Forenzní a analytická toxikologie

Transkript

1 Forenzní a analytická toxikologie Daniel Jun a Kamil Kuča

2 Literatura Forenzní a klinická toxikologie, laboratorní toxikologická vyšetření Marie Balíková, Galén, 2004 Farmakologie a toxikologie H. Lüllmann a kolektiv, Grada Publishing, 2002 Laboratorní diagnostika, T. Zima, Galén, 2003

3 Úvod I. základem forenzní toxikologie = toxikologie, aplikovaná pro právní účely identifikace a kvantifikace toxické noxy a metabolitů, účelem vysvětlit příčiny poškození nebo popř. úmrtí materiál je zkoumán z živých osob (zejména návykové látky) nebo post mortem

4 Úvod II. návykové látky ve vztahu k dopravě, pracovnímu procesu apod. výrazné soudní či administrativní dopady na jedince požadavek na vědeckou a právní obhajitelnost, nezpochybnitelnost -> správná volba vzorků, dostatečné množství (možnost opakované analýzy)

5 Úvod III. řádné značení a protokolace vzorků, nezaměnitelnost správné uchovávání, konzervace zamezení nežádoucí kontaminace (nádoby pro odběr, při zpracování apod.) minimalizace rozkladu vzorku (ztráty) důležité u plynných vzorků

6 Úvod IV. v klinické i forenzní toxikologii se uplatňují postupy STA (systematické analytické toxikologie) řeší vyhledávání jedu a jeho metabolitů, z dílčích kroků analýzy vyplývají následné postupy podmínkou přesná znalost osudu nox, jejich metabolitů a toxických projevů

7 Farmakokinetika, metabolizmus I. absorpce z místa aplikace distribuce v organizmu metabolizmus, eliminace různé způsoby podání, dle toho se liší vstřebané množství, nástup účinku a průběh hladiny látky a jejich metabolitů v těle v čase (intravenózní vs. orální podání)

8 Farmakokinetika, metabolizmus II. Absorpce dle způsobu podání rozsah a rychlost absorpce nejvýznamnější GIT, látky se vstřebávají dle stupně ionizace pasivní difůze neionizované formy do krevních kapilár GIT velmi ionizované látky (paraquat) se vstřebávají podél celého traktu

9 Farmakokinetika, metabolizmus III. žaludek (ph cca 2) -> horní část tenkého střeva (ph 5-7) -> dolní část tenkého střeva (ph 7-8) ->tlusté střevo (ph 7-8) možnost podat absorbens biologická dostupnost rozdíl oproti i. v. podání (%) enterohepatální recirkulace (látky s molek. hmotností > než cca 500) vstřebány přímo nebo jako metabolity

10 Farmakokinetika, metabolizmus IV. Distribuce distribuční objem Vd = a/c a množství noxy vztažené na plazmat. koncentraci c plazmatická konc. po dosažení distribuční rovnováhy ethanol, kofein 35 l, delta 9-THC 630 litrů možnost odhadu podané dávky

11 Farmakokinetika, metabolizmus V. Eliminace hlavně játra a ledviny (plíce, žluč, stolice, pot, mateřské mléko apod.) clearance objem plazmy, očistěné od noxy za časovou jednotku, aditivní hodnota závisí na zdrav. stavu orgánů čím větší je Vd, tím je při dané hodnotě clearance eliminace pomalejší (např. delta 9-THC) eliminační poločas doba, za kterou klesne plazmatická konc. na 50 %

12 Farmakokinetika, metabolizmus VI. játra first-pass effect presystémová eliminace, týká se GIT, působení metabolických systémů ledviny reabsorpce neionizovaných molekul (tubuly, kanálky), filtruje se podíl nevázaný na bílkoviny (glomeruly), závisí na ph krve

13 Farmakokinetika, metabolizmus VII. možnost ovlivnit rychlost eliminace změnou ph moče Akumulace nox plazma, tkáně akumulace dána počtem dávek, intervalem a rychlostní eliminační konstantou

14 Biotransformace působení organizmu na cizorodé látky změna chem. struktury zejména lipofilní noxy podléhají rozsáhlé metabolizaci nejde vždy o detoxikaci látky (methanol -> formaldehyd, kyselina mravenčí; parathion - >paraoxon apod.)

15 Biotransformační reakce I. reakce fáze I nesyntetické zejména oxidační (hydroxylace, O a N dealkylace, tvorba S oxidů a N oxidů), méně redukční a hydrolytické reakce fáze II syntetické konjugační reakce s kys. glukuronovou, sírovou, glycinem, cysteinem, methylace a acetylace maskování funkčních skupin z původní struktury nebo I. fáze (sulfhydrylové, aminové, hydroxylové, karboxylové) konjug. s endogenními substráty obvyklé snížení toxicity

16 Otrava, toxické hladiny nox, jejich interakce I. otrava chorobný stav organizmu, vyvolaný noxou intenzita tox. příznaků závisí na látce, dávce, způsobu podání, frekvenci a stavu organizmu běžné látky mohou být toxické při nesprávném podání MKN-10 schválená v Ženevě hodnotí otravy spíše než dle jedu pro statistické účely (sebevražda, drog. závislost, neúmyslná aplikace látky apod.)

