Kvasinky a jejich využití v potravinářství

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Ústav posklizňové technologie zahradnických produktů Kvasinky a jejich využití v potravinářství Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Josef Balík, Ph.D. LEDNICE 2018 Vypracoval: Daniel Ryšavý

2 Zadání

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Kvasinky a jejich využití v potravinářství vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb. o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 Autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity o tom, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Lednici dne:.. Daniel Ryšavý

4 Poděkování Tímto bych rád poděkoval vedoucímu práce panu doc. Ing. Josefu Balíkovi, Ph.D. za příkladné vedení, ochotu, konzultace, rady a čas, jež mi mohl věnovat při tvorbě bakalářské práce. Dále děkuji manželům Matochovým, za možnost zpracování praktické části bakalářské práce v jejich pivovaru Hradní pivovar Hustopeče.

5 Obsah 1 Úvod Cíl práce Literární část Zařazení a vlastnosti kvasinek Rozdělení a zařazení kvasinek Cytologie kvasinek Chemické složení kvasinek Rozmnožování kvasinek Genetika kvasinek Výživa kvasinek Metabolismus kvasinek Výskyt kvasinek Využití kvasinek v potravinářství Kvasinka Saccharomyces cerevisiae Kvasinky v pivovarství Kvasinky ve vinařství Kvasinky v lihovarství Kvasinky v pekařství Další potravinářské využití kvasinek Vady vybraných potravin způsobené kvasinkami Praktická část Materiál Postup aplikace kvasinek (kvasnic) ve formě rozkvašené mladiny Postup měření extraktu mladiny Výsledky a diskuze Závěr Souhrn Resumé Seznam použité literatury

6 Seznam použitých zkratek acetyl-coa acyl-coa ADP ASVK ATP CKT CO 2 DNA dsrna EPM FNDH 2 FMNH 2 H + IUBMB IUPAC mtdna NAD + NADH ph RNA SCP spp. ssp. (subsp.) var. VÚPS acetylkoenzym A acylkoenzym A adenosindifosfát aktivní suché vinné kvasinky adenosintrifosfát cylindrokónický tank oxid uhličitý deoxyribonukleová kyselina dvouvláknová ribonukleová kyselina extrakt původní mladiny flavinadenindinukleotid redukovaná forma flavinmononukleotidu (FMN) vodíkový kationt International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Mezinárodní unie pro biochemii a molekulární biologii) International Union of Pure and Applied Chemistry (Mezinárodní unie pro čistotu a aplikovanou chemii) mitochondriální deoxyribonukleová kyselina nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma) nikotinamidadenindinukleotid (redukovaná forma) záporný dekadický logaritmus koncentrace vodíkových iontů ribonukleová kyselina single cell protein (bílkovina jednobuněčných mikroorganismů) species pluralis (více druhů) subspecie (poddruh) varieta (odrůda) Výzkumný ústav pivovarský a sladařský 4

7 Seznam tabulek a obrázků Tab. č. 1 Rozdělení mikroorganismů dle nároků na teplotu Tab. č. 2 Rozmanitost tvarů kvasničné buňky Tab. č. 3 Koncentrace složek sušiny v kvasničné buňce Tab. č. 4 Různé zdroje uhlíku pro růst kvasinek Tab. č. 5 Přirozená místa výskytu kvasinek Tab. č. 6 Některé taxonomické změny názvů významných pivovarských kvasinek Tab. č. 7 Čas kvašení mladiny ležáku Hradní 11 kvasinkami o stáří nulky Tab. č. 8 Čas kvašení mladiny ležáku Hradní 11 kvasinkami o stáří jedničky Tab. č. 9 Čas kvašení mladiny ležáku Hradní 11 kvasinkami o stáří dvojky Tab. č. 10 Čas kvašení mladiny ležáku Hradní 11 kvasinkami o stáří trojky Obr. č. 1 Schéma průřezu buňkou kvasinky Obr. č. 2 Schéma metabolismu kvasinek Obr. č. 3 Aktivní suché vinné kvasinky Obr. č. 4 Schéma používání kvasnic a jejich stárnutí Obr. č. 5 Odebírání kvasnic z CKT Obr. č. 6 Kontrola % extraktu mladiny na sacharometru Obr. č. 7 Tabulka teplotních oprav na sacharometru 5

8 1 Úvod Kvasinky jsou jednobuněčné mikroorganismy, které se zařazují mezi vřeckovýtrusné houby. O kvasinkách lze říci, že jsou všudypřítomné. Vyskytují se v potravinách, v květních nektarech, v půdě, ve vzduchu a střevním traktu živočichů, včetně člověka nebo například včel. Dnes je známo asi 1500 druhů kvasinek, z nichž některé slouží jako modelový organismus k výzkumným účelům, zejména fyziologickým, genetickým a molekulárně biologickým (zvláště kvasinka Saccharomyces cerevisiae). Dále jsou kvasinky využívány v lékařství, ve farmakologii a v budoucnu mohou hrát významnou roli ve výrobě biopaliv. Avšak nejvýznamnější jsou kvasinky z hlediska potravinářského, jelikož se jejich schopnost zkvašovat (fermentovat) monosacharidy a některé disacharidy, případně trisacharidy na etanol a oxid uhličitý využívá v kvasném průmyslu. Doklady o tom, že lidé znali fermentační schopnost kvasinek, jsou staré až 8000 let a pocházejí ze sumerské a egyptské keramiky, potažmo z piktografických záznamů z Babylonu. Kvasné procesy ve víně a pivu byly předmětem práce Louis Pasteura, který dokázal, že kvasných procesů se účastní mikroorganismy. Nejznámější a v potravinářství nejdůležitější kvasinka, je kvasinka Saccharomyces cerevisiae, která je označována jako houba milující cukr. Tento druh kvasinky je tak využíván v pivovarství, ve vinařství, v lihovarství, ale také v pekařství pro výrobu droždí, dále potom pro výrobu krmné biomasy a také pro přípravu některých mléčných výrobků, atd. Tato bakalářská práce je příspěvkem do stále aktuální problematiky kvasinek a jejich konkrétního využití v potravinářství, zaměřené zejména na kvasinky rodu Saccharomyces. 6

9 2 Cíl práce Cílem bakalářské práce je prostudovat literaturu pojednávající o zadané problematice a pojednat o taxonomickém zařazení kvasinek, jejich rozdělení, významu a cytologických vlastnostech. Dále vybrat potravinářsky významné druhy kvasinek a popsat jejich vlastnosti. V praktické části zhodnotit alkoholové kvašení mladiny kvasinkami o různém stáří. 7

10 3 Literární část 3.1 Zařazení a vlastnosti kvasinek Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotické mikroorganismy, které náleží mezi houby. Vzhledem k velikosti se společně s plísněmi řadí mezi mikromycety. Své české jméno získaly podle své schopnosti zkvašovat monosacharidy, disacharidy a některé trisacharidy na etanol a oxidu uhličitý. (Šilhánková, 2002) Pro svůj růst vyžadují kyslík, mají však schopnost změnit metabolismus za anaerobních podmínek na fermentační a produkovat tak etanol a oxid uhličitý. (Kalhotka, 2014) Fermentace sacharidů je přirozený jev, jež nevyžaduje lidský zásah, avšak jedinečným úspěchem lidstva je, že se fermentačních vlastností kvasinek naučilo využívat ve svůj prospěch, zejména ve výrobě alkoholických nápojů (především piva a vína) a chleba. Kvasinky patří mezi první mikroorganismy, které byly identifikovány, izolovány a pojmenovány. (Katz, 2012) Rozdělení a zařazení kvasinek Rozdělení kvasinek dle způsobu pohlavního rozmnožování Dle způsobu pohlavního rozmnožování jsou kvasinky zařazovány do dvou hlavních tříd: Ascomycetes, tedy houby vřeckovýtrusné a Basidiomycetes, houby stopkovýtrusné. Nicméně, existuje velké množství druhů, u nichž pohlavní rozmnožování není zjištěno (netvoří pohlavní spory), a ty se zařazují do třídy Deuteromycetes. (Deák, 2008; Janderová, 1999) Zařazení kvasinek dle nároků na teplotu Teplotní spektrum, v němž jsou mikroorganismy schopni se množit a být metabolicky aktivní je velmi široké. Mikroorganismy zařazujeme do tří skupin, podle nároků na teplotu: psychrofilní, mezofilní a termofilní (Junga, 2015) 8

11 Tab. č. 1 Rozdělení mikroorganismů dle nároků na teplotu (Görner, 2004; Kalhotka, 2014) Skupina Teplota [ C] Minimální Optimální Maximální Mikroorganismy Psychrofilní -5 až 5 12 až až 20 Mikroorganismy žijící v chladných vodách a na místech s nízkou teplotou včetně lednic (Listeria) Mezofilní 5 až až až 47 Většina druhů mikroorganismů včetně většiny druhů kvasinek Termofilní 4 až až až 90 Zejména bakterie (rody Bacillus, Clostridium, Lactobacillus) Minimální teplota je taková teplota, při níž je mikroorganismus schopen růst, při optimální teplotě mikroorganismus roste nejrychleji a při maximální teplotě je mikroorganismus ještě schopný množení. (Kalhotka, 2014) Obecně jsou kvasinky schopny růst v rozmezí 0 37 C. Kvasinky s omezeným teplotním rozsahem je možné kategorizovat jako fakultativní nebo striktní psychrofily (Leucospiridium frigidum), jež obecně rostou od 0 do C. Jiné psychrofilní kvasinky však nemohou růst při teplotách pod C, ale dobře se rozvíjí při teplotách až C. Kvasinky, které rostou dobře při teplotě 45 C, se považují za termofilní (Saccharomyces telluris). (Panchal, 1990; Querol, 2006) Termorezistentní kvasinky se vyznačují vysokou odolností vůči vyšší teplotě. Míra odolnosti těchto kvasinek je dána počtem askospor, jelikož právě ty jsou odolné vůči vyšší teplotě. Termorezistentní kvasinky jsou schopny přežívat v pasterovaných produktech při poměrně nízkých teplotách. Jedná se zejména o kvasinky Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bailii a Kluyveromyces bulgaricus. (Klaban, 2011) Zařazení kvasinek dle nároků na kyslík Dle nároků na kyslík se mikroorganismy dělí do čtyř skupin: aerobní, anaerobní, mikroaerofilní a fakultativně anaerobní mikroorganismy. (Šilhánková, 2002) 9

