeta, Ph.D. MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová Mgr. Kateřina Hanzalová 2013

1 OBSAH I) Úvod 2 II) Cíl metodiky 3 III) Vlastní popis metodiky 3 IV) Srovnání novosti postupů 5 V) Ekonomické přínosy 6 VI) Popis uplatnění metodiky 6 VII) Seznam použité literatury 7 VIII) Seznam publikací předcházejících metodice 8 IX) Dedikace metodiky 9 X) Návrh oponentů 9

2 I) Úvod Aplikace biotechnologií v oblasti šlechtění hospodářských zvířat umožňují efektivněji využít genetický potenciál chovatelsky cenných jedinců, rozšířit kombinace rodičovských párů a modifikovat populaci zvířat požadovaným směrem pomocí nových šlechtitelských strategií. V rámci probíhajících šlechtitelských programů jsou embrya skotu získávána především opakovanou superovulací geneticky cenných donorek a přenášena do geneticky bezcenných příjemkyní (MOET). Relativně novou biotechnologickou metodou, která však již našla v oblasti šlechtění skotu své specifické uplatnění, je metoda zrání (IVM), fertilizace (IVF) a kultivace (IVC) oocytů in vitro a produkce in vitro embryí (IVP). Tato metoda umožňuje produkovat geneticky cenná embrya v laboratoři z oocytů získaných buď v průběhu života donorky technikou transvaginální aspirace (OPU) nebo post mortem po vyřazení donorky z důvodu stáří, neplodnosti nebo jiných poruch zdraví (Machatková et al 2000, 2006, 2008). Z celkového počtu embryotransferů, které jsou každoročně provedeny v Evropě, představují přenosy embryí získaných metodou OPU/IVF více než 10% (Knijn, 2012). V chovatelsky vyspělých zemích, především v Nizozemsku, Francii, Německu nebo Itálii, je metoda OPU/IVF úspěšně kombinována s metodou hormonální superovulace dárkyní. Předpokládá se, že produkce OPU/IVF embryí v budoucnu nahradí embrya získaná superovulací, poněvadž umožňuje vyloučit negativní dopady superovulace na zvířata i životní prostředí. Proto se většina subjektů, které chovatelům v EU poskytují služby v oblasti reprodukce a šlechtění skotu, metodami produkce embryí in vitro intenzivně zabývá a ve spolupráci s výzkumnými pracovišti je dále rozvíjí (Smidt a Niemann 1999, Merton et al 2003, Heyman 2005). Ve srovnání s embryi produkovaných pro experimentální účely je však vývoj embryí požadovaného genotypu do přenosuschopných stádií stále málo efektivní. Nezralé oocyty získané od hormonálně neošetřených krav jsou vysoce heterogenní populací z hlediska meiotické a vývojové kompetence, to je schopnosti dokončit zrání a vyvíjet se po oplození. Relativně malá část oocytů (průměrně 25%), které pocházejí z folikulů o velikosti 6-10 mm, je schopna za standardních podmínek kultivace dosáhnout jaderné i cytoplazmatické zralosti a poskytnout vyšší podíl embryí. Převážná část oocytů (průměrně 75 %), které jsou získány z folikulů o velikosti 3-5 mm, vykazuje relativně nízkou úroveň cytoplazmatického zrání a produkce embryí.

