Využití kmenových buněk z pupečníkové krve v životě dítěte

Transkript

1 UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI FAKULTA ZDRAVOTNICKÝCH VĚD Ústav porodní asistence Lucie Przeczková Využití kmenových buněk z pupečníkové krve v životě dítěte Bakalářská práce Vedoucí práce: Mgr. Romana Klášterecká, Ph.D. Olomouc 2014

2 ANOTACE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Název práce: Vyuţití kmenových buněk z pupečníkové krve v ţivotě dítěte Název práce v AJ: The use of umbilical cord blood stem cells in a child's life Datum zadání: Datum odevzdání: Vysoká škola, fakulta, ústav: Univerzita Palackého v Olomouci Fakulta zdravotnických věd Ústav porodní asistence Autor práce: Lucie Przeczková Vedoucí práce: Mgr. Romana Klášterecká, Ph.D. Oponent práce: Abstrakt v ČJ: Bakalářská práce se zabývá problematikou kmenových buněk a pupečníkové krve. Popisuje kmenové buňky a uvádí moţnost jejich terapeutického vyuţití u dětí. Zároveň přehledová práce poskytuje informace o transplantaci. Uvedeny jsou také poznatky o odběru, zpracování a uchování pupečníkové krve v tkáňových bankách. Cílem práce je poskytnout komplexní přehled o dané problematice. Abstrakt v AJ: The Bachelor thesis deals with the issue of stem cells and umbilical cord blood. It describes stem cells and features a possibility of their use in children. The overview also contains information about transplantation. There is included knowledge of sample taking, treatment and conservation of umbilical cord blood in tissue banks. The goal of this thesis is to give a complex overview of this specific topic.

3 Klíčová slova v ČJ: kmenové buňky, transplantace, pupečníková krev, odběr, banky pupečníkové krve, léčba, maligní onemocnění, nonmaligní onemocnění, dětská mozková obrna, cévní mozková příhoda, diabetes mellitus 1. typu, terapie kmenovými buňkami Klíčová slova v AJ: stem cells, transplantation, cord blood, collection, cord blood banks, medical treatment, malignant diseases, nonmalignant diseases, cerebral palsy, stroke, diabetes mellitus type 1, stem cell therapy Rozsah: 51 stran Počet příloh: 0

4 Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a pouţila jen uvedené bibliografické a elektronické zdroje. V Olomouci dne podpis

5 Děkuji Mgr. Romaně Klášterecké, Ph.D., za odborné vedení bakalářské práce, cenné rady a trpělivost při vedení bakalářské práce. Zároveň děkuji Mgr. Ivetě Chvátalové, Ph.D., za poskytnutí materiálů.

6 OBSAH ÚVOD KMENOVÉ BUŇKY Typy kmenových buněk Embryonální kmenové buňky (ESC) Adultní kmenové buňky PLACENTA JAKO ZDROJ KMENOVÝCH BUNĚK Placentární kmenové buňky Amniové epitelové kmenové buňky (AE cells) Plodové mezenchymální fibroblasty (AMF) Etické otázky týkající se AE buněk Placentární mezenchymální kmenové buňky (PD-MSCs) Placentární hematopoetické kmenové buňky (HSCs) Hematopoéza PUPEČNÍKOVÁ KREV Transplantace pupečníkové krve Historie Typy transplantací HLA typizace Odběr pupečníkové krve Banky pupečníkové krve Výhody a nevýhody odběru pupečníkové krve TERAPEUTICKÉ VYUŢITÍ KMENOVÝCH BUNĚK Nonmaligní onemocnění Maligní onemocnění Vyuţití kmenových buněk dle Cord Blood Centra Diabetes mellitus 1. typu Cévní mozková příhoda Dětská mozková obrna Další moţnosti vyuţití kmenových buněk ZÁVĚR ZDROJE... 44

7 ÚVOD Narození potomka představuje výjimečný okamţik v ţivotě ţeny. Porod je však jedinečný také tím, ţe při něm lze získat cennou tekutinu - pupečníkovou krev. Ta je bohatým zdrojem kmenových buněk, které mají schopnost přeměny v téměř jakýkoli buněčný typ tkání lidského těla. Mohou tak mít velký potenciál v léčbě některých dětských onemocnění. Kmenové buňky našly své uplatnění převáţně v léčbě hematologických onemocnění. Předmětem klinických výzkumů jsou však v dnešní době také kmenové buňky získané z tkáně pupečníku a placenty, jeţ mohou být uţitečné při terapii chronických onemocnění, jako je cévní mozková příhoda, mozková obrna, hydrocefalus či diabetes 1. typu. Odběr a uchování pupečníkové krve tedy můţe být důleţitým krokem k dosáhnutí úspěšné terapie nemocí, které jinak mohou na dítěti zanechat trvalé zdravotní komplikace. Pro vypracování bakalářské práce byly stanoveny následující dílčí cíle: Cíl 1. Předloţit dohledané publikované poznatky o kmenových buňkách. Cíl 2. Předloţit dohledané publikované poznatky o transplantaci kmenových buněk z pupečníkové krve. Cíl 3. Předloţit dohledané publikované poznatky o odběru a uchování pupečníkové krve. Cíl 4. Předloţit dohledané publikované poznatky o terapeutickém vyuţití kmenových buněk. Vstupní literatura: HUSER, M., PETRENKO, M. 2004b. Kmenové buňky v gynekologii a porodnictví. Praktická gynekologie: moderní časopis pro gynekology. Brno: roč. 8, č. 4, s ISSN

8 HUSER, M., PETRENKO, M. 2004a. Pupečníková krev - současné moţnosti a perspektivy vyuţití. Praktická gynekologie: moderní časopis pro gynekology. Brno: roč. 4, s ISSN ČECH, E., HÁJEK, Z., MARŠÁL, K., SRP, B Porodnictví 2, přepracované a doplněné vyd. Praha: Grada, s ISBN FILIP, S., MOKRÝ, J., HRUŠKA, I Kmenové buňky. Biologie, medicína, filozofie. Praha: Galén, s ISBN Pro vyhledávání relevantních článků jsem využila vyhledávání pomocí: 1. Databáze: PROQUEST, PubMed, BMJ JOURNALS 2. Vyhledávače: Google a Google scholar 3. Časopisecké zdroje: Praktická gynekologie Vyhledávací strategie: Vyhledávací strategie byla rozdělena do dvou kroků. Prvním z nich bylo stanovení cílů přehledové práce. V souvislosti s nimi byla dohledána vstupní literatura, ze které byly získány základní informace o dané problematice. Druhým krokem bylo vyhledávání převáţně elektronických zdrojů dle uvedených klíčových slov. Vyhledávání proběhlo v období od listopadu 2013 do dubna 2014 ve článcích publikovaných od roku 1998 do roku Na základě klíčových slov bylo nalezeno 106 relevantních článků. Po jejich prostudování byly vyřazeny diplomové a bakalářské práce, stejně jako články s podobným obsahem. Pro potřeby bakalářské práce bylo následně pouţito 55 publikací, z nichţ 14 bylo v jazyce českém a 41 v jazyce anglickém. 8

