Návody pro LABORATOŘE OBORU (N352014) 1. ročník Mgr. 2015/2016, letní semestr LIPIDICKÉ SLOŽENÍ VÝROBKŮ. Ing. Jan Kyselka, Ph.D.

Transkript

1 Návody pro LABORATOŘE OBORU (N352014) 1. ročník Mgr. 2015/2016, letní semestr LIPIDICKÉ SLOŽENÍ VÝROBKŮ Ing. Jan Kyselka, Ph.D. Ústav mléka, tuků a kosmetiky Fakulta potravinářské a biochemické technologie Vysoká škola chemicko-technologická Praha 2016

2 Obecně: Cílem úlohy je rozpoznání vzorku o neznámém složení (olej, plně ztužený olej, rafinované mastné kyseliny, potravinářské emulgátory apod.) na základě stanovení tzv. tukových konstant (hydroxylové číslo, číslo zmýdelnění a číslo kyselosti). Zkoumané suroviny jsou běžné v potravinářských i kosmetických výrobcích. Složení mastných kyselin umožňuje výpočet střední molekulové hmotnosti mastných kyselin či acylglycerolů, která se dosazuje do výpočtů. Ostatní stanovení doplní informaci o přítomnosti volných karboxylových skupin a esterových vazeb v molekule neznámého vzorku. Správnost navržené struktury bude ověřena tenkovrstvou chromatografií podle komerčních standardů až na závěr. 1. Stanovení čísla zmýdelnění Tato norma specifikuje metodu pro stanovení čísla zmýdelnění živočišných a rostlinných tuků a olejů. Za přítomnosti minerálních kyselin dává metoda nesprávné výsledky, pokud nejsou minerální kyseliny stanoveny odděleně. Podstata zkoušky Vzorek se vaří s ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a jeho přebytek se titruje standardním odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové. Chemikálie hydroxid draselný, c(koh) ~ 0,5 mol l -1 v 95% ethanolu. Roztok musí být bezbarvý nebo slámově žlutý. Roztok se skladuje v hnědé skleněné lahvi s pryžovou zátkou a před použitím se odlévá. kyselina chlorovodíková, standardní odměrní roztok, c(hcl) = 0,5 mol l -1 fenolftalein, roztok 10 g l -1 v 95% ethanolu nebo alkalická modř 6 B, roztok 20 g l -1 v 95% ethanolu. varné kamínky Přístroje a pomůcky baňka s kulatým dnem, 250 ml, se zábrusem zpětný chladič se skleněným zábrusem zařízení pro ohřev (vodní lázeň), ohřev přímým plamenem je nevhodný byreta na 50 ml, dělená po 0,1 ml pipeta 25 ml Postup zkoušky 1. Zkušební vzorek Přibližně 2 g analytického vzorku se naváží s přesností na 5 mg do baňky. Poznámka: Hmotnost zkušebního vzorku 2 g byla stanovena pro vzorky s číslem zmýdelnění 170 až 200. Pro vzorky s odlišným číslem zmýdelnění by měla být hmotnost zkušebního vzorku upravena tak, aby byla zneutralizována polovina ethanolického roztoku hydroxidu draselného.