3 Jedním z důvodů je nižší energetický potenciál vývojově méně kompetentních oocytů, které nejsou schopny během svého zrání dostatečně aktivovat své mitochondrie, zajistit mitochondriální reorganizaci a vyprodukovat potřebné zásoby adenosin-trifosfátu (ATP). V naší nedávné studii jsme potvrdili, že zralé, vývojově méně kompetentní oocyty jsou deficitní z hlediska některých mitochondriálních funkcí a produkce ATP (Machatková et al 2012). Přitom obsah ATP v cytoplazmě fertilizovaných oocytů je velmi významný pro úspěšný průběh oplození a nástup embryonálního vývoje. Relativně nízký podíl cytoplazmaticky zralých oocytů s nedostatečnými zdroji energie patří mezi základní problémy, které limitují využití metody IVP embryí, jak v oblasti šlechtění skotu, tak i v dalších oblastech reprodukčních biotechnologií. Aby bylo možno získat požadovaný počet embryí od geneticky cenných rodičů, je nezbytné zvýšit kvalitu cytoplazmy zralých oocytů. Navrhovaná metodika je založena na dvoustupňové izolaci oocytů a diferenciaci podmínek zrání na základě jejich vývojové kompetence. Umožňuje zvýšit energetický status vývojově méně kompetentních oocytů a zlepšit kvalitu jejich cytoplazmy na základě aktivace jejich mitochondrií pomocí specifického stimulans. Stav zralých oocytů je významný pro zvýšení účinosti normálního oplození, vývoje oplozených oocytů do přenosuschoných embryonálních stádií a zachování vývojové schopnosti embryí po embryotransferu. II) Cíl metodiky Záměrem předložené metodiky bylo zlepšit kvalitu vývojově méně kompetentních oocytů skotu na úroveň vývojově více kompetentních oocytů. Finálním cílem metodiky bylo vyvinout efektivnější postup zrání pro vývojově méně kompetentních oocyty, které budou využitelné pro produkci embryí od geneticky cenných rodičů i v dalších oblastech reprodukčních biotechnologií. III) Vlastní popis metodiky 1.1 Příprava donorek oocytů Před odběrem oocytů je nezbytné nejdříve ověřit reprodukční status donorky sonografickým vyšetřením. Podle nálezu na ováriích indukovat říji, využít lze i říji spontánní. Nástup říje potvrdit rutinní kontrolou, ovulaci a růst folikulární vlny je vhodné opět ověřit sonograficky. Oocyty mohou být aspirovány opakovaně, 5-6 krát v jednom cyklu.

4 U březích krav je možno využít folikulární vlny vznikající na ováriích spontánně mezi 60. - 90. dnem březosti. Pokud jsou jako donorky oocytů používány vyřazené krávy post mortem je vhodné pohlavní cyklus synchronizovat. 1.2 Odběr a izolace oocytů 1.2.1 Technika OPU Folikuly o velikosti od 3 mm do 5 mm jsou punktovány a oocyty jsou aspirovány do zkumavky s ekvilibrovaným Tyrodovým médiem. Aspirační médium s folikulární tekutinou je filtrováno přes nylonový filtr (Uhelon 130 extra) o porezitě 100 μm, na kterém jsou aspirované oocyty zachyceny. 1.2.2 Post mortem Vaječníky jsou transportovány do laboratoře v termosce při teplotě mezi 30-35 C. Ovária jsou nejdříve dekontaminována opakovaným oplachem sterilní redestilovanou vodou a následně fyziologickým roztokem PBS-Dulbecco s antibiotiky. Nejdříve jsou punktovány folikuly o velikosti 6-10 mm, ze kterých jsou aspirovány vývojově více kompetentní oocyty. Následně jsou technikou disekce ovariálního cortexu otevřeny folikuly o velikosti 3-5 mm, ze kterých jsou vyplaveny vývojově méně kompetentní oocyty. Obě subpopulace jsou zachyceny na filtru a uchovávány odděleně po celou dobu manipulace. 1.3. Selekce nezralých oocytů Izolované oocyty jsou přeneseny do média TCM-199, a hodnoceny na základě své morfologické kvality. Pro zrání jsou selektovány oocyty s ukončeným růstem, o velikosti 130 μm, bez výraznějších defektů v cytoplazmě, obklopené intaktní zonou pellucidou a coronou radiatou a nejméně jednou vrstvou buněk cumulu. 1.4 Diferencované zrání oocytů Oocyty jsou přeneseny do jamek mikroplotny, ve které jsou kultivovány při teplotě 38,5 C, v atmosfeře vzduchu s 5 % CO 2 po dobu 24 hodin. Vývojově více kompetentní oocyty zrají za standardních podmínek. U vývojově méně kompetentních oocytů je zrací médium nejdříve ekvilibrováno po dobu 1 hodiny, kdy je

