Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici STUDIUM SLOŽENÍ KULTIVAČNÍCH MÉDIÍ PRO MNOŽENÍ ODRŮD MERUNĚK METODOU IN VITRO Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce Ing. Břetislav Křižan, Ph.D. Vypracovala Eliška Kadlecová Lednice 2014

2

3

4 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci Studium složení kultivačních médií pro množení odrůd meruněk metodou in vitro vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna na v souladu s 47b zákona. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Lednici dne: podpis

5 Obsah Seznam použitých zkratek Úvod Cíl práce Meruňka obecná Historie Současnost Meruňka jako potravina Botanický popis Požadavky na stanoviště Plodnost meruněk Odrůdy meruněk Meruňkové podnože Mikropropagace Historie Fáze mikropropagace Přípravná fáze Iniciační fáze Multiplikační fáze Prodlužovací fáze Aklimatizace Média Makroelementy Mikroelementy Cukry Růstové regulátory Vitamíny Nedefinované složky Aktivní uhlí Voda ph média Zpevnění média Sterilita Založení aseptické kultury Znehodnocení založené kultury Další faktory ovlivňující růst explantátu Světlo Teplota Typy mikropropagace Somatická embryogeneze Mikropropagace stimulací axilárního větvení Mikropropagace tvorbou adventivních prýtů Zakořeňování Genetická nestabilita explantátových kultur Ozdravování rostlin Kryoprezervace Dřeviny in vitro Množení pomocí kultur z pupenů Pomocí kultur z embryí Kultury meruněk in vitro

6 Kultury embryí Kultury z adventivních pupenů a axilárního větvení Meristémové kultury Pylové a prašníkové kultury Kultury z listů Skladování za nízkých teplot Prevence hyperhydricity Média pro ozdravované kultury meruněk Porovnání výsledků tradičního a in vitro množení Závěr Shrnutí Resumé Použité zdroje

7 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK MS médium Murashige a Skoog (1962) LS médium Linsmaier a Skoog (1965) B5 médium Gamborg et al. (1968) N6 médium Chu (1978) WPM - Woody Plant Medium (Lloyd a McCown, 1980) SBH - Smith, Hailey and Hough médium (Smith et al., 1969) C 2 d - Chee médium (Chee and Pool, 1987) QL - Quoirin a Lepoivre médium (Quoirin a Lepoivre, 1977) IAA indolyl-3-octová kyselina IBA indolyl-3-máselná kyselina NAA naftyloctová kyselina 4-CPA chlorfenoxyoctová kyselina 2,4-D - 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina 2,4,5-T - 2,4,5-trichlorfenoxyoctová kyselina picloram - 4-amino-3,5,6-trichlorpikolinová kyselina BAP - benzylaminopurin BA - benzyladenin 2-iP isopentenyladenin kinetin furfurilaminopurin ABA kyselina abscisová 6

8 1. ÚVOD Množení rostlin in vitro, tedy technikou mikropropagace, je stále více využíváno nejen ve výzkumu, ale i ke komerčnímu množení rostlin. Umožňuje z relativně malého množství materiálu vypěstovat mnoho samostatných jedinců. To je dáno díky totipotenci rostlinných buněk - schopnosti vytvořit i z jediné zdravé buňky celou rostlinu. Explantáty mohou tedy být i velmi malé, někdy pouhých několik buněk. Mikropropagace je cestou vegetativního množení, dopěstované rostliny mají stejnou genetickou výbavu a většinou i fenotypový projev jako matečná rostlina. Touto cestou lze množit mnoho rostlin, které klasickými metodami nelze množit vůbec, nebo jen velmi obtížně (například orchideje). Pěstování v řízených podmínkách také umožňuje celoroční produkci, šetří místo a často bývá výrazně rychlejší než klasické množení. Nevýhodou je hlavně vysoká cena potřebného zařízení a chemikálií, nutnost dobře proškoleného personálu a u některých rostlinných druhů stále chybějící informace o vhodných médiích a dalších podmínkách množení. Velkou výhodu skýtá možnost ozdravování rostlin od různých patogenů, hlavně od virových infekcí. Zvláště u druhů, které se množí pouze vegetativně, je totiž velké procento infikovaných rostlin, což může výrazně snižovat jejich produktivitu. Při dopěstování nových jedinců z meristematických pletiv, která nejsou vodivými pletivy propojena se zbytkem rostliny, je riziko infekce virovými patogeny minimální. In vitro kultury jsou významné také pro výzkum a šlechtění umožňují dopěstovat haploidní buňky v celé haploidní rostliny, indukovat fúze protoplastů a vznik hybridů, slouží k získávání geneticky modifikovaných rostlin i k indukci a sledování mutací, které mohou být následně podchyceny pro další zkoumání a případné využití. Tekuté kultury v bioreaktorech mohou být využity pro získání cenných sekundárních metabolitů rostlin, které mají často farmaceutické využití. Ke komerčnímu množení dřevin je mikropropagace používána od konce sedmdesátých let 20. století. Nejprve byla používána pro množení drobného ovoce (jahody, maliny) a ovocných dřevin, zvlášť broskvoní. Postupně byly lépe propracovány postupy pro in vitro množení mnoha dalších druhů. 7

9 2. CÍL PRÁCE Cílem této práce je shromáždit dostupné údaje o médiích, která byla použita pro kultivaci a mikropropagaci meruněk, případně konkrétní výsledky a reakce různých meruňkových kultivarů na daná média. Výsledkem by měl být seznam médií, která byla při kultivaci meruněk úspěšná. Tento seznam může být použit v navazujících pracích. 8

10 3. MERUŇKA OBECNÁ Rod meruňka (Armeniaca Mill.) spadá pod čeleď růžovitých (Rosaceae). Tento rod obsahuje mnoho různých druhů a kultivarů, z nichž některé jsou pěstovány jako ovocné stromy. Na území České republiky je však rozšířen pouze jediný druh, který v podmínkách našeho klimatu prospívá meruňka obecná (Armeniaca vulgaris Lam., syn. Prunus armeniaca L.) s množstvím odrůd. Jednotlivé odrůdy můžeme rozdělit do několika kategorií podle geografického výskytu: skupina středoasijská, evropská, íránsko-kavkazská, džungarsko-zailijská a mandžusko-sibiřská. V našich klimatických podmínkách mají význam zejména odrůdy skupiny evropské, pro šlechtění bývají někdy využívány i odrůdy středoasijské skupiny, zejména pro šlechtění ke zvýšení mrazuvzdornosti. (Hričovský, 2004) Do rodu meruňka patří, kromě zmíněné meruňky obecné (Prunus armeniaca L.), meruňka sibiřská (Armeniaca sibirica L.), meruňka mandžuská (Armeniaca mandschurica Köhne), meruňka japonská (Armeniaca mume Sieb.), meruňka Davidova (Armeniaca davidiana Carr.), meruňka brigantská (Armeniaca brigantiaca Vill.) a meruňka černá (Armeniaca dasycarpa Ehrh.). (Bažant, 2004) Meruňka obecná (Prunus armeniaca L.) je značně náročným ovocným druhem, a to jak na klimatické, tak i půdní podmínky. Kritickým obdobím rozhodujícím o výši úrody bývá jaro, kdy jsou pupeny, květy a někdy i mladé plody často poškozovány působením nízkých teplot. Výnosy mohou být proto nepravidelné. Zejména díky tomuto riziku jsou v ČR meruňky spíše okrajovým ovocným druhem. Plody meruněk mohou být konzumovány jak čerstvé, tak i sušené nebo jinak upravované. Jsou oblíbeným ovocem pro výrobu kompotů, marmelád a destilátů. Také mohou být různě tepelně upravovány jako součásti pokrmů. (Bažant, 2004) 3.1 Historie Původní oblastí výskytu divokých druhů meruněk je pravděpodobně severní Čína. Známá zde byla už v době let př. n. l. Na počátku našeho letopočtu se začala z Číny šířit dál. Do Arménie, která byla dlouhou dobu považována za pravlast meruněk, 9

