OPVK CZ.1.07/2.2.00/

Transkript

1 OPVK CZ.1.07/2.2.00/

2 Toxikologie omamných a psychotropních látek OCH/TOPL 7 RNDr. Tomáš Gucký, Ph.D. ZS 2012/2013

3 Metodické aspekty toxikologické analýzy

4 Strategie vývoje nových analytických metod pro KB POŽADAVEK NA ZAVEDENÍ NOVÉHO LAB.VYŠETŘENÍ EKONOMICKÁ A ODBORNÁ ROZVAHA KOMERČNĚ DOST.METODA EKONOMICKÁ ANALÝZA VERIFIKACE METODY IN HOUSE VYVINUTÁ M. LITERÁRNÍ REŠERŠE VOLBA VHODNÉ INSTRUMENTACE DISKUZE S KLINIKEM SPECIFIKACE POŽADAVKU VOLBA VHODNÉ BIOL.MATRICE ZPRACOVÁNÍ A STABILITA VZORKU OVĚŘENÍ INTERFERENCÍ KALIBRAČNÍ A KONTROLNÍ MATERIÁL VALIDACE METODY ZAJIŠTĚNÍ EQC M A R K E T I N G ZAJIŠTĚNÍ EQC VÝVOJ ANAL. METODY PRACOVNÍ ROZSAH MEZE DETEKCE A STANOVITELNOSTI ZAVEDENÍ METODY DO KLINICKÉ LABORATORNÍ PRAXE ZP

5 Správná lab.praxe, certifikace a akreditace Mezinárodní normy: ČSN EN Všeobecná kritéria pro činnost zkušebních laboratoří ISO 9001: Systémy jakosti ČSN ISO 17025: Systémy řízeníkvality v kalibračních a zkušebních laboratořích ČSN ISO 15189: Systémy řízení kvality v klinických laboratořích Certifikace potvrzeníshody systému řízení jakosti v organizaci s mezinárodní normou Akreditace úředníuznánízpůsobilosti laboratoře vykonávat určitou činnost (která je prováděna v souladu s některou z norem) ČIA Český institut pro akreditaci NASKL Národní akreditační středisko pro klinické laboratoře

6 Algoritmus klinickotoxikologického vyšetření SPECIFIKACE POŽADAVKU, VOLBA MATERIÁLU, ANAMNÉZA PODEZŘENÍ NA UŽITÍ OPL TĚKAVÉ, NETĚKAVÉ PODEZŘENÍ NA INTOXIKACI LÉČIVY / PŘÍR.LÁTKAMI PODEZŘENÍ NA OTRAVU ANORG. LÁTKAMI (kovy, CO, apod.) KVALITATIVNÍ, SEMIKVANTITATIVNÍ ORIENT. SCREENING SYSTEMATICKÝ PRŮKAZ NOX TLC SPECIÁLNÍ METODY DOPLŇUJÍCÍ BIOCH. PARAMETRY NEGATIVNÍ POZITIVNÍ KONFIRMACE PŘESNÁ IDENTIFIKACE event. KVANTIFIKACE UŽITÉ NOXY / NOX Množství vzorku: Moč ml Krev 2 x 15 ml Forenzní požadavky

7 Odběr biologického materiálu (BM) pro účely toxikolog. analýzy 1) Odběr BM u zemřelých osob moč (veškerá, která je v močovém měchýři, optimum ml) krev (z dolních končetin, v poslednídobě i ze srdce, popř. z jater 8 ml, možné rozdíly v koncentraci některých medikamentů) žaludeční obsah (veškerý obsah optimum ml) střevníobsah (z tenkého střeva s obsahem 1 m a tlustého střeva s obsahem 0,5 m) orgány (polovina jater, jedna celá ledvina, část mozku a plic) 2) Odběr BM u živých osob moč (50 ml) žaludeční obsah (min. 50 ml) krev (min. 8 ml) 3) Obecná pravidla při odběru BM Pitevní materiál (orgány, ŽO, SO) do širokohrdlých nádob samostatně, nepoužívat žádné konzervační látky, dbát na správné označení odebraného BM, důsledné vyplnění žádanky k toxikologickému vyšetření anamnestické údaje, uvést dobu a způsob odběru vzorku, zabezpečit přepravovaný materiál proti rozbití, resp. proti jinému znehodnocení, materiál po odběru bezprostředně zaslat k toxikologickému vyšetření.

8 Uchování biologického materiálu (BM) pro účely toxikolog. analýzy lednice 4 o C (pro některé TVL nutnost 20 o C) tma Zvláštní význam při intoxikaci návykovými látkami pravost vzorku (měření ph, teplota) vyloučení možné kontaminace (saponáty, dezinfekční prostředky) možnost ředění vzorku donesení si připraveného vzorku Důsledkem je znehodnocení analýzy!!!