5 přidáno mitochondriální stimulans a ph média je upraveno na hodnotu 7,1. Následně je médium ekvilibrováno po dobu 2 hodin. 1.5 Optimalizace oplození oocytů Před oplozením je nezbytné testovat fertilizační schopnost spermií potenciálních otců embryí a optimalizovat podmínky oplození pomocí oocytů běžné populace jatečných krav (Machatková et al 2009). Po rozmrazení inseminačních dávek ve vodní lázni o teplotě 37 C po dobu 60 sekund je sperma podvrstveno v množství 25 μl pod 1000 μl modifikovaného Tyrodova média (SP- TALP). Motilní spermie jsou ze spermatu izolovány metodou swim up probíhající při teplotě 38,5 C po dobu 1 hodiny. Pro oplození oocytů je použito modifikované Tyrodovo médium (IVF-TALP) obsahující 1x10 6 spermií/ml a 10 μg/ml heparinu jako kapacitační agens. 1.6 Kultivace raných embryí Za 20-24 hodin po oplození jsou oocyty zbaveny kumulárních buněk a potencionální zygoty jsou přeneseny na buněčný monolayer stabilní linie BRL (Buffalo rat liver cells ATCC USA) Pro kultivaci je používáno kultivační medium B 2 Menezo s 10% estrálního bovinního séra, ve kterém se embrya vyvíjejí do přenosuschopných stádií při teplotě 39 C, v atmosféře vzduchu s 5% CO 2.po dobu 7-8 dnů. IV) Srovnání novosti postupů V současné době jsou ooocyty skotu izolovány a během zrání jsou kultivovány za standardních podmínek nezávisle na jejich meiotické a vývojové kompetenci. Z tohoto důvodu je účinnost oplození a embryonálního vývoje vysoce variabilní v závislosti na použité populaci oocytů, což vede k nestandardní kvalitě zralých oocytů a nízkému podílu vyvíjejících se embryí. Navržená metodika řeší problém nedostatečných energetických zásob u zralých bovinních oocytů používaných pro reprodukční biotechnologie. Její podstatou je dvoustupňová izolace oocytů a diferenciace podmínek jejich zrání na základě meiotické a vývojové kompetence. Vývojově méně kompetentních oocyty zrají za podmínek, kdy dochází k aktivaci mitochondrií a následně ke zvýšené mitochondriální reorganizaci a produkci ATP. Specifická stimulace mitochondriálních funkcí pozitivně ovlivňuje energetické zásoby zralých oocytů, a tím zlepšuje kvalitu jejich cytoplazmy.

6 Nový způsob zrání umožňuje zlepšit energetický stav vývojově nízce kompetetních oocytů oocytů, zvýšit efektivnost jejich fertilizace i embryonálního vývoje. Výsledkem zrání podle navržené metodiky jsou nejen z hlediska cytoplazmy kvalitnější oocyty ale i účinnější penetrace spermií do oocytů, rychlejší syngamie obou prvojader a nástup dělení. Podíl zralých a normálně oplozených oocytů se zvyšuje průměrně o 10 %, podíl raných embryí stoupá o více než 20 % a podíl embryí využitelných k embryotransferu se zvyšuje průměrně o 30 %. Navržená metodika přispívá k efektivnějšímu využití vývojově méně kompetentních oocytů, které v populaci oocytů získaných od nesuperovulovaných donorek převažují. Zvyšuje se účinnost normálního oplození těchto oocytů, a tím i pravděpodobnost získání požadovaného počtu embryí využitelných jak ke kryokonzervaci tak i přímému embryotransferu. V) Ekonomické přínosy Finanční náklady na zavedení metody diferencovaného zrání bovinních oocytů nejsou vysoké. Pokud pracoviště již disponuje laboratorním vybavením zaměřeným na přípravu IVP embryí, zvyšují se náklady na produkci těchto embryí maximálně o 5 %. V této částce jsou zahrnuty především náklady na jednorázové sety používané při dvoustupňové izolaci oocytů a náklady na přípravu specifických aditiv do zracích médií. Výsledný ekonomický přínos metodiky přípravy embryí skotu z oocytů zrajících za diferencovaných podmínek bude záviset na intenzitě produkce embryí v laboratoři a dosahované úrovni embryonálního vývoje. Pokud vycházíme z předpokladu, že pomocí metodiky lze průměrně zvýšit podíl přenosuschopných embryí až o 30 %, potom náklady na přípravu jednoho embrya se adekvátně sníží. Celkový ekonomický přínos bude závislý na genetické hodnotě a tržní ceně vyprodukovaných embryí. V) Popis uplatnění metodiky V navržené metodice je popsán efektivnější způsob zrání vývojově méně kompetentních oocytů skotu v podmínkách in vitro pomocí aktivace jejich mitochondrií specifickým stimulans. Zvýšení energetických zásob u zralých oocytů zvyšuje účinnost oplození i embryonálního vývoje. Modifikovaný způsob zrání lze využít především u oocytů získaných od geneticky cenných donorek, které jsou oplozovány spermiemi špičkových býků, kdy podíl zralých a

