Návody pro Laboratoře oboru (N352014) Analýza bílkovin

Transkript

1 Návody pro Laboratoře oboru (N352014) Analýza bílkovin 1. Stanovení bílkovin metodou podle Kjeldahla Princip metody dle Kjeldahla Pro stanovení obsahu bílkovin v mléce a mlékárenských výrobcích převažuje stále základní mineralizace dle Kjeldahla s různým stupněm mechanizace a automatizace. Všechny tyto metody zachovávají třístupňový analytický postup: mineralizace, destilace, titrace. Mineralizace vzorků mléka se provádí v digesčních zkumavkách (trubicích), které se vkládají do elektricky vyhřívaných bloků různé konstrukce. Tyto bloky dovolují zlepšit podmínky mineralizace. Přidá se 10 ml koncentrované H2SO4, tableta katalyzátoru (K2SO4+CuSO4) a 10 ml H2O2. Mineralizační bloky umožňují současnou mineralizaci až 20 vzorků mléka, regulovaný postupný záhřev až na mineralizační teplotu 420 C a tím i snížení rizika pěnění vzorku. Destilace amoniaku probíhá v destilační jednotce klasickým způsobem přeháněním vodní parou. Dávkování činidel (roztok hydroxidu sodného, jímací roztok), průběh destilace je řízen automaticky. Vzorek neředěného zmineralizovaného mléka v digesční trubici se vloží do destilační jednotky a uvede se do chodu. Automaticky se nadávkuje příslušné množství 40% hydroxidu sodného a zapne se generátor páry. K úplnému vydestilování amoniaku z mineralizátoru dojde zhruba za 2 až 4 minuty. Vodní pára s vydestilovaným amoniakem kondenzuje v chladiči a destilát stéká do předlohy, která obsahuje 1% kyselinu boritou s indikátorem (bromkresolová zeleň a automatická titrace 0,1mol.l -1 HCl. Varianta a) Příprava vzorku sýrů - hodnocení zrání metylčerveň). Po ukončení destilace následuje Celkový obsah dusíku Sýr se nastrouhá na struhadle, aby došlo k jeho homogenizaci. Do homogenizační nádobky (mixeru) se naváží 15 g sýra (n 1 ), přidá 75 g 0,5 mol.l -1 citrátu trisodného (odvážit diferenčně pomocí odměrného válce = n 2 ) a homogenizuje se při maximálních otáčkách 10 minut. Suspenze se přelije do Erlenmayerovy baňky na 100 ml se zábrusem a temperuje se 1 hodinu při 40 C na magnetickém míchadle s kontrolou teploty. Do předvážené odměrné baňky na 200 ml (V 1 ) se odváží pomocí pipety 60 g (n 3 ) citrátové disperze a po ochlazení se doplní 1

2 destilovanou vodou. Z disperze se odpipetuje 2 x 15 ml (V 2 ) do digesčních trubic pro stanovení celkového obsahu dusíku a asi 2 ml vzorku se odeberou na separaci bílkovin pomocí HPLC. Spotřeba 0,1mol.l -1 HCl = a TN (ml) - dodá vedoucí úlohy po analýze vzorku Přesná koncentrace 0,1mol.l -1 HCl (c HCl )- dodá vedoucí úlohy Výpočet: sestavte vztah pro výpočet obsahu celkového dusíku (%hm) a předložte vedoucímu úlohy ke kontrole. Frakce rozpustná při ph 4,5 Do odměrné baňky na 100 ml se odpipetuje 80 ml citrátové disperze (V 3 ) a 5 minut temperuje za intenzivního míchání v ledové vodní lázni na C. Změří se ph, pomocí 1M HCl se upraví do rozmezí 4,35 4,55 a doplní destilovanou vodou na 100 ml (V 4 ). Vzniklá sraženina se odfiltruje přes filtr s označením 390 (pokud není filtrát čirý, filtrace se opakuje). Ke stanovení se odpipetuje 2 x 15 ml filtrátu (V 5 ). Na separaci bílkovin se opět odebere asi 2 ml filtrátu. Spotřeba 0,1mol.l -1 HCl = a TN (ml) - dodá vedoucí úlohy po analýze vzorku Přesná koncentrace 0,1mol.l -1 HCl (c HCl )- dodá vedoucí úlohy Výpočet: sestavte vztah pro výpočet obsahu dusíku rozpustného při ph 4,6 a předložte vedoucímu úlohy ke kontrole. Varianta b) Příprava vzorku mléka - hodnocení tepelné denaturace Tepelné (kaseinové) číslo vyjadřuje poměr obsahu dusíku kaseinu a denaturovaných syrovátkových bílkovin (bílkovin vysrážených při ph 4,6) k celkovému obsahu dusíku stanoveném metodou dle Kjeldahla. 14 g plnotučného nebo polotučného sušeného mléka nebo 10 g sušeného odstředěného mléka se rozpustí ve 100 ml destilované vody (40 C). Pasterované nebo UHT mléko se analyzuje přímo. Odpipetuje se 5 ml do zkumavky ke stanovení celkového obsahu dusíku (metodou dle Kjeldahla) a 5 ml do kádinky (150 ml) pro izolaci kaseinu. Mléko v kádince se zředí 75 ml destilované vody (40 C), přidá se 1 ml 10%ní kyseliny octové a obsah se promíchá tyčinkou. Po deseti minutách se přidá 1 ml roztoku octanu sodného (34,02 g trihydrátu octanu sodného doplnit na 250 ml destilovanou vodou) a obsah se promíchá. Kádinka se umístní na 45 minut do lednice, pak se přidá 13 ml vody, obsah se 2

