2) Připravte si 7 sad po pěti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

Transkript

1 CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid) při různých počátečních koncentracích substrátu. Množství vzniklého produktu (p-nitroanilin žluté barvy) je úměrné rychlosti hydrolýzy. Po přidání inhibitoru (aprotininu) k reakční směsi se určí míra inhibice enzymové aktivity. Intenzita zbarvení reakčního roztoku se měří při % kyselina octová 0.05 M Tris-HCl pufr, ph 8.2 (obsahuje 0.02 M CaCl 2 ) M BAPNA v dimethylsulfoxidu trypsin (0,25mg/ml) aprotinin (vodný roztok 1:100) Sojový inhibitor trypsinu (0,083mg/ml) 1) Připravte řadu roztoků BAPNA o různé koncentraci ředěním základního roztoku podle následující tabulky: č. zkumavky BAPNA (ml) Dimethylsulfoxid (ml) ) Připravte si 7 sad po pěti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky. 3) Do 1. řady zkumavek pro slepé stanovení přidejte 1.8 ml 0.05 M Tris-HCl pufru, 0.3 ml roztoku kys. octové a 0.2 ml roztoku trypsinu v uvedeném pořadí. 4) Do 2. a 3. řady zkumavek přidejte 1.8 ml 0.05 M Tris-HCl pufru, vložte do termostatu nastaveného na 35 C a nechte cca 5 min vytemperovat. Potom pipetujte postupně v minutových intervalech 0.2 ml roztoku trypsinu, čímž zahájíte enzymovou reakci. Přesně po 10 minutách od zahájení reakce v první zkumavce začněte opět v minutových intervalech přidávat do zkumavek ve stejném pořadí 0.3 ml 30% kys. octové, čímž reakci ukončíte. Upozornění: Doba reakce musí být v každé jednotlivé zkumavce přesně 10 min. 5) Do 4. a 5. řady zkumavek přidejte 1.6 ml 0.05 M Tris-HCl pufru a 0.2 ml roztoku inhibitoru (aprotininu). Dále postupujte stejně jako v bodu 4. 6) ) Do 6. a 7. řady zkumavek přidejte 1.6 ml 0.05 M Tris-HCl pufru a 0.2 ml roztoku inhibitoru (sojový inhibitor trypsinu). Dále postupujte stejně jako v bodu 4. 7) Po ukončení enzymové reakce přidejte do všech zkumavek 4 ml destilované vody, abyste naředili intenzivní žluté zbarvení. Změřte absorbanci výsledného roztoku při vlnové délce 405 nm vždy proti slepému pokusu o téže koncentraci substrátu.. 1

2 Do grafu vyneste naměřené hodnoty absorbance (veličina úměrná reakční rychlosti) proti hodnotám počátečních koncentrací substrátu v reakčním roztoku pro inhibovanou i neinhibovanou reakci. Graficky dvojnásobným reciprokým vynesením absorbance proti počáteční koncentraci substrátu určete hodnotu K m. Určete maximální reakční rychlost V max ( A/10 min) u obou reakcí, vypočítejte procento inhibice a určete její typ. 2) Stanovení glukosy setem BIO-LA-TEST Glukosa se oxiduje kyslíkem za katalýzy glukosaoxidasou na peroxid vodíku a glukonát. Vzniklý H 2 O 2 se stanovuje reakcí katalyzovanou peroxidasou v přítomnosti chromogenu. Vzniklý barevný produkt se měří spektrofotometricky při vlnové délce 500 Glukosa + ½ O 2 + H 2 O glukosaoxidasa > glukonát + H 2 O 2 ½ H 2 O aminoantipyrin + fenol peroxidasa > chinonimin + 4 H 2 O BIO-LA-TEST je komerční set určený pro stanovení hladiny glukosy v krevním séru nebo plasmě v klinických laboratořích. dle návodu ke kitu 3) Stanovení proteolytické aktivity pomocí rozpustného a nerozpustného chromolytického substrátu 3a) Stanovení aktivity trypsinu nerozpustným chromolytickým substrátem Černá želatina jako nerozpustný chromolytický substrát byla připravena zesítěním želatiny glutaraldehydem v přítomnosti černé tuše. Působením trypsinu se hydrolyticky štěpí některé peptidové vazby želatiny a dochází k uvolňování černé tuše do reakční směsi. Výhodou tohoto substrátu je, že je možné měřit aktivitu proteas i v barevných vzorcích, protože černé zbarvení roztoku umožňuje měřit absorbanci v širokém rozsahu vlnových délek M Tris-HCl pufr, ph 8.2 trypsin (0,033mg/ml) černá želatina (10 mg/ml) 1) Připravte si nerozpustný substrát k 0.2 g černé želatiny přidejte 20 ml pufru a na magnetické míchačce nechte nabobtnat cca půl hodiny. 2) Připravte si dvě řady po 6 zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. 3) Do druhé řady napipetujte za stálého míchání 2 ml suspenze černé želatiny a pufr podle následující tabulky. Obsah zkumavek nechejte cca 5 min vytemperovat v termostatu při 37 2

