MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2013 Bc. MARKÉTA VALOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Vliv polynenasycených mastných kyselin na homeostázu cholesterolu Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Gabriela Zorníková, Ph.D. Vypracovala: Bc. Markéta Valová Brno 2013

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv polynenasycených mastných kyselin na homeostázu cholesterolu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucí diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne.. podpis.

4 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych na tomto místě poděkovala všem, kteří přispěli k úspěšnému dokončení této diplomové práce. Zejména Ing. Gabriele Zorníkové, Ph.D., za cenné rady a všestrannou spolupráci, Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D., za pomoc při přípravě vzorků a při analýzách, Ing. Ondreji Škultétymu, za celkovou pomoc při řešení diplomové práce a Ing. Jiřímu Sochorovi, Ph.D., za pomoc při chemických analýzách. Také bych chtěla poděkovat Interní grantové agentuře MENDELU za finanční podporu při řešení této diplomové práce (Vliv krmných aditiv pro hospodářská zvířata na jejich užitkovost a kvalitu potravinářských produktů, TP 2/2011). Díky patří také mé rodině a přátelům, za podporu během celého studia.

5 VLIV POLYNENASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN NA HOMEOSTÁZU CHOLESTEROLU ABSTRAKT Cílem této práce bylo potvrdit hypotézu o příznivém vlivu EPA a DHA na zastoupení plazmatických lipidů. Tyto polynenasycené mastné kyseliny mohou snižovat plasma cholesterol díky zvýšení exprese genu Insig-1 a zároveň snížením exprese genů kódujících HMG-CoA-R a LDL-R. Tato hypotéza byla testována na pokusných zvířatech (Rattus norvegicus) krmených standardní krmnou směsí s přídavkem 3 % rybího tuku (lososový olej). Exprese genu Insig-1 v játrech pokusných zvířat, krmených krmivem s přídavkem lososového oleje, byla 730 % (P < 0,05) oproti kontrole. Avšak na rozdíl od hypotézy, exprese genu HMG-CoA-R byla 165 % (P > 0,05) a exprese genu pro LDL-R byla 210 % (P > 0,05) oproti kontrole. Nicméně bylo prokázáno (P < 0,05), že rybí tuk v dietě u pokusných potkanů snižuje plazmový cholesterol o 10 % (z počáteční hodnoty 1,19 mmol.l -1 na konečnou hodnotu 1,07 mmol.l -1 ). Závěrem našeho pokusu bylo částečné potvrzení předpokládané hypotézy, ale zároveň jsme zjistili, že metabolismus lipidů v plazmě je ovlivěn jiným mechanismem než jsme předpokládali. Klíčová slova Dokosahexaenová kyselina, Eikosapentaenová kyselina, Real-time PCR, Exprese, Cholesterol

6 THE INFLUENCE OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS ON CHOLESTEROL HOMEOSTASIS ABSTRACT The aim of this work was to validate the hypothesis of a positive influence of EPA and DHA on the proportion of plasmatic lipids. These polyunsaturated fatty acids can decrease the plasma cholesterol due to the increase in expression of the gene Insig-1 together with the decrease in expression of the genes coding HMG-CoA-R and LDL-R. This hypothesis had been tested on experimental animals (Rattus norvegicus) that were fed with a standard feeding mixture, with the addition of 3 % fish oil (salmon oil). The expression of the gene Insig-1 in animals livers that had been fed with the feed with the additon of salmon oil was 730 % (P < 0,05) compared to the control. However, on the contrary to the hypothesis, the expression of the gene HMG-CoA-R was 165 % (P > 0,05) and the expression of the gene for LDL-R was 210 % (P > 0,05) compared to the control. Nevertheless, it was proved (P < 0,05) that the fish oil used for the diet of the experimental rats decreased the plasma cholesterol by 10 % (from the initial value 1,19 mmol.l -1 to the finally value 1,07 mmol.l -1 ). The conclusion of our experiment was confirmation of the presumptive hypothesis, but we also discovered the fact that the metabolism of lipids in plasma is influenced by another unexpected mechanism. Keywords Docosahexaenoic acid, Eicosapentaenoic acid, real-time PCR, Expression, Cholesterol

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED LIPIDY Základní rozdělení lipidů Biologické funkce lipidů DOPROVODNÉ LÁTKY LIPIDŮ CHOLESTEROL Biologická funkce cholesterolu Biosyntéza cholesterolu Transport cholesterolu v lidském těle MASTNÉ KYSELINY Nasycené mastné kyseliny Mononenasycené mastné kyseliny Polynenasycené mastné kyseliny LIPOPROTEINY METABOLISMUS LIPIDŮ A MK Genová exprese PPAR SREBP Vliv DHA na homeostázu cholesterolu METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PRO DETEKCI A KVANTIFIKACI GENOVÉ EXPRESE Reverzně-transkripční PCR Real-time PCR Metody pro hodnocení relativní kvantifikace MATERIÁL A METODIKA POKUSNÁ ZVÍŘATA, PODMÍNKY CHOVU A KRMNÉ SMĚSI POUŽITÉ CHEMIKÁLIE POUŽITÉ PŘÍSTROJE ODBĚR VZORKŮ KRVE PRO STANOVENÍ CHOLESTEROLU STANOVENÍ CELKOVÉHO CHOLESTEROLU, HDL-CHOLESTEROLU, LDL- CHOLESTEROLU A TAG ODBĚR VZORKŮ TKÁNÍ PRO ANALÝZU GENOVÉ EXPRESE IZOLACE RNA...49

8 4. 8 KONTROLA KVALITY IZOLOVANÉ RNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE REAL-TIME PCR Ověření a návrh primerů pro real-time PCR Stanovení efektivity reakce Relativní kvantifikace Vyhodnocení relativní kvantifikace Statistické vyhodnocení VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE PŘÍJEM KRMIVA A HMOTNOST POKUSNÝCH ZVÍŘAT KONCENTRACE CELKOVÉHO CHOLESTEROLU, HDL-CHOLESTEROLU, LDL- CHOLESTEROLU A TAG KONTROLA KVALITY A KVANTITY IZOLOVANÉ RNA REAL-TIME PCR Ověření a návrh primerů pro real-time PCR Analýza genové exprese pomocí real-time PCR β-aktin HMG-CoA-R SREBP PPARα LDL-R Insig SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM POUŽITÝCH INTERNETOVÝCH ZDROJŮ SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK PŘÍLOHY...99

9 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Zdroje cholesterolu v dietě...21 Tab. 2 Přehled nasycených MK...25 Tab. 3 Lipoproteiny plasmy...29 Tab. 4 Funkce, lokalizace a ligandy jednotlivých PPAR...31 Tab. 5 Celkové složení krmných směsí...45 Tab. 6 Zastoupení jednotlivých mastných kyselin a jejich příjem v krmné dávce...46 Tab. 7 Složení pufru pro elektroforézu...50 Tab. 8 Seznam primerů, sekvence, číslo referenční sekvence, délka PCR produktu a teplota annealingu...52 Tab. 9 Hodnoty celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG 56 Tab. 10 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl -1 ], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny PALMA...62 Tab. 11 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl -1 ], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny MYPO...63 Tab. 12 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl -1 ], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny LOSOS...64 Tab. 13 Analýza hladiny exprese genu HMG-CoA-R [%]...71 Tab. 14 Analýza hladiny exprese genu SREBP-2 [%]...74 Tab. 15 Analýza hladiny exprese genu PPARα [%]...76 Tab. 16 Analýza hladiny exprese genu LDL-R [%]...77 Tab. 17 Analýza hladiny exprese genu Insig-1 [%]...79 Tab. 18 Analýza hladiny exprese genů: Insig, HMG-CoA-R, LDL-R [%]...81 Tab. 19 Analýza hladiny exprese genů: PPARα, SREBP-2 [%]...82