3 opět promíchá a po 15 minutách se filtruje přes filtrační papír o střední hustotě předem smočený promývacím roztokem (6 ml 10%ní kyseliny octové a 14 ml roztoku octanu sodného doplnit na 1000 ml, zkontrolovat ph, případně upravit na hodnotu 4,8 ± 0,05). Filtrát musí být čirý. Pomocí promývacího roztoku převést kvantitativně obsah kádinky na filtrační papír. Sraženinu třikrát promýt. Filtrační papír se sraženinou vložit do zkumavky ke stanovení obsahu dusíku (metodou dle Kjeldahla). Do třetí zkumavky se vkládá samotný filtrační papír. Vyhodnocení: Tepelné číslo se vypočte ze spotřeb HCl při stanovení dusíku : H V V S = V C P 100 kde V S spotřeba při stanovení dusíku ve sraženině [ml] V P spotřeba při stanovení dusíku v samotném filtračním papíru [ml] V C spotřeba při stanovení celkového obsahu dusíku v mléce [ml] Opakovatelnost: 1,2 % Určení třídy tepelného ošetření sušeného mléka: tepelný ohřev před sušením WPNI tepelné číslo [%] nízký více než 6 mg / g 80,0 nebo méně střední 4,5-5,9 mg / g 80,1-83,0 středně vysoký 1,5-4,4 mg / g 83,1-88,0 vysoký méně než 1,5 mg / g 88,1 nebo více Příprava vzorku syrovátky pro HPLC (modifikace předchozího postupu s menším ředěním; Vasbinder a Kruif, 2003; Vasbinder A. J., de Kruif C. G.: Casein whey protein interactions in heated milk: the influence of ph. International Dairy Journal 13 (2003) ): 0.4 g mléka ve 2 ml Eppendorf. zkumavce se smíchá s 0,8 g destilované vody v bloku (40 C), přidá se 40 μl 10% kyseliny octové, po promíchání a 10 min stání při laboratorní teplotě se přidá 40 μl (1 mol.l -1 ) octanu sodného a 0,72 g destilované vody. Po promíchání a 1 h stání se odstředí 5 min při 3000 g. Supernatant se přefiltruje přes 0,22 μm PVDF filtr do vialky. Varianta c) Stanovení hrubých a čistých bílkovin, výpočet nebílkovinného dusíku v mléce nebo v syrovátce Při mineralizaci neupraveného vzorku (bez izolace bílkovin) se stanoví tzv. obsah hrubých bílkovin. Vhodná navážka pro mléko je 5 g. Takto stanovený obsah bílkovin však zahrnuje i látky nebílkovinné povahy, v mléce je to zejména močovina, dále kreatin, volné 3