9 1 KMENOVÉ BUŇKY Lidský organismus je sestaven z velkého počtu buněk. Kaţdá z těchto buněk má svou úlohu, ke které je přizpůsobena. Všem buňkám dává vznik buňka mateřská, tzv. kmenová. (Koledová, 2011, s. 14) Kmenové buňky Knoppers definuje jako nediferencované, primitivní buňky se schopností rychle se mnoţit a diferencovat do speciálních buněčných typů. (Knoppers et al., 2004, s. 17) Diferenciací se rozumí proces, kterým se buňka stává morfologicky a biochemicky odlišnou. (Cryo-Save, 2014) Koledová dodává, ţe jejich jedinečnost spočívá v sebeobnově, tedy procesu, který buňkám zajišťuje uchování jejich původních vlastností. (Koledová, 2011, s. 15) Předpokladem sebeobnovy je pro kmenové buňky charakteristické asymetrické dělení. V procesu mitózy tak vzniká jedna dceřiná buňka shodná s vlastnostmi buňky mateřské a druhá dceřiná buňka schopná přeměnit se do určitého typu tkáně. V některých situacích se buňky mohou dělit také symetricky. Výsledkem mitózy jsou pak dvě dceřiné buňky identické s buňkou mateřskou nebo dvě buňky určené k diferenciaci. Z populačního hlediska je však konečný počet obou typů dceřiných buněk stejný. (Filip, 2006, s ) Jak uvádí Koledová, aby buňky dosáhly velkého počtu dělení, zasahuje do jejich buněčného cyklu enzym telomeráza, který působí na specializované části DNA - teloméry. Ty v buňce slouţí jako hodiny měřící reprodukční čas buňky. Proto se kmenové buňky mohou zdánlivě mnoţit donekonečna. (Koledová, 2011, s ) Filip uvádí: V evoluci organismů představují kmenové buňky klíčové elementy: Při normálním vývoji mnohobuněčných organismů představují kmenové buňky mezietapu k buněčné diferenciaci; Zároveň mohou být kmenové buňky také vnitřní evoluční rezervou organismu. (Filip, 2006, s. 15) 1.1 Typy kmenových buněk Kmenové buňky můţeme klasifikovat několika způsoby. Dle hierarchického uspořádání dělíme buňky na: 9

10 Totipotentní, které mají schopnost diferencovat na jakýkoliv buněčný typ včetně buňky totipotentní; Pluripotentní buňky vznikají dělením buněk totipotentních a tvoří všechny typy buněk kromě buňky totipotentní; Multipotentní buňky tvoří jen buňky příbuzné danému typu buňky; Unipotentní nebo také progenitorové buňky produkují jen jeden typ buněk. (Doubek, 2008, s. 19) Huser a Petrenko rozlišují kmenové buňky podle původu, a to na buňky embryonální a adultní, které byly odvozeny od organismu dospělého jedince. (Huser, Petrenko, 2004b, s. 15) Koledová uvádí také nádorové kmenové buňky, jako buňky patologického původu, z nichţ vzniká zhoubné onemocnění. (Koledová, 2011, s. 22) Kmenové buňky mají nepostradatelnou funkci pro organismus, vznikají z nich totiţ buňky nové. Tělo dospělého člověka obsahuje více druhů kmenových buněk - tzv. tkáňových kmenových buněk, ze kterých vznikají určité typy buněk typických pro danou tkáň. Vedle tkáňových kmenových buněk můţeme v těle člověka najít také kmenové buňky mezenchymové, které dávají původ buňkám kostí a chrupavek. Vlastní kmenová buňka určitého typu tkáně tak slouţí jako zásobárna pro všechny druhy buněk, které se podílí na regeneraci tkáně. (Koledová, 2011, s ) Kmenové buňky lze získat z následujících zdrojů: časných embryí, která jsou nejvzácnější z důvodu schopnosti diferenciace na všechny tělní buňky; ze zárodečných buněk nebo orgánů plodu ke konci 1. trimestru vývoje a po interrupci, kdy je však schopnost diferenciace omezena; z dalších tkání jedince po narození; z některých tkání dospělého jedince, např. kostní dřeně; z pupečníkové krve dítěte ihned po narození (Pilka a kol., 2001, s ) Embryonální kmenové buňky (ESC) Lidské embryonální kmenové buňky byly poprvé izolovány v r Cílem těchto buněk je produkovat diferencované potomstvo nebo dlouhodobě udrţovat proces sebeobnovy. Skutečnost, jaký profil si buňka zvolí, regulují vnitřní signály. (Filip, 2006, s. 52) 10

11 Jak uvádí Huser a Petrenko, ES buňky je moţno odebrat z moruly či blastocysty, tedy den po početí. (Huser, Petrenko, 2004b, s. 15) Blastocystu tvoří tři vrstvy - trofoblast, blastocoel a vnitřní buněčná hmota, kde se tyto buňky tvoří. (Malínský, Lichnovský, 2006, s. 36) Embryonální kmenové buňky lze izolovat také z vyvíjející se pohlavní ţlázy 5-10 týdenního embrya. (Huser, Petrenko, s. 15) Doubek dodává, ţe jsou přítomny také v pupečníkové krvi. (Doubek, 2008, s. 19) Během preimplantační fáze vývoje jsou blastomery totipotentní. Kaţdou z blastomer však ovlivňují transkripční faktory Nanog, SOX2 a SALL4, které těmto buňkám předurčují, jakým vývojovým směrem se budou dále ubírat. (Cauffman et al., 2009, s ) Blastomery se rychle diferencují za vzniku primitivního ektodermu, ze kterého během gastrulace vznikají tři zárodečné listy - ektoderm, mezoderm a endoderm. (Filip, 2006, s. 52) Jak popisují Pessina a Gribaldo, embryonální kmenové buňky vykazují maximální stupeň plasticity. (Pessina, Gribaldo, 2006, s. 2288) Plasticita znamená schopnost tkáňově specifických kmenových buněk změnit repertoár buněk dceřiných. K této změně dochází, pokud buňka vcestuje do nového mikroprostředí (niche), které začne na buňku působit signálními molekulami, jeţ vedou k aktivaci genů schopných navodit produkci nového a odlišného potomstva. (Ústav histologie a embryologie Lékařské fakulty v Hradci Králové, 2014) Etické aspekty zatím nepovolují, aby byla zavedena studie ESC na člověku, či tyto buňky mohly být pouţity k léčbě. (Doubek, 2008, s. 19) V roce 2001 nabyla v České republice platnosti Úmluva o lidských právech a biomedicíně zakazující vytvářet embrya pro výzkum. Tvorba embryí je tak umoţněna jen pro účely umělého oplodnění. (Huser, Petrenko, 2004b, s. 16) Adultní kmenové buňky Dospělé kmenové buňky tvoří velmi malou část orgánů a tkání dospělého jedince. (Doubek, 2008, s. 19) Pessina a Gribaldo zmiňují, ţe označení dospělé kmenové buňky je poněkud nesprávné, protoţe se vyskytují také u kojenců, v pupečníku a v placentě. Pro buňky bylo proto navrţeno jiné označení, jako například kmenové buňky tkáňové, somatické či postnatální. (Pessina, Gribaldo, 2006, s. 2288) 11

12 Z hlediska fyziologie rostoucího organismu se povaha adultních kmenových buněk mění. Zpočátku se tyto buňky podílí na růstu organismu tím, ţe orgány zvětšují svou velikost. Poté, co je růst dokončen, se hlavní funkcí dospělých kmenových buněk stává zajištění homeostázy. (Pessina, Gribaldo, 2006, s. 2288) I přesto, ţe jsou v dospělém organismu zastoupeny v malém mnoţství, účastní se aktivně na obnově nebo regeneraci buněk poškozených tkání, čímţ je jejich role nenahraditelná. (Doubek, 2008, s. 19) Doubek dále dělí dospělé kmenové buňky na somatické vyskytující se kdekoliv v těle a germinální tvořící pohlavní buňky v ovariích nebo varlatech. (Doubek, 2008, s. 19) 12

