ENZYMY. Klasifikace enzymů

Transkript

1 ENZYMY Enzymy jsou bílkoviny, které katalyzují chemické reakce probíhající v živých organismech. Byly identifikovány tisíce enzymů, mnohé z nich byly izolovány čisté. Klasifikace enzymů Vzhledem k tomu, že rychle stoupá počet známých enzymů, byl zaveden mezinárodně uznávaný systém jejich klasifikace i názvosloví. Enzymy byly rozděleny do šesti hlavních tříd podle typu chemické reakce, kterou katalyzují, a každému byl současně přidělen čtyřčíselný kód a systematický název: 1. oxidoreduktasy katalyzují oxidoredukční reakce. 2. transferasy katalyzují přenos skupin. 3. hydrolasy katalyzují hydrolytické štěpení vazeb. 4. lyasy (synthasy) katalyzují nehydrolytické štěpení za vzniku dvojných vazeb nebo naopak adici na dvojné vazby. 5. isomerasy katalyzují geometrické a strukturální změny uvnitř jedné molekuly. 6. ligasy (synthetasy) katalyzují slučování molekul spojené s hydrolýzou pyrofosfátové vazby např. v ATP. Příklady názvosloví enzymů uvádí tabulka 1. Tabulka 1: Příklady názvosloví enzymů. Triviální název Systematický název Reakce Kód L-Lac + NAD + Laktátdehydrogenasa L-Lac: NAD + -oxidoreduktasa pyruvát + NADH + H + ATP + D-glc Hexokinasa ATP: hexosa-fosfotransferasa ADP + D-glc-6-P Kinetika enzymové reakce Enzymy jako katalyzátory urychlují průběh chemických reakcí v organismu. Je třeba zdůraznit, že pouze urychlují dosažení rovnováhy mezi výchozími látkami (substráty) a produkty tím, že snižují aktivační energii nutnou k tomu, aby reakce proběhla, složení rovnovážné směsi však neovlivňují. Pro enzymové reakce platí obecná pravidla kinetiky chemických reakcí, ale specifickým rysem těchto reakcí je tzv. saturace substrátem. Tento jev, pozorovaný nejprve experimentálně, vedl Michaelise a Mentenovou (1913) k navržení nejjednoduššího mechanismu enzymové reakce. Enzymová reakce probíhá tak, že enzym reaguje nejprve se substrátem (S) za vzniku komplexu enzym-substrát (ES), který se teprve ve druhé fázi reakce štěpí na enzym a produkt (P). E + S k 1 k 1 ES k2 E + P 1

2 Pro počáteční rychlost (v) takové reakce platí, za předpokladu, že je reakce v ustáleném stavu, tzn. že koncentrace komplexu ES je konstantní a že koncentrace substrátu S je mnohem větší než koncentrace enzymu E, rovnice Michaelise a Mentenové, v = V [S] K m + [S] kde V je maximální rychlost reakce a K m = k 1+k 2 k 1 je tzv. Michaelisova konstanta, která charakterizuje afinitu enzymu k danému substrátu. Rovnice Michaelise a Mentenové je rovnice hyperboly, která velmi dobře vyhovuje experimentálním zjištěním pro mnoho enzymů (obr. 1). v V V/2 K m Obrázek 1: Grafické znázornění rovnice Michaelise a Mentenové. [S] Důležitý vztah vyplyne v případě, že se rychlost reakce rovná polovině maximální rychlosti: v = V V 2 2 = V [S] K m = [S] K m + [S] To znamená, že K m se rovná koncentraci substrátu, při které je počáteční rychlost reakce právě polovina maximální rychlosti. Z toho také vyplývá, že K m odpovídá koncentraci substrátu, při které je enzym právě z poloviny nasycen substrátem. Její rozměr je molarita nebo mol.l 1. V oblasti nízkých koncentrací substrátu, když je [S] K m, se rovnice Michaelise a Mentenové redukuje na v = V [S] = konst. [S] K m To je rovnice pro reakci 1. řádu. Když je koncentrace substrátu vysoká, ([S] K m ) přechází rovnice na v = V [S] [S] = V = konst. Za těchto podmínek má enzymová reakce kinetiku nultého řádu. Když je koncentrace substrátu mezi těmito mezními hodnotami (0, 01 K m < [S] < 100 K m ), platí pro en- 2

