Vliv polynenasycených mastných kyselin na zastoupení mastných kyselin ve tkáních a hladinu cholesterolu u potkanů

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Vliv polynenasycených mastných kyselin na zastoupení mastných kyselin ve tkáních a hladinu cholesterolu u potkanů Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Gabriela Zorníková, Ph.D. Vypracovala: Bc. Tereza Kácalová Brno 2014

2 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Vliv polynenasycených mastných kyselin na zastoupení mastných kyselin ve tkáních a hladinu cholesterolu u potkanů vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.. podpis

3 PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat všem, kteří přispěli a pomohli mi při řešení mé diplomové práce. V první řadě vedoucí práce Ing. Gabriele Zorníkové, Ph.D., za spolupráci a cenné rady, Ing. Veronice Rozíkové za pomoc při analýzách vzorků a celkovou podporu při řešení této práce. Poděkování patří mé rodině a přátelům, kteří mi byli oporou během mých studentských let.

4 VLIV POLYNENASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN NA ZASTOUPENÍ MASTNÝCH KYSELIN VE TKÁNÍCH A HLADINU CHOLESTEROLU U POTKANŮ ABSTRAKT Cílem práce bylo prokázat příznivý vliv n-3 polynenasycených mastných kyselin EPA a DHA na koncentraci plasmatických triacylglycerolů a cholesterolu. Podle hypotézy jsou tyto polynenasycené mastné kyseliny schopny snižovat plasmatický cholesterol na základě mechanismu, kde dochází ke zvýšení exprese genu Insig-1 a současně se snižuje exprese genů kódujících enzym pro syntézu cholesterolu (3-hydroxy-3-metylglutaryl- CoA reduktáza; gen HMG-CoA-R) a genu pro LDL-receptor, který je zodpovědný za vstup cholesterolu z plasmy do buněk (receptor lipoproteinů nízké hustoty; gen LDL- R). Pokus probíhal na modelových zvířatech (Rattus norvegicus) krmených standardní krmnou směsí s přídavkem 3 % lososového oleje, 6 % rybího oleje a 6 % oleje z řasy rodu Schizochytrium. Kontrolní skupina byla krmena krmnou směsí s přídavkem 6% oleje světice barvířské, krmivo s přídavkem 3% palmového oleje sloužilo jako negativní kontrola. Každá skupina se skládala z 10 zvířat. Z odebraných vzorků krve byla stanovena hladina celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a triacylglycerolů. Obsah mastných kyselin byl stanovován ve svalové, jaterní a tukové tkáni. Krmivo obohacené o kyselinu eikosapentaenovou a dokosahexaenovou vedlo ke snížení celkového cholesterolu a LDL-cholesterolu v krvi. Byl prokázán (P < 0,05), po přidání rybího oleje, lososového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium do krmné směsi pokusných potkanů, pokles celkového cholesterolu (o 27%, 21%, 27% v tomto pořadí) oproti kontrole. Naším pokusem jsme částečně potvrdili předpokládanou hypotézu. Současně jsme zjistili, že metabolismus plasmatických lipidů ovlivňuje jiný mechanismus, než jsme se domnívali. Klíčová slova: Polynenasycené mastné kyseliny, Dokosahexaenová kyselina, Eikosapentaenová kyselina, Exprese genů, Cholesterol, Ateroskleróza

5 THE INFLUENCE OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS ON REPRESENTATION OF FATTY ACIDS IN TISSUE AND CHO- LESTEROL LEVELS IN RAT ABSTRACT The aim of this work was demonstrate positive effect of n-3 polyunsaturated fatty acids EPA and DHA on the concentration of plasma triglycerides and cholesterol. According to the hypothesis, these polyunsaturated fatty acids are capable of reducing plasma cholesterol in mechanism, where is increased gene expression Insig-1 and simultaneously reduces the expression of genes encoding an enzyme for cholesterol synthesis (3- hydroxy-3-methylglutaryl-coa reductase, a gene for HMG-CoA-R) and the gene for the LDL receptor, which is responsible for the entry of cholesterol from the plasma into the cells (low density lipoprotein receptor, the density, the LDL-R gene). LDL-R.The experiment was conducted on a model animal (Rattus norvegicus) fed with a standard feed mixture with the addition of 3% of salmon oil, fish oil 6% and 6% of oil from algae of the genus Schizochytrium. The control group was fed a feed mixture with the addition of 6% safflower oil, food with the addition of 3% palm oil was used as a negative control. Each group consisted of 10 animals. From the blood samples was determined levels of total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol and triglycerides. The fatty acid content was determined in muscle, liver and adipose tissue. Food enriched with eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid led to a reduction in total cholesterol and LDL-cholesterol levels. It was shown (P <0.05) after the addition of fish oil, salmon oil and algae of the genus Schizochytrium oil to feed mixtures of experimental rats, a decrease in total cholesterol (27%, 21%, 27% respectively) relative to controls. Our attempt partially confirmed the hypothesis. At the same time, we found that plasma lipid metabolism affects different mechanism than we thought. Keywords: Polyunsaturated fatty acids, Docosahexaenoic acid, Eicosapentaenoic acid, Gene expression, Cholesterol, Atherosclerosis

6 Obsah 1 Úvod Cíl práce Literární přehled Lipidy Funkce lipidů Rozdělení lipidů Mastné kyseliny Rozdělení mastných kyselin Nasycené mastné kyseliny Mononenasycené mastné kyseliny Polynenasycené mastné kyseliny Zdroje mastných kyselin PUFA a zdraví Metabolismus mastných kyselin Zdroje mastných kyselin Steroly Cholesterol Funkce cholesterolu Transport cholesterolu v organismu Lipoproteiny Receptory LDL receptor Metabolismus lipidů a mastných kyselin Exprese genů Molekulární biologie-kvantifikace genové exprese RT PCR... 31

7 3.7.2 Real-time PCR Onemocnění Ateroskleróza Dyslipoproteinémie Materiál a metodika Zvířata a strava Použité chemikálie Použité nástroje Stanovení cholesterolu Stanovení HDL cholesterolu, LDL cholesterolu, celkového cholesterolu a TAG Stanovení mastných kyselin Příprava vzorků Extrakce tuku Derivatizace Měření mastných kyselin na plynovém chromatografu Stanovení cholesterolu Statistické vyhodnocení Výsledky práce a diskuze Hmotnost zvířat a příjem krmiva Vliv krmiva na obsah kyseliny linolové ve tkáních Vliv krmiva na obsah kyseliny α-linolenové ve tkáních Vliv krmiva na obsah EPA ve tkáních Vliv krmiva na obsah DHA ve tkáních Celkový cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol a TAG Závěr Seznam použitých zdrojů... 65

8 8 Seznam tabulek Seznam obrázků Seznam příloh Seznam zkratek Přílohy... 76

9 1 ÚVOD Protektivní vliv a význam mastných kyselin s dlouhými řetězci a několika nasycenými vazbami je dlouhodobě známý. Souvislost mezi deficiencí esenciálních mastných kyselin a ranějším nástupem příznaků především kardiovaskulárních onemocnění je prokazatelná. Mastné kyseliny mají důležitou roli jak v buňkách, tak i v celých organismech. Jsou důležitými komponenty biologických membrán, které slouží k udržení jejich struktury a funkce. Ve formě triacylglycerolů jsou zdrojem energie. Jejich celkový význam je popsán v této práci. Hlavně polynenasycené mastné kyseliny sehrávají důležitou roli v řadě biologických procesů. V mé práci jsem se zaměřila na vliv stravy a jejich konkrétních nutrientů na homeostázu cholesterolu a lipidů. Tento poměrně nový obor, nutrigenomika, zkoumá vztah mezi genetickou informací daného organismu a látkou přijímanou v potravě. Tato individuální reakce genomu (transkriptomu) a nutrientu vede k ovlivnění genové exprese. Práce se věnuje možnosti ovlivnění homeostázy cholesterolu a plasmatických lipidů pomocí různých příměsí polynenasycených mastných kyselin ve formě olejů do stravy. Jde především o PUFA n-3, jejichž zdrojem je hlavně rybí tuk, tučné mořské ryby a živočichové, protože je prokázan vliv konzumace mořských živočichů na množství a složení lipidů v organismu. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je charakterizovat vlastnosti PUFA jako transkripčních faktorů při expresi genů ovlivňujících metabolismus cholesterolu, charakterizovat funkce PUFA v lidském organismu a zhodnotit jejich zdravotní aspekty. Ze získaných poznatků pak sestavit literární rešerši. Podílet se na krmném pokusu modelových zvířat, odběrech a zpracování vzorků. Dále analyzovat mastné kyseliny vybraných tkání modelových zvířat a plasmatický cholesterol. Na závěr výsledky statisticky porovnat a vyvodit závěry. Cílem práce je potvrdit hypotézu o vlivu EPA a DHA na hladinu cholesterolu. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Lipidy Lipidy se řadí mezi makronutrienty, spolu s proteiny a sacharidy. Jsou to ve vodě velmi málo rozpustné organické sloučeniny (Svačina, 2008). Lipidy jsou látky rostlinného nebo živočišného původu a vyskytují se v kapalné i pevné formě. Poskytují substrát pro energetický metabolismus, mají stavební funkci jakožto součást buněčných membrán, fungují jako signální molekuly a regulují genovou expresi (Jump et al., 2005). V porovnání se sacharidy a proteiny mají téměř dvojnásobnou energetickou denzitu (39,5 kj/g tuku), tím přispívají ke zvyšování celkové přijaté energie ve stravě. U pokrmů zvyšují chutnost, ovlivňují vůni a konzistenci. Usnadňují vstřebávání vitaminů rozpustných v tucích (Svačina, 2008). Vitaminy rozpustné v tucích (A, D, E, K) jsou nezbytné pro normální fyziologii a metabolismus organismu. Vitamin A (retinol) je esenciální nutrient potřebný v malém množství. Je důležitý pro celkový růst a vývoj organismu, přispívá k dobrému stavu epitelových buněk, pozitivně ovlivňuje zrak, imunitní systém a má pozitivní vliv na reprodukční systém. Vitamin A se tvoří z provitaminu A, karotenoidů. Vitamin D je potřebný k udržení normální hladiny vápníku a fosforu, které jsou zase nezbytné pro normální mineralizaci kostí. Hraje důležitou roli při svalové kontrakci, nervovém vedení a obecně při funkcích ve všech buňkách těla. Vitamin D rovněž moduluje transkripci proteinů buněčného cyklu, které snižují proliferaci buněk a zvyšuje diferenciaci specializovaných buněk těla (např. osteoklasty, enterocyty). Vitamin E (tokoferol) je hlavní v tucích rozpustný antioxidant, důležitý v obranném antioxidačním systému buňky. Vitamin K je nezbytný pro fungování proteinů podílejících se na srážení krve, v procesu mineralizace kostí, buněčného růstu a metabolismu proteinů cévní stěny (FAO, 2004). Doporučení týkající se příjmu dietárního tuku přiklánějí ke snížení celkového množství tuku na hodnotu % z celkově přijatých kalorií. Doporučení pro příjem nasycených tuku se pohybuje v rozmezí 6 9 % (German, 2004). V současnosti je přísun tuků ve stravě 37 % z celkového energetického přísunu (Stránský, 2006). Pokud chceme posoudit přínos nebo negativní dopad příjmu tuků v potravě, je důležité rozlišovat druh tuku a složení. Pokud jsou přítomny nasycené mastné kyseliny, jsou posuzovány jako negativní, protože vedou ke zvýšení hladiny cholesterolu v séru a zvyšují riziko kardiovaskulárních onemocnění. Mononenasycené mastné kyseliny mo- 11

12 hou mít pozitivní vliv na profil lipidů v séru, vést ke snížení oxidace LDL cholesterolu a příznivě ovlivňovat metabolismus diabetiků. Příjem polynenasycených mastných kyselin je třeba zvýšit. Důležitý je také poměr jednotlivých mastných kyselin, a to okolo 5:1 (n-6 : n-3) (Wahrburg, 2004). Hlavní složkou lipidů jsou triacylglyceroly (TAG). Tvoří je mastné kyseliny (MK) esterově vázané na glycerol. Jsou kumulovány ve speciálních buňkách, adipocytech. V potravě zaujímají hlavní část přijímaných tuků. Štěpením se z nich uvolňují volné MK, monoacylglyceroly a v menší míře monoacylfosfolipidy (Svačina, 2008) Funkce lipidů Mezi hlavní biologické funkce lipidů patří přítomnost v membránách živočišných buněk, jejichž jsou strukturální součástí a ovlivňují jejich vlastnosti. Uplatňují se při syntéze steroidních hormonů a lipoproteinů. Jsou jedním z nejdůležitějších energetických zdrojů a rezervoárem energie. Lipidy v podkožní tukové tkáni přispívají k regulaci tělesné teploty, tvoří přirozenou izolaci (Soška, 2001). Prostaglandiny jsou biologicky aktivní lipidy, které se uplatňují při zánětech a zraněních tkání. Patří do skupiny eicosanoidních hormonů a jsou syntetizovány s kyseliny arachidonové (Eilati, 2013). Membránové lipidy hrají důležitou roli v signalizačních reakcích. Jsou zapojeny ve většině buněčných signalizačních kaskád. Membránové lipidy tvoří prekurzory pro buněčné posly. Lipidy se uplatňují jako signální molekuly. Jsou to steroidy (kortisol, progesteron, estradiol), thyroxin, kyselina retinová (Fernandis, Wenk, 2007). Vztah mezi obsahem tuku a senzorickými parametry je nezanedbatelný. Tuk má vliv na řadu parametrů, jako je chuť, vůně, vzhled, šťavnatost, textura, stabilita emulzí, konzistence nebo viskozita. Tuk dodává stravě jemnost a příjemnost při žvýkání a polykání. Vynechání tuků z receptury potravin a pokrmů vede ke zhoršení celkových organoleptických vlastností (Ritzoulis et al., 2009) Rozdělení lipidů TAG se dělí podle počtu uhlíků v lineárním řetězci, nejčastěji jsou s uhlíky. Dále se rozdělují dle nasycenosti řetězce na nasycené - NMK (neobsahují dvojnou vazbu), mononenasycené - MMK (s jednou dvojnou vazbou) a polynenasycené mastné 12