13 2 PLACENTA JAKO ZDROJ KMENOVÝCH BUNĚK Během embryogeneze hraje placenta důleţitou roli. Vyvíjejícímu se plodu poskytuje stálý přísun ţivin a kyslíku a odvádí odpadní látky. Působí také jako filtr. Chrání plod před škodlivými vlivy chemických a infekčních látek, které mohou kolovat v mateřské krvi nebo plod mohou ohrozit vaginální cestou. Placenta také produkuje hormony, cytokiny, růstové a transkripční faktory. Stejně jako ostatní orgány, tak i placenta vykonává tyto funkce prostřednictvím více specializovaných buněčných typů odvozených od prekurzorů buněk, které proliferovaly nebo diferencovaly. (Pipino et al., 2013, s. 44) V průběhu těhotenství buňky plodu migrují skrze placentu do mateřského organismu, kde se mohou usadit v orgánech matky a přetrvávat v nich. Buňky CD34+ nebo CD34+CD38+ plodového původu byly v mateřském organismu zjištěny 27 let po předešlém těhotenství. Tyto progenitorové buňky mohou mít ve skutečnosti regenerativní schopnosti a v případě orgánového či tkáňového poranění jsou schopny mateřskému organismu pomoci. (Pipino et al., 2013, s. 46) Čech, Hájek a kolektiv popisují donošenou placentu jako kruhovitý útvar o průměru 20 cm, šířce 3 cm a váze blíţící se 500 g. Její rozměry se však odvíjí od délky těhotenství a velikosti plodu. Placenta se začíná tvořit jiţ 12. den po oplození a růst dokončuje mezi 36. a 38. týdnem těhotenství. (Čech, Hájek a kol., 2006, s. 50) Vzájemnou komunikaci mezi matkou a plodem zprostředkovává pupečník. Tento provazec vzniká zúţením zárodečného stvolu. Pupečník kryje šedomodrý obal amnion vytvořený postupným zvětšováním výstelky amniové dutiny. Pupeční šňůra dosahuje průměrné délky 50 cm a šířky 2 cm. Umístěna je nejčastěji ve středové části placenty a k dítěti se upíná na přední stěně břicha v oblasti pupku. Uvnitř pupku se nepravidelně vinou tři cévy. V. umbilicalis přivádí okysličenou krev k plodu a dvě a. umbilicales odvádějící odkysličenou krev plodu zpět k matce. Zbylou část provazce vyplňuje Warthonův rosol vytvořený z embryonálního mezodermu. (Čech, Hájek a kol., 2006, s. 49) Aby bylo lépe srozumitelné, odkud pocházejí nejen placentární kmenové buňky, je vhodné nastínit vývoj placenty a plodu. 13

14 Po implantaci embrya do endometria začne trofoblast intenzivně proliferovat za vzniku vnější vrstvy syncytiotrofoblastu, který prorůstá do děloţní sliznice a umoţní tak blastocystě hlubší zanoření. Rozdělením trofoblastu se dále vytváří cytotrofoblast, který představuje vnitřní buněčnou vrstvu. (Malínský, Lichnovský, 2006, s. 42) Embryoblast umoţňuje procesem delaminace (odštěpováním vrstvy buněk) vytvořit hypoblast, ze kterého vzniká entoderm. Zároveň se uvnitř embryoblastu tvoří rozestupem buněk neboli dehiscencí dutina amniového váčku. Na jeho spodině je přítomný epiblast, který dává vznik ektodermu. Ektoderm společně s entodermem pak vytváří zárodečný terčík. Strop amniové dutiny vystýlají buňky plochého tvaru - amnioblasty tvořící amniový epitel. (Malínský, Lichnovský, 2006, s. 42) Z trofoblastu se odděluje také vrstva buněk, tzv. Heuserova membrána. Ta se po spojení s entodermem stává ohraničením dutiny primárního ţloutkového váčku. Posléze se Heuserova membrána oddělí od cytotrofoblastu za vzniku prostoru vyplněného extraembyonálním mezodermem. V tomto mezodermu se utváří štěrbinovité prostory, které se poté spojí a vytváří choriovou dutinu označovanou jako extraembryonální coelom. Vznikem dutiny se extraembryonální mezoderm dále dělí na list parietální přivrácený k trofoblastu a list viscerální pokrývající amniový a ţloutkový váček. Takto vznikají plodové obaly amnion vytvořený viscerálním listem spolu s amniovým epitelem a chorion skládající se z listu parietálního a obou vrstev trofoblastu. (Malínský, Lichnovský, 2006, s ) Postupným vrůstáním mezodermu do sloupců buněk cytotrofoblastu a jeho následnou vaskularizací, se kolem 16. dne gravidity začnou tvořit choriové klky. (Čech, Hájek a kol., 2006, s. 49) Nejprve rostou paprsčitě kolem embrya a vytváří intervilózní prostory naplněné mateřskou krví. Lze rozlišit klky úponové, které pomáhají upevnit chorion ke stěně děloţní a klky resorpční umoţňující kontakt mezi mateřskou a plodovou krví prostřednictvím kapilární sítě, která se v nich větví. (Pipino et al., 2013, s. 45) Prorůstáním choriových klků dochází k postupnému ztenčení sliznice dělohy v oblasti decidua capsularis. Klky kryjící celé plodové vejce pak atrofují a povrch choria se tak stává hladkým (chorion leve). Na straně přivrácené k decidua basalis však klky hypertrofují a vzniká chorion frondosum, ze kterého se vyvíjí placenta. (Čech, Hájek a kol., 2006, s. 50) 14

15 2.1 Placentární kmenové buňky Placenta představuje významný zdroj celé škály kmenových buněk, mezi které se řadí především buňky trofoblastické, krvetvorné, epiteliální a mezenchymální. Zatím zůstává nejisté, zda v prvních týdnech vývoje pluripotentní kmenové buňky v placentě přetrvávají. Bylo prokázáno, ţe placenta obsahuje různá niche kmenových buněk, které tak odráţí rozdílný embryonální původ jejích sloţek. Obsahuje populaci široce multipotentních kmenových buněk vyjadřující embryonální kmenové buněčné markery, jako je např. c-kit, Oct4 a SOX2. Buňky tak mají mezodermální fenotyp, avšak vykazují široký diferenciační potenciál, který není omezen pouze na linii mezenchymálních buněk, ale vztahuje se také na hepatocyty, buňky slinivky břišní, vaskulární, endoteliální a neurální. (Pipino et al., 2013, s. 46) Prvními buňkami, které se v průběhu vývoje placenty objevují, jsou buňky trofoblastu. Ty představují buňky kmenové, které za vhodných podmínek prostředí jeví neomezený proliferační potenciál. Tyto buňky poskytují poţadované sloţky, které umoţňují efektivní a kontrolní podmínky pro utváření fetálního a mateřského vaskulárního systému. (Pipino et al., 2013, s. 45) 2.2 Amniové epitelové kmenové buňky (AE cells) Lidské AE buňky se vyvíjí z epiblastu osmý den po oplození, tedy dostatečně brzy před fází gastrulace, která nastává 15. aţ 17. den vývoje. Tento časový údaj je důleţitý, neboť se označuje jako tzv. bod zvratu, ve kterém se rozhodne o osudu buňky. Jelikoţ se amnion formuje z epiblastu ve chvíli, kdy si epiblast zachovává pluripotenci, AE buňky tak mohou uniknout specifikaci, která je typická pro gastrulaci. Buňky pak mají moţnost uchovat si některé nebo všechny vlastnosti epiblastu, především jiţ zmiňovanou pluripotenci. Amnion tedy zůstává oddělený od vývojových signálů, které regulují diferenciaci epiblastu v tvorbu všech typů buněk a orgánů vyvíjejícího se embrya. (Miki, Strom, 2006, s ) Embryonální kmenové buňky jsou známé také svými unikátními vlastnostmi, mezi něţ se řadí především nízká úroveň exprese antigenů hlavního histokompatibilního komplexu a méně omezený diferenciační potenciál. (Miki, Strom, 2006, s. 133) Pomocí průtokové cytometrie bylo prokázáno, ţe jen velmi malá část primárních AE buněk obsahuje třídu IA a třídu II lidských leukocytárních antigenů, kterým odpovídá nízké riziko odmítnutí tkáně. Pokud se však AE buňky 15