3 2. Stanovení Pomocí pipety se přidá k naváženému zkušebnímu vzorku 25 ml ethanolického roztoku hydroxidu draselného a několik varných kamínků. Na baňku se připojí zpětný chladič, baňka se umístí na vodní lázeň a mírně se vaří za občasného promíchání 60 min (nebo 2 h v případě olejů nebo tuků s vysokým bodem tání, které se obtížně zmýdelňují). K horkému roztoku se přidá 0,5 ml až 1 ml fenolftaleinu a obsah baňky se titruje odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové do vymizení růžového zbarvení indikátoru. Jestliže je roztok tmavý, použijeme 0,5 až 1 ml roztoku alkalické modři 6 B. 3. Slepý pokus Slepý pokus se provede shodným způsobem. Použije se také 25 ml ethanolického roztoku hydroxidu draselného, ale vynechá se zkušební vzorek. 4. Počet stanovení Z jednoho analytického vzorku se provedou dvě stanovení. Vyjádření výsledků Číslo zmýdelnění se vypočte podle vzorce (5.8): ČZ (V 0 - V 1 ). c. 56,1 = [mg KOH.g -1 ] m (5.8) kde V0 je spotřeba standardního odměrného roztoku HCl na slepý pokus [ml]; V1 je spotřeba standardního odměrného roztoku HCl na vlastní stanovení [ml]; c je přesná koncentrace standardního odměrného roztoku HCl [mol l -1 ]; m je hmotnost zkušebního vzorku [g]. Jako výsledek se udává aritmetický průměr svou stanovení, jestliže je dosaženo požadované opakovatelnosti. Výsledek se udává na jedno desetinné místo. Opakovatelnost Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, provedený současně, nebo v rychlém sledu, jedním analytikem, za použití stejného vybavení, na témže vzorku, by neměl přesáhnout 0,5 % (relativních) z aritmetického průměru. Rozdíl mezi dvěma souběžnými stanoveními nemá být větší než 1. Rozdíl mezi stanoveními dvou laboratoří nemá být větší než 2.

4 2. Stanovení složení mastných kyselin jako methylesterů metodou GC Tato norma specifikuje metodu přípravy methylesterů mastných kyselin. Podstatou je zmýdelnění triacylglycerolů a esterifikace uvolněných mastných kyselin v přítomnosti kyseliny sírové. Metoda není použitelná pro tuky obsahující kyselinu máselnou a kapronovou (kravský mléčný tuk). Chemikálie hydroxid draselný, methanolický roztok přibližně 0,5 mol l -1 kyselina sírová, koncentrovaná methyloranž, methanolický roztok 0,02% chlorid sodný, nasycený vodný roztok n-hexan, pro chromotografii síran sodný, bezvodý Přístroje a pomůcky baňka s kulatým dnem, se zábrusem (250 ml) 2x zpětný chladič elektrická vodní lázeň varné kamínky dělicí nálevka (250 ml) nálevka malá Postup zkoušky 1. Příprava methylesterů mastných kyselin Do varné baňky se naváží asi 0,5 g tuku, přidá se 10 ml methanolického roztoku KOH a 2 varné kamínky a vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Pak se přidá pipetou přes zpětný chladič 3 5 kapek methanolického roztoku methyloranže a neutralizuje se koncentrovanou kyselinou sírovou (pipetou přes chladič několik kapek). Po zneutralizování se přikápne ještě asi 5 kapek koncentrované kyseliny sírové navíc, až vznikne růžově-červený roztok, který se znovu vaří pod zpětným chladičem po dobu 30 min. K ochlazenému roztoku se přidá přes chladič 20 ml nasyceného roztoku chloridu sodného a roztok se převede do dělicí nálevky. Methylestery se extrahují 2krát 25 ml n- hexanu. Spojené hexanové extrakty se promývají 3krát 50 ml destilované vody (do neutrální reakce na methylčerveň). Vysuší se přes bezvodý síran sodný. 1% roztok methylesterů je připraven k analýze na GC. 2. Analýza pomocí kapilární plynové chromatografie K analýze bude použit plynový chromatograf Agilent Technology 6890 s plamenoionizačním detektorem (FID). Pro stanovení bude použita kolona SP TM 2560 (Supleco, Bellefont USA) o rozměrech 0,25 mm x 100 m a tloušťce stacionární fáze 0,2 m, která je schopna stanovit cis a trans izomery mastných kyselin. Nosným plynem bude helium o