10 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Vzorec volného cholesterolu...19 Obr. 2 Vzorec esterifikovaného cholesterolu...20 Obr. 3 Vstřebávání cholesterolu v tenkém střevě...22 Obr. 4 Znázornění dvojího číslování uhlíků...24 Obr. 5 Zjednodušené schéma metabolizmu esenciálních MK...27 Obr. 6 Schéma lipoproteinové částice...29 Obr. 7 Mechanismus fungování PPAR...32 Obr. 8 Regulace syntézy cholesterolu pomocí SREBP...34 Obr. 9 Vliv DHA na homeostázu cholesterolu...36 Obr. 10 Detekce a amplifikace RNA pomocí reverzně-transkripční PCR...38 Obr. 11 Syntéza dvojřetězcových cdna z molekul mrna...39 Obr. 12 Hodnoty celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG...57 Obr. 13 Kontrola kvality izolované RNA ze vzorků jater (skupina PALMA)...61 Obr. 14 Melting křivky PCR fragmentu genu β-aktin při teplotě annealingu 60 ºC...65 Obr. 15 Melting křivky PCR fragmentu genu HMG-CoA-R při teplotě annealingu 60 ºC...65 Obr. 16 Melting křivky PCR fragmentu genu SREBP-2 při teplotě annealingu 60 ºC...66 Obr. 17 Melting křivky PCR fragmentu genu SREBP-2 při teplotě annealingu 65 ºC...66 Obr. 18 Melting křivky PCR fragmentu genu PPARα při teplotě annealingu 65 ºC...67 Obr. 19 Melting křivky PCR fragmentu genu LDL-R při teplotě annealingu 65 ºC...68 Obr. 20 Melting křivky PCR fragmentu genu Insig-1 při teplotě annealingu 65 ºC...68 Obr. 21 Melting křivky PCR fragmentu genu Insig při teplotě annealingu 60 ºC...69 Obr. 22 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen β-aktin...70 Obr. 23 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen HMG-CoA-R...71 Obr. 24 Analýza hladiny exprese genu HMG-CoA-R...72 Obr. 25 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen SREBP Obr. 26 Analýza hladiny exprese genu SREBP Obr. 27 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen PPARα...75 Obr. 28 Analýza hladiny exprese genu PPARα...76 Obr. 29 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen LDL-R...77

11 Obr. 30 Analýza hladiny exprese genu LDL-R...78 Obr. 31 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen Insig Obr. 32 Analýza hladiny exprese genu Insig Obr. 33 Analýza hladiny exprese genů Insig-1, HMG-CoA-R a LDL-R...81 Obr. 34 Analýza hladiny exprese genů PPARα a SREBP

12 SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1 Biosyntéza cholesterolu...99 Příloha 2 Doporučené hodnoty lipidů v krevním séru Příloha 3 Amplifikační křivka...101

13 1 ÚVOD Lipidy patří mezi základní složky ve výživě člověka a lidský organismus nemůže existovat bez jejich příjmu. Mají značný fyziologický význam, který bude popsán v následujícím textu. Ve své práci se zabývám problematikou moderního vědního oboru nutrigenomiky. Jedná se o vědní obor, který se zabývá vztahem mezi celkovou genetickou informací (genomem, transkriptomem) a individuální reakcí na látky, které člověk přijímá v potravě. V konečném důsledku se jedná o ovlivnění genové exprese pomocí nutrientů z potravy. Přestože se jedná o poměrně nový vědní obor, základy této problematiky byly známy již v období starověku. Dokazuje to Hippokratův citát: Nechť je tvé jídlo tvým lékem a tvůj lék nechť je tvým jídlem. Zaměřila jsem se především na možnost ovlivnění homeostázy cholesterolu složením dietárních lipidů. Mezi nejúčinnější látky, které ovlivňují metabolismus cholesterolu, patří např. polynenasycené mastné kyseliny, zejm. PUFA n-3. Dietární zdroje těchto látek představují především rybí tuk, tučné ryby a mořští živočichové. Je prokázáno, že zvýšená konzumace ryb a mořských plodů příznivě ovlivňuje zastoupení plazmatických lipidů. 14

14 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je nastudovat literaturu o lipidech a mastných kyselinách, jejich výskytu v potravinách a fyziologické funkci v organismu, dále nastudovat literaturu o metodách molekulární biologie pro detekci a kvantifikaci genové exprese a prostudovat problematiku vlivu mastných kyselin na genovou expresi. Z těchto poznatků sestavit literární rešerši. V druhé fázi je nutné praktické zvládnutí pokusů na laboratorních zvířatech, následné zpracování vzorků dle zvolené metodiky a na závěr statistické vyhodnocení získaných výsledků. Cílem práce je potvrdit hypotézu o příznivém vlivu EPA a DHA na zastoupení plazmatických lipidů a zjistit, které z genů (Insig-1, HMG-CoA-R, LDL-R, PPARα a SREBP-2), resp. jejich exprese, ovlivňují metabolismus cholesterolu u potkanů. 15

15 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3. 1 Lipidy Lipidy (z řeckého lipos = tučný), spolu se sacharidy a proteiny, patří mezi základní složky ve výživě člověka (Holeček, 2006). Jsou to přírodní látky rostlinného i živočišného původu, které se vyskytují jak v kapalné, tak i v pevné formě. Z chemického hlediska se jedná o estery vyšších karboxylových kyselin, které mohou být nasycené nebo nenasycené (Fahy et al., 2009). Lipidy jsou z funkčního i chemického hlediska velmi různorodé látky, ale mají společnou charakteristickou vlastnost hydrofóbnost. Jsou tedy nerozpustné ve vodě, ale dobře rozpustné v nepolárních rozpouštědlech (Ganong, 2005). Lipidy jsou energeticky velmi bohaté (1g tuku obsahuje 39 kj = 9,3 kcal), a proto v živých organismech velice často slouží jako zdroj a zásobárna energie. Význam lipidů je však mnohostranný (Keresteš, 2011). Pro adekvátní vstřebávání vitaminů rozpustných v tucích (zejm. vitamin A a E) je doporučován příjem tuků minimálně % z celkového energetického příjmu (Béder, 2005). Denní příjem lipidů by neměl přesáhnout % z celkového energetického příjmu. V Evropě (kromě Finska, Norska, Itálie a Portugalska) je průměrný příjem tuku vyšší než 35 % z celkového energetického příjmu. Vysoký příjem dietárního tuku je spojován s vyšším rizikem obezity. Podle některých epidemiologických studií bylo zjištěno, že vysoký příjem tuku je spojován s vyšším výskytem rakoviny, zejm. prsu, vaječníků, prostaty a tlustého střeva (Sobotka, 2011). Tuky mají významný vliv ve vztahu výživy a zdraví člověka, a to jak pozitivní, tak negativní. Záleží především na množství a složení přijatého tuku. Složení MK přijatého tuku má významnou úlohu v prevenci řady onemocnění (zejm. onemocnění srdce a cév). Současné výzkumy prokázaly, že složení MK má významnější roli, než množství přijatého cholesterolu (Dostálová, 2012) Základní rozdělení lipidů Na základě tzv. Bloorovy klasifikace se lipidy podle nejjednoduššího schématu rozdělují na jednoduché a složené (Kraml, 2008). 16