12 Aerobní mikroorganismy Jedná se o mikroorganismy, které pro život vyžadují přísun kyslíku. Patří sem např. octové bakterie (rod Acetobacter), některé plísně a některé kvasinky. (Ogle, 2016; Šilhánková, 2002) Mikroaerofilní mikroorganismy Mikroaerofily (Campylobacter spp.) také vyžadují přítomnost kyslíku, avšak v nízké koncentraci (obvykle kolem 5 %). Do mikroaerofilních mikroorganismů se řadí např. v přírodě široce rozšířená skupina mléčných bakterií (rod Lactobacillus). (Engelkirk, 2008; Šilhánková 2002) Anaerobní mikroorganismy Jsou to takové mikroorganismy, např. bakterie rodu Clostridium, které využívají jen anaerobní metabolismus (kvašení), neboť nejsou schopny pro výrobu energie využívat vzdušný kyslík. (Nau Cornelissen, 2007) Fakultativně anaerobní mikroorganismy Tyto mikroorganismy mohou růst jak v přítomnosti vzdušného kyslíku, tak i v jeho nepřítomnosti, mají tedy schopnost jako aerobního tak i anaerobního metabolismu. Vzhledem k tomu, že aerobní metabolismus přeměňuje substrát v energii účinněji, se mikroorganismy v aerobních podmínkách většinou rozmnožují rychleji. (Šilhánková 2002; Tůma, 2015) Typickými fakultativně anaerobními mikroorganismy jsou kvasinky. (Basařová, 2010) V přítomnosti kyslíku se kvasinky rozmnožují pomocí mechanismu známého jako pučení a vytváří se malé množství etanolu. Nicméně, v nepřítomnosti kyslíku se buňky oslabují a kvasinky získávají svou energii převáděním cukrů na oxid uhličitý a etanol. (Yuan, 2018) Cytologie kvasinek Kvasinkové buňky vykazují velkou rozmanitost s ohledem na tvar, barvu a velikost. Ta se u kvasinek velmi liší. Některé kvasinky mohou mít pouze 2 3 µm do délky, zatímco jiné druhy mohou dosáhnout délky µm. Šířka buňky je pak méně variabilní. Pohybuje se v rozmezí 1 10 µm. (Feldmann, 2012) 10

13 Buňka kvasinky je eukaryotická jako u vyšších živočichů nebo rostlin a liší se tak od bakteriální buňky prokaryotické. Obsahuje jádro, které je ohraničeno dvojitou membránou, typické mitochondrie a řadu dalších cytoplazmatických elementů. (Shapton, 1998) Tvar kvasničné buňky Tvar kvasničné buňky je dán rodovou příslušností a podmínkami kultivace. Jako základní tvar se považuje rotační elipsoid, přičemž odchylky mohou jít směrem ke sférickému tvaru nebo obráceně k podlouhlé až vláknité formě buňky. Tvar kvasničné buňky se může měnit i během vlastního vývoje. (Němec, 2015) Tab. č. 2 Rozmanitost tvarů kvasničné buňky (Schaechter, 2012) Tvar buňky Popis Příklady kvasinkových rodů Elipsoidní Elipsoidní tvar buňky Saccharomyces Válcovitý Prodloužené buňky s kulatými konci Schizosaccharomyces Apikulátní Citrónkovitý tvar buňky Saccharomycodes Ogivální Prodloužená buňka zaoblená na jednom konci a na druhém špičatá Brettanomyces Dekkera Lahvovitý Dělící se buňka Pityrosporum Pseudohyfální Řetězce pučících buněk, které Tento tvar se občas nalézá se protáhly bez oddělení. u hladových buněk kvasinek Pseudohyfální tvar je meziprodukt mezi řetězem kvasinkových buněk a hyfami. Saccharomyces cerevisiae a často u kvasinek Candida albicans Hyfální Basidiomycetické buňky rostou Saccharomycopsis spp. podélně a vytvářejí rozvětvené nebo nerozvětvené vlákna, nebo pravé hyfy, příležitostně septa (přepázky), které tvoří mycelium. Dimorfní Kvasinky, které mohou růst jako kvasničné buňky nebo ve vláknitých formách Candida Albicans Yarrowia lipolytica Kluyveromyces marxianus 11

14 Buněčná stěna Buněčná stěna kvasinek je struktura o tloušťce nm. Může tvořit až 30 % suché hmotnosti buňky. Jejími hlavními složkami jsou proteiny a polysacharidy: glukany, manany a v malém množství chitin. Ten je v buňce rozložen nerovnoměrně, avšak největší množství chitinu se vyskytuje v místě jizev, a čím více jich v průběhu života kvasinky přibývá, tím více roste množství chitinu. (Janderová, 1999) Buněčná stěna určuje tvar buňky, její celistvost při růstu a dělení a chrání ji před osmotickým tlakem a mechanickými vlivy (Aguilar-Uscanga, 2003; Šilhánková, 2002) Cytoplazmatická membrána Cytoplazmatická membrána je přibližně 7,5 nm silná a tvoří hojné vychlípeniny vyčnívající do cytoplazmy. Stejně jako ostatní biologické membrány, může být popsána jako lipidová dvojvrstva s ukotvenými globulárními proteiny. Lipidové složky zahrnují především fosfolipidy a steroly. (Walker, 1998) Kromě proteinů a lipidů jsou v cytoplazmatické membráně rovněž v malém množství (přibližně 10 %) zastoupeny sacharidy, jež jsou ve vazbě s proteiny, popřípadě s lipidy. Cytoplazmatická membrána je nejzásadnější hranicí, která odděluje nitro buňky od vnějšího prostředí. Je tzv. osmotickou bariérou, propouští vodu a některé ionty, ale pro makromolekuly sacharidů a proteinů je nepropustná. Mluvíme tedy o tzv. membráně polopropustné, nebo-li semipermeabilní. (Sládek, 2007) Cytoplazma Cytoplazma je složitý koloidní roztok uvnitř buňky, který obsahuje jak nízkomolekulární, tak i vysokomolekulární látky. ph cytoplazmy se pohybuje kolem pěti a jeho hodnoty vzájemně souvisí s fyziologickým stavem buňky. V cytoplazmě jsou přítomny enzymy metabolických drah, díky kterým probíhá řada biochemických dějů, např. glykolýza. (Basařová, 2010) Cytoskelet Kvasničné buňky vyžadují značnou podporu k udržení jejich tvaru. Řešením, které používá většina eukaryotických buněk, je tvorba vlastního cytoskeletu, jež je složen z tuhých proteinových filament třech typů: aktinová filamenta, která jsou zdaleka nejčastějším konstrukčním prvkem, dále intermediární filamenta tato 12

15 filamenta jsou větší než aktinová a mají výrazný žebrovaný vzhled a v poslední řadě mikrotubuly, které jsou největší, nýbrž nejméně časté. (Goodsell, 2009) Jádro Jádro je úložištěm většiny genetické informace a představuje řídící centrum buňky. (Becker, 2005) Je ohraničeno dvojitou membránou, která odděluje jaderný obsah od cytoplazmy. (Fantes, 2000) Obsahuje hrudky chromatinu, jedno či více jadérek, která se nachází v jaderné matrix. (Sládek, 2007) Vakuola Vakuola je velká a pružná organela. (Guthrie, 1991) Může zabírat značnou část objemu kvasinkové buňky a změny její velikosti nebo polohy mohou mít velmi hluboký vliv na buňku jako celku. (Armstrong, 2010) Vakuola je nesmírně složitá organela, která se podílí na několika funkcích. Nejenže rozkládá vysokomolekulární látky na nízkomolekulární a hraje roli v osmotické regulaci, ale také představuje primární úložiště pro některé malé molekuly a biosyntetické prekurzory, jako jsou základní aminokyseliny a fosforečnan sodný. (Klionsky, 1990) Klíčovou funkcí vakuoly je tedy ukládání malých i větších molekul, které jsou do buňky transportovány nebo jsou metabolickými produkty. Obsahuje také lipidy, proteiny, puriny a u některých druhů kvasinek je přítomen i pigment. Vakuoly také vykazují značnou enzymatickou aktivitu. Jedná se zejména o proteázy, endonukleázy a esterázy. (Němec, 2015) Mitochondrie Mitochondrie jsou organely kulatého, oválného nebo protáhlého tvaru. Kvasinky s aktivním oxidačním metabolismem mají vysoce vyvinuté mitochondrie, protože tyto organely jsou místem oxidační fosforylace. (Spencer, 1997) U kvasinek, které rostou v přítomnosti glukózy, se projevuje katabolická represe respirace, což vede k celkovému snížení objemu mitochondriální hmoty na 3 4 %. (Janderová, 1999) Jsou obklopeny dvěma membránami: vnější membrána mající bradavčitý povrch a vnitřní membrána tvořící vychlípeniny kristy. Mitochondrie jsou složeny zejména z lipidů, fosfolipidů a proteinů, jsou sídlem dýchacích enzymů, obsahují RNA a v malém množství DNA, jež je nositelem mimojaderné dědičnosti kvasinek. (Šilhánková, 2002) 13

16 Endoplazmatické retikulum Endoplazmatické retikulum je komplexní síť membránových struktur, z nichž část je spojená s jaderným obalem a zbývající endoplazmatické retikulum je lokalizováno na obvodě buňky. Podílí se na biosyntéze lipidů a na vnějším povrchu se nachází početná zrníčka polyzomů, tedy agregátů ribozomů, na nichž se syntetizují proteiny. (Kurtzman, 2011; Šilhánková, 2002) Golgiho aparát Golgiho aparát je organela, jejíž morfologie se mění podle druhu kvasinek: v případě kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae je Golgiho aparát ve formě rozptýlených cisteren, v případě kvasinek rodu Pichia pastoris a Schizosaccharomyces pombe jsou cisterny uspořádány do zásobníků. (Suda, 2012) Obr. č. 1 Schéma průřezu buňkou kvasinky (Šilhánková, 2002, upraveno) 1) buněčná stěna, 2) jizva zrodu, 3) cytoplazmatická membrána, 4) jádro, 5) jaderná membrána, 6) vakuola, 7) endoplazmatické retikulum, 8) mitochondrie, 9) glykogen, 10) lipidy, 11) Golgiho aparát Chemické složení kvasinek Chemické složení kvasinek se může lišit v závislosti na řadě faktorů, jako je použitý substrát, typ kvasinek, fermentační metoda, stáří, popřípadě podmínky sušení. (Santos, 2012) 14