4 aminokyseliny, nukleové kyseliny. Po zadání navážky lze z přístroje Kjeltec získat výsledek přímo jako obsah bílkovin v % hm. Původní obsah dusíku hrubých bílkovin se vypočte dělením faktorem 6,38. Pro stanovení obsahu nebílkovinného dusíku je nutné stanovit dusík čistých bílkovin. Do kádinky na 150 ml se odpipetuje 5 ml mléka a zváží s analytickou přesností. Vzorek se vysráží přídavkem 5 ml 25%hm roztoku kyseliny trichloroctové (TCA) a promíchá tyčinkou. Po 15 minutách se vzniklá sraženina kvantitativně filtruje přes filtrační papír o střední hustotě předem smočený promývacím roztokem (12,5 %hm TCA). Filtrát musí být čirý. Pomocí promývacího roztoku převést kvantitativně obsah kádinky na filtrační papír. Sraženinu třikrát promýt 10 ml 12,5%hm TCA. Filtrační papír se sraženinou vložit do zkumavky ke stanovení obsahu dusíku. Výpočty: w % (NN TTTT ) = 1,4007.bb.cc NN FFFF.mm FFFF aa ww % (TTTT) = 6,38. ww % (NN TTTT ) ww % (NNNNNN) = ww % NN CCCC) ww % NN TTTT w % (N TP ) obsah dusíku čistých bílkovin [%] b spotřeba HCl po odečtu slepého vzorku [ml] c přesná koncentrace odměrného roztoku přibližně 0,1mol.L -1 HCl, w % (N FP ) průměrný obsah dusíku ve filtračním papíru [%] m FP hmotnost filtračního papíru [g] a navážka vzorku [g] w % (TP) obsah čisté bílkoviny [%] w % (N CP ) obsah dusíku hrubých bílkovin [%] w % (NPN) obsah nebílkovinného dusíku [%] 2. Spektrofotometrické stanovení bílkovin Pro spektrofotometrické stanovení bílkovin lze použít několik metod, výběr vhodné metody záleží na složení vzorku (obsah interferujících složek), na požadované citlivosti, dostupného množství vzorku, rychlosti stanovení, nárocích na chemikálie apod. Lze použít následující metody: měření absorbance v UV oblasti metody založené na interakci s ionty mědi (biuretová, Lowryho, bicinchoninová) stanovení aminoskupin po kyselé hydrolýze (reakce s ninhydridem, s o-ftaldialdehydem) metody založené na vazbě barviv na bílkovinu (metoda Bradfordové) 4

5 Metoda Objem vzorku Rozsah měření (g/l) UV absorbce 1 ml 0, Biuretová metoda 1 ml 1-10 Lowryho metoda (modifikace Hartree) 1 ml 0,1 0,6 Bicinchoninová metoda 100 µl 0,2 1,0 Reakce s ninhydrinem po hydrolýze 1 ml 0,02 0,05 Metoda Bradfordové µl ,3 Stanovení v UV oblasti spektra Pro stanovení bílkovin, které v primární struktuře obsahují aromatické aminokyselin tyrosin a tryptofan (příspěvek fenylalaninu je zanedbatelný), lze využít měření absorbance při při 275 až 280 nm. Pokud jsou ve vzorku nukleové kyseliny, jejich vliv se eliminuje pomocí poměru absorbancí 280/260 nm. Pro stanovení bílkovin se využívá i oblast UV spektra od 205 nm až 236 nm. Při krátkých vlnových délkách ruší řada jiných sloučenin (včetně kyslíku při 205 nm). Za absorbanci bílkovin při kratších vlnových délkách pod 240 nm odpovídá přítomnost Trp, Tyr, Phe, His, Met, Cys a peptidových vazeb. Stanovení méně závisí na aminokyselinovém složení a je výrazně citlivější. Biuretová metoda Metoda je pojmenována podle sloučeniny biuretu, který vzniká tavením močoviny za odštěpení amoniaku. Vazby v močovině se chovají stejně jako dvě peptidové vazby a močovina vytváří za těchto podmínek barevný komplex s mědí. Metoda je založena na chelataci měďnatého iontu imidovými strukturami polypeptidu ionizovanými v silně alkalickém prostředí za vzniku červeno-fialového komplexu. Se stanovením interferují látky redukující měďnaté ionty (glukosa, větší množství sulfhydrylových skupin, vysoké koncentrace amonných solí a některé fosfáty). Biuretová metoda je vhodná pro vzorky obsahující proteiny v koncentraci 1 až 10 g/l. Tmavě červené zbarvení se měří při 550 nm. Hartree Lowryho metoda Lowryho metoda využívá dvousložkové činidlo - první složkou je biuretové činidlo (jako v biuretové metodě), druhou složkou je fenolové Folin-Ciocalteauvo činidlo. Toto činidlo 5