13 kyseliny PMK (s více dvojnými vazbami). Počet uhlíků v řetězci a nasycenost MK v TAG podmiňuje jejich fyzikální vlastnosti (Svačina, 2008). Lipidy se dělí na jednoduché (homolipidy) a složené lipidy (heterolipidy). Homolipidy tvoří dvě podskupiny. Jedná se o tuky a oleje, které jsou estery vyšších karboxylových kyselin a trojmocného alkoholu glycerolu. Druhou skupinou jsou vosky, estery vyšších alifatických kyselin a alkoholů. Heterolipidy mají v molekule nelipidovou složku. Jedná se například o fosfolipidy s kyselinou fosforečnou, glykolipidy obsahující sacharidy a lipoproteiny s navázanými proteiny (Velíšek, 2009). 3.2 Mastné kyseliny Mastné kyseliny jsou ve výživě člověka nejvýznamnější složkou lipidů. Názvosloví používané v organické chemii popisuje mastné kyseliny jako karboxylové kyseliny s alifatickým uhlovodíkovým řetězcem. Uvedená definice však úplně nekoreluje s mastnými kyselinami přítomnými v lipidech, protože ty mohou být cyklické nebo aromatické sloučeniny. Řetězec zakončený karboxylovou skupinou (-COOH) dává mastným kyselinám schopnost rozpouštět se v organických rozpouštědlech, tuto vlastnost mají všechny lipidy. Skupina -COOH je kyselá a má schopnost odštěpovat vodíkové ionty. Podle konformace dané dvojnou vazbou se nenasycené mastné kyseliny vyskytují ve dvou izomerních formách (cis a trans). U cis formy dochází k ohybu řetězce. Přírodní nenasycené mastné kyseliny se v absolutní většině vyskytují v konfiguraci cis. Přírodní kyseliny s trans konfigurací se nacházejí v depotním tuku přežvýkavců. Vznikají průmyslovou hydrogenací nenasycených mastných kyselin, proto se mohou vyskytovat ve ztužených tucích (Velíšek, 2009). MK jsou uchovávány ve formě TAG. Po lipolýze se uvolňují volné MK a jsou transportovány do místa využití, například do jater, srdce, svalů (Češka, 2012). V krvi jsou transportovány jako komplex s albuminem (Soška, 2001). Mastné kyseliny jsou jednou zá základních molekul využívaných jako zdroj energie, řídí a regulují metabolické reakce. Zpracování mastných kyselin se odehrává v játrech (Lottenberg et al., 2012). Doporučená struktura přijímaných tuků v závislosti na složení mastných kyselin je zobrazena v tabulce 1. 13

14 Tab. 1 Doporučený příjem mastných kyselin ve stravě (Urbanová, 2010) Denní podíl Mastné kyseliny Zdroje 10 % % 8-10 % nenasycené MK: kys. palmitová kys. stearová monoenové MK řady n-9: kys. palmitolejová kys. olejová polyenové MK řady n-6: kys. linolová kys. γ-linolenová kys. arachidonová polyenové MK řady n-3: kys. α-linolenová EPA DHA sádlo, lůj, máslo, hydrogenované oleje, některé margaríny olivový olej, avokádo, mandle slunečnicová, řepkový a kukuřičný olej, některé margaríny rybí tuk, výrobky z mořských ryb a živočichů, lněné semínka, sója ořechy Doporučený denní příjem n-3 MK se pohybuje od 200 mg do 1 g EPA a DHA denně (Kirkhus et al., 2011). NMK a MMK jsou v těle syntetizovány z acetyl-koenzymu A, a proto nemusí být ve výživě nutně zastoupeny (Svačina, 2008). Nepostradatelné jsou naopak PMK. Patří mezi ně kyselina linolová (C18:2; n-6) a kyselina α-linolenová (C18:3; n-3). V organismu se z těchto kyselin tvoří kyselina arachidonová (C20:4; n-6), kyselina eikosapentaenová EPA (C20:5; n-3) a kyselina dokosahexaenová DHA (C22:6; n- 3). Pokud je ve stravě snížený příjem prekurzorů těchto kyselin, stávají se esenciálními (Kouba, Mourot, 2011). Koncentrace celkového cholesterolu v séru se pohybuje od 2,9 do 5,0 mmol/l. Při zvýšené koncentraci roste riziko aterosklerózy. Doporučená koncentrace LDLcholesterolu by měla být dle současných doporučení menší než 3,0 mmol/l (respektive 1,2-3,0 mmol/l). Koncentrace HDL-cholesterolu by se měla pohybovat nad 1,0 mmol/l u mužů a nad 1,2 mmol/l u žen. Zvýšená koncentrace se považuje za tzv. negativní rizikový faktor rozvoje aterosklerózy. Nižší hladina je spojena se zvýšením rizika kardiovaskulárních onemocnění (Skalská, 2011). 14

15 3.2.1 Rozdělení mastných kyselin Mastné kyseliny se dělí podle různých parametrů. Dle nasycenosti řetězce dělíme MK na nasycené, mononenasycené a polynenasycené Z hlediska délky řetězce se dělí na MK s krátkým řetězcem (do 6 atomů uhlíku), se středně dlouhým řetězcem (6-12 atomů uhlíku), s dlouhým řetězcem (14-20 atomů uhlíku), s velmi dlouhým řetězcem (více než 20 atomů uhlíku). Ukázka nasycenosti mastných kyselin je na obrázku 1. Obr. 1 Přehled různých typů mastných kyselin (Chatgilialoglu, Rerreri, 2010) MK se nacházejí ve všech organismech jako estery s glycerolem, cholesterolem a sfingosinem. Vyskytují se také v neesterifikované formě jako volné MK (Ganong, 2005). V organismu zastupují důležité fyziologické úlohy. Ve formě TAG jsou základním zdrojem metabolické energie, fungují jako tepelné a mechanické izolátory, jsou obsaženy v chemické struktuře buněčných membrán a druhých poslů. Jsou prekurzory eikosanoidů a substrátem pro lipooxidaci. Zajišťují buněčnou signalizaci při genové expresi, jsou ligandy receptorů (Žák, Macášek, 2001) Nasycené mastné kyseliny Nasycené MK jsou charakteristické tím, že ve svém řetězci neobsahují žádnou dvojnou vazbu. Jejich výskyt a počet uhlíků shrnuje tabulka 2. 15

16 Tab. 2 Přehled nasycených mastných kyselin (Kraml, 2008) Triviální název Počet uhlíků Zkratka Výskyt kys. propionová C3 3:0 kys. máselná C4 4:0 kys. valerová C5 5:0 kys. kapronová C6 6:0 kys. kaprylová C8 8:0 kys. kaprinová C10 10:0 kys. octová C2 2:0 produkty trávení sacharidů v bachoru přežvýkavců, v tlustém střevě člověka produkty trávení sacharidů v bachoru přežvýkavců, částečně v másle a jiných tucích v řadě tuků, zvláště rostlinného původu, v másle kys. laurová C12 12:0 kokosový olej, vorvaňovina kys. myristová C14 14:0 kokosový olej kys. palmitová C16 16:0 kys. stearová C18 18:0 živočišné a rostlinné tuky kys. arachová C20 20:0 podzemnicový olej kys. behenová C22 22:0 semena rostlin kys. lignocerová C24 24:0 podzemnicový olej Mononenasycené mastné kyseliny Mononenasycené MK obsahují ve svém řetězci jednu dvojnou vazbu. Poloha dvojných vazeb se označuje dvěma způsoby. První způsob je značení od uhlíku karboxylové skupiny. Zde se používá řecké písmeno Δ (delta), za ním následuje číslo uhlíku, od kterého začíná dvojná vazba. Druhým způsobem je označení od methylové skupiny, používá se řecké písmeno ω s číslicí uhlíku první dvojné vazby (Kraml, 2008). Mastné kyseliny významné z hlediska humánní výživy a metabolismu jsou uvedeny v tabulce 3. Tab. 3 Mononenasycené mastné kyseliny (Krampl, 2008) Triviální název Zkratka Třída Výskyt kys. palmitolejová Δ9; 16:1 ω7 ve všech tucích kys. olejová Δ9; 18:1 ω9 olivový olej, řepkový olej kys. eruková Δ13; 22:1 ω9 (erukový řepkový olej), hořčičný olej Nenasycené mastné kyseliny obsahující dvojnou vazbu v řetězci mají výrazně nižší bod tání než nasycené mastné kyseliny. Většina nenasycených MK jsou viskózní kapaliny (Velíšek, 2009). 16

17 3.2.4 Polynenasycené mastné kyseliny Polynenasycené mastné kyseliny (PUFA, polyunsaturated fatty acids) mají ve svém řetězci více než jednu dvojnou vazbu. Mají nepostradatelnou roli ve vývoji i funkci mozku a sítnice oka (Carbonera et al., 2014). Velmi důležitý je dostatek PUFA v průběhu vývoje centrálního nervového systému (Mulder et al., 2014). V membránách buněk ovlivňují jejich fluiditu, podílí se na celé řadě membránových procesů, plní funkci membránových receptorů, přenašečů, enzymů a iontových kanálů. PUFA regulují expresi různých genů na úrovni transkripčních faktorů. Hrají důležitou roli v procesu neurotransmise a signální transdukce v mozkové tkáni. PUFA fungují jako prekurzory pro syntézu eikosanoidů, proto zasahují do procesu zánětlivých a imunitních reakcí (Klusáčková, Skoumalová, 2012). Kyselina linolová (LA) a kyselina α-linolenová (ALA) jsou metabolizovány stejnými enzymy, a to elongásami a desaturásami. Kyselina eikosapentaenová (EPA) je odvozena od ALA a kyselina arachidonová od LA. Tyto MK jsou dále přetvářeny enzymy cyklooxygenásou a lipooxygenásou. Eikosanoidy (prostaglandiny, tromboxany a leukotrieny) odvozené od kyseliny arachidonové vykazují prozánětlivé účinky. Eikosanoidy odvozené od EPA působí v mnoha případech pozitivně (Komprda, 2012). Přeměna dietární ALA na EPA je limitována. LA redukuje syntézu EPA, protože LA a ALA mají společné enzymy desaturásu a elongásu, a proto si konkurují (Goyens, 2006). Přehled důležitých mastných kyselin je zobrazen na obrázku 2. 17

18 Obr. 2 Přehled některých polynenasycených mastných kyselin (Evolutionary Health Perspective, 2012) Zdroje mastných kyselin Obsah mastných kyselin a spektrum v tukové složce potravin hraje důležitou roli v prevenci kardiovaskulárních onemocnění. V potravě jsou ve formě esterifikované nebo jako volné MK (Mourek, 2007). Tabulka 4 udává nejčastější výskyt PUFA. Tab. 4 Polynenasycené mastné kyseliny (Krampl, 2008) Triviální název Zkratka Třída Výskyt kys. linolová Δ9, 12; 18:2 ω6 kys. α-linolenová Δ9, 12, 15; 18:3 ω3 kys. γ-linolenová Δ6, 9, 12; 18:3 ω3 kys. arachidonová kys. timnodová (EPA) kys. klupanodonová kys. cervonová (DHA) Δ5, 8, 11, 14; 20:4 Δ5, 8, 11, 14, 17; 20:5 Δ7, 10, 13, 16, 19; 22:5 Δ4, 7, 10, 13, 16, 19; 22:6 ω6 ω3 ω3 ω3 řepkový, kukuřičný, podzemnicový a sójový olej řepkový, lněný, kukuřičný, podzemnicový a sójový olej pupalkový olej, některé rostlinné oleje, v malém množství v živočišných tucích podzemnicový, kukuřičný a sójový olej, u živočichů součást fosfolipidů rybí tuk, vejce rybí tuk, vejce, fosfolipidy mozku rybí tuk, fosfolipidy mozku 18

19 3.2.6 PUFA a zdraví Předpokládá se, že n-3 MK snižují riziko kardiovaskulárních onemocnění prostřednictvím široké škály blahodárných účinků. Jedná se o antiaterotrombogenní efekt a snížení sérových TAG. Naskytují se některé nesrovnalosti týkající se účinků na arytmie, hypertenzi a zánět. n-3 MK jsou náchylné k oxidaci, což může vést ke zvýšené náchylnosti k oxidaci a aterogenitě LDL-cholesterolu. Zvyšuje se tak riziko kardiovaskulárních onemocnění. Rovněž vysoké hladiny isoprostanů, tvořené z volných radikálů indukovaných peroxidací kyseliny arachidonové, byly spojeny s vyšším kardiovaskulárním rizikem. Role n-3 MK, ve spojitosti s oxidačním stresem je nejasná (Kirkhus et al., 2011). Strava bohatá na n-3 MK má chemopreventivní účinky. Tento efekt se uplatňuje například při léčbě rakoviny prsu (Manni et al., 2014). Největší podíl těchto kyselin je získáván z potravin rostlinného původu. Kyselina linolová v dávce pod 1-2 % celkově přijaté energie (tj. menší příjem než 2-5 g/den) způsobuje suchost kůže a zhoršené hojení ran. Doporučené množství PUFA ve stravě je do 10 % celkové denní energie. U kyseliny linolové je to 2-3 % denně u dospělého člověka (tj. 1-2 % celkové denní energie) a u dětí 0,2 g/kg (tj. 2,7 % celkové denní energie) (Svačina, 2008). Je doporučeno konzumovat ryby nejméně dvakrát týdně, což je ekvivalent příjmu mg EPA a DHA za den (1g EPA+DHA denně u pacientů trpících kardiovaskulárním onemocněním) (Greene, 2013). Deficit esenciálních MK vede ke změnám skladby lipidů v tkáních a buněčných membránách, dochází ke snižování mitochondriální oxidace MK. Všechny jsou polynenasycené a patří zde kyselina linolová a α-linolenová. Je zde řazena i kyselina arachidonová, která je prekurzorem eikosanoidů (Krampl, 2008). Tyto esenciální mastné kyseliny mají nezastupitelnou úlohu v lidském organismu jako prekurzory biologicky aktivních látek (eikosanoidy) a také jako modulační složky biologických membrán. Mezi eikosanoidy se řadí prostaglandiny, leukotrieny, prostacykliny, thromboxany a lipoxiny. Uplatňují se při vasokonstrikci, vasodilataci, regulaci krevního tlaku a srážení krve, regulují funkci leukocytů. Kyselina arachidonová se uplatňuje při jejich vzniku (Velíšek, 2009). Některé eikosanoidy působí prozánětlivě, antitromboticky a také proti vysokému krevnímu tlaku a stavům arytmie (Carbonera et al., 2014). Polynenasycené n-3 MK mají schopnost snižovat viskozitu krve, redukují agregaci trombocytů (Mourek, 2007). 19