11 se dostala přes Indii a z Arménie se rozšířila dál do Íránu, odkud ji Řekové, Římané a Arabové dovezli do Středomoří. Do východní Evropy se meruňka dostala přes Turecko a oblast kolem Černého moře. Na naše území byly meruňky pravděpodobně zavlečeny už římskými legiemi ve 2. stol. n. l. Větší pozornosti se jim však dostalo v 16 stol., kdy byly pěstovány v klášterních a zámeckých zahradách, z nichž se později dostaly i k prostým lidem. Do západní Evropy se dostala v průběhu 10. stol., ale k výraznějšímu rozvoji jejího pěstování došlo teprve v 19. stol. (Bažant, 2004) 3.2 Současnost Z celosvětového pohledu nyní meruňky zabírají asi 2,5 % z produkce ovoce v mírném pásmu, což je přibližně 20x méně než kolik je produkováno jablek. Celkový výnos se pohybuje kolem tun za rok. Největším producentem meruněk je Asie, která pokrývá více než třetinu z tohoto množství. Zemí s největší produkcí meruněk (asi tun ročně) je Turecko. Dalšími významnými producenty jsou Maroko, Írán, Pákistán a USA. V Evropě patří k nejdůležitějším producentům meruněk Španělsko ( tun ročně) a Francie ( tun ročně), což dohromady tvoří přibližně 60 % celkové produkce meruněk v Evropě. V České republice jsou meruňkové sady soustředěny na jižní Moravě, která je nejteplejší oblastí. Roční výnosy významně kolísají v závislosti na průběhu počasí daného roku, pohybují se přibližně kolem tun ročně. Produkci také ohrožuje napadení houbou Monilia laxa (Aderh. et Ruhl). Možnost zvýšení produkce sadů představují některé nové odrůdy meruněk, které umožňují vyšší hustotu výsadby. (Bažant, 2004) 3.3 Meruňka jako potravina Meruňky jsou cenným zdrojem energie a vitamínů. Obsahují kolem 4 % cukru, 1 % kyseliny jablečné, volné aminokyseliny, pektin, množství karotenu (provitamin 10

12 vitaminu A), vitamin B 2, vitamin C (kyselinu L-askorbovou), vitamíny P, E, B 1 a PP. Semena jsou ceněna pro vysoký obsah oleje (kolem 40 %). Meruňky jsou také výborným zdrojem minerálních látek, zejména draslíku, dále pak hořčíku, vápníku, síry, železa, fosforu a chlóru. Plody meruněk mají mnoho účinků prospěšných pro lidské zdraví. Pravidelná konzumace meruněk upravuje krevní tlak, zvyšuje vitalitu, pomáhá snižovat hladinu cholesterolu v krvi a pozitivně působí na vývoj u dětí. Také jsou vhodnou součástí stravy při rekonvalescenci, bolestech žaludku a problémech se střevní peristaltikou. (Hričovský, 2004) 3.4 Botanický popis Meruňky rostou jako keře nebo stromy vysoké až 10 m. Růst je poměrně rychlý a dospívají za 3-4 roky. Listy jsou eliptické nebo vejčité, mohou být až okrouhlé, se zubem na špičce a řapíkovým výkrojem srdčitým nebo okrouhlým. Okraj listu je jednoduše nebo dvojitě ozubený, často i pilovitý. Pupeny (květní i listové) se zakládají po 2-3 v paždí listů. Květy se vyvíjí dříve než listy, jsou bílé nebo růžové, velké, na krátké stopce nebo přisedlé. Plodem je peckovice, většinou ze stran mírně smáčknutá, plstnatá, se žlutou, oranžovou až načervenalou slupkou (často s líčkem) a šťavnatou dužninou. Pecka je zploštělá, může být hladká i drsná nebo s jamkami. Semena jsou poměrně velká, s chutí hořkých mandlí, u některých kulturních odrůd mohou být i sladká. (Blaha et al., 1966) 3.5 Požadavky na stanoviště Meruňky jsou velmi náročným druhem, co se týče výběru stanoviště. To je také spolu s počasím hlavním činitelem ovlivňujícím úrodu. Meruňky mají poměrně krátké období dormance a zjara bývají často poupata, květy nebo mladé plody poškozeny nízkými teplotami. (Hričovský, 2004) Celkově meruňky vyžadují silné oslunění, snášejí poměrně dobře i suché periody a méně kvalitní půdu. (Blaha et al., 1966) 11

13 3.6 Plodnost meruněk Meruňky mají ve své genetické výbavě 2 sady chromozomů po osmi (2n = 16) a ve většině případů jsou samosprašné. Některé odrůdy je však pro větší úrodu vhodné vysazovat spolu s jinými například Vesna, Lejuna, Veecot a Leskora. Zcela cizosprašná je odrůda Orangered. Meruňky jsou opylovány převážně včelami. V době květu meruněk však bývá chladno a včelstva jsou slabá, proto se pro podporu opylení v meruňkových sadech často umisťují včelí úly. (Hričovský, 2004) 3.7 Odrůdy meruněk V České Republice ve výsadbách naprosto převládá odrůda Velkopavlovická. Tvoří více než 70 % z celkové rozlohy meruňkových sadů, tedy přibližně 1217 ha. Dalšími pěstovanými odrůdami jsou Maďarská (8,2 %), Karola (5,8 %), Bergeron (4,3 %) a Rakovského (2 %). Jen malé plochy zabírají odrůdy Leskora, Veecot, Vesna, Paviot, Sabinovská a další. V nově zakládaných sadech a při obnovách se od některých odrůd upouští (například Rakovského ), vysazovány bývají odrůdy Velkopavlovická (44,3 %), Bergeron (22,1 %), v menším množství také Karola, Leskora, Maďarská, Veecot, Vesna a některé nové odrůdy, které jsou pro pěstitele lákavé odlišností plodů. Často nabízejí větší, pevnější plody s možností delšího skladování. Také nástup plodnosti bývá u nových odrůd poměrně rychlý (2-4 roky). Na druhou stranu chuťové kvality plodů těchto meruněk bývají jen průměrné. (Bažant, 2004) Velkopavlovická Nejrozšířenější odrůda na našem území, zejména díky atraktivitě svých plodů. Vznikla v 19. století ve Velkých Pavlovicích. Patří mezi bujně rostoucí samosprašné odrůdy. Dřevo je proti nízkým teplotám poměrně odolné, pupeny a květy však bývají náchylné k poškození jarními mrazy. 12