3 zymovou reakci právě rovnice Michaelise a Mentenové a reakce má kinetiku smíšenou nultého a prvního řádu. Grafické určování Michaelisovy konstanty a maximální rychlosti. Jednoduchými úpravami lze rovnici Michaelise a Mentenové, tj. rovnici hyperboly, převést na rovnici přímky. Tuto užitečnou úpravu navrhli Lineweaver a Burk: 1 v = K m V 1 [S] + 1 V Grafické znázornění této rovnice je na obr. 2. Směrnice závislosti 1/v na je dána výrazem K m /V ; úsek, který přímka vytíná na ose 1/v se rovná 1/V a úsek na ose odpovídá 1/K m. Této metody se nejčastěji využívá pro stanovení hodnot K m a V zkoumané dvojice enzym-substrát. 1/v 1/V - Obrázek 2: Reciproký výnos dle Lineweavera a Burka. Vliv koncentrace vodíkových iontů na enzymovou reakci. Koncentrace H + má značný vliv na rychlost enzymové reakce. U většiny enzymů má závislost rychlosti reakce na ph tvar křivky s maximem. ph odpovídající maximu aktivity se označuje jako ph optimum. Účinek vodíkových iontů na enzymy je záležitost poměrně složitá, zjednodušeně lze však říci, že je podmíněn amfoterním charakterem bílkovinné části enzymové molekuly. Hodnota ph optima pro určitou dvojici enzym-substrát závisí především na pk ionizujících skupin v aktivním centru enzymu a pk funkčních skupin substrátu. Inhibice enzymů. Některé látky ovlivňují rychlost enzymových reakcí. Když dojde ke snížení rychlosti, mluvíme o inhibici, při zvýšení rychlosti o aktivaci. V zásadě může být inhibice reversibilní či irreversibilní. Irreversibilní inhibice v podstatě znamená kovalentní modifikaci funkčních skupin enzymu nebo jeho destrukci. Dále se bude mluvit pouze o inhibici reversibilní. U inhibovaných reakcí se uvádí tzv. stupeň inhibice (i), který je definován vzta- 3

4 hem i = v v i v kde v je rychlost neinhibované reakce a v i reakce inhibované. Pak mohou nastat tři situace: 1. stupeň inhibice není ovlivňován koncentrací substrátu. Tento typ inhibice se označuje jako nekompetitivní, 2. stupeň inhibice se snižuje, když koncentrace substrátu vzrůstá inhibice kompetitivní, 3. stupeň inhibice se zvyšuje, když koncentrace substrátu vzrůstá inhibice akompetitivní. Rovnice, které platí pro rychlost inhibovaných reakcí a tvar závislosti 1/v na udává tabulka 2. Inhibiční konstanta K i charakterizuje vztah mezi enzymem a inhibitorem, je to vlastně disociační konstanta komplexu enzym-inhibitor (EI). E + I EI K i = [E] [I] [EI] Z tvaru závislosti 1/v i na při různých koncentracích inhibitoru lze i rozhodnout, o jaký typ inhibice jde. Hodnotu inhibiční konstanty je pak nutné vypočítat pomocí příslušné rovnice. Tabulka 2: Inhibice enzymů. Rovnice závislosti v na[s] a tvar závislosti 1/v na pro různé typy inhibice. Nekompetitivní Kompetitivní Akompetitivní v = V [S] (K m +[S]) (1+ [I] K i ) v = V [S] K m (1+ [I] K i )+[S] v = K m + V [S] (1+ [I] K i ) [S] 1/v [I] 1/v [I] 1/v [I] Jednotka enzymové aktivity. Množství enzymu v roztoku lze určit kvantitativně prostřednictvím jeho katalytické aktivity. Předem je však třeba znát: 1. chemickou podstatu a stechiometrii reakce, kterou enzym katalyzuje, 2. zda enzym vyžaduje pro svou funkci kofaktor, 3. K m pro dvojici enzym-substrát, případně enzym-koenzym, 4. ph optimum enzymu, 4

