Důležité termíny enzymologie. Pavel Jirásek

Transkript

1 Důležité termíny enzymologie Pavel Jirásek

2 Charakteristika enzymů biokatalyzátory umožňující průběh chemických reakcí v živých organismech tj. za mírných podmínek poměrně nízké teploty, atmosférický tlak, hodnoty ph blízké 7 bez enzymů by reakce probíhaly stokrát až milionkrát pomaleji při reakcích se nespotřebovávají snižují hodnotu aktivační energie reakce E a = minimální energie potřebná k převedení látky do stavu schopného chemické reakce (přiblížení molekul, zeslabení starých vazeb a vytvoření předpokladu pro vznik nových)

3 Charakteristika enzymů II vytvoření jednoho nebo několika přechodných stavů mezi substrátem a enzymem, z nichž každý má podstatně nižší hodnotu aktivační energie (dosažitelnou i za mírných podmínek)

4 Charakteristika enzymů III zvyšují rychlost reakce v = úbytek koncentrace reaktantů nebo přírůstek koncentrace produktů za jednotku času (mol/l/s) neovlivňují chemickou rovnováhu pouze zkracují čas nutný k jejímu dosažení snadno regulovatelné viz dále

5 Struktura enzymů globulární bílkoviny, často obsahující ještě nebílkovinnou složku výjimku tvoří některé druhy RNA s katalytickou funkcí (ribozymy) dělení jednoduché čisté bílkoviny např. hydrolázy (pepsin, trypsin ) složené bílkovinná část (apoenzym) nebílkovinná část (kofaktor) koenzym» vázán pouze slabými vazebnými interakcemi větš. deriváty vitaminů prostetická skupina» kovalentní vazba ionty kovů, hem, FAD aktivní komplex apoenzym + kofaktor = holoenzym

6 Aktivní místo (centrum) enzymu místo na enzymu, do kterého se váže substrát téměř vždy pouze slabými vazebnými interakcemi (kovalentní vazba vzácná) vazebné skupiny spojení se substrátem obvykle nepolární katalytické skupiny vlastní katalýza obvykle polární teorie zámku a klíče substrát je klíč, který zapadne jen do správného zámku (enzymu s vhodným tvarem aktivního centra) teorie indukovaného přizpůsobení novější substrát je do jisté míry schopen měnit konformaci enzymu tvar substrátu se někdy přizpůsobuje enzymu

7 Enzymy s kvarterní strukturou enzymy složené z několika podjednotek spojených slabými vazebnými interakcemi podjednotky se mohou vzájemně ovlivňovat různá specifičnost podjednotek mohou vázat rozdílné substráty katalytické podjednotky zajišťují samotnou katalýzu regulační podjednotky vazba aktivátorů, inhibitorů např. synthasa mastných kyselin jeden polypeptidický řetězec složený ze 2 podjednotek schopný katalyzovat všechny kroky syntézy MK

8 Specifita enzymů substrátová závisí hlavně na bílkovinné části absolutní jen jeden substrát vzácná - např. ureasa relativní častější více substrátů s různou afinitou substráty s podobnou strukturou např. členové jedné homologické řady např. alkoholdehydrogenasa kinetická závisí hlavně na koenzymu, některé parametry však ovlivňuje i bílkovinná část (např. redoxní potenciál enzymu) určuje typ reakce u aminokyseliny může podle typu koenzymu dojít k oxidační deaminaci, transaminaci, dekarboxylaci skupina proteas štěpí vždy peptidovou vazbu, ale na různém místě stereospecifita enzym napadá pouze jeden určitý stereoizomer D- monosacharidy, L-aminokyseliny substrát se musí specificky vázat alespoň na tři různá místa, druhý stereoizomer toho schopen není

9 Izoenzymy katalyzují stejnou reakci, ale liší se svými fyzikálněchemickými vlastnostmi rozdílná afinita k substrátu odlišné ph optimum, citlivost k denaturaci, citlivost k inhibitorům nacházejí se v různých kompartmentech nebo tkáních pravé izoenzymy kódované různými geny izoformy vznikají různou posttranslační modifikací

10 Druhy enzymů intracelulární pro vlastní potřebu buňky extracelulární pro katalýzu reakcí probíhajících mimo buňku, kterou byly vytvořeny často syntetizovány v neaktivní formě jako proenzymy (zymogeny) faktory krevního srážení se aktivují až parciální proteolýzou pepsin se aktivuje až při nízkém ph (HCl v žaludeční šťávě) trypsin aktivuje až enteropeptidáza na kartáčovém lemu tenkého střeva