20 Zdrojem n-3 nenasycených mastných kyselin je zelenina a rostlinné oleje (Greene, 2013). Zdrojem EPA a DHA je zejména rybí tuk (Mulder et al., 2014). Strava bohatá na kyselinu linolovou může zvýšit riziko kardiovaskulárních onemocnění, diabetes 2. typu nebo některých druhů rakoviny. Nevyvážený poměr PUFA (n-6:n-3) zvyšuje riziko těchto onemocnění (Komprda, 2012) Metabolismus mastných kyselin V lidském organismu se kyselina linolová a α-linolenová prodlužují o 2 atomy uhlíku (resp. 6). Tento proces je katalyzován elongasami. Vytváří se další dvojné vazby pomocí desatusas a vznikají mastné kyseliny s atomy uhlíku a obsahují 3-6 dvojných vazeb v molekule. V organismu člověka se mastné kyseliny nejčastěji odbourávají β-oxidací. Z molekuly se postupně odštěpuje acetyl-coa, řetězec se zkracuje o 2 atomy uhlíku. (Velíšek, 2009). Schéma metabolismu ω-3 a ω-6 mastných kyselin je na obrázku 3. Obr. 3 Metabolismus ω-3 a ω-6 mastných kyselin (zpracováno podle Velíška, 2009) 20

21 3.2.8 Zdroje mastných kyselin V poslední době vzrůstá zájem o rybí olej pro možné výhody v prevence kardiovaskulárních chorob (Greene, 2013). Rybí olej obsahuje velké množství kyseliny eikosapentaenové (EPA) a dokosahexaenové (DHA), řadí se k významným nutriceutikům díky schopnosti snižovat riziko kardiovaskulárních onemocnění, antihypertenzivním a vazodilatačním účinkům (Mourek, 2007). Rovněž mají schopnost snižovat shlukování krevních destiček a snižovat celkové TAG. Množství EPA a DHA je proměnlivé v závislosti na druhu ryb, prostředí a krmivu. Tučné ryby jako je losos, sleď nebo makrela obsahují nejvyšší množství těchto mastných kyselin (Greene, 2013). Jako zdroj mastných kyselin lze použít olej světlice barvířská (Carthamus tinctorius), jednoletá bodlákovitá rostlina z čeledi hvězdicovitých. Plodem je nažka, která obsahuje 25 až 40 % oleje s vysokým obsahem esenciálních kyselin. Loupaná semena obsahují % oleje (Flider, 2013). Semena podle odrůdy obsahují velký podíl kyseliny linolové nebo olejové (typ linolový, olejový), který má široké využití. Světlice nalézá uplatnění v chemickém průmyslu, v potravinářském a textilním průmyslu, farmacii a humánní výživě (Strašil, Hofbauer, 2007). Uplatnění v lidské stravě má především ve studené kuchyni. Kvůli vysokému obsahu kyseliny linolové (kolem 80 % u značné části odrůd) není vhodný pro tepelnou úpravu. Světlice barvířská je perspektivní alternativní plodina zejména při zaměření na plnohodnotné potraviny a na obsah esenciálních mastných kyselin (Strašil, Hofbauer, 2007). Olej z řasy Schizochytrium se vyznačuje vysokým obsahem n-3 nenasycených mastných kyselin, která se v běžné potravě nachází v mořských rybách a v mořských řasách (Patočka et al., 2011). Olej z mikrořas Schizochytrium je bohatý na DHA, obsah této mastné kyseliny se pohybuje nad 22 % a EPA nad 10 %. Použití oleje v potravinářství je různé, přidává se například do doplňků stravy, dietních potravin pro zvláštní léčebné účely, pekárenských výrobků, sušenek, snídaňových cereálií, dále do potravinářských tuků, obilných energetických tyčinek nebo roztíratelných tuků a zálivek (Gray, 2012). Olej obsahuje i další nasycené mastné kyseliny, včetně kyseliny myristové, palmitové a stearové (Zhang et al., 2013). Palmový olej se získává z oplodí palmy olejné (Elaeis guineensis). Řadí se k nejběžnějším a nejpoužívanějším rostlinným olejům. Ze všech rostlinných olejů má nejvyšší podíl nasycených mastných kyselin. Hlavními složkami jsou kyselina laurová a 21

22 kyselina palmitová. V potravinářství je využíván pro vhodné technologické vlastnosti. Za pokojové teploty se neroztéká, nepodléhá oxidaci tak rychle jako jiné oleje, má delší trvanlivost, snáší vysoké teploty, nepřepaluje se. Bývá obsažen ve směsných stolních olejích, margarínech, sušenkách, čokoládě, instantních polévkách a v dalších potravinách (Bačíková, 2013). 3.3 Steroly Steroly se dělí na kategorie podle výskytu v přírodě na živočišné, rostlinné a steroly hub. Steroly v potravinách živočišného původu jsou ve formě cholesterolu (Svačina, 2008) Cholesterol Cholesterol je primární sloučenina živočišné buňky. Zdrojem je buď strava (exogenní původ) nebo dochází k jeho syntéze organismem (endogenní původ) respektive v živočišných buňkách. K syntéze dochází především v hepatocytech, enterocytech a nervové tkáni. Biosyntéza cholesterolu vychází z dvouuhlíkatých štěpů (acetyl-coa) a skládá se z několika kroků, při kterých se uplatňuje enzym 3-hydroxymethyl-3-glutarylkoenzym A reduktáza (3-HMGCoA). Aktivita tohoto enzymu se mění v závislosti jeho množství v buňce. Snižuje se při dostatku cholesterolu v buňce. Aktivita naopak stoupá při úbytku či nedostatku cholesterolu, ale i při vysokoenergetické dietě a obezitě (Soška, 2001). Cholesterol inhibuje vlastní syntézu blokováním enzymu HMG-CoA reduktázy, dochází k přeměně na mevalovou kyselinu. Pokud je zvýšený obsah cholesterolu ve stravě, poklesne syntéza cholesterolu v játrech a naopak. Zpětný mechanismus však není dokonalý. Strava s nízkým obsahem cholesterolu a nasycených tuků vede jen k mírnému snížení krevního cholesterolu (Ganong, 2005). Cholesterol je složen ze čtyř benzenových jader. V organismu se vyskytuje volný nebo esterifikovaný, a to s mastnou kyselinou navázanou na OH skupině (Češka, 2012). Z hlediska jejich fyzikálních vlastností je volný cholesterol částečně hydrofilní, díky neobsazené OH skupině, naopak esterifikovaný cholesterol je hydrofobní. Esterifikovaná forma cholesterolů je nezbytná pro transport a ukládání v buňkách (Soška, 2001). Struktura volného cholesterolu je zobrazena na obrázku 4. 22

23 Obr. 4 Volný cholesterol (Schmidt, 2013) Denní potřeba cholesterolu v lidském organismu se odhaduje na 1 g. Při smíšené stravě je polovina cholesterolu syntetizována a zbytek je přijímán stravou. Průměrný denní příjem je 500 mg za den. Doporučeno je snižovat příjem cholesterolu a to na 300 mg za den (Krampl, 2008). V tabulce 5 je uveden obsah cholesterolu v některých potravinách. Tab. 5 Cholesterol ve stravě (Krampl, 2008) Potravina Obsah cholesterolu v mg/100g Libové vepřové a hovězí maso Kuřecí a kachní maso 75 Husa a králík 65 Uzeniny (špekáčky, salámy, párky) Hovězí játra 270 Vepřové ledviny až 380 Kapr 70 Pstruh 55 Makrela 50 Tuňák v oleji 42 Sýry Máslo 240 Škvařené sádlo 94 Vejce 230 (1 kus) 23

24 3.3.2 Funkce cholesterolu Cholesterol je nezbytnou součástí membrán buněk a žlučových kyselin. Buňky žláz z něj vytvářejí steroidní hormony. Je to základní složka lipoproteinových komplexů, pomocí nichž je transportován a distribuován po organismu (Ganong, 2005). Na organismus má cholesterol i negativní dopad. U jedinců se zvýšenou hladinou cholesterolu v krvi se vyskytuje ateroskleróza a komplikace s ní spojené. Je prokázána závislost mezi zvýšenou hladinou cholesterolu a kardiovaskulárními onemocněními. Nejvýznamnější rizikový faktor je hypercholesterolemie (Češka, 2012). Za normální hladinu cholesterolu je považována hodnota v rozmezí mg/ml. Snížením plasmatické hladiny cholesterolu dietou a léky dochází ke zpomalení až ke zvrácení progrese aterosklerózy a souvisejících komplikací (Ganong, 2005). Uvádí se, že současný příjem cholesterolu se pohybuje okolo 600 mg za den, doporučuje se nepřesáhnout 300 mg (Stránský, 2006). Vláknina, rozpustná ve vodě (pektin, guar, β-glukany) snižuje zpětnou resorpci cholesterolu a žlučových kyselin v tenkém střevě. Tím dochází k poklesu hladiny cholesterolu v krvi. Strava s obsahem vlákniny nad 30 g za den snižuje nepřímo přísun tuků a energetickou hodnotu stravy (Stránský, 2006) Transport cholesterolu v organismu Tuk přijímaný potravou je ve formě volné nebo esterifikované. V trávicím traktu jsou tuky emulgovány pomocí žlučových kyselin a hydrolyzovány lipolytickými enzymy pankreatické šťávy. Směs natrávených lipidů a žlučových kyselin vytváří v tenkém střevě micely. Cholesterol je transportován skrz membránu enterocytů receptorovým mechanismem. V enterocytech je cholesterol reesterifikován. Asociací s bílkovinami se tvoří lipoproteinové částice. Cholesterol je spolu s fosfolipidy a triacylglyceroly přenášen pomocí těchto lipoproteinů (Lubanda, Vecka, 2009). 3.4 Lipoproteiny Veškeré tuky kromě volných mastných kyselin jsou v plazmě transportovány ve formě lipoproteinů. Lipoproteiny jsou částice, které se skládají z tuku a bílkovinné složky, alipoproteinu (Češka 2012). Struktura lipoproteinu je zobrazena na obrázku 5. 24

25 Obr. 5 Struktura lipoproteinu (Saba, Oridup, 2012) v tabulce 6. Přehled lipoproteinů a jejich biochemické a fyzikální vlastnosti jsou uvedeny Tab. 6 Lipoproteiny plazmy (Češka, 2012) Třída Chylomikrony VLDL IDL LDL HDL Hustota (g/ml) pod: 0,94 1,006 1,019 1,063 nad 1,21 Velikost (nm) Cholesterol (%) Triacylglyceroly (%) Fosfolipidy (%) Proteiny (%) Transport a metabolismus lipoproteinů v organismu začíná po příjmu potravy ve střevě. Tuk je ve formě chylomikronů. Cholesterol z potravy je transportován do jater ve formě chylomikronových zbytků, které vznikají při štěpení chylomikronů lipoproteinovou lipázou. Játra sekretují triacylglyceroly ve formě VLDL (very low density lipo- 25

26 proteins), které míří do mimojaterní tkáně, kde jsou metabolizovány. Z VLDL částic vznikají působením lipoproteinové lipázy IDL (intermediate density lipoproteins) a dalším štěpením LDL (low density lipoproteins) částice. HDL (high density lipoproteins) částice odebírají cholesterol z periferních tkání a transportují jej do jater (Kraml, 2008). 3.5 Receptory Receptory tvoří specifické glykoproteiny. Jsou zodpovědné za vazbu a interakci s lipoproteinovými částicemi. Díky nim se lipoproteinové částice dostávají z buněčné membrány do buňky a tím ovlivňují její metabolismus (Češka, 2012) LDL receptor Základní funkcí LDL receptoru je zajistit buňce dostatek cholesterolu. Ten je dále vyžit jako prekurzor pro žlučové kyseliny a steroidy nebo k syntéze membrán. Receptory se nachází například v játrech, periferní tkáni, méně pak v tukové tkáni (Češka, 2012). Na obrázku 6 je znázorněna interakce LDL-receptoru a LDL částice. Obr. 6 LDL receptor a interakce s LDL částicí (Brown, Goldstein, 2013) 26

27 LDL receptor je syntetizován buňkou při nedostatku cholesterolu v ní. Receptor migruje na povrch buňky a naváže LDL-lipoproteiny z krve. V buňce dojde k rozštěpení komplexu a LDL-receptor může znovu migrovat na povrch buňky (Soška, 2001). 3.6 Metabolismus lipidů a mastných kyselin Důležitou roli v regulaci genů hrají látky lipidové povahy. Navázáním určitých ligandů se aktivují receptory, dochází k vazbě na cílové geny a díky nim dochází k transkripci daného genu. Lipidy přijaté v potravě regulují genovou expresi kontrolou aktivity nebo množstvím klíčových transkripčních faktorů (Jump et al., 2005). Mezi transkripční faktory řadíme PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), SREBP (sterol regulatory element-binding protein), HNF-4α (hepatic nuclear factor 4α) a LXR (liver X faktor). MK ovlivňují hlavně jaderné receptory PPAR a SPEBP. Pro regulaci genů je významný hlavně příjem PUFA (Svačina, 2008) Exprese genů Exprese genů je transformace informací obsažených v DNA funkčních molekul. DNA takto řídí vývoj, aktivitu, fungování buněk a chování celých organismů. Genová exprese je komplexní a regulovaný proces, kterým se genetická informace uložená ve formě DNA přemění v konkrétní buněčné struktury. Výsledné produkty procesu exprese genů jsou molekuly proteinů nebo ribonukleové kyseliny (RNA). Exprese genů obecně zahrnuje transkripci, kdy se přepíše úsek DNA (gen) na mediátorovou RNA (mrna). Ta slouží jako matrice pro syntézu proteinů v procesu translace. Jednotlivé fáze jsou fyzicky izolovány, k transkripci dochází v jádře, k translaci v cytoplazmě buňky (Dziuda, 2010) Homeostáza cholesterolu Centrálním orgánem pro homeostázu cholesterolu jsou játra. Transkripční faktory po vazbě lipofilního ligandu změní konformaci a dojde k přímé vazbě na příslušný element DNA a následné ovlivnění genové exprese (Žák, Macášek, 2001). Kysela eikosapentaenová (EPA) i dokosahexaenové (DHA) patří mezi ligandy PPARα. Tím, že působí odlišně na transkripční faktor PPARα, mění se i aktivita tohoto 27