5 5. vliv teploty na aktivitu i stabilitu enzymu, 6. jednoduchou analytickou metodu pro sledování úbytku substrátu nebo vzniku produktu. Aktivita enzymu se má měřit při jeho ph optimu a při saturační koncentraci substrátu, kdy reakce probíhá kinetikou nultého řádu vzhledem k substrátu. Za těchto podmínek je aktivita enzymu (rychlost reakce) úměrná pouze jeho koncentraci. Standardní jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu l µmol (10 6 mol) substrátu za minutu při 25 C a ph optimu. Označuje se U (z angl. unit). Nověji se zavádí pro vyjádření aktivity jednotka katal, definovaná jako taková aktivita, která přemění 1 mol substrátu za sekundu. 1 kat = 1 mol s 1 = 60 mol min 1 = µmol min 1 = U Koncentrace enzymu se pak vyjadřuje v jednotkách vztažených na jednotku objemu (U/ml). Mírou čistoty enzymového preparátu je tzv. specifická aktivita vyjádřená v jednotkách aktivity vztažených na množství bílkovin v roztoku (U/mg). U enzymů se známou molekulovou hmotností lze pak ještě zjistit tzv. aktivitu katalytického centra (nebo číslo přeměny TN z angl. turnover number), které udává počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu (jedním aktivním centrem) za minutu. Některé zásady práce s enzymy Izolace enzymů. Při čištění a izolaci enzymů se užívá metod běžných při izolaci bílkovin. Proti inaktivním bílkovinám mají enzymy tu výhodu, že lze postup izolace sledovat zjišťováním aktivity. Pro izolaci intracelulárních enzymů je třeba nejprve tkáň rozrušit. K tomu se využívá mletí, homogenizace, zmrazování, případně autolýza. Pak se enzym extrahuje nejčastěji vodou nebo pufrem. Nerozpuštěný zbytek se odděluje filtrací nebo centrifugací. K nejhrubší frakcionaci lze využít tepelné denaturace (zahřátí roztoku na 50 až 60 C po dobu 5 až 15 minut). Dále se využívá zejména frakčního vysolování síranem amonným, který je dobře rozpustný a nedenaturuje bílkoviny. Vysrážené bílkoviny se většinou snadno rozpouštějí ve vodě, přidává-li se po malých dávkách. Před dalšími operacemi bývá nutné odstranit síran amonný z roztoku, a to nejlépe dialýzou, ultrafiltrací nebo odsolením gelovou chromatografií. Srážení organickými rozpouštědly, zejména ethanolem a acetonem, je velmi účinné, ale je třeba je provádět při teplotách pod 5 C. Jinak by bílkoviny nevratně denaturovaly. Částečně vyčištěné preparáty enzymů se dále čistí nejčastěji gelovou chromatografií, ionexovou nebo afinitní chromatografií, připadně elektroforeticky. Izolace enzymu může končit až jeho krystalizací. K zahušťování roztoku enzymů je výhodné používat ultrafiltrace nebo lyofilizace. Měření aktivity enzymu. Počáteční rychlost reakce se měří sledováním úbytku substrátu nebo tvorby produktu s časem. Počáteční rychlost, pro kterou platí rovnice Michaelise a Mentenové, je definována jako rychlost v čase nula, před tím než vznikl 5

6 jakýkoliv produkt. Experimentálně je velmi obtížné takto určit rychlost z několika důvodů. Čas potřebný k promíchání reakčních složek a změření koncentrace není nikdy nulový. Proto se rychlost určuje jako množství substrátu přeměněného za určitý čas, ale pouze v oblasti času, kdy je změna koncentrace měřené reakční složky s časem lineární (obr. 3). Pouze v čase od 0 do t 1 lze měřit počáteční rychlost enzymové reakce. Před zahájením enzymové reakce je nutné 6 až 10 minut vytemperovat odděleně všechny reakční složky směsi na určenou teplotu. Při krátkých dobách inkubace záleží na přesném okamžiku zahájení pokusu. Proto se při přidávání enzymu do reakční směsi pipety vyfukují, protože chyba v přidaném objemu je menší než chyba v době inkubace při pomalém přidávání enzymu. Enzymová reakce se zastavuje nejčastěji denaturací enzymu výraznou změnou ph nebo přidáním inhibitoru. Také mnohonásobným zředěním reakční směsi se sníží na minimum rychlost reakce. Není vhodné zastavovat enzymovou reakci povařením, zvláště u velmi aktivních enzymů. V krátkém období, než enzym tepelně denaturuje, probíhá reakce nekontrolovatelnou rychlostí. Proto také při pokusech s tepelně denaturovaným enzymem je třeba vždy zahřívat enzym bez substrátu. [P] t 1 Obrázek 3: Určování počáteční rychlosti enzymové reakce. t 6