5 průtoku 1,0 ml min -1. Detekce plameno-ionizačním detektorem probíhá při teplotě 220 C, průtoku vodíku 45 ml min -1, vzduch 450 ml min -1 a jako make up plyn bude použit dusík o průtoku 45 ml min -1. Nástřik na kolonu bude proveden autosamplerem Agilent Technology 7683 při teplotě 220 C v množství 1 l. Split poměr bude 1 : 50. Výpočet Získaná relativní procenta obsahu methylesterů mastných kyselin (z chromatogramu) se přepočítají na skutečná hmotnostní procenta mastných kyselin podle vzorce (1) a (2): w = A i. F i 1 A i. F 1 i [% hm.] (1) F i 1 = M MK M MEMK (2) kde Ai jsou relativní procenta obsahu methylesterů příslušné mastné kyseliny (z chromatogramu); Fi 1 je přepočítávací koeficient (tabulka I); MMK je molární hmotnost příslušné mastné kyseliny [g mol -1 ]; MMEMK je molární hmotnost příslušného methylesteru mastné kyseliny [g mol -1 ]; w jsou skutečná hmotnostní procenta příslušné mastné kyseliny [g MKi (100 g MK) -1 ]. Tabulka I: Přepočítávací faktory pro methylestery mastných kyselin vzorec název M MK M MEMK F 1 vzorec název M MK M MEMK F 1 C4:0 máselná 88,11 102,14 0,863 C24:0 lignocerová 368,65 382,68 0,963 C5:0 valerová 102,14 116,16 0,879 C14:1 tetradecenová 226,36 240,39 0,942 C6:0 kapronová 116,16 130,18 0,892 C15:1 pentadecenová 240,39 254,42 0,945 C7:0 heptanová 130,19 144,22 0,903 C16:1 hexadecenová 254,42 268,44 0,948 C8:0 kaprylová 144,22 158,24 0,911 C17:1 heptadecenová 268,44 282,27 0,950 C9:0 pelargová 158,24 172,27 0,919 C18:1 oktadecenová 282,47 296,50 0,953 C10:0 kaprinová 172,27 186,28 0,925 C20:1 eikosaenová 310,53 324,56 0,957 C11:0 undekanová 186,28 200,32 0,930 C22:1 dokosaenová 338,58 352,61 0,960 C12:0 laurová 200,32 314,35 0,935 C24:1 tetrakosaenová 366,63 380,65 0,963 C13:0 tridekanová 214,35 228,38 0,939 C16:2 hexadekadienová 252,40 266,43 0,947 C14:0 myristová 228,38 242,41 0,942 C18:2 oktadekadienová 280,45 294,48 0,952 C15:0 pentadekanová 242,41 256,43 0,945 C20:2 eikosadienová 308,51 322,53 0,957 C16:0 palmitová 256,43 270,46 0,948 C22:2 dokosadienová 336,56 350,58 0,960 C17:0 heptadekanová 270,46 284,49 0,951 C18:3 oktadekatrienová 278,44 292,47 0,952 C18:0 stearová 284,49 298,51 0,953 C20:3 eikosatrienová 306,49 320,51 0,956 C19:0 nonadekanová 298,51 312,54 0,955 C20:4 eikosatetraenová 304,48 318,50 0,956 C20:0 arachová 312,54 326,57 0,957 C20:5 eikosapentaenová 302,46 316,48 0,956 C22:0 behenová 340,60 354,62 0,960 C22:5 dokosapentaenová 330,52 344,54 0,959