16 Jednoduché lipidy (homolipidy) Jednoduché lipidy jsou estery mastných kyselin s alkoholy. Rozdělují se na tuky a vosky podle chemického složení. Tuky jsou estery mastných kyselin s trojmocným alkoholem glycerolem. Vosky jsou estery, které obsahují jeden vyšší jednosytný alkohol a jeden acyl mastné kyseliny (Murray, 2002). Složené lipidy (heterolipidy) Heterolipidy jsou látky, které obsahují ve své molekule část lipidové a část nelipidové povahy. Mezi heterolipidy řadíme fosfolipidy, glykolipidy a lipoproteiny. Fosfolipidy obsahují MK, alkohol a zbytek kyseliny fosforečné. Kromě toho mohou obsahovat i dusíkaté báze a další skupiny. Fosfolipidy se dále dělí na glycerolfosfolipidy (je-li alkoholem glycerol) a sfingofosfolipidy (je-li alkoholem sfingosin). Glykolipidy obsahují MK, sfingosin a sacharidovou složku (Murray, 2002) Biologické funkce lipidů Nejdůležitější funkcí lipidů pro všechny živé organismy je to, že lipidy představují nejbohatší energetický zdroj, a tím hlavní zásobní formu energie v organismu (Holeček, 2006). Důležitá energetická rezerva v podobě triacylglycerolů je uložena v adipocytech. Odtud mohou být podle potřeb organismu mobilizovány v podobě volných MK, které jsou následně oxidovány v mitochondriích příslušných tkání (Kraml, 2008). Lipidy jsou nezbytnou složkou buněčných membrán u všech živých organismů (Soška, 2001). V buňce můžeme rozlišit cytoplazmatickou membránu, která odděluje samotnou buňku od okolního prostředí a endomembránový systém, který zahrnuje membrány uvnitř buněk. Buněčná membrána se skládá z fosfolipidové dvojvrstvy a proteinů. Ze složení buněčné membrány vychází její unikátní vlastnosti, jako je fluidita (polotekutost), amfipatický charakter (obsahuje hydrofobní i hydrofilní vrstvu) nebo semipermeabilita čili polopropustnost (Heijne, 2008). U člověka mají lipidy nezastupitelnou úlohu v mechanické, tepelné a elektrické izolaci organismu. Jedná se především o podkožní tuk a o tukový obal některých orgánů. Účastní se procesu termoregulace organismu (Beňo, 2008). Lipidy mají celou řadu dalších životně důležitých funkcí. Jsou výchozí látkou při syntéze steroidních hormonů a prostaglandinů. Transportní formy lipidů (lipoproteiny) 17

17 představují hlavní způsob transportu řady látek (Holeček, 2006). Lipidy jsou součástí buněčné signalizace. Steroidy, eikosanoidy a některé fosfolipidy slouží jako signální molekuly tím, že vykonávají funkci hormonů, mediátorů nebo tzv. druhých messengerů (Kraml, 2008). Ve střevě usnadňují vstřebávání vitamínů rozpustných v tucích (Svačina a kol., 2008a). Nelze opomenout ani důležitou úlohu lipidů v senzorické analýze potravin. Lipidy se podílejí na specifické chuti potravin (Jarošová a kol., 2004) Doprovodné látky lipidů cholesterol Mezi doprovodné látky lipidů se většinou řadí eikosanoidy (prostaglandiny, prostacykliny, tromboxany, leukotrieny) a isoprenoidy (cholesterol, steroidy, vitamíny A, D, E, K, ubichinon) (Ganong, 2005). Pro tuto práci z nich bude nejdůležitější cholesterol, a proto se o něm zmíním podrobněji Biologická funkce cholesterolu Cholesterol představuje důležitou molekulu v živočišném organismu (Lubanda, Vecka, 2009). Je to látka nezbytná pro správnou funkci buněčných membrán, tvorbu žlučových kyselin, steroidních hormonů a vitamínu D (Lecerf, Lorgeril, 2011). Cholesterol je jednou ze základních strukturálních komponent lipoproteinů (Holeček, 2006). V nervových tkáních je cholesterol součástí myelinových pochev. Cholesterol je nezbytný pro správný růst organismu i pro obnovu tkání (Komprda, 2006). Je však důležité si uvědomit, že přestože je cholesterol pro život nezbytný, může působit také velmi negativně. Hypercholesterolémie (vysoká hladina cholesterolu), zvláště nadbytek LDL frakce, je dnes považován za hlavní příčinu aterosklerózy. Ateroskleróza je onemocnění, které je v rozvinutých zemích jednou z hlavních příčin mortality v populaci (Lubanda, Vecka, 2009) Biosyntéza cholesterolu Z hlediska fyziologie výživy člověka rozlišujeme cholesterol exogenní (přijímaný potravou) a endogenní (syntetizovaný vlastním organismem člověka) (Lecerf, Lorgeril, 2011). Denní potřeba cholesterolu v lidském organismu je asi 1g. Toto množství by mohlo být teoreticky produkováno endogenně, ale při smíšené stravě pochází asi jen 18

18 polovina cholesterolu z vlastní syntézy a zbytek je dodán dietou. (Langmeier a kol., 2009). Endogenní syntéza cholesterolu probíhá v každé živočišné buňce (s výjimkou bezjaderných erytrocytů), nejvíce však v hepatocytech, v nervové tkáni a enterocytech (Soška, 2001). Za fyziologických podmínek existují mechanismy, které regulují endogenní syntézu cholesterolu a udržují tak hladinu plazmatického cholesterolu v normě (Soccio, Breslow, 2004). Biosyntéza cholesterolu probíhá především v játrech. Všech 27 uhlíků molekuly cholesterolu pochází od acetyl-coa, který je výchozí molekulou pro biosyntézu cholesterolu (Goedeke, Fernández-Hernando, 2012) Klíčový enzym, který reguluje syntézu cholesterolu je β-hydroxy- β-metyl-glutaryl-coa-reduktáza (HMG-CoA reduktáza). Při zvýšení příjmu dietárního cholesterolu se automaticky sníží endogenní syntéza a naopak (Komprda, 2006). Podrobné schéma biosyntézy cholesterolu je uvedeno v příloze 1. Cholesterol existuje v organismu ve dvou formách: volný (Obr. 1) a esterifikovaný (Obr. 2). Volný cholesterol se skládá ze čtyř uhlovodíkových kruhů a postranního osmiuhlíkového řetězce. Neobsazená OH skupina volného cholesterolu umožňuje jeho interakci s vodou, proto je částečně hydrofilní. Esterifikovaný cholesterol má stejnou strukturu jako cholesterol volný, ale na místě OH skupiny volného cholesterolu je navázána mastná kyselina. Esterifikovaný cholesterol je díky této vazbě zcela hydrofobní (Soška, 2001). Obr. 1 Vzorec volného cholesterolu (www1) 19

19 Obr. 2 Vzorec esterifikovaného cholesterolu (www2) V potravě se vyskytuje cholesterol pouze v potravinách živočišného původu (Lecerf, Lorgeril, 2011). Průměrný denní příjem cholesterolu v průmyslových zemích je cca 500 mg.den -1. Odbornými společnostmi je však doporučováno snížit příjem cholesterolu na 300 mg.den -1 (American Heart Association Nutrition Committee, 2006) nebo dokonce 200 mg.den -1 (Kraml, 2008). Zdroje cholesterolu v dietě znázorňuje tabulka 1. 20