17 Voda Hlavní část protoplazmy kvasinek je tvořena vodou, jejíž obsah závisí na druhu kvasinek. Obsah vody se pohybuje v rozmezí %. Z celkového množství vody tvoří 80 % voda intercelulární (vázaná uvnitř buněk) a zbývající množství voda hydratační a voda volná (vázaná povrchovými silami). (Němec, 2015) Dusíkaté látky Důležitou roli v redoxním systému kvasničné buňky má peptid glutathion, avšak hlavní částí dusíkatých látek sušiny tvoří jednoduché a složené bílkoviny s prostetickými skupinami a nejčastěji jsou v buňce ve formě apoenzymů. V kvasničné buňce jsou enzymy všech šesti hlavních tříd podle mezinárodní klasifikace IUPAC-IUBMB nebo se při projevu životních funkcí indikují. (Basařová, 2010) Kvasničné buňky obsahují také značné množství volných aminokyselin, jejichž množství a škála jsou dány zejména složením vnějšího prostředí. Ve větším množství se nejčastěji vyskytuje cystin, kyselina glutamová, glycin, histidin, izoleucin, lyzin, fenylalanin, prolin, serin, treonin, tyrozin a valin. Nukleové kyseliny DNA a RNA jsou stejné jako u jiných eukaryotických organismů, takže na rozdíl od organismů prokaryotických, obsahují kvasinky a jiné eukaryotické organismy podstatně větší množství nukleových kyselin a jsou obsaženy také v mitochondriích. (Basařová 2010; Němec, 2015) Sacharidy Sacharidy v buňkách kvasinek jsou obvykle rozděleny na sacharidy tvořící základ buněčné stěny, jejíž hlavní část je tvořena glukanem a mananem, a na sacharidy přítomné v cytoplazmě, kde jsou vždy přítomny dva důležité polysacharidy glykogen a manan. Glykogen, jenž je tvořen molekulami glukózy, je hlavní zásobní látkou kvasinek, kterou si kvasinky vytváří při omezeném množství uhlíku, dusíku, fosforu nebo síry. (Němec, 2015; Wilson, 2010) Lipidy Lipidy jsou důležitou složkou mitochondrií i buněčných membrán. Některé z nich přímo regulují propustnost buněčné stěny, čímž je ovlivňován transport substrátu do buňky. Jsou tvořeny především fosfolipidy, neutrálními lipidy a mastnými 15

18 kyselinami. Analýza lipidů je využívána k rozlišení kvasničných kmenů. (Basařová, 2010) Minerální látky Obsah minerálních látek v sušině je závislý na složení prostředí a na stáří kvasinek. Největší část tvoří fosfor. Vápník a hořčík do značné míry regulují průběh fermentace. Kromě toho, vápník stimuluje množení kvasinek a zpomaluje jejich degeneraci a degradaci, hořčík vystupuje také jako aktivátor řady enzymů. Dalšími důležitými látkami jsou měď, železo, mangan, zinek, draslík, sodík, síra a křemík. (Basařová, 2010; Němec, 2015) Organické látky Z organických látek kvasinky v nízkých koncentracích obsahují provitamin A (β-katoren) a především vitaminy skupiny B (B1, B2, B6), na které jsou bohaté zejména pivovarské kvasinky, které je získávají z mladiny, jelikož její hlavní surovina slad je na tyto vitaminy velmi bohatá. (Šilhánková, 2002) Důležitou složkou membrán kvasinek jsou steroly, které zajišťují konzistenci a propustnost buněčných membrán a podílejí se na transportu aminokyselin, pyrimidinů a na respirační aktivitě kvasinek. V kvasinkách je obsažen zejména ergosterol. (Basařová, 2010) Tab. č. 3 Koncentrace složek sušiny v kvasničné buňce (Basařová, 2010; Němec, 2015; Šilhánková, 2002) Složka Koncentrace [%] Proteiny 50 Sacharidy Nukleové kyseliny 10 Minerální látky 6 12 Lipidy 4 12 Organické látky 0,09 0,15 16

19 3.1.4 Rozmnožování kvasinek Kvasinky se rozmnožují různými způsoby. Jedním ze způsobů je pohlavní rozmnožování, jiné druhy využívají proces příčného dělení, tedy formu vegetativního rozmnožování. Ovšem nejčastějším způsobem rozmnožování kvasinek je pučení, taktéž forma vegetativního rozmnožování. (Anonym, 2000) Vegetativní rozmnožování kvasinek Pučení Pučení je zahájeno tím, že v určitém bodě na povrchu mateřské buňky vzniká malá dceřiná buňka pupen. Mateřská buňka zůstává v průběhu dalšího vývoje téměř stejná, zatímco pupen se zvětšuje, vytvoří novou buňku a většinou se po určité době od mateřské buňky oddělí. (Kurtzman, 2011) Jedna kvasničná buňka se může pučením rozmnožit až dvacetkrát, přičemž po oddělení pupenu vzniká na mateřské buňce jizva. (Bamforth, 2005) Před samotným pučením dochází ke splývání membrán endoplazmatického retikula a následně k jeho dělení. Poté se vakuoly opakovaně dělí a mitochondrie dlouze protahují. Po počátku tvorby pupenu do něho vstupují drobné vakuoly a mitochondrie a současně začne mitotické dělení jádra a jeho migrace k pupenu. Společně s jádrem přecházejí do nově vzniklého pupenu další složky cytoplazmy, po čemž se cytoplazmatickou membránou uzavře kanálek mezi mateřskou a dceřinou buňkou a v pupenu se intenzivně syntetizuje a rozšiřuje endoplazmatické retikulum. (Šilhánková, 2002) Nakonec se dceřiná buňka odděluje od buňky mateřské a stává se nezávislou. Typickým příkladem kvasinek rozmnožujících se pučením jsou kvasinky rodu Saccharomyces. (Hoh, 2002) Příčné dělení Tento způsob vegetativního rozmnožování se u kvasinek vyskytuje zřídka. Mateřská buňka se na pólech prodlouží růstem, jenž je uskutečňován obvykle na pólu proti zárodečné jizvě. Jakmile mateřská buňka dosáhne dvojnásobku své délky, vytvoří se přepážka, jež dává vznik dvěma stejným buňkám. Buňka se dvěma jizvami na pólech narůstá tak, že k původnímu stěnovému prstenci přirůstá na jednom nebo na obou pólech stěna nová, která se vždy syntetizuje z jizevního klínu. U kvasinek rozlišujeme dva typy příčného dělení. V prvním případě, typickým pro rod Schizosaccharomyces, se buňky po ukončení dělení od sebe oddělí, ve druhém případě zůstávají buňky 17

20 po ukončení dělení spojeny a vytváří pseudomycelium nebo pravé mycelium. U mycelia se dělí pouze terminální buňka a centrální pór se vytváří až po následujícím rozdělení terminální buňky. U pseudomycelia se taktéž dělí pouze terminální buňka, nicméně centrální pór se nevytváří a každá buňka představuje samostatnou organizační jednotku. (Němec, 2015) Tvorba mycelia a pseudomycelia je charakteristická pro rody se silným aerobním metabolismem, zejména pak pro rody Endomycopsis, Sporobolomyces a Candida. (Kalhotka, 2014) Jedním z hlavních rozdílů mezi pučením a příčným dělením je, že buňky vytvořené pučením jsou nerovnoměrné velikosti, zatímco buňky příčného dělení mají stejnou velikost. (Hoh, 2002) Helobiální kvasinky Kvasinky, které využívají kombinaci pučení a příčného dělení se nazývají helobiální. Mateřská buňka vytlačí dceřinou buňku nebo pupen, které se od mateřské buňky neoddělují zúžením, ale tvorbou přepážky. Do helobiálních kvasinek se zařazuje rod Saccharomycodes. Konkrétním příkladem tohoto rodu je pak Saccharomycodes ludwigii. (Vashishta, 2010) Další způsoby vegetativního rozmnožování Za určitých podmínek některé kvasinky vytváří vegetativní spory. Blastokonidie, které vytváří kvasinky Aureobasidium pullulans vznikají po stranách nebo na konci hyf (vláken). U některých rodů (např. Trichosporon, Endomyces) může dojít k rozpadu hyf na artrokonidie. Další možností rozmnožování kvasinek jsou chlamydospory, které slouží především k zachování druhu i ve velmi nepříznivých podmínkách. Mohou vznikat jednak na koncích hyf (jak je tomu u kvasinek Candida albicans), interkalárně uprostřed hyf (Aureobasidium pullulans) nebo volně v prostředí (Candida pulcherrima). (Němec, 2015) Pohlavní rozmnožování kvasinek Pohlavní rozmnožování kvasinek je možno charakterizovat jako spájení dvou haploidních buněk, z nichž každá obsahuje jednu sadu chromozomů, za vzniku diploidní buňky, tedy zygoty, jež obsahuje dvě sady chromozomů. Diploidní jádro se poté dělí redukčním dělením (meiózou) na čtyři haploidní jádra. Ta se stávají základem pro vytvoření pohlavních spor. (Němec, 2015; Rosypal, 2003) Většina 18

21 kvasinek tvoří jako pohlavní spory tzv. askospory, což jsou endospory umístěné v asku (vřecku). Naproti tomu některé rody kvasinek (rody Rhodosporidium a Leucosporidium) tvoří pohlavní exospory, tedy spory umístěné vně sporotvorných buněk. (Šilhánková, 2002) V případě, že dochází ke spájení přibližně stejně velkých buněk, jde o spájení izogamní (např. u rodu Saccharomyces) a pokud dojde ke spájení velká buňky s malou, označuje se tento typ spájení jako heterogamní. Při spájení heterogamním může docházet i ke spájení mateřské buňky s pupenem (např. u rodu Debaryomyces). Spájení mezi buňkou a jejím vegetativním potomstvem je možné pouze u tzv. homotalických kmenů. Tyto kmeny mají pouze jeden párovací typ (a nebo α). Avšak u většiny kmenů kvasinek je pohlavní proces rozmnožování založen na existenci buněk různého pohlaví. V tomto případě se jedná o kmeny heterotalické, které mají opačné párovací typy (a a α, h + a h -, + a -). (Němec, 2015) Buněčný cyklus kvasinek Buněčný cyklus popisuje uspořádaný proces, kterým buňka vykonává úkony potřebné k vytvoření dceřiných buněk (duplikátů). (Pagano, 1998) Je obvykle definován jako období mezi dvěma následnými děleními a zahrnuje několik fází: presyntetickou fázi (G 1 ), fázi syntézy DNA (S), postsyntetickou fázi (G 2 ) dorůstání pupenu a mitotickou fázi (M). V G 1 fázi probíhá syntéza RNA a bílkovin, v S fázi se replikuje DNA. Fáze G 2 je fází odpočinkovou, buňka se připravuje na mitózu a dochází k dorůstání pupenu. V M fázi probíhá dělení jádra (karyokinese) a dělení buňky (cytokinese). Kvasničné jádro se dělí endomitózou, při níž jaderná membrána zůstává zachována a chromozomy se rozdělí mezi dvě dceřiná jádra, takže do každého z nich je umístěna jedna chromatida. Mitóza probíhá ve čtyřech fázích: profáze, metafáze, anafáze a telofáze, během níž se jaderné dělení dokončí a vzniknou tak dvě samostatná jádra, každé s jednou kompletní sadou chromozomů. Počtem buněčných cyklů, kterými kvasničná buňka prošla, je dáno její stáří a je označováno jako replikativní stáří, které není závislé na růstových podmínkách, nýbrž na genetické výbavě buňky. (Basařová, 2010) Buněčné cykly kvasinek Saccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe jsou v současné době ty nejprostudovanější buněčné cykly z hlediska nejen kvasinek, ale i ze všech eukaryot. (Humphrey, 2005) 19