6 tvoří polykyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové, které se redukují tyrosinovými zbytky proteinů a barví se modře. Původní Lowryho metoda je z roku 1951, existuje v řadě modifikací, často používaná je modifikace Hartreeho (1972), která je ve srovnání s původním postupem jednodušší a citlivější s lineární odezvou v širším rozsahu koncentrací, vyšší je i stabilita činidel. Bicinchoninová metoda Metoda je založena na alkalické redukci měďnatého iontu na měďný proteinem a následné chelataci měďného iontu kyselinou bicinchoninovou (BCA) za vzniku červeného zbarvení. Pokud vzorek obsahuje redukující sacharidy a amonné ionty, je nutné je před stanovením odstranit (dialýzou, vysrážení bílkoviny), protože silně interferují. Ninhydrinová metoda Při tomto stanovení jsou proteiny nejprve hydrolyzovány na aminokyseliny (např. 6% kyselinou sírovou při 100 C). Po neutralizaci aminokyseliny reagují s ninhydrinem, následuje měření absorbance při 570 nm. Při stanovení neinterferují fenoly a podobné sloučeniny jako při stanovení Folinovým činidlem. Pro kalibraci se obvykle používá leucin, odchylky v intenzitě zbarvení jsou u bílkovin bohatých na prolin a hydroxyprolin, s vysokým obsahem cysteinu nebo silnou glykosylací. Stanovení ruší amonné ionty, lze je eliminovat vysrážením bílkoviny TCA, přítomnost nukleových kyselin nevadí. Nevýhodou je časová náročnost. Metoda Bradfordové Metoda je založena na vazbě barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na proteiny. Maximum absorbance kyselého roztoku barviva se vazbou na bílkovinu mění ze 465 na 595. Coomassie Blue se přednostně váže na zásadité a aromatické aminokyseliny, především arginin. Odezva je lineární v rozsahu jednoho řádu. Stanovení ruší hydroxidy a detergenty. Barva je stabilní přibližně 1 hodinu. Roztoky: Bradford reagent Roztok standardu bílkoviny hovězí sérový albumin (WPI, 0,5 mg bílkovin v 1 ml), příp. jiný vhodný standard Chlorid sodný 0,15 mol/l Pracovní postup: 6

7 Ze zásobního roztoku činidla se odleje potřebné množství (temperace před analýzou, zamezení kontaminace zásoby činidla) Vzorek Objem 0,5 mg/ml roztoku WPI (µl) Objem 0,15 mol/l NaCl (µl) Výsledná koncentrace WPI (µg/ml) Blank S S S S Pozn.: Kalibrační roztoky se připravují každý 3x, paralelní skupina může vyzkoušet linearitu v širším rozsahu koncentrací (S , S , S ) K roztoku standardu se přidá 1 ml Bradford. činidla, promíchá se a nechá se 2 min stát. Změří se absorbance při 595 nm proti slepému vzorku. Z naměřených hodnot se vypočte kalibrační rovnice. 100 µl vhodně naředěného vzorku se změří stejným postupem. Mléko se pro stanovení zředí 3000krát, syrovátka 750krát. (3 paralelní stanovení). Pokud absorbance není v kalibračním rozmezí, upraví se ředění vzorku. 3. Separace bílkovin pomocí RP HPLC Úvod Separace biopolymerů pomoci RP-HPLC závisí na reverzibilní hydrofobní interakci mezi molekulami stanované látky v eluentu a chromatografickým médiem. Počáteční prostředí je vodné, což vede ke vzniku vysoce organizovaných struktur vody kolem molekuly vzorku. Pro dosažení smočeného povrchu se přidává organický modifikátor, obvykle je to 3% - 5% acetonitril. Jakmile se vzorek naváže na médium, hydrofobní povrch vystavený eluentu je minimalizován. Separace závisí na rovnováze mezi eluentem a povrchem media. Rozdělování vzorku zaleží na vlastnostech media, hydrofobicitě vzorku a složení eluentu (mobilní fáze), viz Obr. 1. Na počátku jsou podmínky příznivé pro extrémní rovnovážný stav, kdy je vázáno v podstatě 100 % vzorku. Vzhledem k tomu, že proteiny a peptidy nesou kombinaci dostupných hydrofilních a hydrofobních aminokyselin a jsou poměrně velké, má interakce s médiem vícebodový charakter. 7