9 Screeningové metody KVALITATIVNÍ METODY VÝHODY: NEVÝHODY: Rychlost, snadná dostupnost, mnoho analytů Četné zkřížené reakce falešná pozitivita Vyšší hodnoty CUT-OFF pro některé analyty falešná negativita Riziko subjektivního hodnocení Vyšší spotřeba vzorku SEMIKVANTITATIVNÍ METODY S ELEKTRONICKOU DETEKCÍ VÝHODY: NEVÝHODY: Rychlost, malá spotřeba vzorku, menší riziko zkřížených reakcí, nižší hodnoty CUT-OFF Dostupnost jen na specializovaném pracovišti

10 Vlastní toxikologická analýza BM - každý případ vyžaduje individuální přístup - komplikující skutečnosti: nízká koncentrace noxy, nepřítomnost původní formy látky (nutnáznalost metabolismu), balastnílátky, autolýza (hnilobný rozklad) živý, mrtvý zdravotnictví, policie neznámá látka, cílené vyšetření kvalita, kvantita Základní schéma toxikologického vyšetření příprava vzorku (deproteinace, izolace LLE, SPE, speciální postupy) průkaz (TLC, GC, Imunochemické metody) identifikace (TLC, GC-MS, FID, HPLC-PDA, ECD, NPD, UV-VIS spektrofotometr) stanovení(gc, HPLC, UV-VIS spektrofotometr) interpretace výsledků

11 Průkaz neznámé látky screening NL Imunochemické vyšetření moče na přítomnost NL v současné době je na trhu celá řada imunochemických testů, které jsou pro screeningové vyšetřenímoče na OPL velice výhodné z hlediska Rychlosti Snadné technické obsluhy Materiálová nenáročnost Záchyt i velmi nízkých koncentrací citlivost Skupinový záchyt určité skupiny NL výsledky imunochemických metod pro diskutované látky jsou pouze orientační každý pozitivní výsledek je nutné potvrdit jinou nezávislou metodou vhodnéje screeningové vyšetřeníanalyzovaného materiálu na přítomnost dalších TVL

12 Imunochemickémetody Princip Kompetice (soutěž) měřeného analytu ( léčivo, droga) = antigen Ag(hapten) se značenou formou téhožléčiva či drogy = antigen Ag* o vazebná místa na limitovaném množstvíspecifické protilátky = antibodyab za vzniku biospecifickévazby ve vzniklých imunokomplexechagaba Ag*Ab. Ag + Ag*+ Ab AgAb+ Ag*Ab + Ag + Ag* Podíl vázaného značeného léčiva či drogy je nepřímo úměrný koncentraci měřeného léčiva či drogy ve vzorku.

13 Značeníantigenu (případně protilátky) enzymem EMIT geneticky upraveným enzymem CEDIA radioizotopem RIA fluorescenční látkou FIA chemiluminiscenční látkou LIA Heterogenníimunometody separace molekul značeného reagens vázaného v imunokomplexu od volných molekul značeného reagens v roztoku (radioimunometody) vysoká citlivost Homogenníimunometody bez separace frakcí, jsou jednodušší, rychlejší, lze je snáze automatizovat (enzymová, fluorescenčnía chemiluminiscenčníimunoanalýza)

14 Enzymové imunometody EMIT: enzyme multiplyed immunoassay technique značeníenzymem bakteriální glukozo-6 fosfát dehydrogenáza G6PD nízká koncentrace stanovované látky Ag: zůstává větší množství volné protilátky Ab nevyvázanáprotilátka inhibuje enzym ve značeném antigenu Ag* -snižuje jeho aktivitu menšímu množstvíanalytu odpovídá většímnožstvívolné protilátky a menšíaktivita enzymu většímu množstvíanalytu odpovídá menšímnožstvívolné protilátky a většíaktivita enzymu fotometrické měřeníenzymové aktivity G6P + NAD 6PGL + NADH (340 nm) substrát G6PD

15 Antigeny Ag makromolekuly (polymery: proteiny, polypeptidy ) navozují specifickou imunitní opovědˇ specificky reagujís protilátkami hapten nízkomolekulární látka (léčiva, drogy) navázána na vysokomolekulární nosič Protilátky Ab bílkoviny (glykoproteiny) tělních tekutin vykazujíspecifickou vazebnou schopnost vůči antigenu, na jehož podnět se vytvořily Typy protilátek Ab: cíleně připraveny proti determinantnískupině, která je specifická jen pro jedno chemické individuum např. 6-monoacetylmorfin cíleně připraveny proti chemické struktuře, která je společná pro více strukturně chemicky příbuzných látek např. opiáty

16 TEST Citlivost ng/ml Cut off ng/ml GC-MS Cut off NIDA Cut off Testovaná látka Detekovatelnost Amfetaminy D-Amfetamin 3-5 dní BZD Nordiazepam 1-7 dní Cannabionidy THC-COOH dní Cocain Benzoylecgonin 2-3 dny Opiáty /200 0 Morfin 3 dny TEST Falešná negativita Falešná pozitivita Amfetaminy Efedrin Diclofenac, Ibuprofen Benzodiazepiny Cannabinoidy Cocain Opiáty Flunitrazepam Bromazepam Cannabidiol Cannabinol Cocain, Ecgonin, Ecgonin-methylester Norcodein, Normorfin, Oxycodon, Oxymorfon Codein, MDMA, Karbamazepin Midazolam, Procain, PenicilinG, Lorazepam Diclofenac, Diazepam, Clonazepam Diclofenac, Histamin, Lorazepam, Midazoloam