22 3.1.5 Genetika kvasinek Geny důležitých vlastností kvasinek jsou uloženy jednak v jaderné DNA, ale také v mtdna. V molekulách DNA jsou zakódovány informace o struktuře všech buněčných proteinů a o struktuře molekul RNA, jež se účastní syntézy proteinů. Informace uložené v DNA se normálně vlivem vnějšího prostředí nemění. V kvasničných buňkách může být násobný počet chromozomů (ploidie). Laboratorní kmeny kvasinek jsou zpravidla haploidní, ale např. pivovarské kvasinky jsou polyploidní, mají tedy více než dvě sady chromozomů. Nejčastěji potom tři (triploidie), nebo čtyři (tetraploidie). (Basařová, 2010) Jaderná genetika Většina genetické informace kvasničné buňky je uložena v chromozomech v jádře. Počet chromozomů v kvasničné buňce se různí. Např. kvasinka Saccharomyces cerevisiae má šestnáct chromozomů, zatímco kvasinka Schizosaccharomyces pombe má chromozomy tři. Avšak kromě chromozomů může jádro obsahovat i kruhový tzv. 2 µm plazmid nebo 3 µm DNA. 2 µm plazmid, je kovalentně uzavřená cirkulární molekula dvouvláknové DNA, nesoucí název podle své obvodové délky. Haploidní buňky obsahují asi 60 kopií plazmidu a diploidní buňky 120 kopií. 3 µm DNA je cirkulární molekula DNA v oblasti jadérka o obvodové délce přibližně 3 µm. Je umístěna v jádře, konkrétně v blízkosti jadérka. Vyskytuje se v malém počtu kopií (1 10 kopií) a představuje jednu kopii jednotky kódující ribozomální RNA. (Janderová, 1999; Phillips, 2009) Mitochondriální genetika Kvasničná buňka obsahuje molekul mtdna, které jsou lokalizované v proměnlivém počtu mitochondrií, který je závislý na růstové fázi buňky, kultivačních podmínkách atd. Molekuly mtdna se u různých druhů kvasinek výrazně liší svou velikostí. Např. u kvasinky Schizosaccharomyces pombe je velikost mtdna 6 µm, u Saccharomyces cerevisiae 25 µm a největší molekula mtdna 34 µm je přítomna u rodu Brettanomyces. (Janderová, 1999) Killer faktor Některé kmeny kvasinek (Saccharomyces cerevisiae, Klyveromyces lactis, Pichia farinosa atd.) vylučují bílkovinné toxiny, které jsou smrtonosné vůči náchylným 20

23 kvasinkovým kmenům. Tyto toxiny (killer toxin, killer protein, zymocin, mykocin), označované jako killer faktor, nejsou nebezpečné pro jiné mikroorganismy než pro kvasinky. Vůči vlastním killer toxinům nejsou kmeny citlivé. Killer toxiny se liší mezi kmeny nebo druhy, vykazují různé vlastnosti, pokud jde o strukturní geny, velikost molekul, strukturu a imunitu. V přírodě produkce killer faktoru pravděpodobně kvasinkám poskytuje ekologickou výhodu. Genetické determinanty kódující produkci killer faktoru mohou být lokalizovány na chromozomech, neseny v cytoplazmě lokalizovanou DNA nebo dsrna. (Janderová, 1999; Marquina, 2002) Výživa kvasinek Živiny kvasinky přijímají celým svým povrchem těla. Hlavními mechanismy přenosu živin jsou pasivní a aktivní transport. Pasivní transport, označován též jako usnadněná difúze, probíhá ve směru koncentračního spádu, ale přesto vyžaduje přenašeč. Důležitější je však transport aktivní, který se podílí na přenosu anorganických iontů a jednoduchých sloučenin, jako jsou sacharidy a aminokyseliny. Bílkoviny, které přenášejí anorganické ionty, se nazývají přenašeče. Bílkoviny přenášející organické sloučeniny se označují jako permeázy. (Basařová, 2010) Uhlík Hlavní zdroje uhlíku pro kvasinky představují zejména různé monosacharidy (glukóza, fruktóza, atp.), disacharidy (sacharóza, maltóza, atp.), eventuálně oligosacharidy (maltotrióza, rafinóza). Některé kvasinky produkují extracelulární enzymy, které jim umožňují hydrolyzovat také polysacharidy (škrob, xylany nebo celulózu). Zdrojem uhlíku mohou ovšem být i např. glycerol, laktát, etanol, metanol, alkany atp. (Janderová, 1999) 21

24 Tab. č. 4 Různé zdroje uhlíku pro růst kvasinek (Duvnjak, 1991; Walker, 1998) Zdroj uhlíku Příklady zdrojů Popis Hexózy Glukóza, fruktóza, galaktóza, manóza Glukóza je metabolizovaná všemi kvasinkami. Pokud kvasinky nekvasí glukózu, nekvasí další cukry. Pokud kvasinky fermentují glukózu, fermentují také fruktózu a manózu, ale nemusí nutně galaktózu Pentózy Arabinóza, xylóza, xylulóza Některé kvasinky využívají pentózy lépe než glukózu Disacharidy Maltóza, sacharóza, laktóza, trehalóza, melibióza, celobióza Pokud kvasinky zkvašují maltózu, obecně nezkvašuje laktózu a naopak. Melibióza je využívána k rozlišování pivovarských kvasinek pro ležáky a pro piva typu ALE. Disacharidy jsou využívány velkým množstvím druhů kvasinek Trisacharidy Rafinóza, maltotrióza Kvasinky Saccharomyces cerevisiae rafinózu využívají jen částečně, ale jiné druhy Saccharomyces (Saccharomyces kluyveri) ji využívají zcela Polysacharidy Škrob, inulin Polysacharidy zkvašující kvasinky jsou vzácné. Saccharomycopsis spp. a Saccharomyces diastaticus mohou využít rozpustný škrob. Kvasinky Kluyveromyces spp. obsahují inulinázu Nižší alifatické Metanol, etanol Některé methylotrofní kvasinky, např. alkoholy kvasinky rodu Pichia, mohou být využívány v průmyslu Cukrové alkoholy Glycerol, sorbitol Cukrové alkoholy mohou být (za určitých podmínek) využívány pouze kvasinkami Organické kyseliny Acetát, citrát, laktát, pyruvát Velké množství kvasinek je schopno využívat organické kyseliny, ale jen pár z nich je schopno je zkvašovat 22

25 Dusík Dusík je dalším důležitým prvkem růstového média. Jako zdroj dusíku může sloužit široká škála látek. Aminokyseliny Většina aminokyselin může sloužit jako zdroj dusíku, ačkoli maximální rychlost růstu, kterou mohou podporovat, se mění s konkrétní aminokyselinou. Aminokyseliny, které nejvíce podporují růst, jsou např. glutamin, asparagin, serin. Naproti tomu nejméně růst podporují např. methionin, histidin nebo třeba glycin. Hydrolyzát kaseinu poskytuje směs aminokyselin a s tím i vyšší maximální rychlost růstu a výtěžek jednotlivých aminokyselin. Anorganické zdroje dusíku Amonný dusík ve formě dusičnanu amonného, chloridu amonného a síranu amonného slouží pro kvasinky jako zdroj dusíku. Zejména síran amonný je dobrý, jelikož kromě dusíku kvasinkám poskytuje také síru. V průmyslových fermentacích se síran amonný běžně používá jako zdroj dusíku. Další zdroje dusíku Jako zdroj dusíku může také sloužit malé množství peptidů, jejichž příjem je omezen molekulovou velikostí (jsou štěpeny peptidázami). Dobrý zdroj dusíku může poskytnout močovina, nicméně je zapotřebí přidání biotinového doplňku. Využití dusíku v močovině je sníženo potlačením transportního systému, je-li k dispozici lepší zdroj dusíku. Zdroj dusíku mohou také poskytnout puriny a pyrimidiny. (Berry, 1987) Kyslík Kvasinky se zařazují mezi fakultativně anaerobní mikroorganismy, mohou tedy využívat sacharidy oxidačním, ale i fermentačním způsobem. (Basařová, 2010) Nicméně, kvasinky nejsou schopny dobrého růstu za úplné nepřítomnosti kyslíku. Je to proto, že stejně jako přísun kyslíku pro respirační enzymy během aerobního růstu, je kyslík nutný pro biosyntézu sterolů a nenasycených mastných kyselin. Konkrétně kvasinky potřebují molekulární kyslík pro syntézu nenasycených mastných esterů acyl-coa. Kyslík je tedy pro kvasinky důležitý růstový faktor. Rozdílné kvasinky mají 23

26 různé požadavky na molekulární kyslík a při vysokých tlacích může čistý kyslík kvasinky silně inhibovat. U některých kvasných biotechnologií, u nichž je optimalizace růstu respiračního procesu nejdůležitější (např. v odvětvích s pekařskými kvasinkami a kvasničnou biomasou), musí být v bioreaktorech udržováno dostatečné množství kyslíku, aby se podpořil rychlý růst kvasinek. Také při pivovarském kvašení, často považovaného pouze za anaerobní, je počáteční přítomnost kyslíku a předchozí aerobní růst kvasinek nesmírně důležitá pro další vývoj kvašení. (Walker, 1998) Anorganické soli Prvky obsažené v solích, jež jsou významné pro kvasinky, se rozdělují na makroelementy (hořčík, draslík, vápník, fosfor, síra, chlor), mikroelementy (kobalt, bor, kadmium, molybden, měď, vanad, nikl, chrom, jód). Anorganické sirné sloučeniny, obzvláště sírany, jsou důležitým zdrojem pro syntézu methioninu, cysteinu a glutathionu. Významný prvek je taktéž fosfor, vyskytující se v nukleových kyselinách, fosfolipidech a fosfomananech. (Basařová, 2010) Metabolismus kvasinek Metabolismus je vysoce organizovaný a integrovaný soubor chemických reakcí, s nimiž jsou spojeny energetické přeměny, probíhající v živých organismech, mezi živými organismy a jejich okolím. (Hančová, 1999) Rozlišujeme dva typy procesů: 1. katabolické (degradační) procesy složité látky jsou rozkládány na látky jednodušší. Tyto procesy mají dvojí užitek: vytváří suroviny pro syntézu makromolekul a uvolňují energii, část z nich se využívá při syntéze ATP. 2. anabolické (biosyntetické) procesy z jednodušších látek vznikají látky složitější. Anabolické procesy jsou využívány k náhradě opotřebovaných molekul a k tvorbě energie (ATP). (Mougios, 2006) Glykolýza Glykolýza je katabolická metabolická dráha, probíhající v cytoplazmě. Je společná téměř pro všechny organismy, nezávisle na tom, zda žijí aerobně či anaerobně. (Koolman, 2012) 24

