Schéma zánětlivého procesu v TNF-α cyklu a potenciální místa jeho ovlivnění

Transkript

1 Schéma zánětlivého procesu v TNF-α cyklu a potenciální místa jeho ovlivnění Aktivace buňky Stimulus TACE Signální přenos IκB c-amp Genová transkripce NF-κB Syntéza a uvolnění TNF- α Interakce s receptorem Adhesní molekuly Signální přenos Genová transkripce Migrace Uvolnění mediátorů zánětu (PG, LT, etc.)

2 Molekuly podílející se na mechanismu zánětu (v imunitních a zánětlivých buňkách) a) signální systém (spouští jej interakce s antigenem): - IkB (indukční protein pro kb) - NIK (indukující kinasa pro NFkB) fosforylace IkB - c-amp (cyklický adenosin monofosfát ovlivněný hladinou Ca iontů) b) genová transkripce - NFkB transkripční faktor spouští tvorbu pro-tnf-a c) uvolnění TNF-a - TACE (TNF-a converting enzyme) - (obdobně ICE pro IL-b1) d) migrace buněk - adhezní molekuly (jejich syntéza podporována cytokiny) selektiny, integriny ICAM-1 (intracellular adhesion molecule) VCAM (vascular cell adhesion molecule) e) uvolněné mediátory zánětu prostaglandiny, leukotrieny

3 Hlavní směry současného výzkumu a) interference se signálním systémem především blokáda příslušných MAP-kinas (Mitogen Activating Protein kinase) (známa struktura komplexu IkB NF-kB rtg analýzou) b) inhibice enzymů konvertujících cytokiny do aktivního stavu - jedná se o Zn-metaloproteinasy, možno využít znalostí z MMP (matrix metaloproteinasy) (provedena rtg analýza aktivní domény TACE) c) interference s adhesními molekulami a blokáda jejich funkce - zastav migrace zánětlivých buněk do místa zánětu d) inhibice syntézy, po případě negativní vliv na funkci mediátorů zánětu - především prostaglandiny a leukotrieny

4 Mechanismus účinku imatinibu (Gleevec) inhibuje tyrosin kinasu a tím blokuje aktivaci spojené dvojice genů BCR- ABL která je v pozadí exprese myeloidní leukémie

5 LEKCE 5 - metody optimalizace - historické mezníky vztahů struktura-aktivita - nelineární závislost biol. aktivity na lipofilitě - QSAR statistické řeš pomocí regresní analýzy LFER vztahy v biologických systémech (extratermodynamický přístup) - nelineární závislost biol. aktivity na lipofilitě - statistická kriteria

6 Výzkum a vývoj originálních léčiv Rozdílný přístup u chemických a biotechnologických léčiv - biotechnologická léčiva: - převážně proteiny - jejich strukturu nelze definovat zcela jednoznačně jsou to a) organismu vlastní biomakromolekuly (enzymy, hormony, cytokiny) nebo jejich blízká analoga, po případě jejich aktivní fragmenty b) monoklonální protilátky reagující na specifický antigen - k jejich přípravě využíváme postupy rekombinantní DNA technologie

7 b) chemická léčiva: - jedná o jednoduchá strukturní analoga přirozených ligandů, - řada postupů pro vyhledávání tzv. vůdčích struktur (přírodní léčiva; analoga přirozených ligandů jako agonisté, antagonisté, inhibitory či antimetabolity; studium biologických procesů na buněčné, po případě molekulové úrovni) - ke strukturním obměnám jsou využívány optimalizační matematické metody (souhrnný název CADD)

8 Rozsáhlý počet možných derivátů : N = x k [ n! / k! (n - k)!] x... celkový počet substituentů k... počet současně obsazených poloh n... počet nesymetrických poloh X Příklad: x k n N 100 1, 2, 3 6 2x , 2, x , N R

9 Racionální metody výzkumu léčiv Metody racionálního výzkumu: 1) empirické pravidla vycházející ze zkušenosti omezená platnost, fyzikálně chemická interpretace jen vyjímečně 2) semiempirické využívají různé matematické modely k popisu vztahů mezi strukturou a účinností rozsah platnosti závisí na matematickém modelu a rozsahu tréningové série látek od Hansche po 3D modely 3) sofistikované metody molekulové modelování včetně energetické optimalizace mezimol.interakcí konformační analýza, metody mol.dockingu s přirozeným ligandem spoj s RTG analýzou ligandů a jejich komplexů Např. AutoDock Program Morris G.M. et al, J.Comput.Chem. 1998, 19,