14 Plody jsou sytě oranžové, poměrně velké, šťavnaté a chutné, vhodné pro zpracování i přímý konzum. Bergeron Perspektivní francouzská odrůda, velmi oblíbená po celém světě. Růst je spíše slabší a stromy potřebují pravidelný řez. Tato odrůda velmi dobře snáší mrazy, a to jak co se týče dřeva, tak i pupenů. Jedná se o velmi plodnou odrůdu, u které je nutností regulace násady plodů. Plodnosti stromy dosahují brzy a plodí pravidelně. Plody jsou žlutooranžové s červeným líčkem, chutné, dobře snáší manipulaci a transport. Karola Tato odrůda byla vyšlechtěna ve Valticích křížením Velkopavlovické odrůdy s Klobouckou ranou. Žluté plody s červeným líčkem vynikají chutí a pevností. Leskora Šlechtění této odrůdy probíhalo z části v USA a z části na MENDELU. Roste slaběji až středně silně a je samosprašná pouze částečně. Plody jsou oranžové s líčkem, příjemné chuti, při správné sklizňové zralosti poměrně odolné vůči otlakům. Leskora je v našich podmínkách nejranější odrůdou. Plodnost je až příliš vysoká, vyžaduje každoroční regulaci. (Bažant, 2004, Hričovský, 2004) 3.8 Meruňkové podnože Výběr podnože ovlivňuje odolnost, životnost a plodnost meruněk. Důležitým aspektem při volbě podnože je zejména půda a stanoviště v místě budoucí výsadby. M-VA-1, M-VA-2, M-VA-3 Podnože meruňky pěstované ze semen. Jsou vhodné pro středně těžké půdy, neutrální nebo mírně alkalické. V těžších půdách trpí meruňky na těchto podnožích poruchami z nedostatečného příjmu některých prvků (železo, hořčík, draslík). 13

15 MY-VS-1 Myrobalánové podnože pěstované ze semen. Snáší dobře i těžší půdy a vyšší obsah vápníku. Podporuje mrazuvzdornost a celkovou odolnost stromů. MY-KL-A Podnož množená vegetativně, pochází z myrobalánu. Podporuje mrazuvzdornost. Velkou výhodou je její univerzální použití do různých typů půd snáší jak suché mělké vápenaté půdy, tak i půdy těžké a zamokřené. M-LE-1 Generativně množená podnož, kterou lze použít jako kmenotvornou zajišťuje lepší zdravotní stav stromů a vyšší plodnost. Torinel Vegetativně množená švestková podnož pro meruňky. Brzdí růst, urychluje nástup plodnosti a umožňuje pěstování na těžkých zamokřených půdách. Afinita s meruňkami je dobrá. Vhodná pro intenzivní pěstování. Saint Julien A Vegetativně množená podnož vhodná pro těžké půdy s vyšším ph. Vykazuje náchylnost k onemocnění šarkou peckovin, proti bakteriálním chorobám je však poměrně odolná. Isthara Jedná se o hybridní podnož pocházející z křížení švestky, broskvoně a myrobalánu. Množí se vegetativně. Používá se pro suchá stanoviště bez nadbytku vápníku. Brzdí růst stromu a zlepšuje plodnost. (Bažant, 2004, Hričovský, 2004) 4. MIKROPROPAGACE Mikropropagace rostlin metodou in vitro probíhá jako aseptická kultivace rostlin či jejich částí v kontrolovaných podmínkách. Explantáty jsou kultivovány na živných médiích většinou ve skleněné nebo plastové nádobce (in vitro = ve skle). 14

16 4.1 Historie Historie kultivace rostlinných pletiv metodou in vitro není příliš dlouhá. Za počátky mohou být považovány pokusy Klebse, který izoloval buňky řas a sledoval jejich životní projevy. Přitom formuloval hypotézu, že podobné pokusy by bylo možné provádět i s buňkami vyšších rostlin. Tento výrok se datuje do roku První experimenty s kultivací rostlinných částí na živném médiu prováděl Rechinger, výsledky uveřejnil roku V roce 1902 Haberlandt prováděl pokusy, které měly za účel dokázat, že při kultivaci nezáleží na velikosti rostlinného fragmentu. Tvrdil, že by bylo teoreticky možné použít i jedinou zdravou buňku. Až do roku 1934 byly pokusy s kultivací v umělých podmínkách vždy pouze krátkodobou záležitostí. Teprve v tomto roce se Whiteovi podařilo udržet kulturu po delší dobu, celkem 7 let. Toho dosáhl přídavkem kvasničného extraktu ke kultivačnímu médiu a pasážováním kultury na nová média. V této době bylo také dosaženo úspěšného množení okrasných druhů rostlin in vitro. Tyto pokusy prováděli White, Gautheret a Nobécourt. Od té doby byly prozkoumány postupy in vitro množení tisíců druhů rostlin. (Hradilík, 2005) 4.2 Fáze mikropropagace Průběh mikropropagace lze rozdělit do pěti fází fáze přípravné, iniciační, multiplikační, prodlužovací a na aklimatizaci, tedy přechod do nesterilních podmínek in vivo Přípravná fáze Přípravná fáze sestává z výběru donorové rostliny, odebrání explantátu a založení aseptické kultury 15

17 Před samotným založením kultury je třeba vybrat vhodnou donorovou rostlinu, ze které bude explantát odebrán. Důležitý je především její zdravotní stav, který by měl být co nejlepší. Dále podle druhu a kultivaru volíme odebíranou část. Při odběru je nutné vzít v potaz roční dobu, která souvisí s různým poměrem růstových a jiných látek v rostlině. Nejlépe reagují explantáty odebírané z rostlin v aktivním růstu, s výjimkou explantátů ze zásobních orgánů ty je nejvhodnější odebírat v období dormance. Aby bylo poté dosaženo růstu explantátu, musí být dormance zrušena nízkou teplotou nebo aplikací giberelinů. (Kurtyová, 1987) Explantát je poté nutné desinfikovat a upravit do podoby vhodné pro kultivaci. Proces povrchové desinfekce je podrobněji popsán v kapitole 4.4 Sterilita Iniciační fáze Cílem této fáze je udržovat kulturu a připravovat ji na multiplikaci v další fázi. Médium obvykle obsahuje více rostlinných hormonů ze skupiny cytokininů a světelná intenzita je nižší. Tvoří se axilární nebo adventivní pupeny Multiplikační fáze Dochází k samotné tvorbě prýtů použitelných k množení. Vznikají z axilárních nebo adventivních pupenů. Vyšší genetickou stabilitu ale menší výtěžnost má množení z axilárních pupenů. Médium pro tuto fázi obsahuje menší množství cytokininů než médium v předchozí fázi a světelná intenzita bývá vyšší. (Kurtyová, 1987) Prodlužovací fáze Jednotlivé oddělené prýty se v prodlužovací fázi pasážují na médium s nízkým nebo nulovým obsahem cytokininů. Cílem je růst a prodlužování výhonků, někdy spojené i se zakořeňováním. Pro zakořenění se do média přidávají auxiny a naopak bývá snižováno množství živin. Více se touto problematikou zabývá kapitola 4.9 Zakořeňování Aklimatizace 16