16 přemění v buňky jaterní a pankreatické, hraje v tomto procesu roli významný podíl buněk třídy IA, uţ však ne třídy II. Tato skutečnost naznačuje, ţe amnion můţe být dobře dostupným zdrojem multipotentních kmenových buněk, které mají jisté imunitní privilegium. (Ilancheran et al., 2007, s. 577) AE buňky jsou schopny udrţet plasticitu embryonálních buněk před gastrulací. Jak popisuje Miki a kolektiv amniotické epiteliální buňky izolované z placenty v období termínu porodu vyjadřují povrchové markery, které se běţně vyskytují na embryonálních kmenových a zárodečných buňkách. AE buňky exprimují především transkripční faktory octamer-binding protein 4 (Oct-4) a nanog. (Miki et al., 2005, s. 1549) Oct-4 je známý pro svou schopnost regulovat pluripotenci embryonálních kmenových buněk a udrţovat jejich sebeobnovu. V poporodním období je Oct-4 exprese detekována především v rostoucích oocytech a spermatogoniích. (Miki, Strom, 2006, s. 136). Na rozdíl od embryonálních kmenových buněk netvoří AE buňky teratomy, coţ bylo prokázáno transplantací do imunodeficitního myšího varlete. (Miki et al., 2005, s. 1549) Pluripotentní embryonální tumorové buňky mohou být vytvořeny pouze z buněk získaných před gastrulací, coţ potvrzuje, ţe je gastrulace důleţitá v diferenciaci a specifikaci osudu buňky. (Miki et al., 2005, s. 1549) Jak dokládají histochemické a genetické metody, mají AE buňky schopnost vytvářet in vitro všechny tři zárodečné listy, tedy endoderm diferencující v játra a pankreas, mezoderm vytvářející kardiomyocyty a ektoderm, u něhoţ je dobře popsána diferenciace v nervové buňky. Za určitých podmínek mohou AE buňky diferencovat do zralých neurálních buněk, které syntetizují a uvolňují neurotransmitery. Toto pozorování dokazuje, ţe buňky získané z plodové strany placenty si ponechávají multipotentní fenotyp dlouho poté, co se odliší od epiblastu. (Miki et al., 2005, s. 1549) Plodové mezenchymální fibroblasty (AMF) V embryu ve fázi hypoblastu se začíná vytvářet ţloutkový váček. Extraembryonální mezodermální buňky odvozené od hypoblastu tvoří pod amnioblastem a parietálním endodermem novou buněčnou vrstvu, jejíţ buňky nakonec utvoří plodový mezenchym. Z tohoto důvodu se amnion skládá z amniových embryonálních buněk 16

17 odvozených z epiblastu a z hypoblastu derivovaných AMF. Mezenchymální kmenové buňky mohou diferencovat do mnoha mezenchymálních buněčných linií zahrnující tukové a svalové buňky, osteoblasty a chondrocyty. Převáţná část těchto buněk se však izoluje z kostní dřeně. AMF je obtíţné získat in vitro z placenty bez toho, aniţ by nedošlo ke kontaminaci AE buněk. (Miki, Strom, 2006, s. 138) Etické otázky týkající se AE buněk Etické obavy vztahující se k pouţití embryonálních kmenových buněk souvisí převáţně s potřebou derivovat buňky z vyvíjející se blastocysty. Argumentem se pak stává, ţe derivace ES buněk přeruší normální vývoj, který by mohl vést k vytvoření lidského ţivota. Získání ES buněk z placenty však nemusí tyto obavy podněcovat. V současné době se placenta po porodu zkontroluje a poté se v nemocnici zlikviduje jako biologický odpad. Vzhledem k tomu, ţe je placentární tkáň k dispozici pouze po narození dítěte a není pouţita pro ţádný jiný účel, izolace a vyuţití kmenových buněk by tak neměla vyvolat etický problém. (Miki, Strom, 2006, s. 140) 2.3 Placentární mezenchymální kmenové buňky (PD-MSCs) Mezenchymální kmenové buňky tvoří vzácnou populaci multipotentních kmenových buněk podporujících krvetvorbu a diferencujících se v mezodermální buněčné linie, kterou zastupují kupříkladu osteocyty, chondrocyty, buňky srdečního svalu nebo endoteliální buňky. (Romanov, 2003, s. 105) Kromě toho tyto buňky sekretují velké mnoţství proangiogenetických a antiapoptotických cytokinů. (Semenov et al., 2010, s.193e1) Jak potvrdili výzkumem Li a kolektiv, MSCs mají imunoregulační vlastnosti, které jsou dány přímým imunosupresivním účinkem na proliferaci T-buněk in vitro a jsou tak schopny potlačit lymfocytární reakce. Z tohoto důvodu se mezenchymální kmenové buňky transplantují společně s hematopoetickými kmenovými buňkami, coţ vede ke zrychlení přihojení štěpu a zmírňuje nebo preventivě zamezuje graft-versus-host disease (GVHD). (Li et al., 2005, s. 539) V současnosti jsou lidské mezenchymální kmenové buňky primárně izolovány z kostní dřeně, vyuţívá se však také tkáň tuková a koţní, stejně jako je moţné tyto buňky izolovat z fetální jaterní a plicní tkáně. (Li et al., 2005, s. 539) Semenov a kolektiv uvádí, ţe MSC buňky v sobě ukrývá také placenta, pupečník, amniotické membrány a pupečníková krev. (Semenov et al., 2010, s.193e1) Výsledky studie prováděné Romanovem a kol. naznačují, ţe populace těchto cenných buněk je 17

18 přítomna i v endoteliální a subendoteliální vrstvě pupeční ţíly a můţe být kultivována. (Romanov et al., 2003, s. 105) Znalosti o vitalitě, karyotypu, fenotypu a expanzi placentárních mezenchymálních buněčných izolátech je předpokladem pro jejich terapeutické pouţití. (Semenov et al., 2010, s.193e1) Alogenní transplantace pupečníkové krve u dospělých příjemců je omezená především nízkou CD34+ buněčnou dávkou a následným GVHD. Placenta a pupečníkové krev jsou homogenní (obě mají fetální a extraembryonální mezodermální původ) a buňky přilnavého charakteru z placenty slouţící jako pojítko jsou mnohem kvalitnější neţ stromální buňky z kostní dřeně kultivované pro pupečníkovou krev in vitro. (Li et al., 2005, s. 540) Pouţití buněk kostní dřeně není vţdy vhodné vzhledem k moţnosti vysoké míry infekce a výraznému omezení počtu těchto buněk. Mezenchymální kmenové buňky patří mezi vzácné populace buněk (přibliţně 0,001% - 0,01%) přítomných v dospělé kostní dřeni. Jejich proliferační a diferenciační kapacita se navíc sniţuje s věkem. MSC buňky jsou taktéţ poměrně málo obsaţeny v periferní krvi dospělého a v pupečníkové krvi plodu v období termínu porodu. (Fukuchi et al., 2004, s. 649) Tato skutečnost znamená, ţe hledání alternativních zdrojů těchto buněk pro autologní i alogenní pouţití je stále aktuální (Li et al., 2005, s. 539) V této souvisloti je největší pozornost soustřeďována na tkáně obsahující buňky s vyšší proliferační aktivitou, schopností diferenciace a niţším rizikem virové kontaminace. (Romanov et al., 2003, s. 105) Placenta se tak jeví jako jejich slibný zdroj. (Li et al., 2005, s. 539) Mezenchymální kmenové buňky jsou vzácné svými vlastnostmi a slouţí jako nástroj pouţitelný v rámci tkáňového inţenýrství či buněčné terapie. (Romanov et al., 2003, s. 105) 2.4 Placentární hematopoetické kmenové buňky (HSCs) Hematopoetické kmenové buňky vedou v ţivotě jedince ke vzniku všech krevních buněčných řad. V průběhu fetálního vývoje se buňky vytváří nejprve ve ţloutkovém váčku, později jsou generovány z břišní aorty rozvíjející se aortální gonády mezonefros. Následně se tyto buňky mnoţí a kolonizují fetální játra a slezinu, posléze brzlík, kde se rozšiřují a diferencují, neţ osídlí kostní dřeň, kde setrvávají 18