8 Obrázek 1. Proteiny a peptidy se vážou k médiu RPC ve vodném prostředí a eluují jakmile eluční činidlo se stává více hydrofobní. Postup při RP-HPLC separaci Separace molekul pomocí RP-HPLC závisí na reverzibilní hydrofobní interakci mezi molekulami vzorku v eluentu a médiem. Pro postupnou eluci se množství organického rozpouštědla se zvyšuje tak, aby se prostředí stalo více hydrofobním. K vazbě a eluci dochází nepřetržitě během průchodu vzorku přes kolonu. Více hydrofobní vzorky se pohybují kolonou pomaleji. V důsledku toho jsou vzorky eluovány v pořadí s rostoucí hydrofobicitou. Typický biologický vzorek obsahuje komplexní směs molekul s různým rozsahem hydrofobicity. Většina biomolekul jsou dostatečně hydrofobní pro vazbu na RP-HPLC média ve vodném prostředí, v přítomnosti nízké koncentrace organického modifikátoru jsou schopny eluce ve velmi úzkém rozmezí koncentrace organického modifikátoru. Gradientová eluce je proto nejpraktičtější metoda pro RPC separaci komplexních biologických vzorků. Vzorky se zakoncentrovávají v průběhu vazby. Hlavní fáze separace jsou uvedeny na Obrázku 2. Vzorek se aplikuje za podmínek, které upřednostňují vazbu, obvykle za použití vodného roztoku obsahujícího iontově-párové činidlo kyselinu trifluoroctovou (TFA) pro zvýšení hydrofobní interakce a nízké koncentrací organického modifikátoru, jako je 5% acetonitrilu. Po nástřiku a po průchodu všech nevázaných molekuly (to znamená, že UV signál se vrátil do výchozího stavu), jsou podmínky změněny tak, aby došlo k eluci navázaného vzorku. Eluce začíná zvýšením koncentrace organického modifikátoru, jako je například acetonitril. Molekuly s nejnižším hydrofobicitou se eluují jako první. Řízeným zvyšováním koncentrace organického modifikátoru dochází k separaci molekul s rozdílnou hydrofobicitou. Molekuly s nejvyšším stupněm hydrofobicity budou zadržovány nejsilněni a eluují se jako poslední. Promýváním se odstraní většina z pevně vázaných molekul na konci eluce. Kolona je pak re-ekvilibrována pro následující analýzu. 8

9 Matrix Rovnováha. RP-HPLC kolona je v rovnovaze se startovací mobilní fází. Hydrofobní povrch Hydrofobní peptidy proteiny Ostatní hydrofobní peptidy proteiny a a Vazba vzorku. Hydrofobní molekuly se vážou na hydrofobní médium a zakoncentrovávají se na koloně. Proteiny nebo peptidy s nízkou hydrofobicitou se výmývají po nástřiku vzorku 1. Eluce Gradientová eluce začiná když se UV signál vrací k baseline. S rostoucí koncentrací modifikátoru jsou nejprve eluovány málo hydrofobní molekuly. 2. Eluce Eluce vzorku probíhá podle rostoucí hydrofobicity. 3. Eluce 9

10 Vymývání Vymývání pří vysoké koncentraci modifikátoru, dojde k odstranění velmi hydrofobních kontaminantů před re-ekvilibrací. Obrázek 2. Průběh separace na RP-HPLC Postup při připravě vzorků 1. Příprava roztoku pro sražení kaseinu M acetát sodný M octová kyselina, ph Příprava 3 roztoků s acetonitrilem a TFA: Roztok A 5% acetonitril % TFA v ultračisté vodě Roztok B 80% acetonitril % TFA v ultračisté vodě Roztok S 10 % acetonitril % TFA v ultračisté vodě 3. Odstředění vzorků mléka pro zbavení tuků >14000 g, 10 minut. 4. Pro analýzu syrovátkových bílkovin: a) Sražení kaseinu pomocí míchaní odstředěného mléka a srážecího roztoku v poměru 1:1. b) Zamichat pří otáčkách 1400 min -1 a inkubovat 45 minut při 40 C v termomixeru. c) Odstředění vzorků >14000 g, 10 minut. d) Filtrace supernatantu přes 0.22 μm PVDF mikrofiltr. e) Smichat přefiltrovanou syrovátku s roztokem S v poměru 1:1 5. Spustít analýzu na C18 HPLC koloně. Z dodaných podkladů sestavte kalibrační křivku dané bílkoviny, identifikujte další bílkoviny na chromatogramu a vypočítejte jejich obsah ve vzorku pomocí sestavené kalibrační křivky a dodaných křivek pro zbývající bílkoviny. 10