27 Pro sacharolytické mikroorganismy, tedy i kvasinky, je glykolýza základním anaerobním katabolickým procesem. Je založena na přeměně hexóz (glukóza, fruktóza, manóza, galaktóza) a její úsek k pyruvátu (CH 3 -CO-COO - ) je společný pro většinu živých organismů. Hlavními reakcemi glykolýzy jsou postupná fosforylace hexóz až ve fruktóza-1,6-bisfosfát, jeho štěpení ve dva triózafosfáty a jejich oxidace v 1,3-bisfosfoglycerát. Tato oxidace, pří níž se redukuje koenzym NAD + v NADH + H +, je u některých mikroorganismů jediným zdrojem energie glykolýzy. Část energie takto získané se ihned uloží v ATP. Další část energie se uvolní až po dalších stupních reakce, tj. při přeměně makroergické sloučeniny fosfoenolpyruvátu v pyruvát za vzniku další ATP. Vzhledem k tomu, že při přeměně jednoho triofosfátu vzniknou 2 ATP, tedy z celé hexózy 4 ATP, a protože 2 ATP se spotřebují na fosforylaci hexóz ve fruktóza- 1,6-bisfosfát na počátku glykolýzy, je čistý zisk při odbourání jedné molekuly hexózy pouze 2 ATP. Pyruvát je pak za anaerobních podmínek dekarboxylován na acetaldehyd, a ten je pak za kooperace redukovaného kofaktoru NADH a příslušného enzymu redukován na etanol. Takto vznikají z jedné molekuly hexózy dvě molekuly etanolu, dvě molekuly oxidu uhličitého za současného čistého zisku energie dvou molekul ATP. (Šilhánková, 2002) V případě, že má buňka dostatek kyslíku, přechází pyruvát z cytoplazmy do mitochondrie, kde je oxidován na acetyl-coa. Tato poměrně složitá přeměna se nazývá oxidační dekarboxylace pyruvátu. (Vacík, 1995) Pyruvát je převeden na acetyl-coa reakcí, která se často nazývá vazebná reakce, protože propojuje glykolýzu a citrátový cyklus. (Allott, 2001) Citrátový cyklus Citrátový cyklus neboli Krebsův cyklus je nejdůležitější aerobní katabolický proces mikroorganismů. Má význam jednak energetický, ale je taktéž významný z hlediska látkového metabolismu. Do cyklu vstupuje acetyl-coa a acetyl je v něm postupně oxidován až na CO 2 za redukce čtyř molekul kofaktorů. Redukované kofaktory jsou poté oxidovány dýchacím řetězcem za vzniku ATP. Při oxidaci jedné molekuly acetylu a oxidační regeneraci kofaktoru se získá až 12 ATP. Důležitým zdrojem acetylu je pyruvát, vytvořený glykolýzou z hexózy. Při aerobním využití jedné molekuly hexózy přes pyruvát a Krebsův cyklus vzniká za současné aerobní regenerace vzniklých redukovaných kofaktorů až 38 ATP. 25

28 Meziprodukty cyklu jsou trikarboxylové kyseliny citronová a isocitronová, dikarboxylové kyseliny α-oxoglutarová, jantarová, fumarová, jablečná a oxaloctová. V tomto cyklu jsou využívány kromě acetátu a pyruvátu i etanol po enzymové oxidaci na acetát, glycerol a laktát po přeměně na pyruvát, di- a trikarboxylové kyseliny, vyšší mastné kyseliny a většina aminokyselin po enzymové deaminaci. (Kalhotka, 2014) Dýchací řetězec Citrátový cyklus je ve své katabolické funkci úzce spjat s dýcháním a tedy i s dýchacím řetězcem. V dýchacím řetězci jsou oxidovány redukované kofaktory NADH, FMNH 2 a FNDH 2. Ve své podstatě jde o stupňovitý přenos vodíku z redukovaných kofaktorů na elementární kyslík za vzniku vody. Při oxidaci NADH + H + dýchacím řetězcem vznikají 3 ATP, při oxidaci FADH 2 maximálně 2 ATP. Přenosem vodíku z redukovaných kofaktorů až na kyslík respiračním řetězcem se uvolňuje energie využitelná k syntéze ATP z ADP. Tento děj se nazývá oxidační fosforylace. Respirační řetězec a oxidační fosforylace jsou spřažené procesy, které probíhají u kvasinek a jiných eukaryot v mitochondriích. (Kalhotka, 2014) Etanolové kvašení Během etanolového (alkoholového) kvašení vznikají z jedné molekuly hexózy dvě molekuly etanolu, dvě molekuly CO 2 a 2 ATP. (Šilhánková, 2002) Jde o metabolický proces, při kterém dochází k přeměně sacharidů na etanol a oxid uhličitý působením enzymů, nacházejících se v kvasinkách. (Pelikán, 1996; Sanchez, 2008) Cílem kvašení je vytvoření ATP, nicméně z hlediska energetického je proces kvašení nevýhodný, protože vzniklé metabolity mají ještě značnou energetickou hladinu. Kvasničná buňka tedy musí přeměnit velké množství substrátu na pokrytí celkové potřeby energie. Etanolové kvašení je až po vytvoření pyruvátu shodné s glykolýzou. Následuje dekarboxylace pyruvátu na acetaldehyd, jenž je následně alkoholdehydrogenázou redukován na etanol. (Němec, 2015) Část energie z chemických vazeb je nutno odvést ve formě tepla, z čehož vyplívá, že z poměrně velkého množství sacharidů je pouze malá část převáděna na výstavbu kvasničné buňky. Proto se acetaldehyd redukuje na etanol, čímž se znovu získá NAD +, který je potřebný pro oxidaci glukózy. (Basařová, 2010) 26

29 Glukóza NAD + Glykolýza ADP ATP NADH Přístup kyslíku Pyruvát Bez přístupu kyslíku CO 2 acetyl-coa acetaldehyd Citrátový cyklus Etanol NADH NAD + Aerobní respirace Etanolové kvašení Obr. č. 2 Schéma metabolismu kvasinek (Basařová, 2010, upraveno) Výskyt kvasinek Téměř všechny druhy kvasinek se usídlují a rozmnožují ve vysoce specializovaném prostředí. Jsou přítomny v půdě, ve vodě, na listech rostlin, v květech, v hojné míře v zahnívajících kaktusech, na kazících se plodech, izolovány z potravin, průmyslových provozů atp. (Janderová, 1999) Tab. č. 5 Přirozená místa výskytu kvasinek (Schaechter, 2009) Místo výskytu Popis Půda Půda je pro kvasinky spíše rezervoár pro dlouhodobé přežití, než stanoviště pro růst. Jsou přítomny pouze v horní části aerobních vrstev (10 15 cm), kde se nachází asi kvasničných buněk na 1 g půdy. Některé rody jsou izolovány výlučně z půdy (např. Lipomyces a Schwanniomyces) Voda Kvasinky převažují v povrchových vrstvách čerstvých a slaných vod, ale nejsou přítomny ve velkém množství (asi 1000 buněk na litr). Vzduch Jen několik životaschopných kvasničných buněk můžeme nalézt 27

30 Místo výskytu Vzduch Rostliny Zvířata Budovy Popis na jeden kubický metr vzduchu. Z horních vrstev půdy mohou být proudem vzduchu rozptýleny kvasinky rodu Rhodotorula, Sporobolomyces a Debaryomyces spp. Přítomnost mnoha rozpustných živin (sacharidy) na povrchu rostlin, zejména ovoce, vytváří příznivé podmínky pro růst kvasinek. Šíření kvasinek na fylosféře napomáhá hmyz. Některé kvasinky mohou být pro rostliny patogenní. Několik nepatogenních rodů kvasinek je přítomno ve střevním traktu teplokrevných zvířat nebo na jejich pokožce. Několik kvasinek (např. Candida albicans) je příležitostně patogenní vůči člověku a zvířatům. Množství kvasinek jsou spojeny s hmyzem, jenž působí jako důležitý vektor při přirozeném přenosu kvasinek. Kvasinky jsou v budovách poměrně všudypřítomné. Např. rod Aureobasidium pullulans je běžný na vlhkých domácích tapetách a kvasinky rodu Saccharomyces cerevisiae jsou hojně přítomny na povrchu technologických zařízení ve vinařství. 3.2 Využití kvasinek v potravinářství Kvasinky jsou z technologického hlediska celosvětově jedním z nejvyužívanějších mikroorganismů. Po tisíce let jsou využívány k výrobě alkoholických nápojů a kynutého pečiva. Podstatná je také produkce biologicky aktivních látek, biodegradační aktivita a výroba potravinářské a krmné biomasy. Z potravinářského hlediska je nejvýznamnější kvasinka Saccharomyces cerevisiae. (Kopecká, 2012) Kvasinka Saccharomyces cerevisiae Druhový název kvasinky Saccharomyces cerevisiae pochází z lat. cerevisiae = pivo. Tato kvasinka patří v přírodním prostředí k velmi rozšířeným kvasinkám. Vyznačuje se silnými fermentačními schopnostmi a využívá se např. v pivovarnictví, vinařství, lihovarství nebo pekařství. Druh Saccharomyces cerevisiae se dělí na dva poddruhy neboli subspecie: 28

31 1. Saccharomyces cerevisiae subsp. cerevisiae do tohoto poddruhu se zařazují kvasinky dříve považované za samostatné druhy, např. Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces italicus. Kvasinky tohoto poddruhu zkvašují glukózu, galaktózu, maltózu a sacharózu. Rafinózu, jež je složena galaktózy, glukózy a fruktózy, jsou schopny zkvašovat pouze z jedné třetiny tak, že odštěpují pouze fruktózu. 2. Saccharomyces cerevisiae subsp. uvarum do tohoto poddruhu se zařazují dřívější druhy, např. Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces logos, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces monacensis. Kvasinky tohoto poddruhu, na rozdíl od poddruhu cerevisiae, jsou díky syntéze enzymu melibiázy schopny rozštěpit rafinózu kompletně. (Klaban, 2011) Velikost a tvar kvasinky souvisí se stavem a podmínkami, v nichž se nachází. Z pravidla má buňka mírně oválný tvar, nicméně mohou se vyskytnout i buňky protáhlého tvaru. Délka se pohybuje v rozmezí 6 10 µm a šířka 5 10 µm. Průměrný objem buňky činí 175 mm 3 a povrch okolo 150 µm 2. (Basařová, 2010) Hlavní složku tvoří dusíkaté látky (45 60 %), sacharidy (15 37 %), minerální látky (6 12 %). Dále jsou přítomny také růstové látky a biologicky významné sloučeniny, mezi které patří zejména vitaminy skupiny B (B1, B2, B6), vitamin C, provitamin D, provitamin A (β-katoren) a další. (Němec, 2015) Kvasinka Saccharomyces cerevisiae se vegetativně rozmnožuje výhradně pučením. (Klaban, 2011) Za optimálních podmínek se buněčná hmota zdvojnásobí asi za 2 hodiny. (Kopecká, 2012) Saccharomyces cerevisiae patří k rodům, jež tvoří askospory. Pohlavně se rozmnožuje izogamním spájením, tzn., že se spájí přibližně stejně velké buňky. U heterotalických kmenů kvasinek Saccharomyces cerevisiae se párovací typy označují jako α a a. U těchto kmenů kvasinek dochází ke spájení pouze tehdy, smísí-li se v růstovém substrátu buňky typu α s buňkami typu a (α x a). Buňky určitého párovacího typu vylučují do substrátu specifický peptid, který zastaví buněčný cyklus buněk opačného párovacího typu ve fázi G 1 a taktéž dochází ke změkčení stěny buněk opačného párovacího typu, takže buňky mění tvar. Zároveň také dochází ke vzájemné aglutinaci buněk opačného párovacího typu, což je pravděpodobně výsledek rozdílů ve složení povrchové vrstvy jejich buněčných stěn a vede k usnadnění spájení. Jakmile se vytvoří zygota, může nastat vegetativní 29