20 Tab. 1 Zdroje cholesterolu v dietě (zpracováno podle www3) Potravina Běžná hmotnost 1 porce (g) Obsah cholesterolu (mg) na porci Obsah cholesterolu (mg) na 100 g potraviny Kuřecí maso, vnitřnosti Krocan Hovězí játra, droby Vepřové ledviny Vejce celé syrové Vejce - žloutek 16, Sýr, Ricotta Plnotučné mléko Ořechový koláč Libové vepřové maso Šunka - průměr 56, Máslo 14, Sýr čedar 28, Vanilková zmrzlina Uzeniny 28, Sýr Mozarella 28, Sýr Parmazán Transport cholesterolu v lidském těle V trávicím traktu jsou lipidy emulgovány účinkem žlučových kyselin a hydrolyzovány působením lipolytických enzymů pankreatické šťávy (Langmeier a kol., 2009). Natrávená směs lipidů se žlučovými kyselinami vytváří ve střední části tenkého střeva, jejunu, směsné micely o průměru 3 10 μm. Tyto směsné micely se při styku s kartáčovým lemem enterocytů postupně rozpadají a dostávají se do bezprostřední blízkosti enterocytů. Cholesterol je translokován přes membránu enterocytu pomocí receptoru, který se nazývá protein podobný Niemannovu-Pickovu proteinu 1 (Lubanda, Vecka, 2009). 21

21 Obr. 3 Vstřebávání cholesterolu v tenkém střevě (Kraml, 2008) NPC1L1 - Niemann-Pick C1 like-1 transportér ACAT acyl-coa cholesterolacyltransferáza ABCG5/G8 ATP binding cassette G5/G Mastné kyseliny Jako mastné kyseliny se v biochemii označují biosynteticky vytvořené alifatické monokarboxylové kyseliny, mohou být nasycené nebo nenasycené, většinou se sudým počtem (4-30) uhlíkových atomů a s možnými substituenty v bočním řetězci (Keresteš, 2011). Mastné kyseliny lze rozdělovat podle různých kritérií například podle délky řetězce nebo nasycení (Svačina, Bretšnajdrová, 2008b). V současnosti existuje mnoho studií, které potvrzují významný vliv MK, zejm. MUFA a PUFA na modulaci genové exprese. Tímto dochází k ovlivňování celého lipidového metabolismu organismu (Afman, Müller, 2012). Volné MK jsou jedním ze základních energetických substrátů. MK jsou syntetizovány především v játrech a uloženy jsou ve formě triglyceridů jako zásobní forma energie. Po uvolnění z tukové tkáně jsou v krvi transportovány ve vazbě na albumin (Soška, 2001). Mastné kyseliny člověk přijímá v potravě většinou vázané v neutrálních lipidech (triacylglycerolech) nebo fosfolipidech. Organismus člověka je schopen syntetizovat MK také de novo z acetylkoenzymu A postupným prodlužováním řetězce o dvouuhlíkaté zbytky. Některé MK ale není schopen lidský organismus syntetizovat a musíme je přijímat v potravě. Nazývají se esenciální mastné kyseliny (Komprda, 2007). 22

22 Pro tuto práci budou stěžejní fyziologické účinky MK na hladinu sérového cholesterolu. Hladinu sérového cholesterolu zvyšují (a působí tedy nepříznivě) SFA, zejm. kys. laurová (C 12:0), myristová (C 14:0) a palmitová (C 16:0). Kyselina stearová (C 18:0) působí v tomto smyslu neutrálně. Dále hladinu sérového cholesterolu zvyšují trans-nenasycené MK. Naopak hladinu sérového cholesterolu snižují MUFA a PUFA (Komprda, 2007). Rozdělení mastných kyselin podle délky řetězce s krátkým řetězcem - méně než 6 atomů uhlíku se středně dlouhým řetězcem - 6 až 12 atomů uhlíku s dlouhým řetězcem - 14 až 20 atomů uhlíku s velmi dlouhým řetězcem - více než 20 atomů uhlíku Rozdělení mastných kyselin podle nasycení Nasycené - Saturated fatty acid = SFA - v jejich molekule není žádná dvojná vazba Mononenasycené - Monounsaturated fatty acid = MUFA - v jejich molekule se nachází jedna dvojná vazba Polynenasycené - Polyunsaturated fatty acid = PUFA - v jejich molekule se nachází dvě až šest dvojných vazeb Mastné kyseliny, které se vyskytují v přírodě, jsou karboxylové kyseliny s nerozvětveným řetězcem, které obsahují většinou sudý počet (2-24) uhlíkových atomů (Mourek a kol., 2007). Mastné kyseliny mají amfipatickou strukturu mají hydrofobní (uhlíkový) řetězec i hydrofilní (karboxylová skupina) část. Čím je MK delší, tím se více projevují její hydrofobní vlastnosti a tím méně je rozpustná ve vodě (Holeček, 2006). MK jsou přítomné ve všech organismech, a to zejména v podobě esterů s glycerolem, cholesterolem nebo sfingosinem. Malé množství MK se vyskytuje v neesterifikované formě jako tzv. volné mastné kyseliny (Ganong, 2005). Kromě triviálních názvů se užívá v názvosloví MK i označení číslicemi a řeckými písmeny, tzn. x : y (x = počet uhlíků a y = počet dvojných vazeb). U nenasycených MK vyznačujeme i polohu dvojných vazeb. V tomto lze vycházet buď od uhlíku karboxylové skupiny (označovaného jako uhlík č. 1), nebo od opačného konce řetězce, 23

23 tzn. od uhlíku krajní methylové skupiny. Určujeme-li polohu dvojné vazby od karboxylové skupiny, použijeme řecké písmeno Δ (delta), za kterým následují číslice označující uhlík, ze kterého dvojná vazba vychází. Pokud označujeme polohu od uhlíku krajní methylové skupiny, užijeme řeckého písmene ω (omega), za kterým následuje číslice uhlíku dvojné vazby, počítáno od uhlíku krajní methylové skupiny (uhlík ω1) (Kraml, 2008). Příklad dvojího způsobu označení je znázorněn na obrázku 4. CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH = CH CH 2 CH = CH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO Linolová kyselina Δ9,12; 18:2 Karboxylový uhlík CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH = CH CH 2 CH = CH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 COO Linolová kyselina ω6,9; 18:2 Číslování z opačného konce než karboxylový uhlík Obr. 4 Znázornění dvojího číslování uhlíků (Kraml, 2008) Nasycené mastné kyseliny Přehled nasycených MK (saturated fatty acids, SFA), jejich chemickou zkratku a výskyt v přírodě ukazuje tabulka 2. Zdrojem SFA v potravě člověka jsou především potraviny živočišného původu (Svačina, Bretšnajdrová, 2008b). 24