17 Aplikace imunochemických metod: terapeutické monitorování hladin léčiv TDM : dovolujírychlý klinický zásah diferenciální diagnostika akutních intoxikací paracetamol hepatotoxicita s dlouhou latencí, poškozenílze odhadnout v prvních 12 hod po dávce digoxin kardiotoxicita theofylin astmatické onemocnění carbamazepin, fenobarbital aj. náhodné či úmyslné požití diferenciálnídiagnostika pro skupinový záchyt léčiv a drog při akutních intoxikacích a toxikománii tricyklická antidepresiva barbituráty benzodiazepiny kanabinoidy budivé aminy opiáty kokain

18

19 Konfirmační metody Metody tenkovrstevné chromatografie: vhodné pro systematický průkaz nox orientační nález nutno dále konfirmovat specifičtějšími metodami Příprava vzorku: extrakce do kapaliny A: extrakt bazických a neutrálních nox B: extrakt kyselých nox Metabolity konjugáty nutno uvolnit hydrolýzou

20 Screeningovémetody TLC Způsob provedení: Stacionární fáze silikagel (kyselina křemičitá), oxid hlinitý, komerční přípravky: silufol, kieselgelg Mobilnífáze směs organických rozpouštědel RF faktor podíl vzdálenosti skvrny látky od startu a vzdálenosti čela rozpouštědla RF faktor ovlivňuje: chemická struktura látky složení mobilní fáze ph teplota, vlhkost materiál nosiče

21 TLC Případ č.1

22 UV 366 nm Případ č.2 Po detekci Marquisovým činidlem Po detekci H 2 SO 4 Po detekci Marquisovým činidlem

23 Po detekci Dragendorffovým činidlem a jodem Carbamazepin odparek A i B detekce: 366 nm: modrozelená fluorescence 254 nm: fluorescence Marquis: zelená fluorescence Žluté skvrny metabolitů Drag.: or Hg/ DFK: mf antiepileptikum

24 Případ č.3 detekce: BM detekce: H 2 SO 4, FeCl 3, Dragg., jod detekce: Maquis

25 Případ č.4

26

27 Chromatografie - separační metoda, při které se oddělují (separují) složky obsažené ve vzorku - vzorek se vnáší mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze stacionární fáze je nepohyblivá (ukotvená na stěnách kolony) mobilnífáze je pohyblivá (plyn, kapalina) - pohybem mobilní fáze přes stacionární fázi je vzorek unášen. Složky vzorku jsou na základě svých chemických vlastností zachytávány na stacionární fázi, a proto se při pohybu zdržují. Čím silněji jsou složky vzorku ke stacionární fázi poutány, tim později se eluují z kolony.

28 Plynová chromatografie vzorek, který se ihned po nástřiku mění na plyn, se dávkuje do proudu plynu (mobilní fáze) který jej unáší na kolonu, kde se separují jednotlivé složky vzorku. Složky opouštějící kolonu indikuje detektor pro separaci látek, které mají dostatečný tlak syté páry, jsou tepelně stálé, M R < 1000 (plyny, nedisociované kapaliny, pevné organické molekuly, organokovové látky) Schéma plynového chromatografu

29 Kapalinová chromatografie mobilní fáze je kapalina je možno pracovat za laboratorní teploty bez nutnosti převádět vzorek na plyn, proto je tato metoda vhodná i pro separaci tepelně nestálých a netěkavých sloučenin Schéma kapalinového chromatografu

30 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s detektorem diodového pole s fluorescenční detektorem s elektrochemickým detektorem

31 Kapalinová chromatografie s hmotnostním detektorem

32 Plynováchromatografie s hmotnostním detektorem s plamenovým ionizačním detektorem

33 (x10,000,000) TIC (50.00) (50.00) (50.00) (x1,000,000) TIC (50.00) (50.00) (50.00) 7.0 Metamfetamin IS Amfetamin Chromatografický záznam pacienta (nález amfetaminů) % % Amfetamin Metamfetamin

34 (x1,000,000) 1.0TIC (1.00) (2.01) (3.37) (x1,000,000) TIC (1.00) (2.01) (3.37) Chromatografický záznam pacienta (nález THCCOOH)

35 Konfirmační metody Plynová chromatografie (GC): Plamenoionizační detekce (FID) těkavé látky Hmotnostní spektrometrie (MS) specifická hmotnostní spektra, přesná identifikace na základě znalosti retenčního času a specifických fragmentů molekuly, katalogy, knihovny spekter Kapalinová chromatografie (HPLC): Optická detekce: UV, RF vhodné pro určité typy analytů Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS) extrémně specifický způsob detekce

36 Ukázka chromatogramu GC-MS