28 transkripčního faktoru. Podle hypotézy platí, že mastnou kyselinou aktivovaný transkripční faktor PPARα se naváže do promotoru genu Insig-1. Vzniklý protein INSIG-1 zadrží protein SREBP-2 v Golgiho aparátu. Takto dochází ke snížení exprese genů, které kódují enzym pro syntézu cholesterolu (3-hydroxy-3-metylglutaryl-CoA reduktáza; gen HMG-CoA-R). Tento proces vede ke snižování cholesterolu v krvi. Naopak ke zvýšení koncentrace cholesterolu v krvi dochází tím, že se snižuje exprese genu pro LDL-receptor, který je zodpovědný za vstup cholesterolu z plasmy do buněk (receptor lipoproteinů nízké hustoty; gen LDL-R). Tento mechanismu ovlivňuje hladiny plasmatického cholesterolu (Komprda, 2012). Mechanismus účinku je zachycen na obrázku 7. Obr. 7 Mechanismus účinku homeostázy cholesterolu (Komprda, 2012) 28

29 PPAR Peroxisome proliferator-activated receptors neboli receptory aktivované peroxizomovými proliferátory se vyskytují ve 3 druzích (PPARα, β, γ1 a γ2). Liší se různou biologickou funkcí a lokalizací (Žák, Macášek, 2001). Jsou podskupinou hormonálních receptorů transkripčních faktorů. Každý druh je kódován samostatným genem (Yahia, 2008). Jejich ligandy jsou MK, mezi endogenní ligandy patří PUFA (kys. linolenová, kys. arachidonová, EPA) a jejich metabolity, eikosanoidy. PPAR-α se vyskytují především v játrech, svalovině myokardu, kosterní svalovině a v ledvinách. Jejich funkcí je zvýšení vychytávání MK, snižování hladiny TAG a tvorba malých LDL částic a zvyšování hladiny HDL částic. PPARα regulují expresi genů kódujících enzymy pro proliferaci peroxisomů a oxidaci MK v peroxisomech a mitochondriích. Receptory působí na geny acyl-coa syntézy, karnitin palmitoyltransferázy a alipoproteinů (Yahia, 2008). Ve většině tkání jsou lokalizovány PPAR-β/δ, které zvyšují oxidaci MK. Předpokládá se, že snižují tvorbu malých LDL částic a hladinu TAG a zvyšují hladinu HDL. PPAR-γ se nejčastěji vyskytují v tkáni tukové, v kosterní svalovině, kolonu, v monocytech a makrofázích cévní stěny. Způsobují zvýšení ukládání MK v tukové tkáni, zvýšení diferenciace adipocytů, snížení glykémie, zvýšení inzulínové senzitivity. Předpokládá se, že zvyšují hladinu HDL a snižují hladinu TAG (Kraml, 2008). Struktura PPAR je tvořena třemi doménami. Jedna z domén se váže na úseky DNA PPRE (peroxisome proliferator responsivní element) nacházejících se na PPAR responzivních genech. Po navázání ligandu na receptor se mění jeho konformace, připojí se na specifickou oblast DNA a aktivuje se transkripce cílových genů. PPAR receptory jsou významné transkripční faktory, které fungují při kontrole metabolismu lipidů. Zvyšují katabolismus MK, zesilují β-oxidaci, navozují pokles syntézy apoproteinu, a tím dochází k poklesu sekrece TAG, VLDL a volných MK v krvi. Aktivací receptorů roste vychytávání volných MK buňkami, protože se zvyšuje aktivita transportního proteinu (FATP), translokázy MK (FAT) a acyl-coa-syntázy (ACS) na transkripční úrovni. PPAR stimulují oxidativní metabolismus MK v různých fázích a různých orgánech. Hlavně v játrech snižují množství MK použitelných při tvorbě a sekreci TAG a VLDL (Yahia, 2008). 29

30 SREBP SREBP (Sterol regulatory element-binding protein) funguje jako transkripční faktor a vyskytuje se v několika formách (SREBP -1a, SREBP-1c a SREBP-2). Uplatňuje se při kontrole syntézy cholesterolu a mastných kyselin. Princip mechanismu regulace genové transkripce zahrnuje kontrolu nad jejich jaderným množstvím. SREBP jsou syntetizovány jako prekurzory vázané v endoplasmatickém retikulu (ER) a doprovázeny do Golgiho aparátu pomocí SCAP (SREBP-cleavage activating protein), kde jsou proteolyticky zpracovávány. Poté jsou transportovány do jádra, kde se váží na promotor specifického genu a stimulují transkripci. Steroly indukují ER rezidentní proteiny, INSIG 1 (Insulin-induced gene 1 protein) a SCAP (SREBP-cleavage activating protein). Pokud je v buňce dostatek cholesterolu, komplex SCAP-SREBP zůstává zachován v ER a je zabráněno jeho štěpení. Takto dochází k potlačení syntézy cholesterolu. Při poklesu cholesterolu v buňce se INSIG 1 odštěpí z komplexu SREBP-SCAP a dochází k migraci tohoto komplexu z ER do Golgiho aparátu za přítomnosti transportního proteinu COP II. V Golgiho aparátu dochází působením proteas S1P a S2P (site 1 protease, site 2 protease) k štěpení komplexu SREBP-SCAP. Dimer je transportován do jádra pomocí Importin β. SREBP se v jádře váže na SRE genů. Jedná se hlavně o gen pro LDL receptor a HMG-CoA-reduktasu (Kraml, 2008). Mezi přirozené inhibitory působení SREBP patří cholesterol, steroly a mastné kyseliny (MUFA, PUFA). Fungují na základě regulace jejich dostupnosti a tím ovlivňují účinek v jádře (Worgall, 2001). 3.7 Molekulární biologie-kvantifikace genové exprese Pomocí biochemických a molekulárně biologických metod a analýz jsme schopni lépe chápat vliv jednotlivých složek stravy na lidský organismus. Nutrigenomika je obor, který poskytuje molekulárně genetické chápání toho, jak mohou složky stravy ovlivňovat zdraví. Dochází ke změně exprese nebo struktury genetické výbavy jedince (Kaput, Rodrigues, 2004). Zabývá se úlohou jednotlivých složek výživy, to znamená, že vlivem vhodné stravy se může ovlivnit charakter metabolismu organismu. Zabývá se porozuměním odpovědi organismu na přijímané látky. Poté můžeme hodnotit populaci či jedince podle individuální genové dispozice (genotyp) a v návaznosti na dané znaky (fenotyp) a vytvořit tzv. individuální výživu (Šeda et al., 2006). 30

31 Množství a složení stravy ovlivňuje nástup, průběh i léčbu některých onemocnění. Cílem nutrigenomiky je dosažení dietního režimu jedince tak, aby byly respektovány nejen kvantitativní a kvalitativní potřeby výživy, ale i zdravotní stav a genetické dispozice. Takto lze zabránit vzniku řady civilizačních onemocnění a pomoci při terapii (Rosická, 2011). V současnosti je využití této vědy pro preventivní a léčebná opatření nedostatečné. V budoucnu však může zásadně ovlivnit a individualizovat léčbu některých nemocí (Svačina, 2008). Enzymy jsou látky bílkovinné povahy s biokatalytickou funkcí. Vznikají v důsledku exprese genů. Působí na organismus, ovlivňují metabolismus, který je v rovnováze katabolických a anabolických dějů (Velíšek, 2009). Při vzniku enzymů dochází k převodu informace z DNA do proteinu daného enzymu. Exprese genů se skládá z transkripce, translace a z posttranskripční a posttranslační úpravy (Snustad, Simmons, 2009) RT PCR Reverzně transkripční polymerázová řetězová reakce je metoda, která je založená na detekci RNA a přepisu mrna do cdna reverzní (zpětnou) transkriptázou. Pomocí enzymu reverzní transkriptázy dochází k syntéze DNA, jejíž řetězce se transformují do dvoušroubovice několika způsoby. Jde o metodu tepelně stabilní Taq DNApolymerázy nebo použití druhého primeru. Pro metodu RT-PCR je typická vysoká citlivost. (Snustad, Simmons, 2009) Real-time PCR Metoda real-time RT-PCR umožňuje sledovat množství produktu vznikajícího v průběhu PCR po každém cyklu prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu. Tím se liší od klasické polymerázové řetězcové reakce, kde se vzniklý produkt detekuje až po ukončení reakce pomocí gelové elektroforézy (Šmarda, 2010). Real-time PCR se stala jednou z nejfrekventovanějších metod posledních let. Již po svém objevení se tato metoda stala široce využívanou, a to pro svou rychlost a citlivost. Real-time PCR nabízí možnost sledovat kinetiku amplifikace v reálném čase prostřednictvím akumulace a měření specifických fluorescenčních signálů v každém cyklu (Schefe et al., 2006). 31

32 Tato metoda je založena na detekci vazby fluorescenčního barviva. To vykazuje v roztoku jen malou fluorescenci, ale během elongace se stále větší množství barviva váže na vznikající dvoušroubovici DNA. Při monitorování v reálném čase to vede ke zvýšení fluorescenčního signálu a množství PCR produktu je přímo úměrné naměřené fluorescenci. Reakce probíhá v termocykléru vybaveném optikou, který naměřenou fluorescenci zaznamenává a hodnoty jsou zpracovány softwarem (Bustin, 2002). Graf této reakce ukazuje typickou PCR křivku, kde osa x představuje počet cyklů a osa y naměřenou fluorescenci. Amplifikační křivka má několik fází. V první (lag fázi) probíhá amplifikace, ale fluorescenční signál není měřitelný. V druhé fázi (log fázi) dochází k exponenciálnímu růstu PCR produktu, který je měřen jako fluorescenční signál. Ideálně dochází k zdvojnásobení PCR produktu během každého cyklu. V třetí fázi dochází ke zpomalení reakce vlivem inhibičních faktorů a ztráty enzymů a substrátu pro reakci. Při čtvrté (stacionární) fázi dojde k ustálení a nedochází k další amplifikaci. Pro real-time PCR analýzu je rozhodující druhá (log) fáze, při které je měřitelný exponenciální růst. Hodnota C T je definována jako dílčí počet cyklů, kdy je dosaženo prahové hodnoty fluorescence potřebné pro detekci. Hodnota C T je ovlivněna počátečním množstvím templátu. Čím nižší je množství templátu na počátku reakce, tím více cyklů je potřeba k dosažení detekovatelné fluorescence, tudíž se C T hodnota zvyšuje. Důležitým faktorem je vytvoření externí standardní křivky, a to provedením série ředění templátu. Standardní kalibrační křivka je sestavena vynesením ředícího faktoru (nebo logaritmu množství templátu) proti C T hodnotě ředění. Ředění je velmi citlivé na chyby při pipetování, které vedou ke zkreslení výsledků (Schefe, 2006). Kalibrační křivku často sestaví software i s korelačním koeficientem. Ten udává variabilitu mezi jednotlivými replikacemi, účinnost amplifikací u počátečních koncentrací templátu a chybu při ředění a pipetování (Dorac, 2006). Je možné použít křivku tání (melt-curve analysis) pro analýzu produktu PCR. Po ukončení PCR reakce se postupně zvyšuje teplota a současně je měřená fluorescence. S rostoucí teplotou nastává denaturace PCR produktů, to způsobuje pokles fluorescence. Hodnota fluorescence je zanesena do grafu jako funkce změny teploty. Vrcholy křivky znázorňují produkty PCR, charakteristické svou teplotou tání (Chapman et al., 2012). Používané substráty řadíme do dvou skupin. Jsou to substráty, které nespecificky vážou na dvouvláknovou DNA (SYBR Green) a specifické, mezi které patří sondy mající ve své struktuře oligonukleotidový řetězec, kterým se hybridizují k PCR amplikonu. 32

33 Pracují na principu FRET (fluorescence resonance energy transfer) mezi fluorescenčním barvivem (fluorofor - F nebo R) a zhášečem (quencher - Q). Tato metoda se používá k zabránění fluorescence próby nebo značeného oligonukleotidu před jejich specifickým navázáním při amplifikaci produktu. Nárůst fluorescenční aktivity je způsoben zvýšením vzdálenosti mezi molekulou R a Q po rozštípnutí navázané sondy polymerázou. Test TaqMan využívá značené sondy vážící se na cílový amplikon. Obvykle je využívána Taq polymeráza. Po ukončení reverzní transkripce je potřeba dodat specifické primery pro definici koncových bodů amplikonu. Specifické pro TaqMan test je použití oligonukleotidové sondy, která obsahuje fluorescenční reporterové barvivo na svém 5 konci a zhášeč fluorescence na 3 konci. Pokud není amplikon komplementární k sondě, sonda zůstává neporušená a bez detekované fluorescence (Mičuda, 2006). 3.8 Onemocnění Cholesterol je důležitou složkou organismu, ale jeho vysoká hladina je považována za hlavní rizikový faktor související s rozvojem aterosklerózy, ischemické choroby srdeční a dalších onemocnění. Vznik aterosklerózy a ischemické choroby srdeční se opírá o dvě hypotézy. První je hypotéza lipidová, kde je hlavní příčinou cholesterol a ukládáním lipidů v cévní stěně. Druhá hypotéza je teorie založena na reakci na defekt, kde jsou buňky poškozeny oxidovaným cholesterolem, a tím se iniciuje ateroskleróza a ischemická choroba srdeční (Hur et al., 2013) Ateroskleróza Ateroskleróza je jedno z nevýznamnějších civilizačních onemocnění. Je charakterizována postupným rozvojem degenerativních změn cévních stěn. Toto onemocnění je podporováno řadou rizikových faktorů jako jsou hyperlipidemie, kouření, diabetes, obezita, hypertenze, genetická výbava jedince, pohlaví. Ateroskleróza je hlavní příčinou infarktu myokardu a mrtvice, které jsou společně považovány za jednu z nejčastějších příčin úmrtí (Haluzík, Svačina, 2005). Cholesterol je základní součástí aterosklerotického ložiska v cévní stěně. Celková koncentrace v krvi je součtem všech krevních lipoproteinů bez ohledu na schopnost ovlivňovat aterosklerózu. Běžně se stanovuje koncentrace cholesterolu neseného v částicích LDL a HDL. Triacylglyceroly jsou neseny především v chylomikrech, 33