3 C. Potom přesně v minutových intervalech začněte přidávat do zkumavek roztok trypsinu podle tabulky. č. Zkumavky pufr (µl) trypsin (µl) ) Obsah zkumavek krátce promíchejte a inkubujte v termostatu přesně 30 min při 37 C. Přesně po 30 minutách od zahájení reakce v první zkumavce opět v minutových intervalech inkubační směs krátce protřepejte a ihned přefiltrujte do připravené sady zkumavek. 5) Změřte absorbanci roztoků č. 2 6 proti zkumavce č. 1 (slepý vzorek) při vlnové délce 600 6) Připravte si dvě řady po třech zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. Za stálého míchání pipetujte do 3 zkumavek druhé řady 2 ml suspenze substrátu. Do 1. zkumavky pipetujte 1 ml pufru (slepý pokus). Obsah zkumavek nechte cca 5 min temperovat v termostatu při 37 C. 7) Potom přesně v minutových intervalech přidejte do zkumavek č. 2 a č. 3 1 ml vzorku trypsinu o neznámé koncentraci. Dále postupujte přesně podle bodu 4 a 5. Z naměřených hodnot podle bodu 5 sestrojte kalibrační křivku (závislost absorbance na koncentraci enzymu v µg/ml, závislost není lineární v celém rozsahu). Vypočtěte koncetraci trypsinu v neznámém vzorku v µg/ml. 3b) Stanovení aktivity trypsinu rozpustným chromolytickým substrátem Azokasein je chemicky modifikovaný mléčný protein kasein s navázanou oranžovou sulfanilamidovou skupinou. Hydrolýzou se uvolňují barevné peptidy rozpustné v trichloroctové kyselině. Kyselina trichloroctová také zastaví proteolýzu a precipituje makromolekuly (enzymy a nezhydrolyzovaný azokasein) M Tris-HCl pufr, ph 8.2 trypsin (0,6mg/ml) rozpustný chromolytický substrát: 1% azokasein v 0.05 M Tris-HCl pufr, ph 8.2 5% trichloroctová kyselina 1) Připravte si dvě sady po 6 zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. 2) Do druhé sady pipetujte 1 ml 1% azokaseinu a pufr podle následující tabulky. Obsah zkumavek krátce promíchejte a nechte cca 5 min vytemperovat v termostatu při 37 C. Č. zkumavky pufr (µl) trypsin (µl)

4 3) Potom přesně v minutových intervalech začněte přidávat do zkumavek roztok trypsinu podle tabulky. Obsah zkumavek krátce promíchejte a inkubujte v termostatu 30 min při 37 C. Přesně po 30 minutách od zahájení reakce v první zkumavce opět v minutových intervalech zastavte reakci přidáním 1.5 ml 5% trichloroctové kyseliny a ihned přefiltrujte do připravené sady zkumavek. 4) Změřte absorbanci roztoků č. 2 6 proti zkumavce č. 1 (slepý vzorek) při vlnové délce 366 5) Připravte si dvě řady po třech zkumavkách. K první řadě si připravte 2-3 malé nálevky a filtrační papír. Do všech třech zkumavek druhé sady napipetujte 1 ml 1% azokaseinu a do 1. zkumavky přidejte 1 ml pufru (slepý pokus). Obsah zkumavek krátce promíchejte a nechte cca 5 min temperovat v termostatu při 37 C. 6) Potom přesně v minutových intervalech přidejte do zkumavek č. 2 a č. 3 1 ml vzorku trypsinu o neznámé koncentraci. Dále postupujte přesně podle bodu 3 a 4. Z naměřených hodnot podle bodu 4 sestrojte kalibrační přímku (závislost absorbance na koncentraci enzymu v µg/ml). Vypočtěte koncetraci trypsinu v neznámém vzorku v µg/ml. 4) Závislost enzymové aktivity na ph Stupeň protonace disociovatelných skupin v aktivním místě molekuly enzymu je závislý na koncentraci vodíkových iontů. Závislost aktivita trypsinu na ph se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid) při různých hodnotách ph, přičemž všechny parametry budou konstantní. Množství vzniklého produktu (p-nitroanilin žluté barvy) je úměrné rychlosti hydrolýzy. Intenzita zbarvení reakčního roztoku se měří při % kyselina octová 2, M BAPNA v dimethylsulfoxidu trypsin (0,25mg/ml) složky citran fosforečnanového pufru, roztok G a roztok K složky glycin hydroxidového pufru, roztok B a roztok D 1) Připravte řadu roztoků pufru o různém ph podle následující tabulky: Č Č. 5 6 zkumavky zkumavky pufr K ml 5,4 19,3 27,8 43,6 pufr D ml pufr G ml ,5 pufr B ml 22,4 50 ph 2,62 4,1 5,35 7,01 ph 9,39 10,3 2) Připravte si 2 sady po šesti zkumavkách. Z každého roztoku připravených pufrů odeberte po 2 ml od každého pufru do 2 zkumavek (paralelní stanovení). 4

5 3) Do zkumavek přidejte 0,2 ml roztoku trypsinu a nechte 5 min temperovat v termostatu při 35 C. Potom pipetujte postupně v minutových intervalech 0.2 ml roztoku substrátu, čímž zahájíte enzymovou reakci. Přesně po 10 minutách od zahájení reakce v první zkumavce začněte opět v minutových intervalech přidávat do zkumavek ve stejném pořadí 0.3 ml 30% kys. octové, čímž reakci ukončíte. Upozornění: Doba reakce musí být v každé jednotlivé zkumavce přesně 10 min. 4) Připravte slepý pokus do zkumavky: 2 ml destilované vody, 0.2 ml roztoku trypsinu, 0.3 ml roztoku kys. octové a 0,2 ml substrátu v uvedeném pořadí. 5) Po ukončení enzymové reakce přidejte do všech zkumavek 4 ml destilované vody, abyste naředili intenzivní žluté zbarvení. Změřte absorbanci výsledného roztoku při vlnové délce 405 nm vždy proti slepému pokusu o téže koncentraci substrátu.. Z naměřených hodnot sestrojte graf závislosti absorbance (aktivity enzymu) na hodnotě ph reakčního roztoku. 5