19 v postnatálním ţivotě jedince. (Pipino et al., 2013, s. 58) Procesem sebeobnovy tak zajišťují nepřetrţitou produkci krevních buněk. Díky této jedinečné vlastnosti mohou regenerovat celý hematopoetický systém příjemce po transplantaci a poskytují moţnost vhodné formy léčby dědičných a získaných onemocnění krve. V současnosti jsou proto ve velké míře středem terapeutického zájmu. Nicméně omezená dostupnost lidských leukocytárních antigenů shodujících se s kostní dření dárce a relativně nízká výtěţnost buněk z více dostupných zdrojů, jako je pupečníková krev, sniţuje počet pacientů, kteří by mohli být léčeni. (Gekas et al., 2010, s. 1089) Hematopoéza HSC buňky jsou formovány pouze ve vymezeném časovém úseku embryogeneze, poté je rezerva těchto buněk udrţována sebeobnovou. Na rozdíl od postnatální krvetvorby, která je omezena pouze na kostní dřeň, k fetální hematopoéze dochází ve více různých anatomických lokalitách časově vymezeným způsobem. (Gekas et al., 2005, s. 365) Během fetálního vývoje toto načasování a lokalizace krvetvorby přispívá k rychlé diferenciaci prvních krevních buněk, které embryo potřebuje ke svému přeţití a růstu. Stejně tak umoţňuje vytvořit velkou zásobu nediferencovaných hematopoetických buněk potřebných pro krvetvorbu po narození. (Gekas et al., 2010, s. 1089) První hematopoetická aktivita je pozorována v extraembryonálním ţloutkovém váčku, který produkuje velké kohorty uni- a oligoliniových předchůdců (progenitorů). Ty nejsou schopny sebeobnovy a omezují se pouze na myeloidní a erytroidní vývoj, zatímco skutečné multipotentní HSCs schopné sebeobnovy jsou generovány později. (Gekas et al., 2010, s. 1089) Během rozvoje jsou krvetvorné buňky vystaveny několika odlišným extracelulárním podnětům, které podporují jejich produkci, rozšíření a funkční zrání, aby nabyly fenotypu dospělých HSC a byly schopny plnit jejich funkci. (Dieterlen-Lievre, Corbel, Salaun, 2010, s. 1085) Tak ţloutkový váček, fetální játra a slezina, stejně jako kostní dřeň zajišťují diferenciaci na myeloidní linii, zatímco T a B lymfoidní linie zesiluje a dozrává v brzlíku a v kostní dřeni. Všechny tyto orgánové základy vznikají z mezodermálního stroma, které poskytuje vhodné mikroprostředí odpovědné 19

20 za diferenciaci hematopoetických linií. (Dieterlen-Lievre, Corbel, Salaun, 2010, s. 1085) Placenta nebyla vţdy povaţována za hematopoetický orgán. První zprávy, které naznačují o této funkční moţnosti placenty, publikovali uţ v roce 1961 Till a McCulloch. Ve studii zjistili, ţe transplantace myší placentární tkáně do ozářeného myšího příjemce vede k formaci buněčných kolonií ve slezině. Jiná studie publikovaná v roce 1977 dala důkaz o tom, ţe placenta skrývající HSC, zachránila po transplantaci anemický fenotyp myši. (Gekas et al., 2010, s. 1090) Aţ do nedávné doby byla oblast aorta-gonády-mezonefros, přilehlé struktury a umbilikální artérie povaţovány za hlavní zdroj hematopoetických kmenových buněk. Nicméně vzhledem k nízkému počtu transplantovaných HSC nalezených v oblasti aorta-gonády-mezonefros, bylo otázkou, zda tato vzácná populace můţe jako jediná přispět k podstatnému mnoţství HSC buněk ve fetálních játrech. Vzhledem k tomu, ţe fetální játra nejsou schopná generovat tyto buňky a hematopoetické progenitory de novo, stalo se předpokladem, ţe i jiná neznámá místa embrya přispívají k tvorbě těchto buněk. (Gekas et al., 2010, s. 1090) 20

21 3 PUPEČNÍKOVÁ KREV Krev je důleţitou součástí lidského organismu. Dle Rokyty představuje tekutou tkáň sloţenou z krevních elementů, tedy červených a bílých krvinek a krevních destiček, obsaţených v krevní plazmě. Při své cirkulaci organismem plní krev důleţité funkce, mezi něţ řadíme transport dýchacích plynů a ţivin, odvádění zplodin metabolismu, zajištění homeostázy a imunitních dějů. (Rokyta, 2000, s. 58) Huser a Petrenko definují pupečníkovou krev jako krev z oběhu plodu. Vzhledem k tomu, ţe 97 % krve je obsaţeno v placentě a jen 3 % v pupečníku, jeví se jako správnější označení placentární krev. Výraz pupečníková krev je však v literatuře obecně pouţíván nejčastěji. (Huser, Petrenko, 2004a, s. 17) Pupečníková krev zajišťuje výměnu ţivin a dýchacích plynů mezi matkou a dítětem. Je však také významným zdrojem kmenových buněk, které po přestřihnutí pupečníku při porodu zůstávají spolu s krví ve zbylém pupečníku a v placentě. Hematopoézu udrţují dvě hlavní buněčné sloţky - hematopoetické buňky (HSCs) a mezenchymální progenitorové buňky (MPCs). Hematopoetické buňky mají multipotentní charakter a působí jako dlouhodobé prekurzory pro stromální buňky kostní dřeně, kostí, chrupavek, svalů a pojivové tkáně. (Erices et al., 2000, s. 235) Huser a Petrenko dodávají, ţe tyto krvetvorné kmenové buňky na svém povrchu nesou antigen CD34+, pomocí něhoţ mohou být identifikovány. (Huser, Petrenko, 2004b, s. 15) 3.1 Transplantace pupečníkové krve Světová zdravotnická organizace definuje transplantaci jako přenos lidských buněk, tkání či orgánů od dárce k příjemci za účelem záchrany lidského ţivota. (World health organization, 2013) Historie První studie pupečníkové krve se datuje do roku 1982, kdy H. Broxmeyer a T. Boyse na základě laboratorního pokusu vyvodili, ţe by pupečníková krev mohla slouţit jako cenný zdroj hematopoetických kmenových buněk pouţitelný k transplantaci kostní dřeně. Experiment tak vedl k dalším studiím, které tuto myšlenku rozvíjely. Na univerzitě v Indianapolis začali shromaţďovat vzorky pupečníkové krve, 21