18 Aklimatizací rozumíme převod kultur do nesterilních in vivo podmínek. Převádějí se buď rostliny zakořeněné už v in vitro kultuře, nebo je přechod spojen se zakořeňováním in vivo, což je pracovně méně náročné a tedy i levnější. Rostliny jsou přesazovány do dezinfikovaného substrátu. Pokud nejsou zakořeněné, namáčejí se do roztoku auxinu pro podporu tvorby kořenů, případně může být auxinovým roztokem nasycen substrát. V průběhu aklimatizace často dochází k úhynu rostlin. Je to způsobeno převážně změnami stavby listů při růstu in vitro rostlina prakticky nevytváří kutikulu, průduchy ztrácí schopnost se zavírat. Listy jsou sice zelené, ale díky návyku na heterotrofní výživu ztrácejí schopnost fotosyntézy. Teprve nové listy tvořené in vivo jsou aklimatizované, získávají schopnost fotosyntetizovat a bránit se nadměrným ztrátám vody. Do této doby musí být udržovány při vysoké relativní vzdušné vlhkosti. (Kurtyová, 1987) 4.3 Média Živná (kultivační) média jsou jedním ze základních faktorů potřebných pro úspěšnou kultivaci. Zajišťují explantátu nejen výživu, ale pomocí růstových regulátorů a dalších látek také stimulují jeho růst a vývoj. Nejčastěji používaná živná média jsou MS - Murashige a Skoog (1962) a LS Linsmaier a Skoog (1965). Mezi další poměrně často používaná patří B5 Gamborg et al. (1968), N6 Chu (1978) a WPM - Lloyd a McCown (1980). (Hradilík, 2005) Živná média se obvykle skládají z několika různých komponentů. Pro výživu rostlin jsou zde makroelementy a mikroelementy, cukry, vitamíny, zdroje dusíku a někdy také různé nedefinované organické složky. Dále jsou většinou přítomny růstové regulátory, antioxidanty a aktivní uhlí. Kromě cukrů a aktivního uhlí jsou ostatní komponenty do média přidávány ve formě koncentrovaných zásobních roztoků, které bývají 10x 100x koncentrované (v případě vitaminů až 1000x). Všechny komponenty se mísí s destilovanou nebo redestilovanou vodou a pro zajištění opory bývá médium nejčastěji ztuženo zpevňujícími látkami. 17

19 4.3.1 Makroelementy Makroelementy přidávané do kultivačních médií obsahují nejdůležitější minerální prvky pro rostliny, tedy dusík, draslík, vápník, fosfor a síru. Množství makroelementů se liší pro různé druhy rostlin a postupy kultivace. Dusík se do živného média přidává v různých formách jako nitrátové sloučeniny, amonné soli, je obsažen v aminokyselinách a bílkovinách. Anorganického dusíky by mělo médium obsahovat mm, z toho mm nitrátového dusíku a 2-20 mm amonných sloučenin. Explantáty obvykle lépe přijímají nitrátový dusík, nicméně amonné soli výrazně zlepšují jejich růst. Některé druhy ke své kultivaci amonný dusík bezpodmínečně vyžadují. Dobrým zdrojem organického dusíku jsou aminokyseliny. Jsou přidávány zejména do médií pro kultivaci protoplastů a buněčných suspenzí. Při nižších koncentracích působí na kultury příznivě a stimulují jejich růst, při vyšších jej mohou naopak inhibovat. Zdrojem aminokyselin bývají hydrolyzáty, například hydrolyzát kaseinu nebo N-Z amin. Aminokyseliny mohou být přidávány i jednotlivě v koncentracích do 100 mg.l -1. K tomu bývá používán zejména glycin, L-asparagin a L-glutamin. (Hradilík, 2005) Mikroelementy Mezi mikroelementy řadíme železo, mangan, zinek, bór, měď, kobalt a molybden. Obvykle se dávkují v koncentraci 0,1-100 µm. (Hradilík, 2005) Cukry Cukry jsou v médiu používány jako zdroj uhlíku. Protože v explantátu neprobíhá fotosyntéza a nemůže tak vázat oxid uhličitý ze vzduchu, musí být uhlík dodán v jiné formě - explantát se vyživuje heterotroficky. Nejčastěji se setkáme s použitím sacharózy, někdy také glukózy nebo fruktózy. Sacharóza sama se v průběhu autoklávování z části rozpadá na glukózu a fruktózu. Při přípravě média je obvykle 18

20 použita potravinářská sacharóza (řepný cukr), který má dostatečnou čistotu. Koncentrace cukrů v médiu bývá 2-3 %. Díky obsahu cukrů jakožto látek bohatých na energii mohou na médiu při nedodržení sterilních podmínek růst i nežádoucí mikroorganismy. (Hradilík, 2005) Růstové regulátory Růstové regulátory ovlivňují růst explantátů, zejména růst kalusu, tvorbu prýtů a zakořeňování. Do médií se přidávají auxiny, cytokininy, gibereliny a některé inhibitory Auxiny Auxiny jsou rostlinné hormony mající široké spektrum působení. Do živných médií bývají přidávány zejména díky schopnosti podporovat růst kalusu a adventivních kořenů, dále mohou indukovat tvorbu somatických embryí a díky podpoře apikální dominance stimulují i růst apikálních meristémů. Auxiny přidávané do živných médií: IAA indolyl-3-octová kyselina IBA indolyl-3-máselná kyselina NAA naftyloctová kyselina 4-CPA chlorfenoxyoctová kyselina 2,4-D 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina 2,4,5-T 2,4,5-trichlorfenoxyoctová kyselina picloram 4-amino-3,5,6-trichlorpikolinová kyselina Jednotlivé fytohormony mají různou účinnost na explantáty. Pro porovnání je jako základ brána indolyl-3-octová kyselina (IAA). Nejúčinnější je 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina (2,4-D), která má až 12x vyšší účinnost než IAA. 2,4,5-trichlorfenoxyoctová 19

21 kyselina (2,4,5-T) je přibližně 5x účinnější než IAA, 4-amino-3,5,6-trichlorpikolinová kyselina (picloram) 2-4x účinnější a naftyloctová kyselina (NAA) 2x účinnější. Auxiny se do médií přidávají v koncentraci 0,1-20 mg.l -1. (Hradilík, 2005) Cytokininy Cytokininy v rostlinách stimulují meristémy, podporují dělení buněk a vznik pupenů. Potlačením apikální dominance podporují větvení rostliny prorůstání axilárních pupenů. Na kořenovou soustavu mají spíš inhibiční účinky, brání vzniku adventivních kořenů. Cytokininy přidávané do živných médií: zeatin BAP (BA) - benzylaminopurin 2-iP isopentenyladenin kinetin furfurilaminopurin Můžeme sem zařadit také adenin, který sice nepatří mezi fytohormony, zvyšuje ale účinnost cytokininů. (Hradilík, 2005) Gibereliny Gibereliny ruší dormanci explantátu a podporuje prodlužovací růst. Používají se méně často a vždy je třeba současná přítomnost auxinu, bez kterého jsou gibereliny neúčinné. Gibereliny přidávané do živných médií: GA 3 GA Inhibitory růstu Z látek inhibujících růst explantátu se v in vitro kulturách používá zejména kyselina abscisová, někdy také chlorcholinchlorid, případně další umělé inhibitory. 20