24 Tab. 2 Přehled nasycených MK (Kraml, 2008) Triviální název Počet uhlíků Zkratka Výskyt K. octová C2 2:0 K. propionová C3 3:0 K. máselná C4 4:0 K. valerová C5 5:0 K. kapronová C6 6:0 K. kaprylová C8 8:0 K. kaprinová C10 10:0 produkty trávení sacharidů v bachoru přežvýkavců a v tlustém střevě člověka produkty trávení sacharidů v bachoru přežvýkavců, částečně v másle a jiných tucích zvl. v tucích rostlinného původu, ale i v másle K. laurová C12 12:0 kokosový olej, bobkový list, vorvaňovina K. myristová C14 14:0 kokosový olej, muškát K. palmitová C16 16:0 K. stearová C18 18:0 hojně ve všech živočišných i rostlinných tucích K. arachová C20 20:0 podzemnicový olej K. behanová C22 22:0 semena rostlin K. lignocerová C24 24:0 podzemnicový olej Mononenasycené mastné kyseliny Mononenasycené MK (monounsaturated fatty acids, MUFA) obsahují ve své molekule pouze jednu dvojnou vazbu (Ganong, 2005). Bohatým zdrojem MUFA je např. olej z řepky olejné, dále olivový, slunečnicový nebo konopný olej. Všechny tyto oleje jsou za normálních podmínek tekuté. MUFA přítomné v potravě mají dvojnou vazbu lokalizovanou na 7., resp. 9. uhlíku z methylového konce (Svačina, Bretšnajdrová, 2008b). Nejdůležitější zástupci jsou: Kys. olejová n-9 18:1 Kys. myristolenová n-7 14:1 Kys. palmiolejová n-7 16:1 Kys. eikosanová n-9 20:1 Kys. eruková n-9 22:1 25

25 Polynenasycené mastné kyseliny Polynenasycené MK (polyunsaturated fatty acids, PUFA) obsahují ve své molekule více než dvě dvojné vazby. Ve výživě člověka se řadí k nejvýznamnějším a nejprospěšnějším MK. Byl prokázán pozitivní účinek PUFA na lidské zdraví, a to především v oblasti kardiovaskulárního systému, vývoje mozku u plodu a u novorozenců, demence a kognitivních funkcí (Komprda, 2012). Mezi PUFA se řadí i esenciální MK, tj. takové, které si lidský organismus nedokáže sám syntetizovat a musí být tedy přijímány v potravě (Keresteš, 2011). Pro člověka jsou esenciální dvě MK, a to kys. linolová (LA) a kys. α-linolenová (LNA). LA je výchozím metabolitem PUFA řady n-6, LNA je výchozím metabolitem PUFA řady n-3 (Komprda, Zelenka, 2006). Z LA resp. LNA je lidský organismus schopen dále syntetizovat další potřebné metabolity v rámci obou řad, a to pomocí enzymů desaturáz (zvyšují počet dvojných vazeb) a elongáz (prodlužují molekulu MK). Ve výživě člověka je velmi důležitý vyvážený poměr příjmu MK řady n-6 a n-3 v potravě. Doporučená hodnota poměru n-6/n-3 je 5. Tato hodnota není ale skutečně optimální, jedná se pouze o kompromis mezi skutečně ideální hodnotou 1 a hodnotou, která je v současnosti běžná v rámci stravy západního typu (hodnota 10-20) (Komprda, 2007). Fyziologicky nejvýznamnějším metabolitem LA je kys. arachidonová (C 20:4 n-6). Fyziologicky nejvýznamnějším metabolitem LNA je kys. eikosapentaenová (EPA, C 20:5 n-3) a kys. dokosahexaenová (DHA, C 22:6 n-3) (Poudyal et al., 2011). Konečnými metabolity obou řad PUFA jsou tzv. eikosanoidy (cyklické struktury s dvaceti uhlíky), které mají velmi důležité fyziologické vlastnosti. Do skupiny eikosanoidů patří mimo jiné prostaglandiny (PG), tvořené v trombocytech, leukotrieny (LT), tvořené v endotelových buňkách a tromboxany (TA), vznikající v leukocytech. Uvedené eikosanoidy jsou látky vasoaktivní (působí vasokonstrikčně nebo vasodilatačně) a dále působí na agregaci trombocytů. Eikosanoidy pocházející z řady n-3 mají velice rozdílné fyziologické účinky než ty, které pocházejí z řady n-6 (Das, 2006). Zjednodušené schéma metabolismu esenciálních MK popisuje obrázek 5. Z uvedeného přehledu je patrné, že PUFA mají výrazný vliv na činnost a funkční stav cév, resp. ovlivňují proces aterogeneze a v konečném důsledku možný vznik SCO. Z PUFA n-6 vznikají eikosanoidy řady 2, které působí prozánětlivě, vasokonstrikčně a způsobují agregaci trombocytů. Z PUFA n-3 vznikají eikosanoidy řady 3, které působí právě opačně, tzn. protizánětlivě, vasodilatačně a působí proti shlukování trombocytů (Wall et al., 2010). V konečném důsledku tedy můžeme konstatovat, že PUFA n-3 26

26 snižují riziko vzniku SCO (infarktu myokardu, mozkové příhody apod.), tzv. autoimunitních onemocnění (artritida, psoriáza) a rakoviny. Pokud jsou PUFA n-6 přijímány v nadbytku působí v daném smyslu právě opačně, tedy rizika daných onemocnění zvyšují (Komprda, 2007). Mastné kyseliny řady n-6 (zejm. LA) se vyskytují ve slunečnicovém nebo sójovém oleji. Mastné kyseliny řady n-3 mají dva hlavní zdroje rostlinné a živočišné. Mezi rostlinné zdroje patří především řepkový a lněný olej (obsahující ALA) (Boháčová, 2012) a mezi živočišné zdroje se řadí ryby (především tučné), rybí tuk a mořské plody, které obsahují EPA a DHA (Larsen et al., 2011) Obr. 5 Zjednodušené schéma metabolizmu esenciálních MK (Komprda; 2007) 27

27 Výzkum v Lázních Jeseník byl zaměřen na účinek jogurtu, který byl obohacen polynenasycenými MK řady n-3. U obézních pacientek byla nasazena redukční dieta (6000 kj.den -1 ), byla zařazena individuální pohybová aktivita a byl jim podáván 1 jogurt denně. Jogurt byl obohacen PUFA v dávce 790 mg, z toho EPA + DHA v dávce 620 mg. U kontrolní skupiny byl podáván jogurt stejného složení bez přídavku PUFA. V průběhu podávání jogurtů obohacených PUFA denně po dobu 3 týdnů současně s redukční dietou bylo zjištěno průkazné zvýšení hladiny HDL (Kunešová, 2011). Hlavní roli v udržení a zlepšení zdravotního stavu populace se v současnosti jeví snížení hladiny LDL, zvýšení hladiny HDL a zlepšení celkového lipidového profilu. Tohoto lze podle mnoha studií (Harland, 2012; Lecker et al., 2011; Schulze, 2012) docílit i bez farmakologické léčby, pomocí vhodných potravin. Mezi velmi vhodné potraviny, resp. účinné látky se řadí zejm. rostlinné stanoly a steroly, sójový protein, beta-glukany, ořechy, rostlinné oleje, potraviny bohaté na vlákninu a v neposlední řadě také rybí tuk (Harland, 2012; Lecker et al., 2011; Schulze, 2012). Příznivý vliv složek rybího oleje, především EPA a DHA, na snížení rizika kardiovaskulárních onemocnění, zlepšení dyslipidémie, prevenci rakoviny, snížení rizika ischemické choroby srdeční nebo snížení hypertenze byl publikován již mnohokrát (Given, Gibbs, 2008; Prato, Biandolino, 2012; Simopoulos, 2002; Sidhu, 2003) Lipoproteiny Potravou přijatý tuk a lipidy syntetizované játry a tukovou tkání se musí transportovat do různých tkání a orgánů, aby zde mohly být využity nebo uloženy. Lipidy jsou látky hydrofobní, a proto nemohou být samostatně transportovány ve vodném prostředí (krevní plasma). Nepolární lipidy (TAG a estery cholesterolu) se vážou na polární (amfipatické) lipidy (fosfolipidy a cholesterol) a proteiny, takže vznikají lipoproteiny (LP) mísitelné s vodou (Koolman, Röhm, 2012). Schematické znázornění lipoproteinové částice je na obrázku 6. Optimální zastoupení jednotlivých lipoproteinů, cholesterolu a TAG je uvedeno v příloze 2. 28