34 VLDL, IDL a zbytcích chylomiker. Zvýšená koncentrace triacylglycerolů informuje o zvýšeném množství těchto částic, které nesou cholesterol. Strava bohatá na PUFA řady n-6 snižuje koncentraci celkového cholesterolu a LDL-cholesterolu. Polynenasycené mastné kyseliny n-3 redukují triacylglyceroly, zkracují dobu postprandiální lipemie a vykazují antitrombotický efekt (Soška, 2001). Pro srdeční svalovinu je důležitý neustálý přísun kyslíku a živin pro zachování její funkce a vitality. Pokud dojde k nedokrvení (ischemii myokardu) vzniká ischemická choroba srdeční. Téměř vždy je příčinou ateroskleróza. Jedná se o jedno z nejčastěji se vyskytujících onemocnění v České republice (Hradec, Býma, 2007) Dyslipoproteinémie Dyslipoproteinémie je metabolické onemocnění, při němž dochází ke změně koncentrace krevních lipidů a lipoproteinů. Jedná se o zvýšení koncentrace cholesterolu, TAG, často dochází k současnému snížení HDL cholesterolu (Soška, 2001). 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Zvířata a strava Krmné pokusy byly prováděny v letech 2012 a 2013 v zařízení Ústavu technologie potravin Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Celý pokus probíhal v souladu se Zákonem na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 Sb., ve znění pozdějších předpisů (vyhláška 162/1993 Sb.). Pro tento experiment byli použiti, jako modelová zvířata, laboratorní potkani (Rattus norvegicus). Pokusy podobného typu jsou obvykle zkoušeny na hlodavcích, kteří v souvislosti se signálními drahami PPAR patří mezi druhy proliferující, na rozdíl od člověka. V experimentu byli použiti dospělí samci pokusných zvířat outbredního kmene Wistar albino z chovu Lékařské fakulty Masarykovy university v Brně. Pokus probíhal 42 dnů. Experimentální zvířata, celkem 50 kusů, byla rozdělena na 5 pokusných skupin po 10 potkanech. Potkani byli chováni v boxech (53,5 cm x 32,5 cm x 30,5 cm), byli barevně značeni na různých částech těla pro jejich identifikaci. V místnosti byla udržována teplota 34

35 23 C 1 C, vlhkost vzduchu 60%, světelný režim 12 hodin světlo o intenzitě 200lx a 12 hodin tmy. Počáteční živá hmotnost potkanů byla 213 ± 15 g pro kontrolní skupinu s přídavkem oleje světlice barvířské (SaO) v krmivu, 207 ± 14 g pro skupinu s přídavkem rybího oleje (FO), 210 ± 17 g pro skupinu s přídavkem oleje z řasy Shizochytrium (SCH), 366 ± 4 g pro skupinu krmenou s přídavkem lososového oleje (LO) a 373 ± 4 g pro skupinu s přídavkem palmového tuku (PO). Základním krmivem byla kompletní krmná směs pro myši a potkany firmy Biokron (Bučina), do které bylo po šrotování přimícháno 6 % oleje světlice barvířské (kontrola, SaO, BIO COUNTRY LIFE, Česká republika), 6 % rybího oleje (FO, komerční oleum jecoris asseli, FAGRON, Česká republika) a 6 % oleje řasy Shizochytrium (SchO, Parsippany, NY, USA), 3 % palmového tuku (ASO, Česká republika) a 3 % lososového oleje (ARCO Feed, Česká republika). Ve vzorcích krmných směsí byl analyzován obsah jednotlivých mastných kyselin. Denně byla zjišťována spotřeba krmiva. Potkani byli váženi v týdenním intervalu. Krmné směsi i zdravotně nezávadnou vodu dostávali pokusní potkani ad libitum. Základní krmná směs byla složena z pšenice, ovsa, pšeničných klíčků, sójové moučky, extrudované sóji, kukuřice, sušeného mléka, sušené syrovátky, sušených kvasnic, mletého vápence, dihydrogenfosforečnanu vápenatého, chloridu sodného, L-lysinu a premixu vitamínů a minerálních látek. Krmné směsi jsou popsány v tabulce 7 a příjem MK v krmné dávce v tabulce 8. 35

36 Tab. 7 Složení krmné dávky potkanů Složení Krmivo SCH FO SaO L P Základní krmná směs Složky Olej řasy Shizochytrium (g/kg) Olej rybí Olej světlice barvířské Lososový olej Palmový tuk Hrubý protein Živiny Tuk (g/kg) Vláknina Bezdusíkaté látky Metabolizovatelná energie (MJ/kg) 15,8 15,8 15,8 15,2 15,2 SCH krmivo s přídavkem 6 % oleje z řasy Schizochytrium FO krmivo s přídavkem 6 % rybího oleje SaO kontrolní krmivo s přídavkem 6 % oleje ze světlice barvířské L krmivo s přídavkem 3% lososového oleje P krmivo s přídavkem 3% palmového tuku 36

37 Tab. 8 Příjem MK v krmné dávce v mg.kg -1 živé hmotnosti za den 37

38 Po ukončení pokusu byla zvířata vylačněna (12 h). Zvířatům byla odebrána krev srdeční punkcí do heparinových zkumavek (Dispolab). Byly provedeny analýzy na koncentraci celkového cholesterolu (TC), HDL- cholesterolu (HDLC), LDL-cholesterolu (LDLC) a triacylglycerolů (TAG). Část vzorků jater byla zlyofilizována a zamražena na teplotu -20 C. Následně proběhlo analytické stanovení obsahu mastných kyselin. 4.2 Použité chemikálie Rybí olej (komerční oleum jecoris asseli, FAGRON, Česká republika) Olej světlice barvířské (BIO COUNTRY LIFE, Česká republika) Olej z řasy Schizochytrium (Parsippany, NY, USA) Palmový tuk (ASO, Česká republika) Lososový olej (ARCO Feed, Česká republika) HIP 1 (rozpouštědlo hexan/2-propanol v poměru 3:2) HIP 2 (hexan/2-propanol, poměr 7:2) Roztok síranu sodného (66,6 g bezvodé soli na 1000 ml vody) Kyselina pentadekanová, koncentrace 1 mg/ml v isooktanu (Supelco) BHT (butylhydroxytoulen) 1 % roztok v metanolu (Sigma) 4.3 Použité nástroje Homogenyzér Heidorf Universal 32 (Hettich, Německo) Injekční jehly jednorázové (Dispolab, Česká republika) Injekční stříkačky (Dispolab, Česká republika) Automatický chemický analyzátor BS-200 se softwarem (Mindray, Čína) Lyofilizátor Alpha 1-2 LO (Christ, Labicom, Česká republika) Plynový chromatograf, Fisons GC 8000 series, kapilární kolona Db-23 (60 m x 0,25 mm x 0,25 μm), (Agilent Technologies J&W Scientific, USA) Přístroj PS (Notus-Powersonic, Vráble, Slovesko) Rotační odparka (RV 05 - ST 1P - B model, IKA Labortechnik, Německo) 38

39 4.4 Stanovení cholesterolu Po skončení pokusu byli potkani uvedeni do narkózy anestetikem Isofluran. Vzorky krve byly odebírány do heparinových zkumavek (Dispolab, Česká republika) punkcí ze srdce a dále centrifugovány při 200 x g na 10 minut při teplotě 4 C. Z těchto vzorků se stanovoval celkový cholesterol, TAG, LDL-cholesterol a HDL-cholesterol. Biochemická vyšetření byla prováděna na Ústavu chemie a biochemie Mendelovy univerzity v Brně. 4.5 Stanovení HDL cholesterolu, LDL cholesterolu, celkového cholesterolu a TAG Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG byla stanovena pomocí spektrofotometrického měření na automatickém chemickém analyzátoru se softwarem BS (Co. Mindray, Čína). Byl použit komerční protokol (Greiner Diagnostics GmbH, Německo). LDL-cholesterol byl vypočítán dle vzorce (v mmol.l -1 ): LDL = TC HDL-C TAG/5 LDL - LDL-cholesterol HDL - HDL-cholesterol TC - celkový cholesterol TAG triacylglyceroly Pro potřebu výpočtu jsou používány koeficienty: Cholesterol (celkový, HDL, LDL) mmol.l -1 x 38,7 = mg.dl -1 mg.dl -1 x 0,0259 = mmol.l Stanovení mastných kyselin Vzorky jaterní tkáně byly zbaveny volné a vázané vody lyofilizací. Touto metodou se dosáhlo větší výtěžnosti při extrakci tuku. Lyofilizační teplotní program byl regulován takto: hlavní sušící program při -45 C/ 24 hodin a konečné dosušení 3 hodiny při -50 C. Ze vzorků byl vyextrahován tuk a poté byla provedena esterifikace. Na ply- 39

40 novém chromatografu (Fisons GC 8000 series, kapilární kolona Db-23, Agilent Technologies J&W Scientific, USA) byly stanoveny mastné kyseliny. Výsledky byly vyhodnoceny v programu Statistika 12 (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Byla použita jednofaktorová ANOVA a Duncanův test Příprava vzorků Vzorky stehenní svaloviny (15g), jater (15 g) a viscerálního tuku (8 g) byly přemístěny do hliníkových misek, rozkrájeny na kousky (0,2 cm) a zamraženy při teplotě -30 C. Lyofilizace probíhala v přístroji Alpha 1-2 LO (Christ, Labicom, Česká republika). Vzorky jaterní a tukové tkáně byli sušeny při -45 C po dobu 24 hodin, konečné dosušení trvalo 3 hodiny při -50 C. Vzorky svaloviny se sušili 30 hodin při -45 C a dosoušení trvalo 3 hodiny při teplotě -50 C. Hlavní sušení i dosušování probíhalo pod tlakem 7-4 Pa Extrakce tuku Metoda extrakce byla použita dle autorů Hara a Radin (1978). Lyofilizovaný vzorek jaterní tkáně (navážka 5g) byl zhomogenizován přístrojem Heidorf Universal 32 (Hettich, Německo), k němu bylo přidáno 15 ml směsi rozpouštědel hexan/2-propanol (HIP 1) v poměru 3:2. Směs byla převedena do Erlenmayerovy baňky (150 ml), 15 minut sonifikována v přístroji PS (Notus-Powersonic, Vráble, Slovensko) a následně přes Büchnerovu nálevku zfiltrována. Do filtrátu bylo přidáno 24 ml roztoku síranu sodného (66,6 g bezvodé soli na 1000 ml vody). Směs se 3 minuty promíchávala v dělící nálevce a poté byla oddělena hexanová vrstva do odměrné baňky (50 ml). Vodní vrstva byla reextrahována 10 ml HIP 2 (hexan/2-propanol, poměr 7:2). Odebrané hexanové vrstvy byly převedeny do odměrné baňky (50 ml) a přes 0,5 g bezvodého síranu sodného zfiltrovány do extrakční baňky. Rozpouštědlo bylo odstraněno na rotační odparce (RV 05 - ST 1P - B model, IKA Labortechnik, Německo) při 40 C do 15 minut. Zbylé rozpouštědlo se odstranilo proudem dusíku. Obsah tuku byl stanoven gravimetricky. 40

41 4.6.3 Derivatizace Derivatizací vznikají methylestery mastných kyselin. Reakcí vznikají estery karboxylových kyselin, které jsou více těkavé než samotné mastné kyseliny. Proto jsou vhodnější pro měření plynovou chromatografií. Methylestery vznikly reakcí mastné kyseliny s methanolem za katalytického působení Lewisovými kyselinami (BF 3 ), jde o tzv. bazicky katalyzovanou reakci. Pro stanovení mastných kyselin byla modifikována metoda uvedená Komprdou et al. (1999). Alikvot 50 mg z extrahovaných lipidů byl smíchán v extrakční baňce (50 ml) s 3 ml vnitřního standardu (kyselina pentadekanová, koncentrace 1 mg.ml -1 v isooktanu, Supelco) a 1 ml BHT (butylhydroxytoulen, 1 % roztok v metanolu, Sigma) pro předejití oxidace mastných kyselin. 2 ml 0,5 M methanolátu sodného (1,15 g Na/ 100 ml metanolu) byly přidány ke směsi a směs byla následně zahřívána pod zpětným chladičem ve vodní lázni při 60 C 5 minut. Přes zpětný chladič byl přidán methanolický roztok 14 % fluoridu boritého (2 ml) a reakční směs byla zahřívána dalších 5 minut. Poté byla směs odstavena a byl přidán isooktan (2 ml). Směs byla protřepávána po dobu 15 sekund. Po minutě stání byl přidán nasycený roztok NaCl (5ml) a směs byla znovu 15 sekund protřepávána. Po vychladnutí se oddělila organická vrstva (5 ml), která byla odebrána do vialky pro stanovení plynovým chromatografem Měření mastných kyselin na plynovém chromatografu Pro měření byl použit přístroj Fisons GC 8000 series (ThermoScientific, Waltham, USA) s kapilární kolonou DB-23 (60 m x 0.25 mm x 0.25µm; Agilent J & W Scientific, USA). Injektor byl vyhříván na 250 C, detektor (FID) na 260 C. Byl použit teplotní program: 140 C/ 1 min; gradient 5 C/min do 200 C; zádrž 1 min; gradient 3 C/min do 240 C; zádrž 15 minut. Nosným plynem byl dusík, průtok byl 1,5 ml/min a tlak 200 kpa, split poměr byl 20: Stanovení cholesterolu Cholesterol byl stanovován v krevní plasmě. Vzorky krve byly odebrány do heparinových zkumavek (Dispolab). Ty byly uchovány v termoboxech s ledem až do doby provedení analýzy. Pro biochemické vyšetření bylo použito 1 ml krve. Analýza byla prováděna na Ústavu chemie a biochemie Mendelovy univerzity v Brně. Stanovení cel- 41