22 a to především od dětí, jejichţ sourozenci se potýkali s onemocněním, které vyţadovalo transplantaci. Tohoto počinu vyuţili v roce 1988 v Paříţi Gluckman a kolektiv, kteří uskladněnou krev pouţili při transplantaci dítěte trpícího Fanconiho anémií. V návaznosti na tuto úspěšnou terapii byla v Ohiu v roce 1989 provedena první transplantace od příbuzného dárce a o čtyři roky později se týmu doktorky Kurtzberg podařila uskutečnit transplantace nepříbuzenská. Rok 1993 se stal významným také díky zaloţení první banky pupečníkové krve v New Yorku, která uchovávala a poskytovala krev pro alogenní transplantace. V dalších letech došlo k významnému rozvoji transplantací pupečníkové krve u dětí, s čímţ také souvisí vydání několika publikací napsaných například doktorem Wagnerem či doktorkou Kurzberg. (Smith, Thomson, 2000, s ) Typy transplantací Huser a Petrenko rozlišují několik způsobů, jak lze tkáň přenést. Pod pojmem autologní transplantace se rozumí, ţe příjemcem tkáně se stává sám dárce. V případě pupečníkové krve se příjemci podává krev získaná při jeho porodu. Naproti tomu štěp kostní dřeně se získá u pacienta v době, kdy příznaky onemocnění ustupují. Během onemocnění musí pacient podstoupit razantní léčbu. Ta zahrnuje likvidaci jeho kostní dřeně. K obnovení krvetvorby pak dochází díky jeho vlastního štěpu, který pacientovi dokáţe navrátit dříve odebrané hematopoetické buňky. Pokud dojde k situaci, ţe jsou ve štěpu přítomny nádorové buňky, pacient podstupuje transplantaci jen v tom případě, ţe je jeho organismus schopen se s určitým mnoţstvím vypořádat. (Huser, Petrenko, 2004a, s. 17) Při alogenní transplantaci příjemce obdrţí tkáň jiného dárce. Aby k transplantaci mohlo dojít, musí se určit shoda tkáňových znaků, tedy HLA typizace. (Huser, Petrenko, 2004a, s. 17) Alogenní typ přenosu lze ještě rozdělit na příbuzenský a nepříbuzenský. Při příbuzenském přenosu se dárcem stává rodinný příslušník. Za nejvhodnější se povaţuje tkáň sourozence, protoţe zvyšuje šanci na shodu aţ o 25 %. (Sedláček, 1999) Pokud dochází k nepříbuzenské transplantaci, dárce se hledá v registru dárců kostní dřeně nebo v registru dárců pupečníkové krve, je tedy anonymní. Šance, ţe v registrech bude nalezen vhodný dárce či transplantát, se však pohybuje kolem 50 % a můţe trvat několik měsíců aţ let. (Huser, Petrenko, 2004a, s. 17) 22

23 Xenogenní transplantace představuje přenos tkáně ze zvířete na člověka. V případě potřeby transplantace hematopoetické tkáně se tento typ nevyuţívá. (Huser, Petrenko, 2004a, s. 17) HLA typizace Aby se transplantace zdařila, je nutná shoda HLA mezi dárcem a příjemcem. Moise uvádí, ţe lidské leukocytární antigeny (HLA) byly poprvé objeveny v roce Jsou součástí hlavního histokompatibilního komplexu (MHC), který se nachází na krátkém raménku chromozomu 6. Lidské leukocytární antigeny jsou kódovány šesti hlavními geny, jejichţ alely se liší svými nukleotidovými sekvencemi. To má za následek tvorbu rozdílných transkripčním bílkovinným produktů a následné vyjádření různých HLA antigenů. Z celého lidského genomu jsou právě HLA geny nejvíce polymorfní. (Moise, 2005, s. 1395) Shankarkumar dodává, ţe z tohoto důvodu je jen pár jedinců identických, coţ zajišťuje populaci správné vybavení pro boj s nemocemi. Umoţňují tedy normální funkci imunitního systému tím, ţe dokáţí rozeznat samy sebe od antigenů cizích, které poté prezentují T-lymfocytům. (Shankarkumar, 2004, s. 91) Jelikoţ potomci obdrţí jeden chromozom od kaţdého z rodičů, nastává tak v rodině se dvěma dětma situace, kdy je šance HLA shody jedna ku čtyřem. Pokud dva sourozenci sdílí chromozom jeden, označují se za haploidentické. Šance shody je zde tedy 50 %. HLA se dělí dle struktury a funkce do dvou tříd, z nichţ se antigeny I. třídy (HLA A, B, C) nachází na povrchu téměř všech jaderných buněk lidského těla. Antigeny II. třídy (HLA PR, DQ, DP) jsou exprimovány na povrchu buněk imunitních a mohou být indukovány v jiný buněčný typ. (Moise, 2005, s. 1395) HLA typizace se provádí na základě stanovení shodných znaků. Dříve se k HLA typizaci vyuţívaly sérologické metody (tzv. typizace s niţším rozlišením), které však byly nahrazeny technikami novějšími. Typizace umoţňující střední rozlišení definuje skupinu molekul, které kódují specifický antigen. Nejvyššího rozlišení pak dosahuje typizace vyuţívající sekvenování DNA k určení konkrétní alely. (Moise, 2005, s. 1395) Najem a Minn uvádí, ţe nejvhodnější štěp k transplantaci je ten, který se shoduje ve všech šesti HLA markrech. (Najem, Minn, 2011, s. 13) Butler a Menitove povaţují za prahovou hodnotu úspěšné transplantace shodu třech znaků z šesti. (Butler, 23

24 Menitove, 2011, s. 672) Najem a Minn však dodávají, ţe se proti této shodě upřednostňují čtyři markery z šesti. (Najem, Minn, 2011, s. 15) Nesoulad HLA můţe vést nejen k odmítnutí transplantované tkáně, ale i k potransplantačním komplikacím. (Shankarkumar, 2004, s. 101) Dle Jacobsohna a Vogelsanga se za nejčastější komplikaci povaţuje graft-versus-host disease (GVHD), která je označována také jako reakce štěpu proti hostiteli. Dochází tedy k napadení hostitelských tkání protilátkami, které si proti tkáním vytvořily T-lymfocyty dárce. Hlavními tkáněmi, které GVHD postihuje, jsou kůţe, játra a gastrointestinální trakt. (Jacobsohn, Vogelsang, 2007) Akutní reakce štěpu proti hostiteli se vyskytuje v prvních 100 dnech po transplantaci a je hodnocena stupněm I. (lehká) aţ IV. (těţká). Chronická reakce se rozděluje na omezenou nebo rozsáhlou. Stupeň III. a IV. akutní GVHD nastává v % nepříbuzenských transplantací kostní dřeně, chronická GVHD se vyskytuje u % těchto případů. (Moise, 2005, s. 1396) U pacienta s hematopoetickými malignitami, především chronickou myeloidní leukémií, můţou hrát pozitivní roli zbytkové T-lymfocyty dárce. Ty dokáţí v těle příjemce detekovat dosud přeţívající maligní buňky a ničit je. (Sedláček, 1999) Tato schopnost T-buněk je označována jako graft-versus-leukemic efekt. (Moise, 2005, s. 1396) Aby se zvýšila úspěšnost přijetí štěpu, musí příjemci 5-10 dní před transplantací podstoupit přípravný reţim. Ten zahrnuje samostatnou chemoterapii nebo její kombinaci s radioterapií, aby došlo ke zničení nemocných buněk v těle pacienta a sníţilo se tak riziko odmítnutí štěpu potlačením imunitního systému. (Najem, Minn, 2011, s. 12) V České republice se u dospělých dává přednost pouţití reţimů s redukovanou intenzitou, zatímco u dětí se vyuţívá reţim myeloablativní, který pouţívá vysokodávkovou chemoterapii. Ta se často doplňuje ozářením celého těla pacienta. (Keslová, 2009) Intenzita přípravného reţimu je velmi důleţitá, mnoho těchto terapií je však spojeno s vedlejšími účinky a rizikovými faktory, o kterých by pacienti měli být předem informováni. (Najem, Minn, 2011, s. 13) Moise uvádí faktory, které mohou ovlivnit průběh transplantace. Ty zahrnují věk pacienta a dárce, délku léčby, zdravotní stav pacienta, stupeň shody HLA a celkový počet kmenových a progenitorových buněk obsaţených v jednotce pupečníkové krve určené k transplantaci. (Moise, 2005, s. 1396) Jak zmiňují Butler a Menitove, 24

