PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE

Transkript

1 PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE

2 Tenkovrstvá chromatografie je technika pro identifikaci a separaci směsi organických látek Identifikace složek směsi (nutné použít standard) analysa frakcí sbíraných během purifikace analysa čistoty látek Při TLC se látky ze směsi rozdělují mezi adsorbent (stacionární fáze, obvykle silikagel, SiO 2 ) a solvent (mobilní fáze), která proudí skrz adsorbent

3 Uspořádání tenkovrstvé a papírové chromatografie Vzestupné Sestupné

4 mobilní fáze vzlíná stacionární fází TLC látky rozpuštěné v mobilní fázi putují TLC deskou složky směsi putují rozdílnou rychlostí, která záleží na intermolekulárních silách mezi látkou a silikagelem stacionární fáze a látkou a složkami mobilní fáze stacionární fáze SiO2 je velmi polární - silné dipól-dipól interakce, vodíkové můstky čím polárnější analyt, tím silnější vazba se stacionární fází, tím menší rychlost mobilní fáze relativně nepolární silné Londonovy síly, dipól-dipól interakce, vodíkové můstky nepolární analyt interaguje se stacionární méně silně než s mobilní fází putuje rychleji

5 Charakterizace separece u i R F, i = = um d d i m d i d m u i u m d i d m rychlost skvrny i-tého analytu rychlost (čela) mobilní fáze vzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu vzdálenost čela mobilní fáze od startu

6 Co nám říká hodnota R f? o R f hodnoty lze použít k usnadnění identifikace látky v porovnání se standardy o R f hodnota není fyzikální konstanta, mělo by být provedeno srovnání pouze skvrny na stejné desce za stejnou dobu o Dvě látky, které mají stejnou hodnotu R f mohou být totožné; ty, které mají různé hodnoty R f nejsou totožné

7 málo polární nejvíce polární Typ látky alkany alkeny etery aromáty aldehydy a ketony alkoholy aminy organické kyseliny soli polárnější látky se váží silněji na stacionární fázi málo polární nejvíce polární rozpouštědlo hexany tetrachlormethan toluen chloroform diethyleter ethylacetát aceton methanol kys. octová voda eluční síla běžných rozpouštědel

8 Detekce barevný produkt SUPR UV (látky které světélkují pod UV světlem) vizualizace postřikem s vhodným chemickým činidlem (ninhydrin, H 2 SO 4, KMnO 4, I 2 )

9 Aplikace dělení aminokyselin, vitamínů, alkaloidů, uhlovodíků, nukleotidů, potravinářských barviv, cukrů, Flash chromatografie

10 Flash chromatografie použití pro purifikaci nízkomolekulárních přírodních látek a produktů organických synthes

11 mobilní fáze: - dvou a vícesložkové systemy běžná rozpouštědla: dichloromethan/hexan ether/hexan hexan/ethylacetát dichloromethan/methanol ethanol chloroform/ethanol chloroform/aceton

12 pro odhad retence na koloně: C V =1/R f C V - objem mobilní fáze potřebný k eluci komponenty vztažený na objem kolony R f - hodnota retence na TLC desce

13 Na začátek zařadit metody: s vysokou kapacitou velkým výtěžkem nízké rozlišení Později metody s: vysokým rozlišením dostačujícím výtěžkem kapacita méně významná Základní zásady Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace možné snížení výtěžku) Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími

14 Příklady Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence odstranění fragmentů a komplexů Nevhodné kombinace Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace)

15 Sledování průběhu separace Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] Specifická aktivita [U/mg] Stupeň přečištění Výtěžek 0, % (NH 4 ) 2 SO 4 2, ,4 85 % HIC 2, ,6 60 % dialysa 2,2 6, [%] 1,6 55 % IEX 0, %

16 Sledování průběhu separace Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] 258, (NH 4 ) 2 SO 4 118, HIC 57, GPC 19,

17 Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] 258, (NH 4 ) 2 SO 4 118, HIC 57, GPC 19, Specifická aktivita [U/mg] 0,77 Stupeň přečištění - Výtěžek [%] 100 3,81 4, ,33 13, ,45 85,8 64

18 Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mm maltosy a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na 2 CO 3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm 3.cm -1.mol -1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?

19 Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mm maltosy a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na 2 CO 3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm 3.cm -1.mol -1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?

20 Stanovení koncentrace bílkovin

21 Kjeldahlova metoda stanovení N 2 Mineralizace vzorku převedení organického dusíku na NH 4 + Stanovení NH titrace, fotometrie, selektivní elektrody

22 UV spektrofotometrie

23 UV spektrofotometrie 280 nm aromatické AMK interference nukleotidů nm peptidová vazba Výhody - nedestruktivní metoda

24 VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost

25 Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v silně alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidové vazby Cu 2+ Měření : nm 1-10 mg/ml

26 Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Tyr, Trp, Cys Měření : nm µg/ml

27 Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm µg/ml

28 BCA metoda Meření : 562 nm 0,4-100 µg/ml

29 Měření: 575 nm Ninhydrinová metoda

30

31 Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu (fluorescamin) na bílkovinu měření vzniklé fluorescence Měření: 390/475 nm 10 ng

32 Stanovení koncentrace DNA

33 Metoda měření absorbance v UV oblasti

34 Metoda s diaminobenzoovou kyselinou Měření: depurinace + DABA Měření: 420 nm 25 µg Metoda s difenylaminem Měření: depurinace + DPA Měření: 595 nm 25 µg

35 Ethidiumbromid Fluorescenční metody 4`,6`-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 2-(2-[4-hydroxyphenyl]-6-benzimidazolyl)-6- (1-methyl-4- piperazyl)benzimidazol trihydrochlorid (Hoechst 33258)

36 Stanovení koncentrace RNA

37 Metoda měření absorbance v UV oblasti 1 OD 260 = 40 µg/ml ssrna A 230:260:280 ~1:2:1

38 Metoda s orcinolem Princip: depurinace + reakce s orcinolem Měření: 660 nm