42 kového cholesterolu, LDL-cholesterolu, HDL-cholesterolu a triacylglycerolů bylo provedeno enzymaticko-kolorimetrickou metodou na automatickém analyzátoru BS-200 (Co. Mindray, China) za použití komerčních kitů (Greiner Diagnostic GmbH, Německo). Reakční roztoky a vzorky byly umístěny na chlazeném disku (4 C) a automaticky pipetovány do plastikových kyvet s optickou dráhou 0,5 cm. Směs byla následně promíchána. Inkubace probíhá v kyvetovém prostoru temperovaném na 37 C. Promývání dávkovacích jehel destilovanou vodou bylo prováděno mezi jednotlivými pipetováními. Přístroj byl řízen softwarem BS (Co. Mindray, China). 4.7 Statistické vyhodnocení Výsledky stanovení mastných kyselin v tkáních a krevních lipidů byly vyhodnoceny v programu Statistica 12 (StatSoft Inc., Tulsa, USA), byla použita jednofaktorová ANOVA s následným použitím Duncanova testu. Data byla zpracována a zanesena do tabulek a grafů programu Excel 2003 (Microsoft). 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE 5.1 Hmotnost zvířat a příjem krmiva Průměrný denní příjem krmiva byl u skupiny Losos 23 ± 1 g.den -1, skupina Palma 24 ± 2 g.den -1, skupina Světlice 26 ± 2 g.den -1, skupina Ryba 26 ± 1 g.den -1 a u skupiny Řasa 27 ± 2 g.den -1. Průměrný denní přírůstek u pokusných zvířat činil 3,01 ± 0,12 g u skupiny Losos, 3,25 ± 0,19 g u skupiny Palma, 1,57 ± 0,20 g u skupiny Světlice, 1,56 ± 0,27 g u skupiny Ryba a 1,55 ± 0,33 g u skupiny Řasa. Konečná živá hmotnost pokusných zvířat činila 511 ± 9 g u skupiny Losos, 529 ± 11 g u skupiny Palma, 430 ± 33 g u skupiny Světlice, 420 ± 37 g u skupiny Ryba a 441± 35 g u skupiny Řasa. V našem pokusu potkani skupiny Losos přijímali lososový olej v množství 1,85 g.kg -1 tělesné hmotnosti na den, rybí olej v množství 3,71 g.kg -1 tělesné hmotnosti na den u skupiny Ryba a olej z řasy rodu Schizochytrium v množství 3,71 g.kg -1 tělesné hmotnosti na den u skupiny Řasa. V experimentu Yamazaki et al. (2011) dosahoval příjem rybího oleje 1 g.kg -1 tělesné hmotnosti za den. Příjem EPA a DHA souhrnně byl 42

43 v pokusné skupině Losos 118 mg.kg -1 za den, u skupiny Ryba 865 mg.kg -1 za den a u skupiny Řasa 1332 mg.kg -1 za den. Při pokusu Lu et al. (2011) byla použita celková dávka EPA a DHA 169 mg.kg -1 za den. V experimentu Popovic' et al. (2011) bylo použito 228 mg.kg -1 za den. 5.2 Vliv krmiva na obsah kyseliny linolové ve tkáních Tab. 9 Obsah kyseliny linolové v mg.100g -1 tkáně svalové, jaterní a tukové u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje z řasy rodu Schizochytrium v KS Průměr Svalovina (mg.100g -1 ) Játra (mg.100g -1 ) Tuk (mg.100g -1 ) Losos 712,20 542, ,43 Palma 701,92 469, ,69 Řasa 8,24 555,29 174,76 Ryba 8,72 717,56 179,28 Světlice 14, ,79 276,39 Směrodatná odchylka Losos 297,64 143, ,58 Palma 188,04 121, ,90 Řasa 1,90 314,39 20,33 Ryba 3,68 143,01 17,76 Světlice 5,62 247,05 27,59 Tabulka 9 zobrazuje obsah linolové kyseliny (mg.100g -1 ) ve svalové, jaterní a tukové tkáni potkanů u skupin s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje z řasy rodu Schizochytrium v KS. Je zde uveden průměr (n=10) u každé pokusné skupiny a směrodatná odchylka. 43

44 Obsah MK v mg/100g tkáně Obr. 8 Obsah kyseliny linolové v mg.100g -1 svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS B B Losos 100 Palma Řasa 10 A A A Ryba Světlice 1 Svalovina Průměry označené různými indexy (A, B) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupiny s přídavkem světlicového oleje byl zaznamenán nižší obsah kyseliny linolové (P<0,05) ve srovnání se skupinami Losos a Palma (obr. 8). Z obrázku 8 lze vyvodit, že svalová tkáň potkanů skupiny Losos a Palma konvertovaly LA efektivněji (P<0,05) než v případě Světlice. Obsah LA se mezi skupinami Řasa, Ryba a Světlice nelišil (P>0,05). 44

45 Obsah MK v mg/100g tkáně Obr. 9 Obsah kyseliny linolové v mg.100g -1 jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS C AB A AB B Losos Palma Řasa Ryba 400 Světlice Játra Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupiny s přídavkem světlicového oleje byl zaznamenán vyšší obsah kyseliny linolové (P<0,05) ve srovnání s ostatními skupinami. (obr. 9). Z obrázku 9 lze vyvodit, že svalová tkáň potkanů skupiny Světlice konvertoval LA efektivněji (P<0,05) než v případě ostatních skupin. Obsah LA se mezi skupinami Losos, Řasa a Ryba nelišil (P>0,05). 45

46 Obsah MK v mg/100g tkáně Obr. 10 Obsah kyseliny linolové v mg.100g -1 tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS B B A A A Losos Palma Řasa Ryba 10 Světlice 1 Tuk Průměry označené různými indexy (A, B) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupina s přídavkem světlicového oleje byl zaznamenán nižší obsah kyseliny linolové (P<0,05) ve srovnání se skupinami Losos a Palma (obr. 10). Z obrázku 10 lze odvodit, že tuková tkáň potkanů skupiny Losos a Palma konvertovaly LA efektivněji (P<0,05) než v případě Světlice. Obsah LA se mezi skupinami Řasa, Ryba a Světlice nelišil (P>0,05). 46

47 5.3 Vliv krmiva na obsah kyseliny α-linolenové ve tkáních Tab. 10 Obsah kyseliny α-linolenové v mg.100g -1 svalové a jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS Průměr Svalovina (mg.100g -1 ) Játra (mg.100g -1 ) Losos 5,82 6,78 Palma 4,92 5,53 Řasa 0,34 17,16 Ryba 0,47 28,50 Světlice 0,22 9,83 Směrodatná odchylka Losos 2,39 1,55 Palma 3,20 2,20 Řasa 0,08 7,31 Ryba 0,23 7,48 Světlice 0,07 3,13 Tabulka 10 zobrazuje obsah α-linolenové kyseliny (mg.100g -1 ) ve svalové a jaterní tkáni potkanů u skupin s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS. Koncentrace kyseliny α-linolenové v tukové tkáni byl pod hranicí detekovatelnosti (limit 0,042 mg.100g -1 ). V tabulce je uveden průměr (n=10) u každé pokusné skupiny a směrodatná odchylka. 47

48 Obsah MK v mg/100g tkáně Obr. 11 Obsah kyseliny α-linolenové v mg.100g -1 svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS B B Losos Palma Řasa Ryba Světlice 1 0 A Svalovina A A Průměry označené různými indexy (A, B) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupiny s přídavkem světlicového oleje byl zaznamenán nižší obsah kyseliny α-linolenové (P<0,05) ve srovnání se skupinami Losos a Palma (obr. 11). Z obrázku 11 je patrné, že svalová tkáň potkanů skupiny Losos a Palma konvertovaly ALA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah ALA se mezi skupinami Řasa, Ryba a Světlice nelišil (P>0,05). 48

49 Obsah MK v mg/100g tkáně Obr. 12 Obsah kyseliny α-linolenové v mg.100g -1 jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS C B A Losos Palma Řasa Ryba 10 A A Světlice 5 0 Játra Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). Koncentrace kyseliny α-linolenové u skupin Řasa a Ryba se změnily vůči kontrolní skupině Světlice (P<0,05). Koncentrace kyseliny α-linolenové u skupiny Světlice byla nižší než u skupiny Řasa a koncentrace u skupiny Řasa byla nižší než u skupiny Ryba. Z obrázku 12 je patrné, že jaterní tkáň potkanů skupiny Ryba konvertovala ALA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah ALA v kontrolní skupině Světlice se nelišil od skupin Losos a Palma (P>0,05). 49

50 5.4 Vliv krmiva na obsah EPA ve tkáních Tab. 11 Obsah EPA v ηg.g -1 svalové, jaterní a tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS Průměr Svalovina (ηg.g -1 ) Játra (ηg.g -1 ) Tuk (ηg.g -1 ) Losos 156,28 789, ,49 Palma 45,94 109,66 564,45 Řasa 1,60 793,50 16,84 Ryba 5, ,54 28,49 Světlice 1,56 31,70 21,76 Směrodatná odchylka Losos 51,61 232,71 506,85 Palma 26,30 105,74 140,25 Řasa 0,37 229,92 5,74 Ryba 2,69 706,97 10,70 Světlice 0,05 37,58 1,43 Tabulka 11 uvádí obsah EPA (ηg.g -1 ) ve svalové, jaterní a tukové tkáni potkanů u skupin s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS. Je zde uveden průměr (n=10) u každé pokusné skupiny a směrodatná odchylka. 50

51 Obsah MK v ηg/g tkáně Obr. 13 Obsah EPA v ηg.g -1 svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 256 C 128 B A Losos Palma Řasa Ryba 4 2 A A Světlice 1 Svalovina Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). V koncentraci EPA u skupiny Losos byla zaznamenána změna, a to zvýšení vůči kontrolní skupině Světlice (P<0,05). Koncentrace EPA u skupiny Palma byla vyšší vůči kontrolní skupině Světlice (P<0,05). Koncentrace EPA u skupin Losos byla vyšší než u skupiny Palma (P<0,05). Z obrázku 13 je patrné, že svalová tkáň potkanů skupiny Losos konvertovala EPA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah EPA v kontrolní skupině Světlice se nelišil od skupin Řasa a Ryba (P>0,05). 51

52 Obsah MK v ηg/g tkáně Obr. 14 Obsah EPA v ηg.g -1 jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS C 1000 B B Losos 100 A A Palma Řasa Ryba 10 Světlice 1 Játra Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). V koncentraci EPA u skupin Losos a Řasa byla zaznamenána změna, a to zvýšení vůči kontrolní skupině Světlice (P<0,05). Koncentrace EPA u skupiny Ryba se změnila, došlo ke zvýšení vůči kontrolní skupině Světlice (P<0,05). Z obrázku 14 je patrné, že jaterní tkáň potkanů skupiny Ryba konvertovala EPA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah EPA v kontrolní skupině Světlice se nelišil od skupiny Palma (P>0,05). 52

53 Obsah MK v ηg/g tkáně Obr. 15 Obsah EPA v ηg.g -1 tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 10000,00 C 1000,00 B Losos 100,00 A A A Palma Řasa Ryba 10,00 Světlice 1,00 Tuk Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupiny Světlice byl zaznamenán nižší obsah EPA (P<0,05) ve srovnání se skupinami Losos a Palma (obr. 15). Koncentrace EPA u skupin Losos byla vyšší než u skupiny Palma (P<0,05). Z obrázku 15 je patrné, že tuková tkáň potkanů skupiny Losos konvertovala EPA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah EPA se mezi skupinami Řasa, Ryba a Světlice nelišil (P>0,05). 53

54 5.5 Vliv krmiva na obsah DHA ve tkáních Tab. 12 Obsah DHA v ηg.g -1 svalové, jaterní a tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS Průměr Svalovina (ηg.g -1 ) Játra (ηg.g -1 ) Tuk (ηg.g -1 ) Losos 910, , ,77 Palma 439, , ,31 Řasa 51, ,60 554,72 Ryba 22, ,00 155,41 Světlice 3,88 832,17 5,29 Směrodatná odchylka Losos 336,57 657, ,65 Palma 98,74 190,00 382,70 Řasa 10, ,78 58,76 Ryba 6, ,49 13,68 Světlice 2,11 242,29 4,61 Tabulka 12 uvádí obsah DHA (ηg.g -1 ) ve svalové, jaterní a tukové tkáni potkanů u skupin s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS. Je zde uveden průměr (n=10) u každé pokusné skupiny a směrodatná odchylka. 54

55 Obsah MK v ηg/g tkáně Obr. 16 Obsah DHA v ηg.g -1 svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS C B Losos 100 A A Palma Řasa Ryba 10 A Světlice 1 Svalovina Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupiny Světlice byl zaznamenán nižší obsah DHA (P<0,05) ve srovnání se skupinami Losos a Palma (obr. 16). Koncentrace DHA u skupiny Losos byla vyšší oproti skupině Palma (P<0,05). Z obrázku 16 je patrné, že svalová tkáň potkanů skupiny Losos konvertovala DHA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah DHA se mezi skupinami Řasa, Ryba a Světlice nelišil (P>0,05). 55

56 Obsah MK v ηg/g tkáně Obr. 17 Obsah DHA v ηg.g -1 jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS B B 6000 Losos 5000 Palma C A A Řasa Ryba Světlice 0 Játra Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupiny Světlice byl zaznamenán nižší obsah DHA (P<0,05) ve srovnání se skupinou Losos (obr. 17). Koncentrace DHA u skupin Řasa a Ryba byly vyšší oproti kontrole (P<0,05). Z obrázku 17 je patrné, že svalová tkáň potkanů skupiny Řasa konvertovala DHA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah DHA se mezi skupinami Řasa a Ryba nelišil (P>0,05). 56

57 Obsah MK v ηg/g tkáně Obr. 18 Obsah DHA v ηg.g -1 tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS C 1000 B A A Losos Palma 100 Řasa 10 A Ryba Světlice 1 Tuk 0 Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). U kontrolní skupiny Světlice byl zaznamenán nižší obsah DHA (P<0,05) ve srovnání se skupinami Losos a Palma (obr. 18). Koncentrace DHA u skupiny Losos byla vyšší oproti skupině Palma (P<0,05). Z obrázku 18 je patrné, že tuková tkáň potkanů skupiny Losos konvertovala DHA efektivněji (P<0,05) než v případě kontrolní skupiny. Obsah DHA se mezi skupinami Řasa, Ryba a Světlice nelišil (P>0,05). 5.6 Celkový cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol a TAG Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG zobrazuje tabulka 13, kde je u 5 pokusných skupin uveden průměr včetně směrodatné odchylky. Je zde vypočteno procentuální snížení nebo zvýšení dané frakce u pokusných skupin (Palma, Losos, Řasa, Ryba) vůči kontrole (Světlice). 57