25 klinické výsledky souvisí s celkovým počtem jaderných buněk v jednotce. Jejich minimální počet vztaţený na kilogram příjemce by měl dosáhnout hodnoty 2,5x10⁷. (Butler, Menitove, 2011, s. 672) Verneris a kolektiv však dodávají, ţe se štěpy stávají účinnějšími, pokud obsahují spíše 3,5x10⁷ jaderných buněk na kilogram člověka při úplné shodě HLA a 4x10⁷ buněk při shodě menší. (Verneris et al., 2009, s. 4294) Vzhledem k tomu, ţe jednotka pupečníkové krve obsahuje 1x10⁹ jaderných buněk, vyuţívá se pupečníková krev spíše k transplantaci malým dětem. U dospělých a mladistvých se upřednostňuje tzv. double transplantace, kdy se příjemci podávají dva transplantáty různých dárců. Hlavní překáţkou pouţití pupečníkové krve u dospělých a mladistvých je riziko selhání štěpu a opoţděné zotavení krvetvorné tkáně. Aby se sníţil výskyt těchto neţádoucích projevů, vyuţívá se metody ex vivo rozšíření T-regulačních buněk. (Butler, Menitove, 2011, s. 672) T-regulační buňky (Tregs) popisují Najem a Minn jako imunitní supresorové buňky, které omezují imunitní odpověď organismu. Studií na myších bylo prokázáno, ţe v případě vyčerpání Tregs po jejich podání s alogenním transplantátem HSC, dochází ke zvýšené T-buněčné odpovědi na tumory, vlastní antigeny a patogeny, coţ má za následek zvýšení GVHD u příjemců. (Najem, Minn, 2011, s. 12) Jelikoţ dnes dochází k častějším transplantacím u dětských pacientů, je třeba se zabývat také otázkou kvality jejich ţivota. Soukupová uvádí, ţe intenzivní přípravný předtransplantační reţim můţe mít za následek pozdní komplikace, které nastávají převáţně z důvodu nezralosti tkání a orgánů mladého jedince. Komplikace tvoří heterogenní skupinu onemocnění, jeţ nemusí mít fatální následky, ovšem téměř vţdy ovlivňují kvalitu ţivota vyléčeného jedince. Nejčastější komplikace jsou spojeny s reakcí štěpu proti hostiteli. U dítěte se objevuje postiţení očí jako je mikrovaskulární retinopatie či katarakta, postiţení dutiny ústní a zubů projevující se mukozitidou. Zasaţeny mohou být také plíce ve formě plicní obstrukce nebo pneumonie. Onemocnění srdce se projeví srdečním selháním či arytmií, onemocnění ledvin zase nefropatiemi. Dále se můţe objevit porucha funkce štítné ţlázy nebo kostního a kloubního aparátu. Závaţná je tvorba malignit, která převáţně postihuje kůţi. Komplikace navíc ovlivňují růst a pubertu dětí. (Keslová, 2009) 25

26 3.2 Odběr pupečníkové krve Moise popisuje odběr pupečníkové krve pomocí dvou technik. Odběr in vivo se provádí v okamţiku, kdy ještě placenta nebyla porozena a pupeční pahýl tedy zeje z rodidel. Sběr krve in vitro se uskutečňuje aţ po porodu placenty do speciálního odběrového zařízení. (Moise, 2005, s. 1399) V České republice se upřednostňuje technika in vivo. (Pilka a kol., 2001) Will uvádí, ţe odběru pupečníkové krve nebrání ani porod císařským řezem, kdy však krev lze získat jedině po vybavení placenty. Děje se tak z důvodů moţné kontaminace mateřskou krví a je taktéţ důleţité operaci zbytečně neprodluţovat. (Will, 1999). Odběr by měli provádět pouze zaškolení pracovníci mající znalosti o odběru, zpracování, přepravě a uskladnění pupečníkové krve. (Butler, Menitove, 2011, s. 671) Pokud se rodička rozhodne pro uskladnění pupečníkové krve, musí podstoupit odebrání důkladné rodinné anamnézy. Ta se soustředí především na přezkoumání hematologických a imunitních abnormalit, stejně jako moţných maligních onemocnění. Pokládány jsou také otázky týkající se cestování, aby se mohl vyloučit moţný infekt získaný ve specifických zámořských zemích. Dále jsou dotazy směřovány na vystavení se ţivé virové vakcíně, uţívání nelegálních drog nebo vysoce rizikové sexuální chování. Jestliţe se dárcem stává kojenec, je nutné vyloučit přítomnost homozygotní hemoglobinopatie. (Moise, 2005, s. 1400) Před porodem se pak rutinně provádí odběr vzorků na mikrobiologické vyšetření zahrnující HIV, hepatitidu typu B a C, T-lymfotropní virus (HTLV) a syfilis. (Franklin, Smith, 2000, s. 130) K odběru pupečníkové krve dochází ihned po podvázání a přestřihnutí pupeční šňůry na porodním sále. (Moise, 2005, s. 1398) Je důleţité zajistit, aby porodník či porodní asistentka účastnící se odběru nepřerušili pupečník dříve neţ je zvykem. Tímto se předchází moţnému poškození plodu. (Will, 1999) Před samotným sběrem se pupečník otře a dezinfikuje pomocí jodpovidonu a alkoholu, přičemţ musí být přidrţován v dostatečné vzdálenosti od hráze, aby se zabránilo moţné kontaminaci mateřskou krví a bakteriemi. (Moise, 2005, s. 1399) Pupečník je podloţen sterilní rouškou a ještě jednou důsledně dezinfikován v místě vpichu. (Butler, Menitove, 2011, s. 671). Poté se hrot jehly zanoří do pupeční ţíly. Jehla je napojena pomocí 26