32 rozmnožování v diploidním stavu. Ve vhodných podmínkách však může dojít ke sporulaci diploidních buněk. Celá buňka se přemění v askus (vřecko). Pro sporulaci je zapotřebí silný aerobní metabolismus, jenž je u rodu Saccharomyces zajištěn nepřítomností zkvasitelných sacharidů. Sporulace je podporována vysokým ph (8,0 9,0). Některé kmeny Saccharomyces cerevisiae jsou homotalické, tudíž po vypučení spory se vzniklé vegetativní buňky brzy spájejí a haploidní vegetativní fáze prakticky neexistuje. (Šilhánková, 2002) Kvasinky v pivovarství Pivovarství je jeden z nejstarších oborů lidské činnosti sahající hluboko do historie života na naší planetě. Za kolébku pivovarství je považována Mezopotámie, kde se z obilovin zřejmě vyráběly kvašené nápoje, předchůdci dnešního piva. Průmyslová i domácí výroba piva se opírá o cílené využívání kvasinek, zejména druhu Saccharomyces cerevisiae. Výrobní proces piva předpokládá použití kvasnic s dobře definovanými vlastnostmi. Termín kvasinky je využíván převážně z laboratorního hlediska, zatímco termín kvasnice označuje aktivní biomasu kvasinek využívaných v provozu. (Basařová, 2010) Při kvašení piva se využívají tzv. spodní a svrchní pivovarské kvasinky a jejich schopnost přeměňovat sacharidy na etanol a oxid uhličitý. (Kopecká, 2012) Taxonomie pivovarských kvasinek Původní pojmenování rodu pivovarských kvasinek (Zuckerpils cukerná houba) pochází z roku O rok později tyto kvasinky dostaly název Saccharomyces cerevisiae. Jde o latinský ekvivalent původního označení spojený s druhovým názvem souvisejícím s latinským označením pro pivo. (Basařová, 2010) V 80. letech 19. století izoloval dánský botanik a mikrobiolog Emil Christian Hansen v kodaňském pivovaru Carlsberg dva kmeny spodně kvasících kvasinek. Kmen č. 1 dostal název Saccharomyces carlsbergensis a kmen č. 2, používaný v pivovarech v Mnichově, Saccharomyces monacensis. Později oba názvy splynuly pod jediné označení, Saccharomyces carlsbergensis. (Basařová, 2010; Matoulková, 2007) V roce 1883 Hansen z anglických piv izoloval a popsal druh svrchně kvasících pivovarských kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Název Saccharomyces carlsbergensis pro spodní pivovarské kvasinky a název Saccharomyces cerevisiae pro svrchní pivovarské 30

33 kvasinky se používal do roku Ostatní rody se v pivovarství považovaly za cizí nebo divoké kvasinky. Za cizí kvasinky se považovaly např. kvasinky Saccharomyces uvarum a Saccharomyces logos, které se však v roce 1970 zařadily společně s kvasinkami Saccharomyces carlsbergensis pod jeden společný druh Saccharomyces uvarum. V roce 1984 splynul i tento druh pod společný název Saccharomyces cerevisiae, kam se do té doby zařazovaly jen svrchní pivovarské kvasinky. Nicméně, velké množství pivovarských technologů toto rozdělení neuznávalo, jelikož se tyto druhy z technologického hlediska liší. Dnes se v pivovarské literatuře můžeme setkat s různými obměnami názvů. Pro spodní pivovarské kvasinky např. Saccharomyces cerevisiae var. carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae var. uvarum, ssp. carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis), Saccharomyces uvarum (carlsbergensis). Pro svrchní pivovarské kvasinky existují podobné obměny. (Basařová, 2010) Saccharomyces pastorianus je dnes jediný správný název spodních pivovarských kvasinek a Saccharomyces cerevisiae svrchních pivovarských kvasinek. (Matoulková, 2007) Tab. č. 6 Některé taxonomické změny názvů významných pivovarských kvasinek (Matoulková, 2007, upraveno) S. pastorianus S. bayanus S. oviformis S. bayanus S. pastorianus S. cerevisiae S. cerevisiae var. ellipsoideus S. willianus S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae S. carlsbergensis S. carlsbergensis S. logos S. uvarum S. logos S. bayanus S. uvarum S. uvarum 31

34 Spodní pivovarské kvasinky Saccharomyces pastorianus jsou spodní pivovarské kvasinky, jež sedimentují na dno kvasné nádoby. Teplotní rozmezí pro kvašení těchto kvasnic je 7 15 C. (Basařová, 2010; Matoulková, 2007) V mnoha zemích je pivo, které je spodně kvašené, označováno jako ležák, jehož existují různé druhy, např. Pilsner (německý, evropský, americký) Dortmunder, Münchener, Bock, Schwarzbier, atp. (Basařová, 2010; Esslinger, 2009) Svrchní pivovarské kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsou svrchní pivovarské kvasinky, které jsou vynášeny do kvasné deky. Teplotní rozmezí kvašení svrchních pivovarských kvasinek je C. (Basařová, 2010; Matoulková, 2007) Svrchní kvašení je nejstarší metoda výroby piva a byla jediná, která byla používána až do poloviny 19. století. Pro svrchně kvašená piva je typická jejich zvláštní vůně, která je primárně vytvářena právě kvasinkami svrchního kvašení. (Esslinger, 2009) Typy svrchně kvašených piv jsou např. ALE, pšeničné, Alt, Stout, Porter atp. (Basařová, 2010; Esslinger, 2009) Lambic Lambic je jediné pivo svého druhu na světě. Jde o spontánně kvašené pivo, což znamená, že kvašení je prováděno mikroorganismy přítomnými v pivovaru a okolní atmosféře. Kromě kvasinek rodu Saccharomyces jsou přítomny kvasinky rodu Brettanomyces, Dekkera, Kloeckera, bakterie rodu Pediococcus a enterické bakterie. Kvašení tradičního piva lambic trvá asi dva roky. Jednotlivé mikroorganismy pracují postupně a produkují jedinečnou chuť piva lambic. Třetí až sedmý den po ochlazení mladiny zahajují kvašení enterické bakterie a kvasinky Kloeckera apiculata. Po třech až čtyřech týdnech přebírají kvašení druhy Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces bayanus. Jsou odpovědné za hlavní etanolové kvašení, které trvá tři až čtyři měsíce. Po uplynutí této doby přebírají kvašení bakterie Pediococcus damnosus a bakterie mléčného kvašení. Po osmi měsících se v pivu nachází nová populace kvasinkových buněk. Jedná se o druhy Brettanomyces bruxellensis a Brettanomyces lambicus. Ty jsou odpovědné za další snížení zbytkového extraktu a vývoj speciálních příchutí. Po hlavním kvašení mohou být přítomny také kvasinky rodu Candida, Pichia, Hansenula a Cryptococcus. Celkově se může na kvašení piva lambic podílet až deset druhů mikroorganismů. (Guinard, 1990) 32

35 3.2.3 Kvasinky ve vinařství Etanolové kvašení hroznového moštu je pravděpodobně nejstarší formou biotechnologického použití mikroorganismu, jež je lidmi používán již několik tisíc let. V hroznovém moštu se vyskytují různé druhy kvasinek v závislosti na odrůdě hroznů, klimatických podmínkách, zemědělských ošetřeních atp. Tyto domorodé kvasinky mohou při interakci s jinými mikroorganismy, jako jsou houbové mikroorganismy, bakterie a viry, provádět spontánní alkoholové kvašení. Je zřejmé, že všechny tyto mikroorganismy přispívají ke změnám v moštu, přičemž metabolity některých mikroorganismů jsou substráty pro ostatní mikroorganismy. Pokud jde o domorodé kvasinky, v počátečních fázích kvašení působí řada různých kvasinek, ale když vzroste koncentrace etanolu, převládají kvasinky Saccharomyces cerevisiae kvůli své vysoké odolnosti vůči etanolu. Organoleptické vlastnosti hotového vína závisejí na typech kvasinek působících během alkoholového kvašení. (Hui, 2012) Teplota kvašení se pohybuje v rozmezí C. (Pavloušek, 2015) Někdy mohou původní kvasinky a další mikroorganismy způsobit znehodnocení vín. Z tohoto důvodu, a aby se zabránilo takovému znehodnocení, se do moštu přidává oxid siřičitý, který zabrání vývinu původních kvasinek, a vybrané kmeny (obvykle Saccharomyces cerevisiae) se do moštu naočkují. Kvasinky jsou také vybírány na základě odrůdy hroznů, složení moštu, podmínek kvašení a typu vína. V případě nepříznivého prostředí moštu, tzn., nízké ph, vysoká koncentrace cukrů a vysoká koncentrace oxidu siřičitého, se kvasinky musí tomuto nepříznivému prostředí přizpůsobit. Alkoholové kvašení vytváří velkou rozmanitost těkavých sloučenin, které mají významný vliv na senzorické vlastnosti vína. Tyto sloučeniny patří do různých chemických skupin, jako jsou vyšší alkoholy, mastné kyseliny, estery, karbonylové sloučeniny, sloučeniny síry atd. Kvantitativně jsou kvasné těkavé sloučeniny nejhojnějšími sloučeninami aroma vína a jsou odpovědné za charakter vína. Sloučeniny vzniklé během etanolového kvašení silně závisí na odrůdě hroznů, složení moštu, podmínkách kvašení a kvasinkovém kmeni. Kromě toho, dochází na konci kvašení k autolýze kvasinek a do vína se uvolňují látky, jako jsou manoproteiny, mastné kyseliny, peptidy, aminokyseliny atd., které také ovlivňují senzorické vlastnosti vína, a to jak přímo prostřednictvím nových těkavých sloučenin, tak prostřednictvím interakce uvolněné sloučeniny s těkavými sloučeninami vína. V dnešní době je použití genomových technik pro zlepšení kmenů zaměřeno na získání nových kvasinek, aby se vyrobily nové typy vína přizpůsobené požadavkům spotřebitelů a aby se získaly 33