22 Kyselina abscisová (ABA) patří mezi fytohormony. Pro rostlinu je stresovým signálem. V explantátových kulturách se používá pro navození dormance, stimulaci somatické embryogeneze, tuberizace a kvetení. Brzdí růst kultury. (Hradilík, 2005) Vitamíny Rostliny si nezbytné vitaminy syntetizují samy, u explantátových kultur tato schopnost však často chybí nebo je snížena. Proto je třeba do živného média některé vitamíny přidat. Nejčastěji se v živném médiu setkáme s těmito vitamíny: thiamin (0,1-10 mg.l -1 ) kyselina nikotinová (0,1-5 mg.l -1 ) pyridoxin (0,1-10 mg.l -1 ) myo-inositol ( mg.l -1 ) Jako další se může přidávat kyselina askorbová, pantotenová, listová, p-aminobenzoová, biotin a riboflavin. (Hradilík, 2005, Kurtyová, 1987) Nedefinované složky Nedefinované organické složky médií bývají především různé hydrolyzáty, dále kvasničný, banánový nebo sladový extrakt, šťáva z rajčat nebo pomerančů, kokosové mléko, míza nebo výluhy ze dřeva. Tyto látky se do médií přidávaly hlavně v minulosti, kdy částečně nahrazovaly působení růstových regulátorů. Můžeme se s nimi setkat dodnes u některých neochotně rostoucích explantátů a také v komerčním množení metodou in vitro, protože samostatné komponenty výživy jsou často příliš drahé. (Hradilík, 2005) Aktivní uhlí Aktivní uhlí bývá do médií přidáváno kvůli prodloužení intervalů mezi pasážováním. Má schopnost vázat na sebe látky, které brzdí růst explantátu a jsou pro něj toxické. Explantát tyto látky sám vylučuje a bez přídavku aktivního uhlí se tyto sloučeniny 21

23 v jeho okolí kumulují. Zároveň s nežádoucími látkami však aktivní uhlí absorbuje i látky žádoucí, zejména fytohormony, a to jak uměle přidané tak i přirozené vylučované explantátem. Koncentrace aktivního uhlí bývá v mediu 0,05-2 %. (Hradilík, 2005) Voda Pro přípravu kultivačních médií je třeba destilovaná nebo redestilovaná voda ph média Kyselost (ph) média je určena koncentrací iontů vodíku. Odvíjí se od ní příjem živin rostlinou nebo explantátem a celkově ovlivňuje metabolismus. Pro živná média se ph většinou upravuje na 5,5-5,8. Změny ph se provádí přidáním kyseliny chlorovodíkové nebo hydroxidu sodného. Je třeba počítat s tím, že kyselost média se mění při jeho sterilizaci v autoklávu. (Skirvin et al., 1986 in Kamenická a Rypák, 1983) Zpevnění média Média mohou být tekutá nebo tuhá, přičemž tuhá bývají používána častěji. Do tekutých médií bývají přidávány skleněné kuličky, čedičová vata, molitan, perlit nebo jsou používány proužky papíru, aby poskytly oporu explantátu. Výhodou tuhých médií je, že explantát ležící na jejich povrchu má zajištěn dostatek vzduchu. Pro zpevnění bývají přidávány různé látky - nejčastěji se můžeme setkat s agarem, dále s Agargelem, Phytagelem, Gerlitem nebo agarózou. Stupeň tuhosti média určuje množství přidané zpevňovací látky. Agar je nejrozšířenější látkou pro zpevňování médií. Jedná se o produkt z mořských řas a má své využití i v potravinářství. Pro in vitro kultivace bývá používán velmi čistý agar, který nevyžaduje zdlouhavé přípravy. Tuhost média zpevňovaného agarem ovlivňuje několik faktorů nejvýznamnější je množství přidaného agaru, dále pak ph média a druh agaru. Obvykle bývá přidáván v koncentracích 0,8-1 %. (Hradilík, 2005) 22

24 4.4 Sterilita Sterilita je základním faktorem ovlivňujícím úspěšnost kultivace in vitro. Sterilní musí být jak sklo a nástroje používané pro odvození kultury nebo pasážování, tak i médium, povrch rostliny a prostředí pro manipulaci s explantátem. Nástroje a sklo se nejprve umyjí ve vodě s přídavkem detergentu a následně opláchnou, nejprve vodou pitnou a poté destilovanou. Takto vyčištěné sklo a nástroje je dále třeba sterilizovat v horkovzdušném sterilátoru nebo v autoklávu. V průběhu práce s explantáty je třeba nástroje sterilizovat namočením v 95 % etanolu a opálením nad kahanem. Média sterilizujeme v autoklávu nebo filtrací. Nádoba, ve které se médium sterilizuje, musí být přitom uzavřená (používá se buničitá vata, alobal nebo kovová víčka s otvorem zacpaným molitanem). Při sterilizaci v autoklávu je třeba zvolit vhodnou délku sterilizace, a to podle objemu roztoku, který se sterilizuje. (Hradilík, 2005) Tab. 1 - Minimální doba sterilizace média při 121 C a 105 kpa (Kováč, 1992 cit. podle Hradilík, 2005) Objem média Minimální doba potřebná pro (ml) sterilizaci (min) Ne všechny složky média mohou být sterilizovány v autoklávu bez poškození. Tlak pro sterilizaci se nastavuje do 140 kpa, při vyšším tlaku (a tím i teplotě) jsou poškozovány i relativně stabilní komponenty médií. Mezi termolabilní komponenty médií patří vitaminy, bílkoviny a jednotlivé aminokyseliny, nespecifikované složky a z fytohormonů gibereliny. Tyto složky nelze sterilizovat v autoklávu a je tedy potřeba použít filtraci. Aby bylo dosaženo sterility, musí být velikost pórů použitého membránového filtru menší než 0,2 µm. Takto 23

25 sterilizované roztoky se do zbytku média, který byl sterilizován v autoklávu, přidávají až po jeho zchladnutí, ale před ztuhnutím (přibližně při 50 C). K úspěšnému založení explantátové kultury je třeba povrchově dezinfikovat i rostlinný materiál. Infekce z explantátu zpočátku působily velké problémy a znehodnocení pokusů. Povrchová dezinfekce rostlinného materiálu není snadná - na jednu stranu je třeba zničit bakterie a ostatní patogeny, na druhou stranu ale nesmí být pletiva rostliny příliš poškozena. Nelze tedy použít vysoké teploty. K povrchové dezinfekci jsou používány roztoky s dezinfekčními účinky. Důležitá je koncentrace roztoku a doba jeho působení. (Hradilík, 2005) Tab. 2 Přípravky používané k povrchové dezinfekci explantátů (Hradilík, 2005) účinná látka chemický vzorec koncentrace (%) doba působení (min) chlorid rtuťnatý HgCl2 0, chlornan sodný NaClO 0, chlorid vápenatý CaCl dusičnan stříbrný AgNO peroxid vodíku H2O etanol C2H5OH 70 5 bromová voda Br Použít lze i některé komerční přípravky, jako: Savo Chloramin B Ajatin antibiotika (pro likvidaci endogenních organismů; někdy jsou přidávána i do média) 24