17 Otrava, toxické hladiny nox, jejich interakce II. jedna látka může být tedy zařazena pod více kódů po určení příčiny otravy požadavky na zhodnocení jejího stupně obtížné, někdy malé rozdíly mezi terapeutickou a toxickou hladinou, individuální rozdíly, nutná aproximace u intoxikací, na rozdíl od klinických studií díky nejasným anamnestickým údajům bývá obtížné uvádět krevní hladiny nox bez důkladné analýzy každé otravy

18 Otrava, toxické hladiny nox, jejich interakce III. problém korelovat krev. hladinu s účinkem neznámý dávkovací režim analytické nedokonalosti interakce více látek netypické reakce (alergie apod.) akumulace díky narušení org. snížení či zastavení vylučování u fatalit redistribuce látek různé, např. genetické dispozice problematika někt. látek je složitější (např. u delta 9-THC je opožděný nástup euforického účinku oproti vrcholu plazm.hladiny)

19 Obecné přístupy k terapii I. informace o jedech podá Toxikologické informační středisko Všeobecné fakultní nemocnice v Praze 2 (stálá informační služba, aktualizované údaje) Snížení absorpce jedu laváž žaludku, zvracení, podání nespecifického antidota (aktivní uhlí) a zvýšení jeho pasáže(laxativa) specifická antidota kyseliny a zásady apod.

20 Obecné přístupy k terapii II. Zrychlení eliminace jedu forsírovaná diuréza zvýš. eliminace jed, podají se diuretika (furosemid, roztok manitolu), doplňují se minerály infuzí kyselého ph moče se dosáhne podáním chloridu amonného, zásaditého (alkalického) podáním laktátu nebo citrátu sodného Hemoeliminační metody hemodialýza (difůze, ultrafiltrace), hemoperfůze (adsorpce) účinné hlavně je-li jed v krvi a ne kumulován v tkáních u závažných otrav, možné komplikace

21 Obecné přístupy k terapii III. Symptomatická podpůrná léčba kontrola tzv.vitálních funkcí (oběh, dýchání, teplota, neurologické funkce) Detoxikace absorbovaných jedů podáním antidot těžké kovy vazba na SH skupiny (např. kys. dimerkaptosulfonová, DMPS při otravě arzénem) donátor SH skupin N-acetylcystein u otrav paracetamolem antagonisté (naloxon opiáty; benzodiazepiny flumazenil; organofosfáty atropin, reaktivátory)

22 Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno I. informace o vystavení organizmu noxe se získají chemicko-toxikologickým vyšetřením volba správného biolog. vzorku využití anamnestických údajů (typ látky, cesta vstupu, frekvence kontaktu s jedovat. látkou apod.) podpora či vyvrácení diagnózy otravy, umožní lékaři zvolit vhodnou terapii kvantifikace látky v krvi pomáhá stanovit závažnost otravy

23 Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno II. při kontrolních vyšetřeních možnost omezit se na např. moč nebo krev post mortem neomezené možnosti odběru, obvykle femorální a srdeční krev, moč, vzorky jater a ledvin, plicní tkáň, mozková tk., vlasy apod. odběry dle typu otravy a dostupnosti jednotlivých vzorků

24 Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno III. analýza mekonia (novorozenecká smolka, tvoříse od 12 týdne těhotenství) průkaz závislosti matky analýza vlasů možnost sledování historie u abúzu drog, chronické intoxikace apod. u tzv. Human Performance Toxicology (sledování způsobilosti osob k určité činnosti) mají význam i alternativní biol. materiály (sliny nelze provést nežádoucí manipulace se vzorkem)

25 Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno VIII. detekční okno čas od intoxikace, po který lze sledovat dostupnými analyt. technikami výskyt sledované látky a jejich metabolitů hodiny sliny, pot, krev dny moč, stolice týdny až měsíce vlasy, nehty, novorozenecká smolka

26 Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno IX. forenznídůkaz vyžaduje jasnou identifikaci látky, nestačí skupina (např. opiáty, amfetaminy apod.) analytické techniky musí umět rozlišit spolehlivě jednotlivé látky nebo jejich metabolity a zároveň umožnit i jejich kvantifikaci často stopová množství nox faktor stability vzorků přítomnost látky v různých biol. vzorcích umožní často sestavit anamnézu intoxikace

27 Vývojové trendy v analytické toxikologii I. aplikovaná věda, kombinace znalostí z farmakologie, chemie a fyziologie 1950 TLC 1960 GC 1970 GC, HPLC, imunometody 1980 GC-MS, SPE, SPME 1990 LC-MS, GC-MS-MS apod GC-MS-MS, LC-MS-MS atd., on site technologie