28 Obr. 6 Schéma lipoproteinové částice (www4) Rozeznáváme čtyři základní skupiny lipoproteinů, které jsou fyziologicky důležité. Jsou to chylomikrony, které pocházejí ze střevní resorpce triacylglycerolů. Lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL, very low density lipoproteins), které jsou jaterního původu a exportují TAG. Lipoproteiny o nízké hustotě (LDL, low density lipoproteins) a lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL, high-density lipoproteins) se účastní metabolismu VLDL a chylomikronů a také v cholesterolovém transportu. Triacylglycerol je v chylomikronech a VLDL převažujícím lipidem, zatímco cholesterol a fosfolipidy jsou převládajícími lipidy v LDL resp. v HDL (Murray, 2002). Přehled složení lipoproteinů v plasmě člověka uvádí tabulka 3. Tab. 3 Lipoproteiny plasmy (Češka, 1999) Třída Chylomikrony VLDL IDL LDL HDL Hustota (g/ml) < 0,94 1,006 1,019 1,063 > 1,21 Velikost (nm) Cholesterol (%) Triglyceridy (%) Fosfolipidy (%) Proteiny (%)

29 3. 5 Metabolismus lipidů a MK Regulace lipidového a lipoproteinového metabolismu je řízena řadou genů. Modulací exprese těchto genů se organismus adaptuje na změny aktuální energetické potřeby (Afman, Müller, 2012). Exprese genů, které zásadním způsobem kontrolují a řídí lipidový metabolismus, je řízena nukleárními receptory (Kaput, Rodriguez, 2004). Navázáním příslušných ligandů se aktivují nukleární receptory, váží se na cílové geny, a tak umožňují jejich transkripci. Hlavními transkripčními faktory je skupina PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) a skupina SREBP (sterol regulátory element-binding protein). Dalšími transkripčními faktory jsou HNF-4α (hepatic nuclear factor 4α) a LXR (liver X receptor) (Jump, 2004). Mastné kyseliny, zejm. polynenasycené mastné kyseliny působí jako významné nutrientové ligandy pro PPAR a SREBP (Nakamura et al., 2004) Genová exprese Molekuly DNA obsahují informaci k ovládání aktivit buněk a k řízení vývoje, fungování a chování organismů, které tyto buňky obsahují. Tato informace je zakódována v sekvencích nukleotidů uvnitř molekul DNA tvořících genom. Strukturou a funkcí celých genomů se zabývá podobor genetiky, který se nazývá genomika (Snustad, Simmons, 2009). Relativně novými podobory genetiky jsou nutrigenetika a nutrigenomika, které mají velký budoucí potenciál, jak pro genetiku a související obory, tak i pro dietologii a související obory (Ferguson, Barnett, 2012). Nutrigenetika je vědní obor, který se zabývá vlivem jednotlivých genetických polymorfizmů na reakci jedince na látky přijímané v potravě. Nutrigenomika je vědní obor, který se zabývá vztahem mezi celkovou genetickou informací (genomem, transkriptomem) a individuální reakcí na látky přijímané v potravě (Šeda, Šedová, 2005). Nutrigenomika využívá technologie genomiky k tomu, aby odhalila, jak složky potravy mohou ovlivňovat genovou expresi a celkový metabolismus organismu (Afman, Müller, 2012). 30

30 PPAR PPAR (peroxisome proliferator activated receptors; receptory aktivované peroxizomovými proliferátory) jsou nukleární transkripční faktory, které patří do velké skupiny steroidních receptorů (Das, 2006). Původně byly objeveny u hlodavců jako regulátory proliferace peroxisomů, odtud pochází jejich název. Tato skutečnost ovšem nemá s metabolismem lipidů žádnou přímou souvislost (Haluzík, Svačina, 2005). Rozlišujeme 3 typy: PPAR-α, PPAR-δ (někdy označované PPAR-β/δ) a PPAR-γ. Přestože jsou si navzájem velmi podobné, mají rozdílné biologické funkce a jinou lokalizaci (Charoensuksai, Xu, 2010). Funkce, lokalizace a ligandy jednotlivých PPAR zobrazuje tabulka 4. Tab. 4 Funkce, lokalizace a ligandy jednotlivých PPAR (Kraml, 2008) Nukleární TF Lokalizace Přirozené ligandy Syntetické ligandy Funkce játra, kosterní sval, Zvýšení vychytávání MK a PPAR-α myokard, ledvina, monocyty/makrofágy MK fibráty oxidace MK Snížení hladin TAG Zvýšení hladin HDL (v cévní stěně) Snížení tvorby malých LDL Zvýšení oxidace MK PPARβ/δ většina tkání MK Snížení hladin TAG? Zvýšení hladin HDL? Snížení tvorby malých LDL? Zvýšení ukládání MK v tukové tuková tkáň, kosterní tkáni PPAR-γ sval, monocyty/makrofágy (v cévní stěně), MK thiazolidindiony Zvýšení diferenciace adipocytů Snížení glykémie Zvýšení inzulínové senzitivity kolon Zvýšení hladin HDL? Snížení hladin TAG? 31

31 Mechanismus fungování PPAR lze zjednodušeně popsat v několika krocích (schéma na obrázku 7). Ligand (např. DHA) prochází cytoplasmatickou membránou a naváže se na PPAR. Tímto dochází ke konformační změně a aktivaci PPAR. PPAR spolu s RXR (retinoid X receptor) vytváří heterodimerní komplex a přechází do buněčného jádra. Tento komplex PPAR/RXR se následně váže přímo na rozpoznávací sekvenci na řetězci DNA, tzv. PPAR responsive element. PPAR responsive element se skládá ze dvou přímo se opakujících nukleotidových sekvencí AGGTCA. Výsledkem celého procesu je exprese cílového genu (Nakamura et al., 2004). Obr. 7 Mechanismus fungování PPAR (zpracováno podle Komprdy, 2012 a Nakamury, 2004) MK (dále také eikosanoidy) jsou považovány za endogenní ligandy všech typů PPAR. SFA, MUFA a PUFA s rozdílnou délkou řetězce mají různou afinitu k jednotlivým PPAR, všechny MK mají však největší afinitu k PPAR-α (Haluzík, Svačina, 2005). Obecně lze konstatovat, že všechny typy PPAR více váží PUFA ω3 a ω6 s uhlíky než MUFA nebo SFA (Nakamura et al., 2004). 32