7 normálně oplozených oocytů je rozhodující pro zisk embryí požadovaného genetického původu. Významný přínos může mít metodika také při produkci embryí uchovávaných jako genové zdroje a ohrožených živočišných druhů, kdy zdroje oocytů jsou značně limitovány. Efektivnější metoda zrání je aplikovatelná i v rámci vývoje technologicky náročnějších reprodukčních metod, jako jsou klonování a transgeneze, které vyžadují kvalitní zralé oocyty a progresivně se vyvíjející raná embrya. Metodika je určena jak výzkumným pracovištím produkujícím experimentální embrya skotu pro řešení svých experimentálních záměrů tak i specializovaným laboratořím, které se zabývají produkcí embryí požadovaného genetického původu v rámci služeb chovatelům v oblasti reprodukce a šlechtění skotu včetně embryotransferu. VI) Seznam použité literatury Heyman Y. Nuclear transfer: a new tool for reproductive biotechnology in cattle. Reprod Nutr Dev, 2005, 45: 353 361. Knijn, H. National statistical data of embryo transfer activity in Europa (2011). In: Proceeding of the 28th A.E.T.E. Annual Meeting Saint Malo, France, 7th-8th September 2012; 43-53. Machatkova, M., Hanzalova, K., Horakova, J., Reckova, Z., Hulinska, P. Collection of oocytes from donors in the growth phase of follicular development can enhance the production of bovine embryos for cryopreservation. Vet Med-Czech 2006, 51, 232-238. Machatkova M., Hulinska P., Reckova Z., Hanzalova K., Spanihelova J. Pospisil R. In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Vet Med Czech, 2008, 53, 358-364. Machatkova M, Jokesova E, Horky F, Krepelova A. Utilization of the growth phase of the first follicular wave for bovine oocyte collection improves blastocyst production. Theriogenology. 2000; 54:543-550 Merton J.S., de Roos A.P.W., Mulaart E., de Ruigh L., Kaal L., Vos P.L.A.M., Dieleman S.J. Factors affecting oocyte quality and quantity in commercial application of embryo technologies in the cattle breeding industry. Theriogenology. 2003, 59: 651-674

8 Smidt D., Niemann H. Biotechnology in genetics and reproduction. Lives Prod Sci. 1999, 59: 207-221 VII) Seznam publikací autorů, které předcházely metodice Machatkova M., Ješeta M., Hulinska P., Knitlova D., Nemcova L., Kanka J. Characteristics of bovine oocytes with different meiotic competence in terms of their mitochondrial status and expression of nuclear-encoded factors. Reprod Dom Anim, 2012, 47:806 814. Kanka, J., Nemcova, L., Toralova, T., Vodickova-Kepkova, K., Vodicka, P., Jeseta M., Machatkova, M. Association of the transcription profile of bovine oocytes and embryos with developmental potential Anim Reprod Sci 2012, 134(1-2): 29-35. Machatková M., Ješeta M., Hulínská P., Rečková Z., Hanzalová K. (2009): Predikce fertility býků in vitro pomocí penetračního testu, metodika certifikována MZe dne 24.8.2009 Machatkova M., Hulinska P., Reckova Z., Hanzalova K., Spanihelova J. Pospisil R. In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Vet Med Czech, 2008, 53, 358-364. Machatkova, M., Hanzalova, K., Horakova, J., Reckova, Z., Hulinska, P. Collection of oocytes from donors in the growth phase of follicular development can enhance the production of bovine embryos for cryopreservation. Vet Med-Czech 2006, 51, 232-238. Machatkova M, Krausova K, Jokesova E, Tomanek M. Developmental competence of bovine oocytes: effects of follicle size and the phase of follicular wave on in vitro embryo production. Theriogenology. 2004; 61, 329-335. Machatkova M, Jokesova E, Horky F, Krepelova A. Utilization of the growth phase of the first follicular wave for bovine oocyte collection improves blastocyst production. Theriogenology. 2000; 54:543-550

9 VIII) Dedikace Metodika vznikla na základě metodických poznatků získaných v průběhu řešení projektu NAZV QI91A018(50 %) a výzkumného záměru MZE 0002716202 MZe ČR (50%). Podíl práce autorů: Ing. Marie Machatková, CSc (30%), Ing. Michal Ješeta, Ph.D. (30%), MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová (20%), Mgr.Kateřina Hanzalová (20%). IX) Návrh oponentů MVDr. Jan Bažant SVS ČR Slezská 7 120 56 Praha 2 Doc. MVDr. Radko Rajmon Ph.D. Katedra veterinárních disciplin FAPPZ, ČZU Kamýcká 129 Praha 6 - Suchdol