28 Vývojové trendy v analytické toxikologii II. současné analytické metody mají detekční limity až pg/ml ng/ml pro co nejcitlivější detekci je zapotřebí vzorek moče, kde jsou látky zakoncentrovány výsledky analýz mohou upřesnit volbu dalších biol. vzorků k analýze potřeba dostatečného množství vzorku pro opakování analýz

29 Vývojové trendy v analytické toxikologii III. v současné době rozvoj imunochemických metod možnost pracovat s mikrolitry vzorku jednoduché analýzy v terénu, rychlé výsledky použití zejména pro screening uplatnění při rozhodování dalšího postupu v analýze neustálé zlepšování citlivosti a selektivity protilátek

30 Vývojové trendy v analytické imunochromatografie toxikologii IV. analýza by měla zohlednit vždy účel zjištění nox význam anamnestických údajů počáteční analýza neznámé škodliviny by měla začít screeningem skupin látek, na který pak navazují specifické konfirmační analýzy

31 Vývojové trendy v analytické toxikologii V. nutnost sledovat nové trendy v literatuře přibývají nové látky ze skupiny léčiv problematika design drugs potřeba neustálého vývoje analytických metod, variability potřeba zkušených odborníků

32 Současné toxikologické Chemické testy analytické metody I. jednoduché testy orientační např. těžké kovy (Reinschůvtest) tečkovací reakce na destičce, umožní zjištění funkčních skupin (Dragendorffovo činidlo na látky obsahující dusík apod.) vyžaduje zručného a zkušeného odborníka vodítko pro další postupy

33 Současné toxikologické analytické metody II. Spektrofotometrie UV/VIS jedna z prvních metod v analytické toxikologii dnes význam jako nedestruktivní detekční metoda v tandemovém spojení s HPLC vhodná pro kontrolu čistoty látek a jejich roztoků (standardy apod.) u specif. metod stanovení karboxyhemoglobinu v krvi, kyanidů

34 Současné toxikologické analytické metody III. Imunochemické metody komerční kity standardizovány a validovány výrobcem analýzy slin, krve a moče principem jsou protilátky z různých zdrojů, které s větší či menší selektivitou vážou noxu na principu zámku a klíče selektivní (např. pro methamfetamin) nebo skupinové (amfetaminy)

35 Současné toxikologické analytické metody IV. Imunochem. metody pokračování v toxikol. záchytu se záměrně užívají širokospektré protilátky záchytové metody pracují na principu kompetice o omezené množství protilátky mezi analytem (drogou) ve vzorku a značeným analytem v reagentu analyt je detekován dle své schopnosti vytěsnit nebo blokovat fixní množství značeného analytu z vazby na protilátku značení realizováno enzymem, fluorescenční látkou nebo radioaktivním izotopem

36 Současné toxikologické analytické metody V. měří se množ. vázané protilátky na značený analyt nebo zbytkové množství volného znač. analytu ve vztahu ke konc. měř. analytu ve vzorku dle principů se dělí na EIA RIA ELISA CEDIA FPIA, KIMS a ostatní

37 TLC Současné toxikologické analytické metody VI. stacionární fáze na desce různé stacionární fáze (sorbenty) extrakce vzorku, opakované nanášení vyvíjení v soustavě v uzavřené komoře detekce UV zářením nebo chemicky postřikem desky vhodnou detekční soustavou možnost užití denzitometrie nebo jen vizuální detekce vhodná pro vzorky, kde je vyšší koncentrace látek

38 Současné toxikologické analytické metody VII. HPLC (vysoceúčinná kapalinová chromatografie) TLC v kolonovém uspořádání různé druhy sorbentů, rozdílná zrnitost (velmi častý oktadecylsilan) normální či reverzní fáze isokratická nebo gradientová eluce mobilní fází detekce UV/VIS spektrofotometrem nebo fluorescenčním detektorem (vyšší citlivost) v poslední době systémy HPLC-MS a HPLC-MS-MS

39 Současné toxikologické analytické metody VIII. Plynová chromatografie (GC) stacionární fáze adsorbent nebo kapalina chem. vázaná na vnitř. stěnu kapilární kolony nejběž. kapalnou fází jsou polydimethylsilikony modifikované polárními skupinami přítomnými v postranním řetězci mobilní fáze plynná inertní plyn (dusík, helium, vodík) izotermální režim nebo teplotní program různé druhy detektorů tepelně vodivostní (TCD), plameno-ionizační (FID)

40 Současné toxikologické analytické metody IX. GC - pokračování nitrogen-phosphorus detector (NPD) MS detektory - hmotnostní detektory, poskytnou po ionizaci látky spektra

41 Validace selektivita citlivost otázka úpravy vzorků - stabilita