11 Názvosloví enzymů systematický název přesný popis katalyzované reakce doporučený název jednodušší než systematický, obvykle označení substrátu a typu reakce + koncovka áza - např. alaninaminotransferáza) triviální název některé historické názvy koncovka in např. pepsin

12 EC klasifikace každý enzym má svůj čtyřciferný číselný kód třída, podtřída, podpodtřída, pořadové číslo v oficiálním seznamu 6 tříd podle typu katalyzované reakce EC1.x.x.x oxidoreduktázy EC2.x.x.x transferázy EC3.x.x.x hydrolázy EC4.x.x.x lyázy (syntázy) EC5.x.x.x izomerázy EC6.x.x.x ligázy (syntetázy)

13

14 Oxidoreduktázy katalyzují redoxní reakce přenášejí vodík nebo kyslík nebo pouze elektrony z jedné látky na druhou dehydrogenáza katalyzuje odebrání vodíku ze substrátu (H nebo H - ), který je tak oxidován desaturáza HC 2 -CH 2 - -CH=CH- (metabolismus MK) reduktáza katalyzuje přenos vodíku na substrát, tj. redukci substrátu oxidáza katalyzují přenos elektronů ze substrátu na kyslík peroxidáza oxidace různých látek za přítomnosti H 2 O 2, který funguje jako akceptor vodíku, resp. jako zdroj kyslíku a mění se tak na vodu oxygenáza zabudovává atom (monooxygenáza = hydroxyláza) nebo molekulu kyslíku (dioxygenáza) do substrátu

15 Kofaktory oxidoreduktáz NAD + /NADH+H + NADP + /NADPH+H + koenzym, přenos H + +2e - prekurzorem je vit. B 3 (niacin) NADH+H + přenáší redukční ekvivalenty z katabolických metabolických drah do dýchacího řetězce; NADPH+H + funguje jako redukční činidlo při biosyntézách P i

16 Kofaktory oxidoreduktáz II FMN/FMNH 2 (flavinmononukleotid) FAD/FADH 2 (flavinadenindinukleotid) prostetická skupina, přenos 2H + + 2e - prekurzorem je vit. B 2 (riboflavin) funkčně srovnatelné, součást tzv. flavoproteinů - přenos redukčních ekvivalentů z katabolických drah do dýchacího řetězce a další redoxní procesy (FADH 2 ), dýchací řetězec (FMNH 2 )

17 Kofaktory oxidoreduktáz III ubichinon/ubichinol (CoQ/CoQH 2 ) koenzym, přenos 2H + + 2e - z části syntetizován, z části přijímán potravou přenašeč redukčních ekvivalentů v dýchacím řetězci

18 Kofaktory oxidoreduktáz IV kyselina lipoová prostetická skupina, přenos 2H + + 2e - vnitromolekulový disulfidický můstek redukce na dithiol účastní se hlavně oxidativní dekarboxylace α- ketokyselin (součást např. pyruvátdehydrogenázového komplexu)

19 hem Kofaktory oxidoreduktáz V prostetická skupina, přenos e - (Fe 2+ Fe 3+ ) několik tříd hemů (a,b,c) lišící se substituenty dýchací řetězec, monooxygenázy, peroxidázy

20 Transferázy katalyzují přenos funkčních skupin mezi donory a akceptory skupinatransferáza (např. aminotransferáza) kináza = fosfotransferáza přenáší fosfátovou skupinu z makroergní molekuly (např. ATP) na substrát fosforyláza přenáší fosfátovou skupinu na organickou látku obvykle se fosforylázou myslí glykogenfosforyláza, která využívá volný fosfát k štěpení vazeb v glykogenu ( Glc-1-P) transketoláza přenášejí dvouuhlíkaté zbytky, pentózový cyklus transaldoláza přenášejí tříuhlíkaté zbytky, pentózový cyklus

21 Kofaktory transferáz koenzym A (CoA) přenáší acylové zbytky, thioesterová vazba prekurzorem je vit. B 5 (kyselina pantothenová) metabolismus živin

22 Kofaktory transferáz II thiamindifosfát (TPP) přenáší hydroxyalkylové zbytky prekurzorem je vit.b 1 (thiamin) účastní se oxidativní dekarboxylace α-ketokyselin, součást transketoláz

23 Kofaktory transferáz III pyridoxalfosfát přenáší aminoskupiny prekurzorem je vit. B 6 (pyridoxin) metabolismus aminokyselin (transaminace, dekarboxylace ); glykogenfosforyláza