26 Povrchově dezinfikovat je možné jak rostlinné orgány, tak semena. Při dezinfekci se předpokládá, že vnitřní pletiva rostlin bývají ve většině případů sterilní. Po povrchové dezinfekci se tedy odebírají pletiva, která nepřišla do kontaktu s nesterilním vnějším prostředím. Při dezinfekci semen je výhodou, že semena jsou odolnější a lze použít silnější koncentrace roztoků nebo delší dobu působení. Z takto ošetřených semen vyrostou při kultivaci v aseptických podmínkách sterilní rostliny. Sterilita prostředí, ve kterém je manipulováno s explantáty, je zajištěna použitím laminárního boxu. Ten nasává vzduch a dokonale jej filtruje. Tento vzduch poté proudí horizontálně přes pracovní plochu boxu a ven, takže brání vstupu potenciálně infikovaného vzduchu. Pracovní plocha je sterilizována použitím dezinfekčního roztoku. Pokud jsou v místnosti instalovány germicidní výbojky, sterilizuje se navíc celá místnost přibližně jednou týdně zářením. (Hradilík, 2005) 4.5 Založení aseptické kultury Pro založení aseptické kultury je nejprve třeba vybrat matečnou rostlinu. Ta by měla být ve výborném zdravotním stavu, důležitý je i stav fyziologický, její vlastnosti a růstové schopnosti. Další kultivaci explantátu také ovlivňuje cyklofýza rostliny a topofýza odebírané části. Lépe většinou reagují a rostou explantáty získané z mladých rostlin. Odebraná rostlinná část je nejprve pečlivě očištěna a umyta. Poté, už v laminárním boxu, je tato část ponořena do dezinfekčního roztoku tak, aby jeho hladina sahala asi 2 cm nad dezinfikovanou rostlinnou část. Pokud je materiál silně kontaminovaný, lze dezinfekci i opakovat nebo kombinovat různé dezinfekční roztoky. Pokud jsou mikroorganismy přítomny i uvnitř pletiv, je nutné pro dezinfekci použít antibiotika. Ta se aplikují buď jen povrchově na explantát, nebo mohou být přidávána přímo do kultivačních médií. Po skončení dezinfekce je třeba vymýt dezinfekční roztok ze sterilizovaných pletiv. To se provádí ponořením explantátu do destilované vody opět ve sterilních podmínkách v laminárním boxu. Vymývání trvá přibližně 15 minut a většinou se provádí 3x. Po skončení vymývání je třeba explantát dále zpracovat. Zpracování závisí na cíli práce a metodice daného postupu. Obvykle se odstraňují konce explantátu, protože bývají 25

27 poškozeny dezinfekčním roztokem. Dále je explantát podle potřeby rozdělen na části nebo preparován. K tomu se používají sterilní nástroje, které jsou navíc sterilizovány i v průběhu práce. Nakonec je upravený explantát přenesen na živné médium do nádoby, která je uzavřena tak, aby zabránila infekci z vnějšího prostředí. (Hradilík, 2005) 4.6 Znehodnocení založené kultury Nedostatečná sterilizace explantátu nebo kontaminace explantátu nebo média během manipulace se projeví obvykle do tří dní od založení kultury. V takovém případě je většinou nutné napadený explantát i médium zlikvidovat, nádobu vymýt a znovu vysterilizovat a opakovat celý proces založení explantátové kultury. Často se také vyskytuje problém s hnědnutím nebo černáním explantátu. Může být způsoben poškozením dezinfekčním roztokem nebo hromaděním fenolických látek. Proti hromadění fenolických látek je možné zakročit přidáním kyseliny L-askorbové, snížením nebo zastavením aktivity fenoláz nebo odstraněním fenolických sloučenin z média (je možné použít aktivní uhlí nebo polyvinylpyrrolidon k absorpci těchto látek). Hnědnutí explantátu způsobenému akumulací látek lze bránit častějším pasážováním. Pasážování explantátu, tedy jeho přesun na nové médium, se provádí obvykle po 4-5 týdnech nebo častěji, pokud je kultura čerstvě založená. (Hradilík, 2005) 4.7 Další faktory ovlivňující růst explantátu Světlo Při organogenezi a tvorbě kalusu je důležité i světlo. Při nedostatku světla explantáty rychle nekrotizují, stejná reakce však může nastat i při přemíře osvětlení, kde je příčinou nejspíš rychlý metabolismus taninů. Kromě intenzity světla, která ovlivňuje organogenezi i růst explantátu, je důležité i světelné spektrum. Stimulaci tvorby prýtů způsobuje u různých druhů dřevin různé světelné spektrum. (Kamenická a Rypák, 1983) 26

28 4.7.2 Teplota Optimální teplota pro explantátové kultury se většinou pohybuje mezi C. Po založení kultury je vhodné krátké období nižších teplot, které zvyšuje vitalitu explantátů a omezuje riziko infekce. Vhodné může také být střídání vyšší teploty přes den a nižší přes noc. (Chalupa, 1981cit. podle Kamenická a Rypák, 1983) 4.8 Typy mikropropagace Mikropropagace, tedy množení explantátových kultur in vitro, je typ klonového množení. Primokultura, která je získána z explantátu, se dále dělí a roste. Zahrnuje somatickou embryogenezi, stimulaci axilárního větvení a tvorbu adventivních prýtů. (Hradilík, 2005) Somatická embryogeneze Somatická embryogeneze je proces, při kterém embryo a později nová rostlina vzniká z jediné somatické buňky. Somatická embrya přitom procházejí fázemi diferenciace stejně jako zygotická embrya. Tato metoda je velmi perspektivní díky vysokému počtu jedinců získaných z malého množství pletiva. Somatická embrya vznikají z buněk embryogenního kalusu nebo suspenze. Ty se vyvíjí z diferencovaných pletiv působením auxinů, často bývá používán 2,4-D. Dediferenciace probíhá nejlépe v mladých pletivech. Po vzniku embryogenního kalusu další vývoj somatických embryí probíhá na médiu bez auxinů, zato s vysokým obsahem redukovaných forem dusíku. Často také bývají přidávány aminokyseliny a kyselina abscisová. Získaná somatická embrya mohou být dopěstována na celé rostliny, použita do bioreaktorů nebo k výrobě umělých semen. (Hradilík, 2005) 27

29 4.8.2 Mikropropagace stimulací axilárního větvení Tato metoda mikropropagace je poněkud pomalejší, zaručuje ale vysokou genetickou stabilitu získaných rostlin. Je často využívána u rostlin, kde zatím nebyl nalezen účinný postup somatické embryogeneze nebo tvorby adventivních prýtů. Axilární větvení je stimulováno v pupenech. Mohou být použity jak pupeny vrcholové, tak i úžlabní. Podle intenzity apikální dominance z pupene vzniká jeden nebo více prýtů. Apikální dominance bývá potlačena přidáním cytokininů do kultivačního média Mikropropagace tvorbou adventivních prýtů Adventivní prýty vznikají přímo z rostlinných orgánů, jako jsou stonky, listy nebo hlízy. Podle Hradilíka (2005) rozlišujeme čtyři stupně mikropropagace: iniciace sterilní kultury multiplikace orgánů odvozených z explantátu zakořenění, vznik nových rostlin životaschopné autotrofní rostliny převedené do in vivo podmínek 4.9 Zakořeňování Prýty získané kultivací in vitro zakořeňují buď také in vitro, nebo v nesterilních podmínkách in vivo. Jde o indukci tvorby adventivních kořenů, které musí být funkční a po zakořenění postačovat k výživě rostliny. Optimální teplota pro zakořeňování je C. Při zakořeňování na živném médiu in vitro je poměrně velké riziko, že vzniklé kořeny nebudou funkční. Také jsou často bez kořenového vlášení a velmi křehké. Kořenové vlášení se tvoří spíše při použití tekutého média. Pro tvorbu kořenů jsou hlavními fytohormony auxiny, které se aplikují v koncentracích 0,1-10 mg.l -1. Množství je závislé především na druhu zvoleného auxinu. Cytokininy tvorbu kořenů naopak inhibují, proto jsou pro zakořeňování používána média bez 28