36 kmeny, které jsou odolnější vůči etanolu, antimikrobiálním sloučeninám a dalším stresovým účinkům. (Hui, 2012) Kvasinky na révě vinné Kvasinky jsou rozmístěny nepravidelně na povrchu vinné révy. Nacházejí se v malých množstvích na listech, stonku, nezralých hroznech, zřídka se vyskytují na květu. Kolonizují zejména povrch hroznů během zrání. Počet kvasinek na hroznové bobuli těsně před sklizní, je v rozmezí 10 3 až 10 5 v závislosti na zeměpisné poloze vinice, klimatických podmínkách během dozrávání, hygienickém stavu sklizně a ošetření vinné révy. Nejpočetnější populace kvasinek je přítomna v teplých klimatických podmínkách (nižší zeměpisné šířky, vyšší teploty). Po sklizni, transportu a drcení plodiny počet kvasničných buněk obecně dosahuje 10 6 kvasničných buněk/ml moštu. Počet apikulátních druhů kvasinek přítomných na hroznech je omezen. Nejpočetnější kvasinky jsou Kloeckera apiculata a Hanseniaspora uvarum. Dále kvasinky rodu Rhodotorula a v menších poměrech Metschnikowia pulcherrima, Candida famata, Candida stellata, Pichia membranefaciens, Pichia fermentans, Hansenula anomala. Na jednom pozemku v Alsasku byly nalezeny kmeny Saccharomyces uvarum na hroznech, v lisu a v kádích, kde představovaly až 90 % kvasinek, které se podílely na kvašení. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae se na hroznech vyskytují extrémně vzácně. (Ribéreau-Gayon, 2006) Aktivní suché vinné kvasinky Při použití řízeného kvašení se používají tzv. ASVK aktivní suché vinné kvasinky. ASVK lze vybírat podle požadovaného typu vína, které bychom chtěli vyrobit, přičemž na našem trhu se těchto kvasinek prodává velké množství. (Pavloušek, 2010) Ve vinařství se ve formě ASVK nejčastěji využívají kvasinky Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces bayanus. (Pavloušek, 2015) 34

37 Obr. č. 3 Aktivní suché vinné kvasinky (Pavloušek, 2010) Kvasinky v lihovarství Výběr vhodných kvasinek je velmi důležitý pro všechny palírny. Na výrobu whisky se dříve používaly vyčerpané pivovarské kvasinky. Takové kvasinky byly nenákladné a mohly se pohodlně získat a použít. Nicméně, více specializované lihovarské kvasinky, které mají lepší toleranci k etanolu a širšímu rozmezí substrátů, se v průběhu let staly více populární. Čisté kultury lihovarských kvasinek jsou nyní komerčně dostupné. Mnoho z nich má takové genetické složení, které jim umožňuje fermentovat větší molekuly sacharidů, jako je např. maltotetraóza a také mají schopnost lépe odolávat fermentačnímu namáhání. Důležitými parametry kvasinek pro lihoviny jsou: produkce alkoholu, tolerance vůči osmotickému tlaku, teplotě a ph. Důležitá je také rychlost kvašení a správná tvorba metabolitů pro konkrétní destilovaný produkt. (Russell, 2014) Destilované alkoholické nápoje se mohou vyrábět z alkoholických materiálů, jako jsou kvašená obilná zrna, kvašená ovocná šťáva, šťávy z cukrové třtiny, melasa, med nebo také šťáva z agáve. (Reed, 2012) Lihovarské kvasinky jsou primárně kmeny Saccharomyces cerevisiae s výjimkou přírodních fermentací, při kterých může být přítomen jakýkoli jiný druh kvasinek. Např. při kvašení melasy, jež je používaná pro výrobu rumu, jsou přítomny kvasinky Schizosaccharomyces pombe 35

38 a Saccharomyces cerevisiae (s různými divokými kvasinkami). (Reed, 2012; Russell, 2014) Získávání lihovarských kvasinek Primární kvasinky mohou být v palírně množeny z vlastní startovací kultury nebo dodávány komerčním výrobcem kvasinek v různých formách, např. suché kvasinky nebo tekuté kvasinky. Sekundární kvasnice (většinou vyčerpané pivovarské kvasinky) mohou být smíchány s primárními kvasinkami a v mnoha případech vede toto mísení ke konečnému vyššímu výtěžku etanolu. Existuje řada dodavatelů vysoce kvalitních lihovarských kvasinek a užívání vyčerpaných pivovarských kvasnic tak bylo vyřazeno kvůli problémům s nabídkou, kvalitou a udržováním konzistentní chuti s různou kvalitou kvasinkových kultur. Chuť a vůně destilátu mohou být ovlivněny právě kvasinkovým kmenem, který byl pro fermentaci vybrán. (Russell, 2014) Kvasinky v pekařství Chléb je jednou z prvních lidstvem vyráběných a konzumovaných potravin a dnes představuje základní potravinu pro mnoho částí světa. Kvašený chléb byl poprvé vyroben starými Egypťany před více než 5000 lety. Kvašený chléb tvoří většinu chleba prodávaného na dnešním trhu, zejména v západních zemích. Ve většině chlebů jsou kvasným činidlem pekařské kvasnice (droždí), tj. Saccharomyces cerevisiae. Takový chléb může být také nazýván kvasnicový. Příkladem kvasnicového chleba je např. běžný bílý chléb nebo různé druhy hnědého chleba, celozrnný chléb a mnoho druhů gurmánského chleba (smíšené zrno, ovoce atd.). (Hui, 2012) V chlebu je hlavní součástí kvasinkami vytvářený oxid uhličitý, který v těstě během kynutí vytváří bubliny. Kvašení tak výrazně zvyšuje objem těsta. Případný alkohol vyprchá během pečení. (Hui, 2012; Katz, 2015) Pekařské droždí Komerční výroba pekařského droždí na výrobu chleba byla zavedena na konci 19. století. V současnosti se pro výrobu využívají zejména kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Vyrábí se v aseptických systémech, ve kterých je vhodný kmen vybrán a rozmnožován za sterilních podmínek. Pro zvýšení počtu kvasničných buněk 36

39 je zapotřebí intenzivní aerace (Kulp, 2003) Pekařské kvasinky se kultivují na melase tak, aby se dosáhlo maximálního výtěžku. (Bamforth, 2005) Kvásek V zásadě je kvásek kašovitá směs mouky, vody a kvasinek používaná v procesu výroby chleba. Kváskový chléb má bohatou chuť, texturu a často také zvýšenou výživou hodnotu a trvanlivost. (Gupta, 2013) Nejčastěji nalézané kvasinky v kvásku jsou Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua a Candida humilis. Stabilita fermentace kvásku může záviset na interakcích mezi kvasinkami a bakteriemi mléčného kvašení. Během kvašení jsou vždy přítomny kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Vynikající aktivitu prokazují také kvasinky Kluyveromyces marxianus v přítomnosti laktózy a syrovátkové bílkoviny v těstě. Ve srovnání se Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua a Candida humilis jsou kvasinky Kluyveromyces marxianus charakterizovány jako tolerantní vůči kyselému prostředí a fungují tedy dobře s bakteriemi mléčného kvašení, jako jsou např. Lactobacillus sanfranciscensis. Tyto bakterie mohou hydrolyzovat maltózu. Při přítomnosti bakterií mléčného kvašení během kvašení těsta dochází ke snížení maximální rychlosti růstu kvasinek, avšak konečný počet buněk není nijak ovlivněn. Výsledná produkce etanolu je snížena. Kvasinky však podporují produkci mannitolu a kyseliny octové bakteriemi mléčného kvašení. (Hui, 2012) Další potravinářské využití kvasinek Kefír Kefír je fermentovaný mléčný nápoj produkovaný působením bakterií a kvasinek, které existují v symbióze v zrnech kefíru. Produkce kefíru je založena na tradici obyvatel Kavkazu, která se od konce 19. století rozšířila do jiných částí světa. Několik studií ukázalo, že kefír a jeho složky mají antimikrobiální, protinádorovou, protikarcinogenní a imunomodulační aktivitu a také zlepšují trávení laktózy. Hlavní kvasinky schopné fermentace laktózy nalezené v zrnech kefíru jsou Candida kefyr, Kluyveromyces lactis var. lactis, Debaryomyces hansenii a Dekkera anomala a neschopné fermentace laktózy Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Pichia fermentans, Kazachstania unispora, Saccharomyces turicensis, Issatchenkia orientalis a Debaryomyces occidentalis. Bakterie podílející se na tvorbě kefíru jsou 37

40 např. Lactobacillus lactis subsp. lactis, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kefiri atp. (Leite, 2013) Produkce mikrobiální biomasy a enzymů Výroba mikrobiálních bílkovin je považována za významný zdroj zajišťující bílkovinný program na základě netradičních a sekundárních surovin a pomocí moderních biotechnologických postupů. Mikrobiální bílkoviny (SCP single cell protein = bílkovina jednobuněčných mikroorganismů) jsou sušené buňky nejrůznějších mikroorganismů, jež se vyrábí kultivací ve velkoobjemových zařízeních ze sacharidických nebo petrochemických surovin. Nejvyužívanějším mikroorganismem pro výrobu krmného droždí je Candida utilis. Dalšími využívanými kvasinkami pro výrobu biomasy jsou např. Candida tropicalis, Kluyveromyces fragilis, Paecilomyces variotti, Rhodotorula glutinis, Endomycopsis fibuliger, Endomycopsis lipolytika, Candida oleophila atp. Pro produkci enzymových preparátů se v praxi využívají bakterie, plísně i kvasinky. Při výběru vhodného mikroorganismu je rozhodující reakční mechanismus, přičemž požadovaný enzym musí být produkován v co nejvyšší koncentraci. Např. z kvasinek rodu Saccharomyces se získává invertáza, jež se využívá pro výrobu invertního cukru ze sacharózy, inulináza získaná ze Saccharomyces fragilis se využívá pro hydrolýzu inulinu z čekankových kořenů, beta-galaktosidáza z Kluyveromyces lactis má využití pro přípravu bezlaktózového mléka. (Pelikán, 1996) Vady vybraných potravin způsobené kvasinkami Pivo Kvasinky během kvašení přirozeně produkují acetaldehyd, který jsou však schopny za běžných okolností přeměnit na alkohol. Pokud jej však kvasinky neodbourají, jsou s největší pravděpodobností oslabené nebo došlo během kvašení ke kontaminaci mladiny. Takové pivo je ve vůni i chuti cítit po zelených jablkách, případně po zelenině. Řešením proti tomuto problému je zejména přímá hygiena, dostatečná doba ležení a zakvašování pouze zdravými kvasinkami v optimální kondici. Další vadou piva, kterou mohou kvasinky způsobit, je tvorba diacetylu, který v pivu vytváří nežádoucí máslovou chuť a vůni. Kvasinky jsou schopny jej odbourávat, nicméně ke snadnějšímu odbourání jsou lepší vyšší teploty, tudíž tvorba diacetylu 38