10 Programy pro molekulové modelování a konformační analýzu Název BIOGRAPH CHEM-X CHARMM INSIGHT CERIUS 2 QUANTA SYBYL HYPERCHEM SPARTAN AM1 AMBER Funkce G,S,M,CA,MM,MD,MO G,S,M,CA,MM,ST,MO S,M,CA,MM,MD,ST,MO G,S,M,CA,MM,MD,MO G,S,M,CA,MM,MD,ST,MO G,S,M,CA,MM,MD,MO,FE,PR,S T G,S,M,CA,MM,MD,MO,ST G,S,M,CA,MM,MD,MO,ST G,S,M,CA,MM,MD,MO,ST S,M,CA,MM,MD,ST,MO G grafický model a manipulace S výstavba malých molekul M výstavba makromolekul CA konformační analýza MM molekulární mechanika MD molekulární dynamika FE perturbace volné energie DG distanční geometrie PR interakční energie ST statistické metody (PLS) MO molekulové orbitaly (kvant.chemické metody včetně ab initio)

11 Mezníky historie vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou 1869 Alexander Crum-Brown a T.R. Fraser (angličtí org.chemici) biologická účinnost je funkcí strukturních prvků látky 1893 Richet francouzký fyziolog): potvrz tohoto postulátu narkotická účinnost látek je nepřímo úměrná jejich rozpustnosti ve vodě 1897 Overton a Meyer: jako fyzikální veličinu použili rozdělovací koeficient látek mezi olej a vodu přímá úměrnost Hammettova rovnice 1941: rovnovážné (rychlostní) konstanty reakcí substituovaných látek přímo úměrné elektronovým efektům Formálně stejně: Zahradník 1960: biologická účinnost přímo úměrná charakteru substituentu (veličina t, lze ji nahradit lipofilním parametrem p) 1963 Hansch a Fujita: multiparametrový vztah ; kvantifikace lipofility (log P, p, f) 80. léta: využítí počítačové grafiky a programů MM k optimalizaci interakčních energií k modelování interakcí ligandů s biomakromolekulami

12 Základní předpoklad pro vztah mezi strukturou a biologickou aktivitou: Chování látky v biologickém systému je určováno její strukturou (projevuje se fyzikálně chemickými vlastnostmi) Důvody: a) transport a distribuce látky b) afinita k odpovídajícímu receptoru c) interakce s receptorem závisí na fyzikálně chemických vlastnostech (a může být parametrizována) Předpoklad pro použití kvantitativních vztahů mezi strukturou a biol. aktivitou (QSAR): Všechny substruktury přispívají k biol. aktivitě látky aditivním způsobem bez ohledu na ostatní změny v molekule princip aditivity (neplatí obecně)

13 QSAR založené na LFER (Linear Free Energy Relationships) DG = DH - T.DS entropické změny jsou zanedbatelné nebo úměrné DH Biologická aktivita je lineární funkcí strukturních změn, nejjednodušší statistický postup lineární regresní analýza Model C. Hansche a spol. Strukturní změny jsou vyjádřeny odpovídajícími změnami fyzikálně chemických vlastností (Extratermodynamický přístup) log K X = a 1. x H + a 2 x E + a 3 x S a n x N + const x H, x E, x S,...x N příspěvky odpovídající změnám lipofilních, elektronových, stérických a dalších vlastností K X rychlostní (rovnovážná) konstanta biol.odpovědi Nedodrž principu aditivity se řeší na úrovni fyz.chem. veličin

14 2. Free & Wilson model de novo log A = m + S S b i. z j m... příspěvek neměnné části struktury k aktivitě (průměrná Řeš: hodnota aktivit jedotlivých látek) b... počty jednotlivých strukturních elementů z... příspěvek strukturního elementu k aktivitě (de novo substituentová konstanta) n rovnic pro aktivity jednotlivých látek (součet příspěvků + m) m tzv. symetrických rovnic (součet všech příspěvků substituentů v jedné poloze je roven 0) slabina metody Nevýhody: nezbytný značný počet látek predikce zúžena na použité substituenty fyzikálně chemická interpretace mechanismu účinku n možná Výhody: znalost fyzikálně chemických parametrů n nutná