58 Plasmatická hladina v mmol/l Tab. 13 Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG (mmol.l -1 ) u jednotlivých skupin potkanů, v závorce je uvedeno zvýšení/snížení oproti kontrole (%) Průměr Cholesterol (mmol.l -1 ) HDL (mmol. l -1 ) LDL (mmo.l 1 ) TAG (mmol.l -1 ) Palma 1,25 (- 7%) 0,37 (- 8%) 0,87 (+ 1%) 1,88 (+ 27 %) Losos 1,07 (- 21%) 0,35 (- 12%) 0,75 (- 13%) 0,94 (- 36 %) Řasa 0,98 (- 27%) 0,31 (- 22%) 0,64 (- 26%) 0,68 (- 54 %) Ryba 0,98 (- 27%) 0,32 (- 20%) 0,65 (- 24%) 1,45 (- 2 %) Světlice (kontrola) 1,35 0,40 0,86 1,48 Směrodatná odchylka Palma 0,108 0,063 0,051 0,130 Losos 0,141 0,080 0,102 0,050 Řasa 0,092 0,021 0,069 0,176 Ryba 0,070 0,026 0,046 0,372 Světlice (kontrola) 0,145 0,053 0,068 0,389 Obr. 19 Hladiny celkového cholesterolu (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 A B A A B Losos Palma Řasa Ryba Světlice 0,0 Celkový cholesterol Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). Skupiny Losos, Řasa a Ryba se statisticky lišily (P<0,05) od kontroly, došlo ke snížení celkového cholesterolu oproti kontrolní skupině Světlice (obr. 19). Koncentrace celkového cholesterolu skupin Palma a Světlice se nelišil (P>0,05). 58

59 Plasmatická hladina v mmol/l Obr. 20 Hladiny HDL-cholesterolu (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 0,5 0,5 0,4 0,4 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0,0 AB B Průměry označené různými indexy (A, B) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). A HDL-cholesterol A B Losos Palma Řasa Ryba Světlice Skupiny Řasa a Ryba se statisticky lišily od kontrolní skupiny Světlice (P<0,05), došlo ke snížení HDL-cholesterolu oproti kontrole (obr. 20). Koncentrace HDLcholesterolu skupin potkanů Losos, Palma a Světlice se nelišila (P>0,05). 59

60 Plasmatická hladiva v mmol/l Plasmatická hladina v mmol/l Obr. 21 Hladiny LDL-cholesterolu (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 C B Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). A LDL-cholesterol A B Losos Palma Řasa Ryba Světlice Skupiny Řasa a Ryba se statisticky průkazně lišily od kontrolní skupiny Světlice (P<0,05), došlo ke snížení LDL-cholesterolu oproti kontrole (obr. 21). Koncentrace LDL-cholesterolu skupiny Losos poklesla oproti kontrole (P<0,05). Koncentrace LDLcholesterolu skupin potkanů Palma a Světlice se nelišil (P>0,05). Obr. 22 Hladiny TAG (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 2,5 2,0 C B B 1,5 Losos Palma 1,0 A A Řasa Ryba 0,5 Světlice 0,0 TAG Průměry označené různými indexy (A, B, C) se od sebe statisticky průkazně liší (P<0,05). 60

61 Skupiny Losos a Řasa se statisticky lišily od kontrolní skupiny Světlice (P<0,05), došlo ke snížení TAG oproti kontrole (obr. 22). Skupina Palma měla statisticky průkazně vyšší koncentraci TAG (P<0,05) oproti kontrole. Koncentrace TAG u skupin Řasa a Světlice se nelišily (P>0,05). Očekávali jsme, že přídavkem lososového oleje, rybího oleje a oleje z řasy rodu Schizochytrium do KS dojde ke snížení koncentrace celkového cholesterolu, snížení koncentrace TAG, zvýšení koncentrace HDL-cholesterolu a snížení koncentrace LDLcholesterolu. Snížení koncentrace celkového cholesterolu se v našem pokusu potvrdilo. Došlo k poklesu o 21% u skupiny Losos, o 27% u skupiny Řasa a o 27% u skupiny Ryba oproti kontrole Světlice, jejíž průměrná koncentrace byla 1,35 mmol.l -1. Hypotéza o snížení koncentrace TAG se potvrdila u skupin Losos a Řasa. Došlo k poklesu o 36% u skupiny Losos a u skupiny Řasa o 54% oproti kontrolní skupině, jejíž průměrná koncentrace byla 1,48 mmol.l -1. U skupiny Ryba se koncentrace TAG statisticky nelišila od kontrolní skupiny. Namísto očekávaného zvýšení koncentrace HDL-cholesterolu došlo k jejímu poklesu. U skupiny Losos o 12%, u skupiny Řasa o 22% a u skupiny Ryba o 20 % oproti kontrole. Kontrolní skupina Světlice měla průměrnou koncentraci HDLcholesterolu 0,40 mmol.l -1. Potvrdilo se předpokládané snížení koncentrace LDLcholesterolu. Tato frakce se v pokusu snížila o 13% u skupiny Losos, o 26% u skupiny Řasa a o 24% u skupiny Ryba v porovnání s kontrolou. Koncentrace LDL-cholesterolu kontrolní skupiny Světlice byla 0,86 mmol.l -1. Přídavek palmového oleje do krmiva sloužil jako negativní kontrola. Předpokládali jsme zvýšení koncentrace celkového cholesterolu, TAG a LDL-cholesterolu. Naopak mělo dojít ke snížení koncentrace HDLcholesterolu. V pokusu došlo ke zvýšení koncentrace celkového cholesterolu o 5 % (P>0,05) a ke zvýšení koncentrace TAG o 27 % (P<0,05). Zvýšení koncentrace LDLcholesterolu nebylo statisticky průkazné (P>0,05), koncentrace byla vyšší o 1%. V experimentu se statisticky průkazně nelišily koncentrace HDL-cholesterolu u skupiny Palma a kontrolní skupiny (P>0,05). Odchylky od předpokládaných hypotéz mohly být způsobeny nedostatečným množstvím účinné látky (EPA a DHA) v podávaných olejích nebo nízkou dávkou olejů v krmných dávkách. Možným důvodem je také ovlivnění metabolismu lipidů krevní plasmy jiným mechanismem, než který byl předpokládán. 61

62 Koncentrace celkového cholesterolu u pokusné skupiny Losos byla v průměru 1,07 ± 0,042 mmol.l -1, u skupiny Řasa 0,98±0,092 mmol.l -1, u skupiny Ryba 0,98±0,070 mmol.l -1. Autoři experimentů souvisejících s touto tématikou uvádějí tyto hodnoty celkového cholesterolu: Ferramosca et al. (2012) 2,45 mmol.l -1, Xiao et al. (2012) 2,36 mmol.l -1, Yamazaki et al. (2011) 1,01 mmol.l -1, Popovic' et al. (2011) 0,54 mmol.l -1. Koncentrace HDL-cholesterolu v našem experimentu byla u pokusné skupiny Losos 0,75 ± 0,031 mmol.l -1, u skupiny Řasa 0,98±0,092 mmol.l -1, u skupiny Ryba 0,98±0,070 mmol.l -1. V podobných experimentech byly naměřeny tyto hodnoty: Xiao et al. (2012) 1,84 mmol.l -1 ; Popovic' et al. (2011) 0,23 mmol.l -1 ; Rossmeisl et al. (2014) 2,51 mmol.l -1. Takahashi (2011) uvádí, že došlo ke snížení HDL-cholesterolu z hodnoty 1,56 mmol.l -1 skupiny s přídavkem palmového tuku v KS na hodnotu 0,58 mmol.l -1 u skupiny krmené přídavkem rybího oleje v KS. Naopak Yamazaki et al. (2011) uvádí, že neobjevili průkazný rozdíl v koncentraci HDL-cholesterolu u skupiny krmené KS s přídavkem rybího tuku a u kontrolní skupiny. Popovic' et al. (2011) a Xiao et al. (2012) publikují vyšší koncentrace HDL-cholesterolu u skupiny krmené KS s přídavkem rybího tuku. V našem pokusu byla naměřena koncentrace LDL-cholesterolu v plasmě u pokusné skupiny Losos 0,75±0,102 mmol.l -1, u skupiny Řasa 0,64±0,069 mmol.l -1 a u skupiny Ryba 0,65±0,046 mmol.l -1. Zjištěné koncentrace LDL-cholesterolu se v obdobných experimentech lišily. Byly naměřeny tyto hodnoty: Ferramosca et al. (2012) 1,11 mmol.l -1 ; Popovic' et al. (2011) 0,17 mmol.l -1. V našem experimentu byla koncentrace HDL-cholesterolu u skupiny Losos 0,35±0,080 mmol.l -1, u skupiny Řasa 0,31±0,021 mmol.l -1 a u skupiny Ryba 0,32 ±0,026 mmol.l -1. Popovic' et al. (2011) uvádí hodnotu 0,23 mmol.l -1. Při porovnávání různých pokusů musíme brát v úvahu i odlišnou metodiku experimentu dále například kalibraci přístrojů, analytické stanovení nebo různé obsahy účinných látek. Přídavek lososového, rybího oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium do krmné směsi potkanů v našem experimentu snížil celkový cholesterol. Podobné výsledky publikovali Ferramosca et al., (2012) a Xiao et al., (2012). Při pokusu Yamazaki et al. (2011) nebyl shledán rozdíl mezi koncentrací celkového cholesterolu pokusné skupiny 62

63 (přídavek lososového oleje do KS) a kontrolní. Možnou příčinou by mohlo být množství přijatého lososového oleje (1 g na kg živé hmotnosti a den). V našem pokusu byl příjem lososového oleje vyšší (1,85 g na kg živé hmotnosti a den) než v pokusu Yamazaki et al. (2011). Bylo také zjištěno, že snížení celkového cholesterolu v experimentech založených na hypotéze, z níž vycházel náš pokus, nemusí být založen pouze na příjmu n-3 PUFA, ale i na dalších faktorech výživy, jako je například obsah mikroživin ve stravě. Výsledky naší studie potvrdily předpokládanou hypotézu jen částečně. Bylo zjištěno, že metabolismus plasmatických lipidů ovlivňuje odlišný mechanizmus, než bylo předpokládáno. Toto téma je potřeba dále studovat a objasnit na dalších experimentech. Při pokusech by měla být pozměněna metodika, a to například změnou zdrojů mastných kyselin, změnou poměru PUFA, zvýšením dávek nebo suplementací přímo danými účinnými n-3 MK. 63

64 6 ZÁVĚR Tato diplomová práce se zabývala problematikou vlivu PUFA na zastoupení mastných kyselin ve tkáních a hladinou cholesterolu u potkanů. V teoretické části je práce zaměřena na studium vlastností PUFA jako transkripčních faktorů při expresi genů ovlivňujících metabolismus cholesterolu. Dále se zabývá funkcí PUFA v lidském organismu a hodnotí zdravotní aspekty. V praktické části diplomové práce byl popsán krmný pokus modelových zvířat, odběr a zpracování vzorků, analýza mastných kyselin vybraných tkání modelových zvířat a plasmatického cholesterolu. Cílem práce bylo potvrdit hypotézu o příznivém vlivu PUFA na zastoupení plasmatických lipidů. Kyseliny eikosapentaenová a dokosahexaenová mohou redukovat plazmový cholesterol prostřednictvím zvýšení exprese genu Insig-1 a zároveň snížením exprese genů kódujících HMG-CoA-R a LDL-R. Tato hypotéza se testovala na pokusných zvířatech (Rattus norvegicus), která byla krmena standardní krmnou směsí s přídavkem 3 % lososového olej, 6 % rybího oleje a 6 % oleje z řasy rodu Schizochytrium. Obsah MK v jaterní tkáni koreloval s obsahem MK v krmivech potkanů. Bylo průkazně dokázáno (P < 0,05), že bohaté zdroje n-3 MK, v této práci konkrétně lososový olej, rybí olej a olej z řasy rodu Schizochytrium, přidány do krmiva snižují celkový cholesterol a LDL-cholesterol. Došlo tedy k poklesu celkového cholesterolu a LDL-cholesterolu u skupin přijímajících krmivo s vyšším podílem PUFA n-3 ve srovnání se skupinou přijímající krmivo s vyšší koncentrací PUFA n-6. V závěru můžeme konstatovat, že byla částečně potvrzena předpokládaná hypotéza, přestože jsme zjistili, že metabolismus plasmatických lipidů je ovlivněn jiným mechanizmem, než bylo předpokládáno. Tato oblast si žádá další zkoumání a provedení dalších pokusů, které by pomohly objasnit tuto problematiku. 64

65 7 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ BAČÍKOVÁ, H. (2013) Kokosový a palmový olej. Vitalia [online cit ]. BROWN, M. a J. L. GOLDSTEIN (2013) The Nobel Prize in Physiology or Medicine Press Release. Nobelprize.org. BUSTIN, S. (2002) Quantification of mrna using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems, č. 29, s CARBONERA, F; E. BONAFE; C. MARTIN; P. MONTANHER, C. RIBEIRO; L. FIGUEIREDO; V. ALMEIDA; J. VISENTAINER; N. TRUSHIN; A. CALCAGNOT- TO; A. DAS; J. LIAO a K. EL-BAYOUMY (2014) Effect of dietary replacement of sunflower oil with perilla oil on the absolute fatty acid composition in Nile tilapia (GIFT). Food Chemistry, č. 148, vyd. 7, s ČEŠKA, R. (2012) Cholesterol a ateroskleróza, léčba dyslipidémií. Vyd. 4., V Tritonu 2. Praha: Triton, ISBN DZIUDA M. (2010) Data Mining for Genomics and Proteomics: Analysis of Gene and Protein Expression Data, John Wiley & Sons, New Jersey, 336 s. EILATI, E.; C. SMALL; S. MCGEE; N. KURREY (2013) Anti-inflammatory effects of fish oil in ovaries of laying hens target prostaglandin pathways. Lipids in Health and Disease, č. 12, vyd. 1, s. 152 FERNANDIS, A. a M. WENK (2007) Membrane lipids as signaling molecules. Curr Opin Lipidol, č. 18. FERRAMOSCA, A., L. CONTE a V. ZARA (2012) A krill oil supplemented diet reduces the activities of the mitochondrial tricarboxylate carrier and of the cytosolic lipogenic enzymes in rats. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, č. 96, vyd. 2, s FLIDER, F. (2013) Development and commercialization of GLA safflower oil. Lipid Technology, roč. 25, č. 10, GANONG, W. (2005) Přehled lékařské fyziologie. 20. vyd. Praha: Galén, xx, 890 s. ISBN GERMAN, B., C. DILLARD (2004) Saturated fats: what dietary intake. The American Journal of Clinical Nutrition, č. 3. GOYENS, P. (2006) Conversion of α-linolenic acid in humans is influenced by the absolute amounts of α-linolenic acid and linoleic acid in the diet and not by their ratio. The American Journal of Clinical Nutrition [online cit ]. 65