6 3. Stanovení čísla kyselosti a kyselosti Norma specifikuje dvě metody (titrační a potenciometrickou) pro stanovení kyselosti ve všech živočišných a rostlinných tucích a olejích. Kyseliny jsou vyjadřovány jako číslo kyselosti nebo alternativně jako kyselost počítaná konvenčně. Metody jsou rovněž použitelné i pro mastné kyseliny (olein, stearin a destilované mastné kyseliny) při rozsahu hodnot čísla kyselosti od 0,05 mg KOH g -1 výše. Definice Číslo kyselosti: miligramy hydroxidu draselného potřebné k neutralizaci volných mastných kyselin obsažených v 1 g tuku nebo oleje. Kyselost: běžné vyjádření volných mastných kyselin ve hmotnostních procentech. Podle druhu tuku nebo oleje může být vyjádřena podle tabulky II. Jestliže jsou výsledky uvedeny jako kyselost bez dalšího označení, je podle dohody kyselost vyjádřená jako kyselina olejová. Jestliže vzorek obsahuje minerální kyseliny, jsou tyto kyseliny podle dohody stanovovány jako mastné kyseliny. Tabulka II: Vyjádření kyselosti podle druhu tuku Tuk nebo olej Vyjádření jako Molární hmotnost [g mol -1 ] Kokosový olej, palmojádrový olej a podobné oleje kyselina laurová 200 Palmový olej kyselina palmitová 256 Oleje z některých Brassicaceae* kyselina eruková 338 Všechny ostatní tuky kyselina olejová 282 *, v případě bezerukového řepkového oleje může být kyselost vyjádřená jako kyselina olejová Titrační metoda je nejvhodnější pro tuky a oleje, které nejsou silně zabarvené. Podstata zkoušky Zkušební vzorek se rozpustí ve směsi rozpouštědel a přítomné volné mastné kyseliny se titrují ethanolickým roztokem hydroxidu draselného. Chemikálie všechny použité chemikálie musí být čistoty p. a. a voda destilovaná nebo voda odpovídající čistoty. směs 95% ethanolu s diethyletherem (1 : 1, v/v). Tato směs se zneutralizuje těsně před použitím roztokem hydroxidu draselného za přídavku 0,3 ml roztoku fenolftaleinu na 10 ml směsi. Upozornění: Diethylether je velmi hořlavý a může tvořit výbušné peroxidy. Musí být používán s velkou opatrností. Poznámka: Jestliže není možné použít diethylether, lze použít směs toluenu a ethanolu. Jestliže je to nutné, může být ethanol nahrazen 2-propanolem.

7 hydroxid draselný, standardní odměrný roztok v ethanolu, c(koh) = 0,1 mol l -1 nebo jestliže je to nezbytné c(koh) = 0,5 mol l -1. Přesnou koncentraci roztoku hydroxidu draselného je třeba stanovit bezprostředně před použitím. Používá se roztok připravený nejméně před 5 dny a dekantovaný do hnědé skleněné láhve, uzavřené pryžovou zátkou. Roztok musí být bezbarvý nebo slámově žlutý. fenolftalein, ethanolický roztok v 95% ethanolu, 10 g l -1 Přístroje a pomůcky analytické váhy kónická baňka, 250 ml byreta, 10 ml dělená po 0,1 ml Postup zkoušky Příprava analytického vzorku se provádí podle metody 1. Zkušební vzorek se naváží podle předpokládaných hodnot čísla kyselosti uvedených v tabulce III do kónické baňky (250 ml), rozpustí se v ml předem zneutralizované směsi diethylehter/ethanol a přidá se pár kapek fenolftaleinu. Roztok se titruje za stálého míchání roztokem 0,1mol l -1 KOH do bodu ekvivalence indikovaného změnou barvy indikátoru (růžové zbarvení fenolftaleinu musí vydržet nejméně 10 s). U téhož analytického vzorku se provádějí dvě stanovení. Tabulka III: Hmotnost zkušebního vzorku při stanovení čísla kyselosti Předpokládané číslo kyselosti Hmotnost zkušebního vzorku [g] Přesnost vážení [g] < 1 20,0 0, ,0 0, ,5 0, ,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Poznámky: V případě velmi nízkých čísel kyselosti (menší než 1) je vhodné nechat mírně probublávat dusík titrovaným roztokem. Standardní ethanolický roztok hydroxidu draselného může být nahrazen vodným roztokem hydroxidu draselného nebo sodného, jestliže objem přidané vody nepovede k oddělení fází. Jestliže spotřeba 0,1mol l -1 KOH je větší než 10 ml, je třeba použít roztok 0,5mol l -1. Jestliže dojde k zakalení roztoku během titrace, je nutno přidat dostatečné množství směsi rozpouštědel, aby byl roztok opět čirý. Vyjádření výsledků Číslo kyselosti Číslo kyselosti se vypočte ze vztahu (3): ČK = 56,1. V. c m [mg KOH.g -1 ] (3)