30 cytokininů. V dalších fázích růstu kořenů nohou auxiny také působit inhibičně, proto bývají používány pouze na počátku zakořeňování k indukci rhizogeneze. Prýt je možné buď ošetřit auxinem jen jeho ponořením do roztoku, nebo se auxin aplikuje do média a po několika dnech kultivace na tomto médiu je prýt přepasážován na médium s nízkým nebo žádným obsahem auxinu. Tvorbu kořenů může také podpořit snížená koncentrace živin v médiu. In vivo zakořeňování znamená přenos nezakořeněného prýtu do nesterilních podmínek a následnou indukci rhizogeneze. Při přenosu musí být prýty co nejdokonaleji zbaveny kultivačního média. Substrát použité pro zakořeňování musí být desinfikovaný, dostatečně vzdušný a vododržný s neutrálním nebo slabě kyselým ph. Tyto podmínky splňují různé uměle vytvářené substráty a porézní materiály (čedičová vata, rašelina, perlit). I při zakořeňování prýtů in vivo jsou používány roztoky auxinů, do kterých se prýty krátce namáčí. Po přesazení do substrátu je vhodné ošetření fungicidem, který zabrání rozvoji houbových patogenů. V průběhu zakořeňování je třeba rostliny aklimatizovat postupným snižováním relativní vzdušné vlhkosti. Do té doby heterotrofně vyživované prýty přecházejí na autotrofní výživu a nově vytvořené listy začínají fotosyntetizovat. Listy vytvořené in vitro tuto schopnost většinou nemají, také nemívají vytvořenou kutikulu a funkční průduchy. Při přechodu na autotrofní výživu jsou tedy použity jako zásobní orgány pro tvorbu listů nových. (Hradilík, 2005) 4.10 Genetická nestabilita explantátových kultur Suspenzní a kalusové kultury jsou při dlouhodobé kultivaci málo geneticky stabilní. Nejčastěji dochází ke genomovým mutacím (aneuploidii, polyploidii), ztrátě některých chromozomů nebo ke vzniku chimér. To vede k fyziologickým a morfologickým změnám. Tyto změny nejsou sice žádoucí pro klonové množení, jsou však výborným materiálem pro šlechtění nových odrůd, zejména se zaměřením na rezistenci. Vedle genetických změn také při množení in vitro vznikají změny fenotypů, které jsou způsobeny epigenetickými nebo fyziologickými změnami. Mezi ně patří změny 29

31 trichomů, květů a morfologie listů, zpomalení růstu a regenerace, barevné změny a mnoho dalších. Při dlouhodobých kulturách bývá problémem ztráta morfogenní schopnosti buněk, tedy schopnost tvořit prýty a později i kořeny. Někdy se tuto schopnost daří obnovit změnou některých kultivačních podmínek. (Hradilík, 2005) 4.11 Ozdravování rostlin Explantátové kultury bývají používány k získání ozdravených rostlin bez bakterií, plísní a virových infekcí. Bakterie a plísně jsou většinou zničeny už při počáteční sterilizaci, proti bakteriím mohou být navíc přidávána antibiotika do média. Velice žádoucí je zbavení rostlin virových infekcí. Obzvláště rostliny množené pouze vegetativně jsou viry ohroženy, semeny se virová infekce většinou nepřenáší. Pro produkci bezvirózních rostlin je třeba odebrat část rostliny, kde je riziko napadení viry nejnižší - meristém z pupenu, který není spojen vaskulárním systémem se zbytkem rostliny. Odebírá se meristém o velikosti do 1 mm a ten se dále kultivuje. Pro účinnější eliminaci virů je možné použít i antivirotika nebo termoterapii, tedy vystavení explantátu nebo celé rostliny vyšším teplotám (až 50 C po několik desítek minut). Tyto teploty jsou pro viry smrtící, zatímco meristematická pletiva je snáší. (Hradilík, 2005) 4.12 Kryoprezervace Kryoprezervace umožňuje dlouhodobé uchovávání explantátových kultur v kapalném dusíku při teplotě -196 C. Buňky je třeba při tomto procesu chránit kryoprotekcí, protože mohou být poškozeny vznikem krystalků ledu a zvýšením koncentrace buněčných roztoků. Proto se při přípravě na zmrazení přidávají do média kryoprotektivní látky například sacharóza, manitol, sorbitol, glycerol, dimetylsulfoxid a další. Pro kryoprezervaci jsou vhodnější malé buňky s hustou cytoplazmou a bez silné buněčné stěny. Snižování teploty může probíhat postupně v průběhu několika minut nebo naráz rychlým ponořením do kapalného dusíku. (Hradilík, 2005) 30

32 4.13 Dřeviny in vitro Ačkoliv množení in vitro bylo zpočátku zkoumáno hlavně na bylinách a okrasných rostlinách, postupně byly vypracovány účinné postupy i pro množení dřevin, zejména ovocných. Obecně je možno říci, že dřeviny jsou při pěstování in vitro náročnější než většina bylin. U dřevin se organogeneze či embryogeneze často daří indukovat jen u první generace meristémů, například z embryí. To je spojeno s nízkou koncentrací inhibičních látek v explantátu, hlavně kyseliny abscisové a fenolických sloučenin. Důležitý je také věk mateřské rostliny. Mezi věkem donoru a intenzitou růstu explantátu je pravděpodobně přímý vztah. Explantátové kultury ze starších rostlin je obvykle těžké založit a udržet. (Kamenická a Rypák, 1989) Množení pomocí kultur z pupenů U dřevin je nejčastější metodou stimulace axilárního větvení v pupenech. Z pupenů lze totiž poměrně dobře odvodit sterilní kulturu díky ochraně vnitřních pletiv šupinami. Takto regenerované prýty také ochotněji zakořeňují. Z pupenů mohou být také k množení odebírány meristémy pro dopěstování rostlin ozdravených od virů. Velikost těchto odebíraných meristémů se pohybuje do maximálně 1 mm. Pěstování nových rostlin z meristémových kultur je dnes v popředí zájmu výzkumů, protože rostliny množené převážně vegetativně jsou často virovými chorobami značně napadené. Pěstování z meristémů také likviduje i napadení ostatními škůdci a patogeny. Meristémové kultury a z nich vypěstované rostliny jsou geneticky stabilní, což je také jednou z významných výhod této metody. (Kamenická a Rypák, 1989) McCown (1985 cit. podle Kamenická a Rypák, 1989) rozlišuje při mikropropagaci dvě období první sestává z odvození kultury a druhé ze samotného množení. U dřevin bývá nejproblematičtější období založení kultury. Založení kultury se skládá ze tří fází izolace, udržování a indukce organogeneze. U dřevin je přitom problém se zvýšenou kontaminací pletiv, což je dáno dlouhým vývojovým cyklem ontogeneze. 31