15 Nelineární závislost biol. aktivity na lipofilitě Lineární závislost na lipofilitě pouze v omezeném rozsahu lipofility Za určitou hraniční hodnotou projeví se pokles aktivity (způsobený poklesem účinné koncentrace v místě účinku) Důvody nelineární závislosti: In vitro: - nepřímá závislost lipofility (L) na rozpustnosti (S) (když S klesá rychleji než biol.aktivita stoupá účinná koncentrace n dosažena) - tvorba micel: kritická micelární koncentrace (CMC) klesá se stoupající lipofilitou (efektivní koncentrace monoméru rovněž) In vivo: - transport rozhoduje o efektivní koncentraci náhodný proces (random walk) rovnováha ustáleného stavu látky silně hydrofilní látky silně lipofilní látky se střední lipofilitou

16 Matematické vyjádř nelineární závislosti: 1. Hansch & Penniston - parabolický model random walk model transportu Gaussova normální distribuční funkce pro pravděpodobnost výskytu: A = f (log P) = a. exp-[(log P log P o ) 2 / b] (1) Log P o A max Kinetický model transportu: (viz dva následující obr.) řeš soustavou diferenc. rovnic kopíruje parabolu E i = A.C.K X (2) E i. vhodně definovaná biol. odpověď A.C.. koncentrace v místě účinku K X rychlostní (rovnovážná) konstanta E i = { a. exp-[(log P log P o ) 2 / b}. C. K X (3) pokud C způsobuje stejnou biol. odpověď (E i je konst.) log (1/C) = k 1 log P - b (log P) 2 + log K X + const (4) log K X = k 2 log P + c s + d E S + e x top + const (5) log (1/C) = a log P - b (log P) 2 + c s + d E S + e x top + const (6)

17 H 1 L 1 H i L i L n k 1 k 2 Kinetický model transportu k 1 k 2 H 1 - H n, L 1 L n : hydrofilní a lipofilní kompartmenty k 1, k 2 : rychlostní konstanty transportu

18 Závislost koncentrace látky v posledním kompartmentu na log P (20 kompartmentový model)

19 Shrnutí platnost Hanschova modelu QSAR je podmíněna: a) chování látky v biologickém systému je určováno její strukturou b) všechny substruktury přispívají k biol. aktivitě látky aditivním způsobem c) entropické změny jsou zanedbatelné nebo úměrné DH (biologická aktivita je lineární funkcí strukturních změn) d) strukturní změny jsou vyjádřeny odpovídajícími změnami fyzikálně chemických vlastností e) o transportu látky biologickým systémem rozhoduje její lipofilita (vyjádřena log P)

20 2. Kubinyi (1978) bilineární model - transport s protiproudou distribucí a) zavádí: rozdílný objem lipidní a hydrofilní fáze V L / V H = b (7) b) rozlišuje: koncentrace v posledním vodném kompartmentu: c n koncentrace v okolí receptoru: c r c) liší se řešm pravděpodobnostní funkce, kterou lze vyjádřit c n rovnicí: c n = k.p n/2 / (bp + 1) n (8) jestliže: P r = c r / c n (charakterizuje rovnováhu mezi vodným kompartmentem a bezprostředním okolím receptoru) pak: c r = k.p r.p n/2 / (bp + 1) n (9) mezi P r a P platí lineární vztah: log P r = a 1.log P + b 1 (logaritmováním c r a dosazm za log P r ) log (1/C) log c r.k X = log k 1 + a 1 log P + b 1 + (n/2)log P n log (bp + 1) + log K X (10) log (1/C) = a.log P b.log (b P + 1) + c + log K X (11)

21 Kubinyi: bilineární model H 1 L 1 H 2 L i H i R k 1 k 2 k 2 k 2 k 1 k 1, k 2... rychlostní konstanty transportu v protiproudém uspořádání H, L... hydrofilní a lipofilní kompartmenty s rozdílným objemem k 1 k 2 k 1

22 Bilineární model závislosti biologické odpovědi na log P

23 Srovnání obou modelů nelineární závislosti na lipofilitě Bilineární model: - vyznačuje se vyšší přesností a statistickou významností (výpočet optima lipofility, sestupná část závislosti) - vyžaduje větší množství experimentálních dat (nižší počet stupňů volnosti) - b je nelineární parametr (výpočet postupnou iterací) Hlavní využití je-li dostatečný počet látek v sestupné části Parabolický model: Bilineární model: Výpočet optimální lipofility (log P opt ) log P opt = -a / 2b log P opt = log a - log b - log (b - a)

24 Příklad: Hemolytická aktivita N-alkylpiperidinů Příklady n r s log (1/C) = log P (log P) log P opt = 4.25 log (1/C) = log P log ( P + 1) log P opt = 3.89 log b = Hemolytická aktivita N-alkylpyridiniových solí: log (1/C) = log P (log P) log P opt = 3.56 log (1/C) = log P log ( P + 1) log P opt = 3.05 log b =