11 4. Stanovení volných aminoskupin spektrofotometricky Princip metody Při reakci primárních aminoskupin s o-ftaldialdehydem (OPA) za přítomnosti N-acetyl-Lcysteinu (NAC) vzniká 1-alkylthio-2-alkylisoindol, který absorbuje při vlnové délce 335 nm. Příprava vzorku OPA činidlo se připraví smísením 0,04 g OPA rozpuštěného v 1 ml methanolu, 40 ml NA 2 B 4 O 7 (0,1 mol l -1, ph = 9,55), 2,5 ml SDS (20 %hm), 0,05 g NAC rozpuštěného v malém množství destilované vody a doplněním na objem 50 ml destilovanou vodou. Takto připravené činidlo se nechá stát 1 hodinu. Pro kalibraci se připraví roztoky kyseliny glutamové o koncentracích 0 0,16 mmol l -1, které se následně proměří na spektrofotometru při vlnové délce 335 nm. Citrátový výluh (celkový dusík sýra) se zředí 1:1 destilovanou vodou, frakce rozpustná při ph 4,6 se neředí. Mléko se ředí vodou 1:5, ze sušené syrovátky se připraví 7% roztok a nechá se minimálně 1 hodinu stát. Poté se smíchá 0,2 ml vzorku a 1 ml SDS (1 %), po 15 minutách se smíchá 0,3 ml této směsi s 2 ml demi vody. Tímto je vzorek připraven na stanovení volných aminoskupin. Pro samotné měření vzorku do plastové kyvety napipetuje 1 ml OPA činidla a 1 ml připraveného vzorku. Obsah kyvety se promíchá a po 12 minutách se proměří absorbance proti slepému pokusu (místo vzorku se přidá destilovaná voda). Pokud je absorbance mimo kalibrační rozmezí je nutné ředění vzorku upravit. 5. Titrační kyselost a formolová titrace Titrační kyselost 50 ml vzorku se titruje 0,25 mol l -1 roztokem NaOH za přídavku 2 ml 2% roztoku fenolftaleinu do slabě růžového zabarvení, které má srovnávací roztok 50 ml vzorku + 1 ml 5% roztoku CoSO4.H2O. Zabarvení má vydržet 1 min. 11

12 Výsledek se vyjádří: buď jako číslo spotřebovaných ml 0,25mol.l l -1 NaOH na 100 ml vzorku, což je vyjádření dle Soxhlet - Henkela (SH): SH= b. 2. c / 0,25 b * c *1000 či jako látkový obsah kyselin v: mmol l 1 = a kde: a = množství vzorku, použité k titraci, ml b = spotřeba přesně 0,25 mol l -1 NaOH při titraci 50 ml vzorku, c = koncentrace standardního roztoku, mol.l-1 (zde je 0,25) Příprava 0,25 mol.l -1 NaOH Pro přípravu 1 L roztoku se naváží 10,20 g NaOH a rozpustí se v čerstvě převařené destilované vodě a doplní se na 1 l. Přesná koncentrace se stanoví pomocí 0,125 mol.l -1 roztoku kyseliny šťavelové (C 2 H 2 O 4.2H 2 O; MW 126,07). S přesností 0,0002 g se naváží 7,87938 g, rozpustí se v převařené vodě a doplní se do 500 ml. Do titrační baňky se odpipetuje 20 ml roztoku kyseliny šťavelové, přidají se 2-3 kapky 2% roztoku fenolftaleinu v ethanolu a titruje se NaOH do růžového zbarvení. Formolová titrace Princip metody Podstatou metody je titrace volných -COOH skupin aminokyselin po reakci neutralizovaného mléka za přídavku formaldehydu za podmínek metody. Metoda je použitelná pouze pro mléka s kyselostí do 9 SH (9 ml NaOH, 0,25 mol. l-1). Metody může být využito i ke sledování proteolytických změn bílkovin u různých mléčných výrobků. Byly vypracovány různé modifikace metody (dle Schulze, Pyneho či Steinegera). Liší se především použitým množstvím mléka a koncentrací standardního roztoku NaOH při titraci. Postup dle Steinegera K 50 ml nebo 25 ml mléka se přidá 2 ml 2% fenolftaleinu a roztok se titruje 0,25M roztokem NaOH do růžového zbarvení (tzn. provádí se stejně jako stanovení titrační kyselosti dle SH). Pak se přidá 5 ml 30 % formaldehydu čerstvě zneutralizovaného na fenolftalein, promíchá a ponechá 2 min stát. Následuje neutralizace uvolněných -COOH louhem stejné koncentrace do růžového zbarvení. Spotřeba při druhé titraci přepočtená na 100ml vzorku se nazývá aldehydové číslo. 1 stupeň aldehydový odpovídá 0,0758 g dusíku. Celkový obsah bílkovin se získá násobením faktorem 6,38. 12