8 kde V je spotřeba standardního odměrného roztoku KOH [ml]; c je přesná koncentrace standardního odměrného roztoku KOH [mol l -1 ]; m je hmotnost zkušebního vzorku [g]. Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení. Kyselost Kyselost může být vypočtena z výsledků získaných podle stanovení čísla kyselosti buď titrační metodou, nebo potenciometrickou indikací. Kyselost v hmotnostních % se vypočte podle vztahu (4): k = V. c. M V. c. M m = 10. m [% hm.] (4) kde V je spotřeba standardního odměrného roztoku KOH [ml]; c je přesná koncentrace standardního odměrného roztoku KOH [mol l -1 ]; M je molární hmotnost kyselin vybraných pro vyjádření výsledků (viz tabulka II) [g mol -1 ]; m je hmotnost zkušebního vzorku [g]. Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení. Rozdíl mezi dvěma stanoveními je uveden v tabulce IV. Tabulka IV: Rozdíl mezi dvěma stanoveními čísla kyselosti Interval hodnot ČK [mg KOH g -1 ] v absolutních hodnotách [mg KOH g -1 ] 1,0 10,0 0,2 10,0 30,0 0,5 Rozdíl mezi dvěma stanoveními ve vztahu k naměřené hodnotě [% rel.] nad 30,0 2,0

9 4. Stanovení jodového čísla podle Wijse Tato norma specifikuje metodu stanovení jodového čísla v živočišných a rostlinných tucích a olejích, dále uváděných obecně jako tuky. Definice Jodové číslo je množství halogenu, vyjádřené jako jód, vázaného na vzorek za podmínek specifikovaných touto normou, vztažené na hmotnost vzorku. Vyjadřuje se v gramech na 100 g tuku. Princip Zkušební vzorek se rozpustí v rozpouštědle a přidá se Wijsovo činidlo. Po stanoveném čase se přidá roztok jodidu draselného a voda a uvolněný jód se titruje roztokem thiosíranu sodného. Činidla jodid draselný (KI) 10 % vodný roztok roztok škrobu - 2,5 g škrobu se smísí s 15 ml vody, ke směsi se přidá 500 ml vařící vody, vaří se 3 min, potom se nechá vystydnout roztok thiosíranu sodného, c(na2s2o3) = 0,1 mol l -1, standardizovaný ne více než 7 dnů před použitím chloroform - rozpouštědlo Wijsovo činidlo obsahující jodmonochlorid v kyselině octové (poměr I : Cl by měl být v rozmezí 1,1 0,1; v laboratořích je dostupné komerčně připravené Wijsovo činidlo) Přístroje a pomůcky kónická baňka se zábrusem a skleněnou zátkou (500 ml) analytické váhy (váživost s přesností 0,001 g) Postup zkoušky 1. Zkušební vzorek Podle očekávaného jodového čísla se naváží s přesností 0,001 g množství vzorku uvedené v tabulce V do 500ml baňky. 2. Stanovení Podle tabulky V se přidá dané množství rozpouštědla a pipetou 25 ml Wijsova činidla (nepipetujte ústy). Zazátkuje se, obsah baňky se promíchá a baňka se umístí na tmavé místo. Slepý pokus se připraví stejným postupem s tím rozdílem, že není přítomen zkušební vzorek. Pro vzorky s jodovým číslem nižším než 150 g (100 g) -1 se nechá baňka v temnu 1 h. Pro vzorky s jodovým číslem nad 150 g (100 g) -1, pro polymery, oleje obsahující konjugované mastné kyseliny, oleje obsahující ketokyseliny a výrobky značně zoxidované se nechá baňka v temnu 2 h.