25 Příklady Inhibice mitochondriální MAO (lidská játra): Log (1/K i ) corr = log P (log P) I log P opt = 2.64 Log (1/K i ) corr = log P ( P + 1) I log P opt = 2.45 log b = Střevní absorpce různých organických kyselin: Log k abs = log D (log D) log D opt = 1.70 Log k abs = log D log (39.81 D + 1) log D opt.. nemá optimum log b = 1.600

26 Lineární regresní analýza Lineární regresní analýza biologická aktivita (závislá veličina) vyjádřena lineární kombinací vhodných parametrů (nezávislých veličin): log (1/C St ) = ( 0.095) Sp ( 0.202) DpK a ( 0.123) E S ( 0.078) D ( 0.372) n = 30 r = s = F = 35 Více než jeden parametr vícenásobná regresní analýza Nezbytné podmínky: a) číselné hodnoty všech veličin b) počet látek > počet proměnných Tzv. náhodné korelace: Minimum dat 6 látek na jeden parametr (Topliss) Předpoklady: 1. mezi nezávislými veličinami a závisle proměnnou existuje lineární vztah 2. chyby jsou pouze v hodnotách závisle proměnné (platí částečně)

27 Lineární regresní analýza Regresní analýza založena na metodě nejmenších čtverců při výpočtu regresních koeficientů platí minimalizační podmínka: S (Y exp - Y calc ) 2 je minimální (1) Výpočet regresních koeficientů: pomocí maticového počtu nezbytný počítač a vhodný program (STATGRAPH, SYSTAT) Nejjednodušší případ rovnice přímky: a. směrnice přímky b. úsek na ose y y = ax + b (2) a = (Sxy 1/n SxSy) / [Sx 2 (Sx 2 /n)] (3) b = Sy/n - asx/n (4) Interpretace regresních koeficientů 1. určuje změnu závisle proměnné pro jednotkovou změnu příslušné nezávisle proměnné 2. velikost regresního koeficientu relativní vliv na závisle proměnnou (biologickou účinnost)

28 Statistické hodnoc regresních rovnic Ad 2. platí pouze tehdy, když: - - nezávisle proměnné nejsou kolineární - - mají stejné numerické rozmezí použití normalizovaných dat Statistická kriteria r. koeficient vícenásobné korelace (korelační koeficient) Y i+ vypočtené hodnoty Y i. experimentální hodnoty Y f průměrná hodnota /r/.. hodnoty od 0 1 r = [S (Y i+ - Y f ) 2 / S (Y i - Y f ) 2 ] 1/2 (5) Nutno posuzovat vždy v souvislosti s počtem stupňů volnosti f: f = n p 1 (6) r % pravděpodobnosti, že biol. aktivita je vyjádřena příslušnou regresní rovnicí

29 s residuální standardní odchylka Statistická kriteria s = [S (Y i+ - Y i ) 2 / (n - p - 1)] 1/2 (7) s. chyba s jakou je závisle proměnná vypočtena regresní rovnicí je mírou rozptylu hodnot závisle proměnné kolem regresní funkce Odlehlý výsledek (outlier): Potvrz neplatnosti tzv. nulové hypotézy: Y i+ - Y i > 2s Kriteria statistické významnosti a 1 = a 2 =.. = a n = 0 Fischer-Snedecorovo kriterium F (pro celou rovnici): F = [r 2 (n-p-1)] / (1 r 2 ) p (8) Porovnání vypočtené hodnoty s tabulkovou hodnotou pro daný počet stupňů volnosti f a počet parametrů p se provede při zvolené hladině statistické významnosti a F(calc) F (tab). nulová hypotéza neplatí (a = 0.01 regresní rovnice vysvětluje závisle proměnnou s 90% pravděpodobností; a = pravděpodobnost je 99%)

30 Statistická kriteria Studentův t-test (statistická významnost a meze spolehlivosti regresních koeficientů): t i = a i /s i (9) a i... příslušný regresní koeficient s i... odpovídající standardní odchylka (její výpočet pro každý parametr je součástí statist. programu) Meze spolehlivosti: a i = ts i (10) hodnota t se nalezne v tabulce pro určitou hladinu statist. významnosti a a pro daný počet stupňů volnosti f aby byla splněna podmínka: a i a i (11) log (1/C St ) = ( 0.095) Sp ( 0.202) DpK a ( 0.123) E S ( 0.078) D ( 0.372) (12) n = 30 r = s = F = 35