32 SREBP SREBP (Sterol regulatory element-binding proteins) jsou skupina nukleárních transkripčních faktorů, které zásadním způsobem regulují expresi genů zúčastněných v syntéze MK, TAG, fosfolipidů a cholesterolu. Zatím byly popsány 3 typy: SREBP 1a, SREBP 1c a SREBP 2 (Müller-Wieland, 2002). SREBP 1c preferenčně aktivuje syntézu TAG a fosfolipidů. SREBP 1a a SREBP 2 aktivují geny pro syntézu a transport cholesterolu (Nakamura et al., 2004). Cholesterol a další steroly, ale i MUFA a PUFA, jsou přirozenými inhibitory působení SREBP. Neváží se ale na ně jako ligandy (jako je tomu např. u PPAR), ale regulují jejich dostupnost pro jejich následný účinek v jádře (Worgall et al., 2002). Všechny SREBP jsou syntetizovány jako inaktivní transkripční prekurzory uložené v endoplazmatickém retikulu (ER). Proteolytickými enzymy jsou odštěpovány z membrán Golgiho komplexu a jako aktivní TF migrují do jádra (Soccio, Breslow, 2004). V jádře se váží na specifickou část promotorové oblasti cílového genu sterol response element SRE (Dif et al., 2006). SREBP je v ER vázán na dva proteiny SCAP (SREBP-cleavage activating protein) a INSIG 1 (Insulin-induced gene 1 protein). Je-li v buňce dostatek cholesterolu, SREBP zůstává navázán na proteiny. Při poklesu hladiny intracelulárního cholesterolu se INSIG 1 uvolní z komplexu SREBP-SCAP. Tímto je umožněna migrace komplexu SREBP- SCAP z ER do Golgiho komplexu (pomocí transportního proteinu COP II). V Golgiho komplexu působí na SREBP dvě proteasy S1P a S2P (site 1 protease, resp. site 2 protease). Jejich působením dochází k odštěpení SREBP od SCAP a jako dimer je transportován do jádra (pomocí přenašeče Importin β). V jádře se dimer SREBP váže na SRE řady genů, a umožňuje tak jejich transkripci. Jedná se především o gen pro HMG-Co-A-reduktasu a gen pro LDL receptor (Kraml, 2008). Celý proces je velmi složitý a zahrnuje mnoho mezikroků. Zjednodušené schéma je znázorněno na obrázku 8. 33

33 Obr. 8 Regulace syntézy cholesterolu pomocí SREBP (zpracováno podle Kramla, 2008 a Komprdy, 2012) psrebp SREBP SCAP INSIG 1 ER S1P S2P prekurzorová forma SREBP sterol regulatory element-binding proteins SREBP-cleavage activating protein (protein aktivující štěpení SREBP) Insulin-induced gene 1 protein (insulinem stimulovaný gen) endoplazmatické retikulum protéza štěpící prekurzorovou formu SREBP (site-1 protease) protéza štěpící prekurzorovou formu SREBP (site-2 protease) 34

34 Vliv DHA na homeostázu cholesterolu Jak již bylo řečeno výše, EPA (C 20:5 n-3) a DHA (C 22:6 n-3) jsou fyziologicky nejvýznamnější metabolity kyseliny α-linolenové. Je průkazně potvrzeno, že PUFA n-3 (zejm. EPA a DHA) snižují riziko ischemické choroby srdeční, snižují krevní tlak, snižují riziko vzniku některých typů rakoviny (Mateos, Lewandowski, Su, 2012), působí preventivně proti kardiovaskulárním onemocněním (Prato, Biandolino, 2012; Poudyal et al., 2011), pozitivně ovlivňují koncentraci TAG a pozitivně působí na metabolický syndrom (Huertas-Lopez, 2012). DHA ovlivňuje homeostázu cholesterolu složitým procesem, který obsahuje mnoho mezikroků, a může mít ve výsledku dva protichůdné vlivy. Zjednodušené schéma ukazuje obrázek 9. DHA se přesouvá přes plazmatickou membránu do jádra buňky a působí aktivaci transkripčních faktorů PPAR a SREBP. Tímto dochází k iniciaci transkripce dvou genů gen pro HMG-CoA-R (3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzym A reduktáza) a gen pro LDL-R (LDL-receptor). HMG-CoA-R je klíčový enzym syntézy cholesterolu, určuje rychlost syntézy cholesterolu a ovlivňuje celý metabolismus cholesterolu v organismu. LDL-receptor (pro lipoproteiny nízké hustoty) má obrovský význam pro přenos lipidických frakcí z krevního oběhu do buněk. DHA také stimuluje fosforylaci kináz, čímž dochází k fosforylaci zbylé části SREBP. Vazba fosforylované formy SREBP na DNA je inhibována. Tímto mechanismem dochází k inhibici enzymu HMG-CoA-R, důsledkem toho je snížení koncentrace cholesterolu v krevním oběhu. Naproti tomu dochází také k inhibici genu pro LDL-receptor, tím je potlačena syntéza dané bílkoviny a sníží se množství LDL-receptoru. Výsledkem je snížení vstupu cholesterolu do buňky (Komprda, 2012). Zde se střetávají dva protichůdné vlivy: HMG-CoA-R způsobuje snížení koncentrace cholesterolu v krvi, ale LDL-R způsobuje zvýšení koncentrace cholesterolu v krvi. Důsledkem tohoto mechanismu je hypotéza, že PUFA n-3 snižuje hladinu plazmatického cholesterolu, ale kvůli těmto mechanizmům může dojít i k opaku (Sato, 2010). 35

35 Obr. 9 Vliv DHA na homeostázu cholesterolu (zpracováno podle Komprdy, 2012 a Sato, 2010) 1) DHA přímo aktivuje PPARα 2) DHA vytěsňuje cholesterol z plazmatické membrány 3) DHA stimuluje fosforylaci kináz 4) aktivovaný PPARα aktivuje gen Insig 5) zvýšení množství proteinu INSIG v membráně endoplazmatického retikula 6) SREBP-2 je zadržen v membráně endoplazmatického retikula 7) snížení množství aktivní formy SREBP-2 8) zbylá část SREBP-2 je fosforylována 9) inhibice vazby fosforylované formy SREBP-2 na DNA 36

36 3. 6 Metody molekulární biologie pro detekci a kvantifikaci genové exprese Vliv výživy na lidské zdraví je dnes prokázaný. Avšak až nedávný rozvoj biochemických a molekulárně biologických metod umožnil detailnější objasnění mechanismů působení jednotlivých složek potravy (Šeda, Šedová, 2004). Pomocí analýzy transkriptomu, proteomu a metabolomu je nám schopna nutriční genomika poskytnout koncepci individualizované výživy. Personalizovaná výživa respektuje nejen kvantitativní a kvalitativní potřeby jedince a jeho aktuální zdravotní stav, ale i genetické dispozice jedince. Hlavním cílem tohoto relativně nového oboru je zabránit vzniku některých onemocnění, jako je obezita, hypertenze nebo diabetes mellitus 2. typu (Kaput, Rodriguez, 2004). Většina metabolických pochodů v lidském těle je katalyzována bílkovinnými enzymy. Sekvence AMK všech proteinů je kódována DNA. Aby bylo možné vytvoření funkčních enzymů (i všech ostatních bílkovin) je potřeba převést informaci zakódovanou v DNA do proteinů. Proces exprese genů lze rozdělit do dvou hlavních fází: transkripce a translace (plus další fáze jako jsou posttranskripční a posttranslační úpravy). Metody analýzy genové exprese můžeme nejjednodušeji rozdělit na dvě skupiny: studium transkripce a studium translace (Pritchard, Korf; 2007). V současnosti dochází k neustálému vývoji nových metod, které se využívají ke studiu genové exprese. Jedna z nejpoužívanějších technik molekulární biologie je dnes polymerázová řetězová reakce (PCR = polymerase chain reaction). Polymerázová řetězová reakce byla objevena v roce 1985 Kary B. Mullisem, který za tento objev dostal v roce 1993 Nobelovu cenu (Brown, 2007). PCR napodobuje replikaci in vivo, jedná se tedy o techniku, která selektivně amplifikuje úsek nukleové kyseliny in vitro. (Mazura a kol., 2001) V této práci se zaměřím na dvě modifikované metody PCR: reverzně transkripční PCR a real-time PCR Reverzně-transkripční PCR Reverzně-transkripční PCR je metoda určená k amplifikaci molekul RNA (Obr. 10 a Obr. 11). RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR, a proto je nutné izolovanou RNA nejdříve převést na cdna zpětnou (reverzní) transkriptázou. Od toho je odvozen název této metody (Šmarda a kol., 2010). Enzym reverzní transkriptáza katalyzuje 37