66 GRAY, R. (2012) Olej z mikrořas Schizochytrium bohatý na DHA a EPA. Europien Commision. GREENE, J., S. ASHBURN, L. RAZZOUK a D. SMITH (2013) Fish Oils, Coronary Heart Disease, and the Environment. American Journal of Public Health, roč. 103, č. 9, s HALUZÍK, M. a Š. SVAČINA (2005) Metabolický syndrom a nukleární receptory: PPAR. 1. vyd. Praha: Grada, ISBN HRADEC, J. a S. BÝMA (2007) Ischemická choroba srdeční: doporučený diagnostický a léčebný postup pro všeobecné praktické lékaře: 2007, Praha: Společnost všeobecného lékařství ČLS JEP. ISBN HUR, S., B. MIN, K. NAM, E. LEE a D. AHN (2013) International Journal of Molecular Sciences, č. 14, vyd. 6, s CHAPMAN, REBEKAH a JUAN (2012) Using Quantitative Real Time PCR Melt Curve Analysis of Partial CO1 Sequence for Rapid Biotype Differentiation of Bactericera cockerelli (Hemiptera: Triozidae), č. 4. CHATGILIALOGLU, Ch. a C. FERRERI (2010) Biomimetic Chemistry: Radical Reactions in Vesicle Suspensions. Biomimetics Learning from Nature. InTech. JUMP, D., D. BOTOLIN, Y. WANG a J. XU (2005) National Center for Biotechnology Information,Fatty acid regulation of hepatic gene transcription [online cit ]. KAPUT, J. a R. RODRIGUEZ (2004) Nutritional genomics: the next frontier in the postgenomic era, roč. 16, č. 2, s KIRKHUS, B., A. LAMGLAIT, K. EILERTSEN, E. FALCH, T. HAIDER, H. VIK, N. HOEM, T. HAGVE, S. BASU, E. OLSEN, I. SELJEFLOT, L. NYBERG, E. ELIND a S. ULVEN (2012) Effects of similar intakes of marine n-3 fatty acids from enriched food products and fish oil on cardiovascular risk markers in healthy human subjects. British Journal of Nutrition, č. 107, vyd. 09, s KLUSÁČKOVÁ, Z. a A. SKOUMALOVÁ (2012) Úloha mastných kyselin v rozvoji Alzheimerovy choroby. Klinická biochemie a metabolismus. 2012, roč. 20, č. 3, s KOMPRDA, T. (2012) Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids as inflammationmodulating and lipid homeostasis influencing nutraceuticals: A review. Journal of Functional Foods.. sv. 4, č. 1, s ISSN

67 KOUBA, M. a J. MOUROT (2011) ScienceDirect. A review of nutritional effects on fat composition of animal products with special emphasis on n-3 polyunsaturated fatty acids [online cit ]. KRAML, P. (2008) Hyperlipoproteinémie v klinické praxi. 1. vyd. Praha: Tigis, 128 s. Horizonty diabetologie. ISBN LOTTENBERG, A., M. AFONSO, M. LAVRADOR, R. MACHADO a NAKAN- DAKARE (2012) The role of dietary fatty acids in the pathology of metabolic syndrome. The Journal of Nutritional Biochemistry. Překlad John Bester, č. 23, vyd. 9, s LUBANDA, H. a M. VECKA (2009) Cholesterol přítel či nepřítel?. Chemické listy, č. 103, s MANNI, A., J. RICHIE, H. XU, S. WASHINGTON, C. ALIAGA, R. BRUGGEMAN, T. COOPER, B. PROKOPCZYK, N. TRUSHIN, A. CALCAGNOTTO, A. DAS, J. IAO a K. EL-BAYOUMY (2014) Influence of omega-3 fatty acids on Tamoxifeninduced suppression of rat mammary carcinogenesis. International Journal of Cancer, č. 134, vyd. 7, s MIČUDA (2006) Web.lfhk.cuni.cz. Real-time PCR [online cit ]. MOUREK, J. (2007) Mastné kyseliny Omega-3: zdraví a vývoj. Vyd. 1. Praha: Triton, ISBN MULDER, K., J. KING, S. INNIS, H. BARADARAN, R. RIBEIRO, L. FIGUEIREDO, V. ALMEIDA, J. VISENTAINER, N. TRUSHIN, A. CALCAGNOTTO, A. DAS, J.LIAO a K. EL-BAYOUMY (2014) Omega-3 Fatty Acid Deficiency in Infants before Birth Identified Using a Randomized Trial of Maternal DHA Supplementation in Pregnancy. PLoS ONE, č. 9, vyd. 1, e83764 PATOČKA, J., M. BAKHSHI a J. HRDINA (2011) Zdravotní rizika potravin nového typu. Zdravotně sociální fakulta, Jihočeská universita v Českých Budějovicích. POPOVIC T., BOROZAN S., ARSIC A., DEBELJAK-MARTAČIC J., VUČIC V., (2011) Effects of n-3 Supplementation on Plasma and Liver, Phospholipid Fatty Acids Profile in Aged Wistar Ratsrats. Croatica Chemica Acta, č. 84, s RITZOULIS, C., D. PETRIDIS, E. DERLIKIS, K. FYTIANOS a P. ASTERIOU (2010) Utilization og inverse water in oil emulsions as fat replacers in Frankfurter model s ausages: infuence of fat emulsion content on the organoleptic and mechanical properties. Journal of Texture Studies, č. 41, vyd. 1, s

68 ROSICKÁ, M. (2011) Endocare. Nutrigenomika, budoucnost v dietních intervencích [online cit ]. ROSSMEISL, M., D. MEDRIKOVA, E. VAN SCHOTHORST, J. PAVLISOVA, O. KUDA, M. HENSLER, K. BARDOVA, P. FLACHS, B. STANKOVA, M. VECKA, E. TVRZICKA, A. ZAK, J. KEIJER aj. KOPECKY (2014) Omega-3 phospholipids from fish suppress hepatic steatosis by integrated inhibition of biosynthetic pathways in dietary obese mice. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, č. 1841, vyd. 2, s SABA, A. a O. ORIDUP (2012) Lipoproteins and Cardiovascular Diseases. Lipoproteins - Role in Health and Diseases. InTech SCHEFE, J., E. Kerstin, E. LEHMANN, I. BUSCHMANN, T. UNGER a H. FUNKE- KAISER (2006) Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel gene expression s C T difference formula. Journal of Molecular Medicine, č. 84, vyd. 11, s SCHMIDT, E. (2013) Why You Need Cholesterol. Meridian Health Clinic. SKALSKÁ, M. (2011) Životně důležité laboratorní hodnoty. Stobklub.cz [online cit ]. SNUSTAD, D a M. SIMMONS (2009) Genetika. Vyd. 1. Brno: Masarykova univerzita, xxi, 871 s. ISBN SOŠKA, V. (2001)Poruchy metabolizmu lipidů: diagnostika a léčba. 1. vyd. Praha: Grada, 166 s., ISBN STRÁNSKÝ, M. (2006) Výživa v prevenci a léčbě hypercholesterolemie: Ústav výživy, 3. lékařská fakulta University Karlovy. STRAŠIL, Z. a J. HOFBAUER (2007) Technologie pěstování a možnosti využití světlice barvířské - safloru (Carthamus tinctorius L.). Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, s. 18., ISBN SVAČINA, Š. (2008) Klinická dietologie. Vyd. 1. Praha: Grada, 381 s. ISBN ŠEDA, LIŠKA a ŠEDOVÁ (2006) Aktuální genetika, Nutrigenomika [online cit ]. ŠMARDA, J. (2010) Metody molekulární biologie. 1. vyd., 2. dotisk. Brno: Masarykova univerzita, ISBN TAKAHASHI Y. (2011) Soy protein and fish oil independently decrease serum lipid concentrations but interactively reduce hepatic enzymatic activity and gene expression 68

69 involved in fatty acid synthesis in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 57, URBANOVÁ. (2010) SPRÁVNA VÝŽIVA. Východoslovenský ústav srdcových a cievnych chorob. VELÍŠEK, J. (2009) Chemie potravin. Rozš. a přeprac. 3. vyd. Tábor: OSSIS, xx, 623 s. ISBN FAO (2004) Vitamin and mineral requirements in human nutrition. 2nd ed. Rome: FAO, ISBN WAHRBURG, U. (2004) What are the health effects of fat?. Eur J Nutr., č. 43. WORGALL, T. (2001) Unsaturated fatty acid-mediated decreases in sterol regulatory element-mediated gene transcription are linked to cellular sphingolipid metabolism. Pubmed.gov [online] [cit ]. XIAO Y., G. QIANCHUN, X. JIQU, G. FENGHONG, H. QINGDE, Y. ZHIHUA, (2012). Effects of cold-pressed and vitamin E-enriched flaxseed oils on lipid profile and antioxidant status in high-fat fed rats. European Journal of Lipid Science and Technology, 114, YAHIA, R. (2008) PPARs: thiazolidindiony : nové trendy léčby metabolického syndromu. Vyd. 1. Olomouc: Svatava Antonie, ISBN YAMAZAKI, R., A. BRITO, I. COELHO, D. PEQUITTO, A. YAMAGUCHI, G. BORGHETTI, D. SCHIESSEL, M. KRYCZYK, J. MACHADO, R. ROCHA, J. AIKAWA, F. IAGHER, K. NALIWAIKO, R. TANHOFFER, E. NUNES a L. FER- NANDES.(2011) Low fish oil intake improves insulin sensitivity, lipid profile and muscle metabolism on insulin resistant MSG-obese rats. Lipids in Health and Disease, č. 10, vyd. 1, s. 66 ZHANG, G., Y. LIU a J. LI (2013) Concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids from oil of schizochytrium limacinum by molecular distillation: Optimization of technological conditions. Industrial and Engineering Chemistry Research. roč. 52, č. 10, s ŽÁK, A. a J. MACÁŠEK (2001) Ateroskleróza: nové pohledy. 1. vyd. Praha: Grada, ISBN

70 8 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Doporučený příjem mastných kyselin ve stravě 12 Tab. 2 Přehled nasycených mastných kyselin 16 Tab. 3 Mononenasycené mastné kyseliny 16 Tab. 4 Polynenasycené mastné kyseliny 18 Tab. 5 Cholesterol ve stravě 23 Tab. 6 Lipoproteiny plazmy 25 Tab. 7 Složení krmné dávky potkanů 36 Tab. 8 Příjem MK v krmné dávce v mg.kg -1 živé hmotnosti za den 37 Tab. 9 Obsah kyseliny linolové v mg/100g tkáně svalové, jaterní a tukové u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 43 Tab. 10 Obsah kyseliny α-linolenové v mg/100g svalové a jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 47 Tab. 11 Obsah EPA v ηg.g -1 svalové, jaterní a tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 50 Tab. 12 Obsah DHA v ηg.g -1 svalové, jaterní a tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 54 Tab. 13 Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG (mmol.l -1 ) u jednotlivých skupin potkanů, v závorce je uvedeno zvýšení/snížení oproti kontrole (%) 58 70

71 9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Přehled různých typů mastných kyselin 15 Obr. 2 Přehled některých polynenasycených mastných kyselin 18 Obr. 3 Metabolismus ω-3 a ω-6 mastných kyselin 20 Obr. 4 Volný cholesterol 23 Obr. 5 Struktura lipoproteinu 25 Obr. 6 LDL receptor a interakce s LDL částicí 26 Obr. 7 Mechanismus účinku homeostázy cholesterolu 28 Obr. 8 Obsah kyseliny linolové v mg/100g svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 44 Obr. 9 Obsah kyseliny linolové v mg/100g jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 45 Obr. 10 Obsah kyseliny linolové v mg/100g tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 46 Obr. 11 Obsah kyseliny α-linolenové v mg/100g svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 48 Obr. 12 Obsah kyseliny α-linolenové v mg.100g -1 jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 49 Obr. 13 Obsah EPA v ηg.g -1 svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 51 Obr. 14 Obsah EPA v ηg.g -1 jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 52 Obr. 15 Obsah EPA v ηg.g -1 tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 53 Obr. 16 Obsah DHA v ηg.g -1 svalové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 55 Obr. 17 Obsah DHA v ηg.g -1 jaterní tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 56 71

72 Obr. 18 Obsah DHA v ηg.g -1 tukové tkáně u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 57 Obr. 19 Hladiny celkového cholesterolu (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 58 Obr. 20 Hladiny HDL-cholesterolu (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasyrodu Schizochytrium v KS 59 Obr. 21 Hladiny LDL-cholesterolu (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 60 Obr. 22 Hladiny TAG (mmol.l -1 ) u skupin potkanů s přídavkem lososového, palmového, rybího, světlicového oleje a oleje řasy rodu Schizochytrium v KS 60 72

73 10 SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1 Příprava vzorků tkání potkanů 76 73

74 11 SEZNAM ZKRATEK 3-HMGCoA enzym 3-hydroxymethyl-3-glutaryl-koenzym A reduktáza ACAT acyl-coa cholesterolacyltransferáza AF Agronomická fakulta ALA kyselina α-linolenová c koncentrace cdna komplementární DNA CT DHA DLP DNA E EPA ER g HDL cyklus, ve kterém fluorescence vzorku protne stanovený fluorescenční práh kyselina dokosahexaenová dyslipoproteinemie deoxyribonukleová kyselina efektivita, resp. efektivita PCR (efficiency) kyselina eikosapentaenová endoplasmatické retikulum gram lipoprotein o vysoké hustotě (high density lipoprotein) HMG-CoA-R 3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzym A reduktáza INSIG proteinový produkt genu Insig INSIG 1 Insulin-induced gene 1 protein kcal kilokalorie kj kilojoule KD krmná dávka KS krmná směs l litr LA kyselina linolová LDL lipoprotein o nízké hustotě (low density lipoprotein) LDL-R receptor lipoproteinů nízké hustoty LP lipoproteiny MENDELU Mendelova univerzita v Brně mg miligram MK mastné kyseliny ml mililitr 74

75 mmol milimol MUFA mononenasycené mastné kyseliny PCR polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) PPAR peroxisome proliferator activated receptor (receptory aktivované peroxizomovými proliferátory) PUFA polynenasycené mastné kyseliny RNA ribonukleová kyselina rrna ribozomální RNA RT-PCR reverzně transkripční PCR SCAP SREBP protein aktivující štěpení SREBP SCO s rdečně-cévní onemocnění SFA nasycené mastné kyseliny SRE sterol response element SREBP sterol response element-binding protein TAG triacylglycerol TF transkripční faktor VLDL lipoprotein o velmi nízké hustotě (very low density lipoprotein) 75

76 12 PŘÍLOHY Příloha 1 Příprava vzorků tkání potkanů 76