10 Po této době se přidá 20 ml jodidu draselného a 150 ml vody. Titruje se standardním odměrným roztokem thiosíranu sodného, dokud nezačne mizet žluté zabarvení. Přidá se několik kapek roztoku škrobu a pokračuje se v titraci právě do vymizení modrého zbarvení při intenzivním míchání. Provede se stanovení slepého pokusu. Tabulka V: Hmotnost zkušebního vzorku Předpokládané jodové číslo [g (100 g) -1 ] Hmotnost zkušebního vzorku [g] Objem rozpouštědla [ml] méně než 1,5 15, ,5 2,5 10, ,5 5 3, , , , , ,10 20 Poznámka: navážka vzorku musí být taková, aby Wijsovo činidlo bylo v 50 60% přebytku. Vyjádření výsledků Jodové číslo (JČ) vyjádřené v gramech na 100 g se vypočte ze vztahu (5.1): JČ = 12,69. (V 1 - V 2 ). c m [g I 2. (100 g) -1 ] (5) kde V1 je objem thiosíranu sodného použitého při titraci slepého pokusu [ml], V2 je objem thiosíranu sodného použitého při titraci vzorku [ml], c je koncentrace thiosíranu sodného [mol l -1 ], m je hmotnost zkušebního vzorku [g]. Výsledky se zaokrouhlují podle tabulky VI. Tabulka VI: Zaokrouhlování výsledků JČ [g (100 g) -1 ] Zaokrouhlení na méně než 20 0, ,5 60 a vyšší 1

11 Přesnost 1. Opakovatelnost Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která jsou provedena v rychlém sledu (nebo současně), stejným analytikem, za použití stejného vybavení, na témže vzorku, by neměl přesáhnout hodnotu r uvedenou v tabulce VII. 2. Reprodukovatelnost Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která jsou provedena za použití stejné metody, na témže vzorku, v různých laboratořích, na různém zařízení, různými analytiky, by neměl přesáhnout hodnotu R uvedenou v tabulce VII. Tabulka VII: Hodnoty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti JČ [g (100 g) -1 ] r R méně než 20 0,2 0, ,3 3, ,0 3, ,5 5,0 Poznámka: Jodové číslo lze stanovit také Hanušovou metodou, která se liší od Wijsovy metody činidlem Hanušovo činidlo obsahuje jodmonobromid rozpuštěný v kyselině octové. Princip metody je shodný s Wijsovou metodou.

12 5. Stanovení hydroxylové čísla Podstata zkoušky Volné hydroxylové skupiny se acetylují anhydridem kyseliny octové a množství spotřebovaného anhydridu, počítaného jako kyselina octová, se stanoví zpětnou titrací ethanolickým roztokem hydroxidu draselného c(koh) = 0,5 mol l -1. Chemikálie anhydrid kyseliny octové, bezvodý toluen, bezvodý pyridin, bezvodý ethanol, 96 %předem zneutralizovaný na fenolftalein 0,5 mol l -1 l KOH ethanolickým roztokem methanol, bezvodý hydroxid draselný, c(koh) = 0,5 mol l -1, ethanolický, standardní odměrný roztok fenolftalein, 1% ethanolický roztok síran sodný, bezvodý kyselina sírová, koncentrovaná acetylační činidlo: do kalibrovaného válečku se zábrusem (100 ml) se odměří 23 ml anhydridu kyseliny octové a za míchání se doplní na 100 ml toluenem. Uchovává se v temnu. Přístroje a pomůcky baňka s kulatým dnem, 250 ml vodní lázeň varné kamínky zpětný vzdušný chladič, 1 m dlouhý, průměr 8 mm byreta, 50 ml pipeta Postup zkoušky Do baňky (250 ml) se zábrusem se naváží podle tabulky V.XII potřebné množství zkoušené látky, odpipetuje se podle tabulky V.XIII dané množství acetylační směsi a pyridinu. Po promísení a přidání varných kamínků se pod zpětným chladičem zahřívá na vodní lázni přesně 1 h. Reakční směs musí být přitom ponořena 1 cm pod hladinu. Po té se přidá zpětným chladičem na každých 5 ml acetylační směsi 1 ml vody (viz tabulka V.XIII). Promíchá se a zahřívá se na vodní lázni 10 min. Po ochlazení se chladič i zábrus opláchnou 5 ml ethanolu (zneutralizovaného) a titruje se odměrným, ethanolickým roztokem KOH (0,5mol l -1 ) na fenolftalein do růžového zbarvení. Stejným způsobem, ale bez vzorku, se provede i slepý pokus. Vyjádření výsledků Hydroxylové číslo se vypočte podle vztahu (5.16): 56,1. c. (V 0 - V 1 ) ČOH = m + ČK [mg KOH g -1 ] (5.16)