37 syntézu řetězců DNA, které jsou komplementární k templátům RNA. Výsledné řetězce DNA se mohou převést na dvojřetězcovou DNA pomocí několika různých metod. Jedná se například o metodu s použitím druhého primeru a tepelně stabilní Taq DNApolymerázy. Výsledné molekuly DNA se následně amplifikují při standardní PCR (Snustad et al., 2009). Obr. 10 Detekce a amplifikace RNA pomocí reverzně-transkripční PCR (Snustad et al., 2009) 38

38 Obr. 11 Syntéza dvojřetězcových cdna z molekul mrna (Snustad et al., 2009) Citlivost této metody je velmi vysoká, a tak umožňuje detekci specifické mrna v jediné buňce. Hlavní výhoda této metody spočívá v možnosti detekce takových molekul mrna, které se v buňce vyskytují ve velmi nízkých hladinách (Šmarda a kol., 2010) Real-time PCR Real-time PCR je metoda molekulární biologie, která je založena na principu klasické PCR. Při klasické PCR je obvykle amplifikovaný produkt detekován pomocí gelové elektroforézy až po ukončené PCR reakce (Šmarda a kol., 2010). Při metodě real-time PCR je produkt detekován a měřen po každém proběhnutém cykle, což 39

39 umožňuje detekci produktu a zároveň kvantifikaci předvoleného množství templátu. Velkou výhodou této metody je to, že odpadá potřeba gelové elektroforézy. Při realtime PCR je možné pracovat také s RNA, potom se tato metoda nazývá real-time RT PCR. Tato metoda je používána především na expresní analýzy, při kterých je díky vysoké citlivosti a lehkému provedení ideální metodou pro detekci a kvantifikaci mrna (Leong et al., 2007; Bustin, 2000). Detekce PCR produktu v průběhu reakce je umožněna přidáním fluorescenční barvy do reakční směsi. Množství PCR produktu je přímo úměrné měřené fluorescenci. Reakce probíhá ve speciálním cykleru, který po každém cykle měří fluorescenci a údaje zaznamenává. Tyto údaje jsou poté zpracovány softwarem, který sestrojí graf křivky amplifikační reakce, kde na ose x leží počty jednotlivých cyklů a na ose y naměřená fluorescence. Křivka amplifikační reakce (Příloha 3) má dvě fáze exponenciální a neexponenciální. V exponenciální fázi se v každém cyklu množství PCR produktu zdvojnásobí. V neexponenciální fázi došlo k vyčerpání některého z komponentů reakce, a proto se množství PCR produktu dále nezvyšuje. Na počátku reakce je fluorescence nízká a nedekovatelná. V průběhu reakce se postupně zvyšuje množství PCR produktu, čímž se zvyšuje i měřená fluorescence. Právě ten cyklus, ve kterém se nahromadilo dostatečné množství PCR produktu, aby byla fluorescence detekovatelná, se nazývá treshold cycle (C T ). Hodnoty treashold cyklu jsou pro jednotlivé vzorky různé a závisí od počátečního množství teplátu. Čím vyšší je množství templátu, tím méně cyklů stačí k dosažení detekovatelné fluorescence a tím nižší hodnotu C T má daný vzorek. (Bustin, 2000) Pro ověření spolehlivosti reakce slouží standardní (kalibrační) křivka. Pro sestrojení standardní křivky je potřeba provést reakci s ředící řadou templátu. Standardní křivka se sestrojí vynesením logaritmu množství templátu (nebo ředícího faktoru), proti hodnotě C T pro dané ředění. Standardní křivka je většinou sestrojena pomocí softwaru, který vypočítá i korelační koeficient. Korelační koeficient nás informuje o tom, jaká je variabilita mezi replikacemi a zda je amplifikace stejně efektivní pro různé počáteční koncentrace templátu. Korelační koeficient nám také ukazuje chybu při ředění a při pipetování. Optimální hodnota korelačního koeficientu je 0,990 (Dorak, 2006). PCR produkty je možné ověřit analýzou křivky tání (melt-curve analysis). Po ukončení PCR reakce je postupně zvyšována teplota a zároveň je měřená fluorescence. S rostoucí teplotou dochází k denaturaci PCR produktů, čímž klesá fluorescence. Změna fluorescence je vnesena do grafu jako funkce změny teploty. Jednotlivé vrcholy křivky 40

40 představují PCR produkty, charakteristické svou teplotou tání (Tm). Tato analýza nám umožňuje odhalit nespecifické amplifikace i bez gelové elektorforézy (Dorak, 2006). Existují dva základní typy chemických přístupů využívaných v real-time PCR: přidání nespecifických interkalačních fluorescenčních látek, např. SYBR Green, YO- PRO-1, etidium bromid do reakční směsi (Mackay et al., 2002) nebo použití sekvenčně specifických primerů a prób, např. TaqMan, molecular beacons, scorpions primer (Bustin, 2000). Nenavázaný SYBR Green I vykuzuje nízkou fluorescenci. Má schopnost se nespecificky navázat na DNA, což vede ke značnému zvýšení fluorescence. V PCR reakci se váže na nově vznikající dvojvláknové úseky při extenzi primerů, a tím dochází k zvýšení fluorescenčního signálu, který je měřený po každé extenzi. Vzhledem k nespecifické vazbě na DNA dochází k začlenění i do nespecifických PCR produktů nebo do dikérů, které mohou vznikat spojením primerů. Tímto může dojít k nepřesnostem a zkreslení výsledků. Nespecifické produkty se dají detekovat analýzou křivky tání (Bustin, 2004). Výhodou nespecifických fluorescenčních barviv je nízká cena a jednoduchost práce. Při vhodném návrhu pokusu a optimalizaci PCR reakce je možno dosáhnout výsledků srovnatelných s TaqMan, který většinou zajišťuje vyšší specificitu reakce (Ponchel et al., 2003). Jednou z nevýhod tohoto postupu je to, že není možné tento postup využít při multiplex reakci (reakce s několika páry primerů v jedné zkumavce), protože není možné odlišit fluorescenční signál jednotlivých amplikonů ve zkumavce (Bustin, 2004). Při použití značených oligonukleotidů a prób se využívá schopnost fluorescenčně rezonančního přenosu energie (FRET) mezi fluorofórem a zhášečem, popř. jiný princip zhášení fluorescence. FRET je spektroskopický proces přenosu energie mezi dvěmi molekulami vzdálenými až 100 Å (Mackay et al., 2002). Tento postup se používá, aby zabránil fluorescenci próby nebo značeného oligonukleotidu před jejich specifickým navázáním při amplifikaci produktu. Nejpoužívanější technologií je TaqMan, která využívá značenou sondu. TaqMan, vyžaduje kromě sekvenčně specifických primerů také přítomnost sekvenčně specifické TaqMan próby, která na svém 5 konci nese fluorescenční reportérovou molekulu a na 3 konci zhášač fluorescence. Intaktní próba nevykazuje žádnou fluorescenci, kvůli blízkosti reportéru a zhášeče. Při annealingu hybridizuje próba na cílovou sekvenci ve směru extenze nového řetězce. 5'-3' exonukleázová aktivita DNA-polymerázy odštěpí při extenzi primeru reportérovou 41