33 Obtížnou fází je zejména fáze udržovací (stabilizační). Charakteristické pro ni jsou změny v intenzitě růstu. Tuto fázi ovlivňuje zejména stáří donorové rostliny, tedy juvenilita explantátu, a také část roku, kdy byl explantát odebrán. Mladší explantáty zpravidla regenerují daleko lépe než starší. Konkrétní část roku je důležitá zejména u dřevin s přerušovaným růstem, kdy odběr v nesprávnou dobu může výrazně snížit šanci na úspěšné množení. (Kamenická a Rypák, 1989) Pomocí kultur z embryí Pomocí pěstování rostlin z embryokultur je možné ozdravovat rostlinný materiál od virů (viry většinou semena nenapadají), testovat životaschopnost semen, zkrátit jejich dormanci a překonat špatnou klíčivost. Také jsou využívány ve šlechtitelství a jsou vhodným objektem studia regenerace a dormance rostlin. Pro pěstování embryí je důležitá zejména fáze dormance, ve které se právě nacházejí. Obecně můžeme rozlišit predormanci, vlastní dormanci a postdormanci. Predormance začíná u našich dřevin na podzim před opadem listů. Indukuje ji snížení teplot (obvykle se hrance pohybuje kolem 10 C, závisí na konkrétním druhu) a délka dne. Dochází k narůstání hladiny inhibičních látek. Dormance se vyznačuje zpomalením metabolismu rostliny a nejvyšší hladinou endogenních inhibičních látek. Důležitou úlohu má především kyselina abscisová. Embryo je ve fázi dormance ještě nevyvinuté, osemení nepropustné, semeno jako celek není připraveno na klíčení. Někdy může být dormance i vynucená, pokud jsou vnější podmínky nepříznivé. Postdormance je následující období, kdy už je semeno při vhodných vnějších podmínkách schopné klíčit. (Kamenická a Rypák, 1989) První popis vývinu izolovaných dormantních embryí v in vitro kultuře pochází z roku 1931 od Flemiona, který se zabýval embryi Sorbus aucuparia L.. Dormantní embrya špatně klíčila a růst kotyledonů byl nepravidelný. (Kamenická a Rypák, 1989) Podle Erdelské (1981 cit. podle Kamenická a Rypák, 1989) je pro in vitro kultivaci embryí nejdůležitější stupeň diferenciace pletiva, přičemž čím je embryo vyvinutější, 32

34 tím snadněji se pěstuje. Většinou je možné dopěstovat embryo teprve po dosažení srdcové fáze, při odebrání v mladších fázích vývoje bývají rostliny slabé a často se vyskytují defekty a abnormality v růstu. Embrya izolovaná ve fázi růstu podle Raju a Manna (1970 cit. podle Kamenická a Rypák, 1989) rostou výrazně intenzivněji než embrya z období dormance. Přitom ale kultivace embryí v období hluboké dormance někdy umožňuje překonat fázi odpočinku a urychlit jejich klíčení. (Kamenická a Rypák, 1989) 4.14 Kultury meruněk in vitro Mikropropagace byla úspěšně použita jak u podnoží, tak u ušlechtilých odrůd meruněk. Významným přínosem je přitom možnost produkce rostlin ozdravených od virových infekcí, které snižují životaschopnost a plodnost rostlin. Pro získání bezvirózních rostlin jsou kultivována meristematická pletiva, často odebíraná z rostlin po termoterapii. Nejčastějším způsobem množení meruněk in vitro stále zůstávají kultury pupenů, ve kterých dochází k axilárnímu větvení, a kultury, na nichž se tvoří adventivní pupeny přímo na orgánech. Některá média použitá pro různé kultury popisuje kniha Plant culture media viz Tab

35 Tab. 3 Přehled některých médií použitých pro meruňky (George et al., 1987) růstové sacharóza regulátory výsledek: médium: [g.l -1 ] [mg.l -1 ] autor indukce kalusu Murashige & Skoog (1962) 30 2 NAA, 2 Kin Harn a Kim (1972) proliferace axilárních pupenů Skirvin et al. (1980) 20 _ Skirvin et al. (1980) zakořenění 0,13. MS (1962) 30 0,1-2 NAA Skirvin et al. (1980) 70 % indukce adventivních výhonů Lloyd a McCown (1981) iP Snir (1984) % zakořenění Snir a Erez (1980) 20 0,5 NAA Snir (1984) glukóza: vývoj a klíčení Turkey (1933) 5 g.l -1 _ Turkey (1938) 34

36 Kultury embryí Kultury embryí meruněk a broskvoní rostou dobře v jednodušších kultivačních médiích. (Petrů a Řeťovský, 1956 cit. podle Pašková, 1995) Jako zdroj uhlíku je nejvhodnější sacharóza o koncentraci okolo 2 %. (Turkeyová, 1934 cit. podle Pašková, 1995) Roku 1993 Burgos a Ledbetter zkoumali možnosti kultivace meruňkových embryí v různých vývojových stádiích. S úspěchem byla použita média SBH (Smith et al., 1969), WPM (Lloyd and McCown, 1980) a C 2 d (Chee and Pool, 1987). Úspěšnost kultivace závisela přitom především na vývojovém stádiu embrya ukázalo se, že embrya v nejmladším vývojovém stadiu, tedy o velikosti 5-9 mm, klíčí nejlépe. Obtíže s klíčením starších embryí jsou pravděpodobně spojeny s nárůstem obsahu inhibičních látek. Na Mendelově univerzitě byl proveden pokus ohledně založení a dopěstování embryokultur meruněk, konkrétně raných odrůd Leskora (LE 836), LE 3255, LE 946, Priusadebnyj a Harland. Použito bylo médium Hough (1980) ve třech různých variantách týkajících se růstových regulátorů jedna varianta regulátory neobsahovala, další dvě se lišily v množství giberelinů. Semena byla stratifikována, kultivace probíhala na světle se zastíněním zóny kořenů. V kultuře se vyskytlo mnoho růstových abnormalit. Podle Paškové (1995) se jako nejvhodnější médium z tří zkoušených verzí jeví Hough (1980) bez růstových regulátorů. Naopak podle Anny Kurtyové (1987) není toto médium bez růstových regulátorů vhodné, protože výtěžnost rostlin byla slabá. Jako nejvhodnější pro hybridy Leskora x Burevestnik s LE 946 x Burevestnik a Leskora x Dionis s LE 946 x Šantungské označil médium Hough (1980) s 0,5 mg.l -1 BAP, 0,2 5 mg.l -1 IBA, 0,2 mg.l -1 NAA a 0,1 mg.l -1 GA 3. Na tomto médiu vyklíčilo 80 % embryí hybridu Leskora x Burevestnik s LE 946 x Burevestnik a 93,3 % embryí hybridu Leskora x Dionis s LE 946 x Šantungské. Tato autorka uvádí, že vysokého procenta vyklíčených embryí (80 %) bylo dosaženo i u média s přídavkem 1,0 mg.l -1 2,4-D a 0,5 mg.l -1 BAP, vyskytlo se zde však velké množství abnormalit v růstu kořenů mladých rostlin. V obou případech byly do média přidány vitaminy thiamin (0,5 mg.l -1 ) a kyselina askorbová (20 mg.l -1 ) 35