24 Kofaktory transferáz IV biotin přenáší CO 2 vit. H (B 7 ) kofaktor všech karboxyláz

25 Kofaktory transferáz V S-adenosylmethionin (SAM) přenáší methylové zbytky methylační reakce

26 Kofaktory transferáz VI tetrahydrofolát přenos jednouhlíkatých zbytků v různých oxidačních stavech prekurzorem je kyselina listová syntéza nukleotidů, metabolismus některých aminokyselin

27 Kofaktory transferáz VII nukleosidfosfáty (ATP, GTP ) přenos fosfátu (P i ) endergonické reakce 3-fosfoadenosin-5-fosfosulfát (PAPS) přenos sulfátu (SO 2-4 ) syntéza GAG, biotransformační reakce

28 Hydrolázy katalyzují hydrolytické reakce štěpí substráty za vstupu vody esteráza štěpí esterovou vazbu R 1 -CO-O-R 2 R 1 -COOH + HO-R 2 fosfodiesteráza štěpí fosfodiesterovou vazbu R 1 OH + P i -R 2 fosfatáza odštěpuje fosfát P i -O-R P i + HO-R peptidázy, glykosidázy, lipázy

29 Lyázy katalyzují nehydrolytické štěpení vazeb v substrátu jestliže lyasa katalyzuje reakce ve smyslu syntézy, nazývá se syntáza přidávají nebo odebírají malou molekulu do/ze substrátu hydratázy adice vody -CH=CH- + H 2 O -CH(OH)-CH 2 - dehydratázy eliminace vody dekarboxylázy koenzymem dekarboxyláz bývá pyridoxalfosfát

30 Izomerázy katalyzují izomerační reakce cis-trans izomerázy epimerázy epimerizace monosaridů (epimer se liší konfigurací na jednom uhlíku ) mutázy změna polohy fosfátové skupiny v molekule

31 Ligázy katalyzují silně endergonní slučování dvou molekul za současné spotřeby energie (hydrolýza ATP) příklady: pyruvátkarboxyláza acetyl-coa karboxyláza koenzymem obou karboxyláz biotin glutaminsyntetáza

32 Určete třídu enzymu aspartátaminotransferáza (AST) transferáza alkalická fosfatáza (ALP) hydroláza kreatinkináza (CK) transferáza laktátdehydrogenáza (LD) oxidoreduktáza alaninaminotransferáza (ALT) transferáza lipáza (LPS) hydroláza

33 Rychlost enzymově katalyzovaných reakcí aktivita enzymu udává schopnost enzymu přeměnit substrát za jednotku času katal(kat) = přeměna 1 mol substrátu za 1 s v medicíně se běžně používají μkat a nkat mezinárodní jednotka: U = přeměna 1 μmol substrátu za 1 min 1 katal = U

34 teplota Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí zvyšuje počet molekul schopných reakce vyšší kinetická energie částic vyšší počet srážek více molekul překoná E a pro každý enzym však existuje teplotní limit, pak nastává denaturace bílkovinné složky a ztráta katalytické aktivity

35 Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí II ph závisí na něm disociace funkčních skupin enzymu a substrátu každý enzym má svoje ph optimum většinou v rozmezí ph 5-9 extrémní hodnoty ph způsobí denaturaci enzymu a ztrátu jeho katalytické aktivity

36 Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí III množství substrátu a afinita enzymu k substrátu S + E ES P + E s rostoucí koncentrací substrátu roste rychlost reakce k maximální hodnotě (v max ), dokud není enzym substrátem plně nasycen

37 Rovnice Michaelis-Mentenové v rychlost reakce v max maximální rychlost reakce při úplném nasycení enzymu substrátem [S] koncentrace substrátu K M Michaelisova konstanta koncentrace substrátu, při které je rychlost rovna ½ v max informuje o afinitě substrátu k enzymu (jak snadno se substrát váže do aktivního místa enzymu) nepřímá úměra běžné enzymy mají hodnotu K M v rozmezí mol/l

38 enzym č.2 má nižší hodnotu K M a tedy vyšší afinitu k substrátu

39 Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí IV počet molekul enzymu s rostoucí koncentrací enzymu se rychlost reakce zvyšuje pro počáteční rychlosti platí přímá úměra (dokud je rychlost zpětné přeměny P na ES zanedbatelná) regulace kompartmentace v různých kompartmentech odlišný počet molekul enzymu změna absolutní koncentrace enzymu indukce nebo represe exprese genu kódujícího daný enzym transkripční faktor trvá déle než se projeví (hodiny, dny) modulace aktivity již nesyntetizovaného enzymu aktivace /inhibice např. fosforylací/defosforylací; odbourání enzymu