41 je problémem zejména ležáků, které kvasí za nižších teplot, než svrchně kvašená piva. Aby se zabránilo tvorbě diacetylu, je důležité dávkovat dostatečné množství zdravých a vitálních kvasinek a dobře provzdušnit mladinu. Kvasinky také mohou v pivu vytvořit nežádoucí kvasnicovou až chlebnatou chuť. K tomu dochází, jsou-li použity nezdravé nebo zmutované kvasinky nebo je-li pivo příliš dlouho ponecháno nad vrstvou sedimentovaných neaktivních kvasinek, protože dochází k jejich autolýze a uvolňuje se hrubá a silná chuť. Mladé pivo může tuto chuť také vykazovat, avšak při zrání a sedimentaci kvasinek se vytrácí. Důležité tedy je nenechávat pivo příliš dlouho nad vrstvou neaktivních kvasinek. Dále je důležité používat zdravé a vitální kvasinky. (Novotný, 2017) Víno Vady vína způsobují nežádoucí změny v chuti, vůni nebo vzhledu vína. Vznikají zejména na základě fyzikálních a chemických reakcí, které zde probíhají. (Pavloušek, 2010) Nejznámější a nejrozšířenější vadou vína je tzv. křísovatění vína, které se vyskytuje zejména u vín s nižším obsahem alkoholu (do 12,5 %). V nádobách se na hladině vína vytváří charakteristický bílý případně šedobílý povlak nazvaný křís (lidově šum nebo květ). Hlavním původcem jsou kvasinky Candida mycoderma, Pichia membranaefaciens a Hansenula anomala, které oxidují etanol na oxid uhličitý a vodu a tvoří těkavé kyseliny spolu s aldehydy. Nejlepším opatřením proti křísovatění je držet nádoby s vínem zcela plné, popřípadě prázdný prostor zasířit, čímž se zabrání styku hladiny se vzduchem. Bakterie octového kvašení, konkrétně pak Acetobacter ascendens, Acetobacter mesooxydans atd., a kvasinky rodu Hanseniaspora, Kloeckera a Brettanomyces způsobují tzv. octovatění vína. Kromě kyseliny octové vznikají i jiné těkavé kyseliny (mravenčí, máselná a propionová) a jejich estery. Ve víně se tak objevuje zápach a chuť po octu. Preventivním opatřením proti octovatění je zpracovávání zdravých hroznů, správné čištění a dezinfekce výrobního zařízení, dostatečné zasíření moštu, rychlé nakvášení použitím kulturních kvasinek a stále plné nádoby s vínem. Pach po myšině se objevuje u zdlouhavě kvašených vín, která se docukřují. Původci takové nemoci jsou jednak bakterie Lactobacillus brevis a Lactobacillus cellobiosus, ale také kvasinky rodu Brettanomyces. Této nemoci lze zabránit silným sířením, čiřením, aktivním uhlím a sterilní filtrací. 39

42 Kvasinky rodu Brettanomyces jsou také nejčastějšími původci pachu po koňském potu. V malém množství sice pozitivně ovlivňují aroma vína (vůně po kosatcích, hřebíčku, dýmová vůně), avšak při vyšší koncentraci způsobují vadu vína, která se nejčastěji vyskytuje u červených vín zrajících v sudu barrique. Pro zamezení tvorby této nemoci je důležitá dobrá hygiena a dostatečné zasíření (kvasinky rodu Brettanomyces nesnášejí oxid siřičitý). (Kalhotka, 2014) Droždí Divoké kvasinky představují velmi závažnou kontaminaci pro drožďárenský průmysl, avšak při dnešní úrovni výrobního procesu je tato kontaminace téměř vyloučena a může k ní dojít až u hotového výrobku. Patří sem rod Candida, Lipomyces aj., které mají význam při výrobě droždí krmného. Divoké kvasinky mohou být přítomny maximálně v množství 15 %, přílišná kontaminace způsobuje nakyslou a nahořklou chuť. Kromě kvasinek mohou droždí kontaminovat také plísně, zejména rod Aspergillus, Penicilium, Mucor aj. V drožďárnách je častým kontaminantem Geotrichum candidum. Bakterie kontaminující droždí mohou být např. rod Clostridium, Lactobacillus a z prvozních vod Pseudomonas, Sarcina nebo Escherichia coli. (Pelikán, 1996) Majonézy Majonézy se vyrábí ze žloutků a oleje a kromě těchto základních surovin se pro jejich výrobu používá také sůl, koření, cukr a ocet. Majonézy není možné tepelně upravit, a proto patří mezi rychle se kazící potraviny, přestože mají poměrně nízké ph (4,1 3,4). Na jejich mikrobiálním kažení se podílí především kvasinky, např. rody Saccharomyces, Candida, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Pichia aj., jež mohou způsobovat bombáže. Dostatečné trvanlivosti lze dosáhnout řádnou hygienou výroby, používáním pasterovaných surovin a nízkými teplotami během celého výrobního procesu až po jejich spotřebu. Pokud se toto nedodrží, tak je povolená chemická konzervace neúčinná. (Kalhotka, 2014) Kromě výše uvedených potravin, se kvasinky mohou podílet na kažení ovocných nápojů, masa, konzerv, kořenících přípravků, čokolády, cukrovinek aj. Aby se zabránilo kontaminaci potravin nežádoucími mikroorganismy, je důležité dodržování správných výrobních procesů a hygieny s nimi spojené. (Heredia, 2009) 40

43 Většina potravin je vhodnou živnou půdou pro mikroorganismy, a proto proti nim musí být chráněna jednak během zpracování, ale také během skladování a distribuci. V kvasném průmyslu a v jiných provozech, využívajících činnosti mikroorganismů, je nutné vyloučit nebo potlačit kontaminující mikroorganismy, které mohou negativně ovlivnit kvalitu hotového výrobku. K tomu jsou používány fyzikální a chemické prostředky a jejich kombinace. Dále je nutné zachovávat přísné hygienické zásady, aby nedošlo ke kontaminaci potravin patogenními či jinými mikroorganismy, ani k jejich rozmnožení v potravinách. (Šilhánková, 2002) 41

44 4 Praktická část V rámci praktické části bakalářské práce je porovnávána a hodnocena rychlost prokvášení extraktu původní mladiny (EPM) jednofázovou technologií, o objemu mladiny 10 hl v CKT o objemu 12,5 hl kvasinkami (kvasnicemi) o rozdílném stáří. Měření a hodnocení bylo prováděno v Hradním pivovaru Hustopeče a to u 11 ležáku, tedy piva kvašeného spodními pivovarskými kvasinkami Saccharomyces pastorianus. Stářím kvasnic v tomto případě rozumíme to, kolikrát byly použity, resp. kolikrát byly aplikovány ke kvašení mladiny. V případě, že jsou ke kvašení aplikovány úplně nové (nepoužité) kvasnice, označují se jako nulky (nultá generace) a jedná se o suché pivovarské kvasinky nebo o čerstvou nultou generaci kvasinek ve formě rozkvašené mladiny. Kvasinky, které už byly jednou použity, se označují jako jedničky (první generace), dvakrát použité jako dvojky (druhá generace), třikrát použité jako trojky (třetí generace) atd. Opakované aplikace kvasnic závisí na použitém kmeni, nicméně jedna dávka se z pravidla opakovaně aplikuje 4x 6x. Obr. č. 4 Schéma používání kvasnic a jejich stárnutí (vlastní obrázek) 0) kvasnice nulky, 1) kvasnice jedničky, 2) kvasnice dvojky, 3) kvasnice trojky, 4) kvasnice čtverky 4.1 Materiál Měření bylo prováděno pomocí sacharometru u různých šarží piva typu ležák s názvem Hradní 11, tedy u spodně kvašeného piva, které má 11 11,99 % extraktu původní mladiny (EPM) před zakvášením. Znamená to tedy, že ve 100 g mladiny je obsaženo 11 11,99 g cukernatých látek. Dle tohoto poměru se určují stupňovitosti 42

45 i u ostatních piv. Např. 12 pivo znamená, že ve 100 g mladiny je obsaženo 12 12,99 g cukernatých látek. Ke kvašení mladiny jsou v Hradním pivovaru Hustopeče, v případě ležáků, používány spodní pivovarské kvasinky Saccharomyces pastorianus, konkrétně pak kmen RIBM 2 jež je dodáván z VÚPS ve formě rozkvašené mladiny ve stáří nulek. Takové kvasinky jsou v hustopečském pivovaru používány až do stáří čtyřek. V tomto stádiu se již nepoužijí, tzn., že je jedna dávka kvasnic opakovaně aplikována max. 4x. Na jednu šarži piva typu ležák (o objemu 10 hl) se zde používá ~ 10 l kvasnic ve formě rozkvašené mladiny. Dle informací od paní inženýrky Petry Kubizniakové z mikrobiologického oddělení VÚPS je RIBM 2 tradiční český kmen kvasinek Saccharomyces pastorianus, který se hodí zejména pro výrobu piva typu český ležák, je pro něj typická vyšší tvorba esterů a nižší produkce vicinálních diketonů (např. diacetyl). Schopnost prokvášení je 75 % z celkového množství cukrů, sedimentace je střední až vysoká, optimální teplota kvašení je 9 12 C a tolerance k alkoholu je střední. 4.2 Postup aplikace kvasinek (kvasnic) ve formě rozkvašené mladiny 1. Odebrání hibernujících kvasinek do sterilních nádob z příslušných zařízení, tedy ze zásobníku zákvasu nebo přímo z CKT (12,5 hl) došlo-li k dostatečné sedimentaci kvasinek 2. Proprání kvasinek čistou vodou a jejich provzdušnění 3. Sedimentace kvasinek na dno sterilních nádob 4. Odebrání zakalené vody a odumřelých kvasinek, jež se vyplavily 5. Napuštění mladiny o příslušné teplotě do nádob se sedimentovanými kvasinkami a jejich promíchání 6. Aktivace kvasinek mladinou o příslušné teplotě a cukernými látkami přítomnými v mladině 7. Nasazení aktivních kvasinek do příslušného CKT s mladinou Příslušnou teplotou mladiny je myšlena taková teplota, která je vhodná pro použité kvasinky. Obsah cukerných látek v mladině závisí na tom, kolika stupňovité pivo je vařeno. 43

46 Obr. č. 5 Odebírání kvasnic z CKT (vlastní foto) 4.3 Postup měření extraktu mladiny 1. Odebrání mladiny do odměrného válce 2. Vložení sacharometru do odměrného válce s mladinou 3. Kontrola % extraktu mladiny na sacharometru (při teplotě 20 C) 4. Poznačení % extraktu mladiny Takový postup je nutno opakovat každý den od chvíle, kdy byla mladina uvařena a zchlazena, až do chvíle, kdy dojde k prokvašení mladiny na požadovanou hodnotu extraktu mladiny, v případě Hradní 11 4,4 4,5 %. Jakmile se této hodnoty dosáhne, uzavře se na CKT průtokový ventil a mladina se v té chvíli začíná přirozeně sytit oxidem uhličitým vytvářeným kvasinkami během kvašení. Požadovaná hodnota se různí v závislosti na stylu piva a požadavků na něj. V případě, že jsou kontrolovány % extraktu mladiny a teplota mladiny neodpovídá 20 C, je nutné změřit její teplotu a dopočítat skutečnou hodnotu % extraktu mladiny, jelikož s vyšší nebo nižší teplotou stoupá, resp. klesá hodnota % extraktu mladiny. K tomuto výpočtu slouží teploměr a tabulka teplotních oprav, jež jsou součástí sacharometru. 44

47 Obr. č. 6 Kontrola % extraktu mladiny na sacharometru (vlastní foto) Obr. č. 7 Tabulka teplotních oprav na sacharometru (vlastní foto) 45