13 kde c je koncentrace standardního odměrného roztoku KOH [mol l -1 ]; V0 je spotřeba standardního odměrného roztoku KOH na slepý pokus [ml]; V1 je spotřeba standardního odměrného roztoku KOH na vlastní stanovení [ml]; m je navážka [g]; ČK je číslo kyselosti. Tabulka V.XII: Navážka vzorku podle očekávaného hydroxylového čísla Očekávané hydroxylové číslo navážka [g] [mg KOH g -1 ] I II III , , , , , , , , , , ,20 Tabulka VXIII: Množství acetylační směsi a pyridinu v závislosti na navážce Skupina I II III acetylační směs [ml] pyridin [ml] voda [ml] Poznámka: Při pipetování se neotírá pipeta o stěnu, ale nechá se vykapat. Spotřeba na slepý pokus při 5 ml acetylační směsi je ml 0,5mol l -1 roztoku KOH. Při použití ml acetylační směsi by byla spotřeba značně velká, proto se při titraci odpipetuje do baňky se směsí na promíchání 50 nebo 100 ml 0,5mol l -1 roztoku KOH. V případě vysokého čísla kyselosti Při vysokém čísle kyselosti je stanovení hydroxylového čísla nespolehlivé a je nutné převést mastné kyseliny na příslušné methylestery. Doesterifikování přítomných volných mastných kyselin 2 5 g tuku ve varné baňce se převrství ml absolutního methanolu, přidá se 5 10 ml směsi methanol + kyselina sírová (4 + 1) a vaří se 2 h pod zpětným chladičem. Přidá se ml 10% vodného roztoku NaCl a estery se vyextrahují diethyletherem. Etherový roztok se promyje 10% roztokem NaCl do neutrální reakce, vysuší přes bezvodý síran sodný, zfiltruje a diethylether se oddestiluje. Zbytek se vysuší. Stanoví se hydroxylové číslo (viz dříve) a uvede se, že bylo stanoveno z methylesteru.

14 6. Tenkovrstvá chromatografie (TLC = thin layer chromatography) Tato metoda dělení je založena na rozdělení látky mezi kapalnou a pevnou fázi a lze ji použít k rozdělení a identifikaci látek obsažených ve vzorku. Chromatografovaná látka je mobilní (pohyblivou) fází odtrhávaná ze stacionární (nepohyblivá) fáze a unášena ve směru jejího pohybu a znovu zachycována fází stacionární, čímž dochází k rozdělení jednotlivých složek látky. Chemikálie kyselina fosfomolybdenová, 5% (w/w) ethanolický roztok n-hexan diethylether kyselina mravenčí, koncentrovaná Přístroje a pomůcky vialka 1,5 ml TLC destička (TLC Silica gel 60 F254) Hamiltonova mikrostříkačka vyvíjecí nádoba horkovzdušná pistole Postup zkoušky Do vialky se naváží 0,01 g vzorku s přesností na 1 mg, který se rozpustí v 1 ml hexanu. Připravený roztok vzorku se mikrostříkačkou nanese cca 0,5 cm od okraje TLC destičky v množství 0,1; 0,3; a 0,6 μl. Destička se vloží do vyvíjecí nádoby obsahující vyvíjecí soustavu (n-hexan : diethylether : kys. mravenčí = 80 : 20 : 2 v/v/v) a nádoba se uzavře. Po dosažení mobilní fáze výšky cca 0,5 cm od horního okraje destičky, se destička vyjme a usuší. Následně se postříká roztokem kyseliny fosfomolybdenové a vypálí horkovzdušnou pistolí. Přítomnost jednotlivých složek se identifikuje pomocí standardů. estery cholesterolu triacylglyceroly volné mastné kyseliny cholesterol 1,3-diacylglyceroly 1,2-diacylglyceroly monoacylglyceroly fosfolipidy Obr.1: TLC separace lipidů (Silica gel 60 F 254), mobilní fáze n-hexan : diethylether : kys. mravenčí = 80 : 20 : 2