40 Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí V přítomnost aktivátoru aktivuje neaktivní proenzymy parciální proteolýza odštěpí se část molekuly proenzymu aktivní enzym alosterická aktivace nutná přítomnost alosterického centra navázání aktivátoru do alosterického centra způsobí příznivou deformaci aktivního centra umožní navázání substrátu křivka alosterických enzymů je sigmoidální přítomnost inhibitoru

41

42 Inhibice enzymů kompetitivní inhibitor má podobnou strukturu jako přirozený substrát, váže se do aktivního centra enzymu inhibitor soutěží se substrátem o aktivní centrum přítomnost kompetitivního inhibitoru zvyšuje K M snižuje afinitu enzymu k substrátu zvýšenou koncentrací substrátu lze inhibitor vytěsnit (rychlost v max se nemění) např. inhibice alkoholdehydrogenázy methanolem

43

44 Inhibice enzymů nekompetitivní inhibitor není strukturně podobný substrátu, váže se mimo aktivní místo navázání inhibitoru deformuje aktivní centrum enzymu dochází ke snížení v max (snížila se koncentrace molekul enzymu schopných katalýzy) nelze potlačit zvýšenou koncentrací substrátu (K M se nemění) vratná pouze pokud se inhibitor neváže na enzym kovalentně např. sarin (nervový jed) nevratně inhibuje acetylcholinesterázu

45

46 Principy regulace enzymové aktivity v metabolických drahách regulace zpětnou vazbou meziprodukt nebo konečný produkt metabolické dráhy inhibuje jednu z prvních reakcí např. palmitoyl-coa inhibuje Ac-CoA karboxylázu zkřížená regulace meziprodukt jedné metabolické dráhy ovlivňuje jinou metabolickou dráhu např. malonyl-coa inhibuje karnitinový přenašeč a tím i degradaci MK zabezpečuje, aby současně neprobíhala degradace i syntéza regulace krokem vpřed meziprodukt ovlivňuje jeden z následujících enzymů metabolické dráhy např. jeden z prvních produktů v syntéze nukleotidů aktivuje následující enzymy zajišťuje, aby dráha proběhla celá

47 Enzymy jako markery poškození určité tkáně při poškození tkáně se enzymy uvolní do extracelulárního prostředí jejich aktivitu lze měřit v krvi aktivita je mírou poškození tkáně, která je pro enzym specifická játra a žlučové cesty ALT (alaninaminotransferáza) katalyzuje přenos aminoskupiny z alaninu na 2-oxoglutarát cytosolický enzym zvýšená hladina při poškození buněčné membrány (při malém poškození) - např. u akutní virové hepatitidy, akutním toxickém poškození jater nebo po předávkování alkoholem

48 Enzymy jako markery poškození určité tkáně II AST (aspartátaminotransferáza) katalyzuje přenos aminoskupiny z aspartátu na 2-oxoglutarát převážně mitochondriální enzym signalizuje vážnější poškození, AST vyšší než ALT svědčí o nekróze buněk GMT (gamaglutamyltransferáza) katalyzuje přenos γ-glutamylu z glutathionu na AMK a umožňuje transport AMK přes buněčnou membránu do cytosolu indikátor hepatobiliárního poškození, zvláště u chronických stavů a při cholestase (nejvyšší hodnoty při obstrukci žlučových cest) je nejcitlivějším ukazatelem poškození jater alkoholem, značí také metastatické procesy v játrech, u virové hepatitidy v rekonvalescenci (hodnocení průběhu) ALP (alkalická fosfatáza) katalyzuje hydrolýzu fosfátových esterů při alkalickém ph zvýšená při hepatobiliárních onemocněních (obstrukce, abscesy, metastázy)

49 Enzymy jako markery poškození určité srdeční sval tkáně II CK (kreatinkináza) - izoenzym CK-MB - cytoplazmatický enzym, katalyzuje fosforylaci kreatinu na kreatinfosfát pomocí ATP AST, LDH (laktátdehydrogenáza) pouze historický význam pankreas: pankreatická amyláza (stoupá při akutní pankreatitidě) a lipáza kosterní sval: CK - izoenzym CK-MM

50 Otázky k procvičení Fosfatáza katalyzuje hydrolýzu esterové vazby ANO K M se udává v jednotkách rychlosti reakce (mol.s -1 ) NE O kompetitivní inhibici jde, pokud substrát s inhibitorem soutěží o aktivní centrum enzymu ANO Nekompetitivní inhibici lze snížit zvýšením koncentrace substrátu NE