27 odběrové hadičky na uzavřený sběrný vak s obsahem antikoagulancií v obvyklém sloţení citrát-fosfát-dextróza. (Moise, 2005, s. 1399) Vak by měl být při odběru udrţován v takové poloze, která umoţňuje jeho naplnění pomocí gravitace. (Butler, Menitove, 2011, s. 671). Poté co krev pupeční šňůrou přestane vytékat, odebírající jehlu vysune, zbylou krev v odběrové hadičce nechá vtéct do vaku a následně hadičku zaškrtí. Na závěr se odebere ještě krev matce a přibliţně 2 ml sráţlivé krve z placenty pro účely virologického vyšetření. (Moise, 2005, s. 1400) Odběr in vitro technikou popisuje Moise ve svém článku Umbilical cord stem cells. Ke sběru pupečníkové krve obvykle dochází mimo porodní box. Porodník či porodní asistentka podváţí a přestřihnou pupečník v jeho distální části a následně se porodí celá placenta. Mělo by se dbát na to, aby se placenta i pupečník vlivem příliš silného tahu nenatrhly. Vzniklé prasklinky tak mohou být snadno kontaminovány bakteriemi a pupečníková krev je znehodnocena. Placenta se poté sterilně vloţí do přídrţného zařízení, které má podobu visutého trychtýře. Pupeční šňůra prochází otvorem na dně trychtýře a je tak volně přístupná zdravotníkovi, který po její důkladné dezinfekci můţe provést odběr mající stejný průběh jako v případě techniky in vivo. (Moise, 2005, s. 1399) Tyto dvě moţnosti odběru jsou také porovnávány z hlediska objemu získané krve a počtu jaderných buněk, který se zdá být vyšší při odběru in vivo. Moţným důsledkem je zaškrcení placentárních cév při děloţní involuci, která nastává fyziologicky po porodu dítěte. Dalším moţným vysvětlením je tvorba makroskopických krevních sraţenin, která můţe nastat v souvislosti s prodlouţením doby odběru z důvodu manipulace s tkáněmi. (Moise, 2005, s. 1399) Will také poukazuje na rozdíl v kvalitě získaných buněk. In vitro odběr totiţ můţe poskytnout menší mnoţství krvetvorných kmenových buněk, čímţ je jednotka znehodnocena a musí být vyřazena. (Will, 1999) Moise uvádí také několik perinatálních faktorů, které mohou ovlivňovat mnoţství buněk v jednotce. Vyšší čísla jsou spojována s prvorozeným dítětem, protrahovaným porodem, větší porodní hmotností a vyšším gestačním stářím plodu. Zmiňuje i zkrácení časového intervalu od porodu k podvázání pupeční šňůry. Naopak niţší mnoţství buněk v jednotce ovlivňuje kouření matky, coţ koreluje s menší porodní hmotností plodu. (Moise, 2005, s. 1398) 27

28 Lazárková ještě popisuje výhody kombinovaného odběru, který je poměrně mladou metodou. Ta spočívá v zahájení odběru pupečníkové krve klasickou cestou, tedy in vivo. Pokračuje se sběrem krve z povrchových ţil placenty. Neţ však k této fázi dojde, musí být placenta opláchnuta fyziologickým roztokem a dezinfikována přípravkem bez obsahu jódu. Poté se krev z placenty nasává sterilně do stříkaček s obsahem antikoagulačního roztoku a takto naplněné stříkačky se vyprazdňují do sběrného vaku, ne však do toho stejného, ve kterém je přítomna pupečníková krev. Tímto se zabraňuje smíchání odebraných krví, protoţe u krve z placenty hrozí větší riziko kontaminace a celá odebraná jednotka by tak byla znehodnocena. Sběr krve z placentárních cév pokračuje aţ do doby, dokud lze krev nasát. Cílem metody je získat co největší moţný objem této vzácné tekutiny. Placentární cévy lze při odběru střídat. (Lazárková, 2013) Po skončení odběru je jednotka pupečníkové krve označena štítkem, na kterém je zaznamenáno, jakého objemu jednotka nabývá a kolik váţí. Předtím, neţ se jednotka zmrazí, je taktéţ zaznačen počet jaderných, mononukleárních a CD34+ buněk obsaţených v krvi. Všechny tyto parametry jsou v současnosti významné, neboť na nich závisí výsledek transplantace. Butler a Menitove uvádí, ţe se minimální počet jaderných buněk vztaţený na kilogram příjemce pohybuje kolem 2,5 x (Butler, Menitove, 2005, s ) Aby tedy byla jednotka pupečníkové krve k uţitku, je dle Willa potřeba dodrţet její odebrané mnoţství. To se pohybuje mezi 40 aţ 150 ml, ve kterých je obsaţeno 4-11 x 10 8 jaderných buněk. (Will, 1999) Zachování kvality jednotky pupečníkové krve ovlivňuje také teplota při transportu a skladování, která se udává v rozmezí 22 ± 4 C. (Butler, Menitove, 2005, s. 671) Předtím, neţ se jednotka zamrazí, odešlou se vzorky krve na bakteriologické, virologické a plísňové vyšetření a provede se také testování na HLA typizaci. Do pupečníkové krve se poté přidá roztok hespanu usnadňující během odstřeďování oddělení červených krvinek od mononukleárních krvinek bílých. Následně dochází k oddělení plazmy a v jednotce zůstává konečný objem 20 ml. Obecně platí, ţe je v konečné fázi přidán ještě 10 % dimethylsulfoxid (DTMO) a jednotka můţe být kryokonzervována a uloţena do tekutého dusíku, který dosahuje teploty C, v níţ tkáň vydrţí neporušená po mnoho let. (Moise, 2005, s. 1400) 28

29 3.3 Banky pupečníkové krve Butler a Menitove zmiňují dva typy bank pupečníkové krve. Veřejné banky přijímají pupečníkovou krev novorozence po informovaném souhlasu rodičů. Jednotka krve se poté stává majetkem banky pro budoucí pouţití. Krevní zásoby banky podléhají registraci a jsou proto dostupné všem zdravotnickým zařízením, které jeví zájem o jednotky pupečníkové krve k potřebným transplantacím. (Butler, Menitove, 2005, s. 670) Z tohoto důvodu musí krevní jednotky splňovat přísné normy pro testování infekčních chorob. Důsledně je také provedena HLA typizace a záznamy o typech a počtu buněk. Jednotky, které nesplňují určitá kritéria tak nejsou zahrnuta do aktivních zásob a slouţí k vědeckým účelům. (Moise, 2005, s. 1401) Výběr dárce do registru je tedy velmi pečlivý. Předchází mu zjištění celkové rodinné anamnézy, aby se minimalizovalo riziko přenosu některých dědičných poruch, především postihující krvetvorbu, jeţ by mohly mít dopad na příjemce. Kontraindikací k poskytnutí krve jako transplantátu jsou také závaţná postiţení nebo nemoci identifikované u plodu před narozením. Další vylučovací kritéria zahrnují infekční nemoci matky, jako je HIV, hepatitida, závaţné komplikace během těhotenství, předčasný porod s porodní hmotností plodu menší neţ 1500g nebo perinatální asfyxie plodu. (Butler, Menitove, 2005, s. 671) Kaţdé dítě musí po narození podstoupit fyzikální vyšetření, které by mělo odhalit sebemenší anomálii spojenou s vrozenou hematologickou poruchou. Půl roku po porodu je nutné, aby dárce znovu vyšetřil lékař a podal příslušné bance lékařskou zprávu. (Moise, 2005, s. 1400) Soukromé banky provádí sběr a uchování pupečníkové krve výhradně pro individuální potřeby rodiny. Původně byly tyto banky koncipovány pro autologní pouţití, pokud by se u dítěte v průběhu ţivota vyvinulo onemocnění, jehoţ léčbu by umoţnila právě pupečníková krev. Banky později povýšily pouţitelnost krve i pro alogenní transplantace v rámci rodiny. Jednotky proto nejsou zařazeny v registru dostupném veřejnosti. Odebraná pupečníková krev je odeslána do centrální laboratoře ke zpracování. Jelikoţ je pouţita pouze v rámci rodiny, neprovádí se u ní tak přísná testování. Odběr, zpracování a uskladnění je však spojeno s poplatkem, který rodina musí uhradit. (Moise, 2005, s ) Šance, ţe se u dítěte vyvine onemocnění léčitelné jeho vlastní pupečníkovou krví, dosahuje 0,04 % aţ 0,005 %. 29