Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA

Transkript

1 Únor 2012 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 192 (katalogové číslo ) Verze 1 96 (katalogové číslo ) QIAsymphony DSP DNA Mini souprava QIAsymphony DSP DNA Midi souprava , CS QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R CS Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN technologie přípravy vzorku a analýzy Společnost QIAGEN je předním dodavatelem inovativních technologií přípravy vzorku a analýzy, které umožňují izolaci a detekci obsahu jakéhokoliv biologického vzorku. Naše moderní, vysoce kvalitní produkty a služby zaručují úspěch od odebrání vzorku až po výsledek. QIAGEN udává standard v následujících oblastech: Purifikace DNA, RNA, a proteinů Rozbory nukleových kyselin a proteinů Výzkum microrna a RNAi Automatizace technologií přípravy vzorku a analýzy Naší misí je umožnit vám dosáhnout velkých úspěchů a průlomů. Pro více informací navštivte

3 Obsah Qiagen technologie přípravy vzorku a analýzy 2 Použití 4 Shrnutí a vysvětlení 4 Princip procedury 4 Dodávaný materiál 7 Obsah soupravy 7 Požadovaný materiál, který není dodáván se soupravou 8 Varování a bezpečnostní opatření 9 Skladování a manipulace s reagenty 11 Skladování a manipulace se vzorky 11 Procedura 12 Automatická purifikace pomocí QIAsymphony SP 12 Protokol Purifikace DNA 18 Návod na řešení problemů 22 Kontrola kvality 25 Omezení 26 Reference 26 Symboly 27 Kontaktní informace 28 Příloha: Kvantifikace a určení čistoty DNA 29 Kvantifikace DNA 29 Čistota DNA 30 Informace pro objednávky 31 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012 3

4 Použití QIAsymphony DSP DNA Mini a Midi soupravy využívají technologii magnetických částic pro automatickou izolaci a purifikaci nukleových kyselin z biologických vzorků. Produkt je určen pro používání profesionálními uživateli, jako jsou laboranti a lékaři školení v molekulárních biologických technologiích. Systém QIAsymphony DSP DNA je určen pro in vitro diagnostické účely. Shrnutí a vysvětlení QIAsymphony DSP DNA soupravy jsou určeny k použití pouze v kombinaci s QIAsymphony SP. QIAsymphony DSP DNA soupravy poskytují činidla pro plně automatizovanou a současnou purifikaci celkové DNA z plné lidské krve, buffy coatu, tkání, FFPE tkání, buněčných a bakteriálních kultur stejně tak jako virové DNA z plné lidské krve. Výkonnostní charakteristiky však nebyly stanoveny pro všechny druhy virů, tkání, FFPE tkání, buněčných kultur a bakterií a musí tedy být ověřeny uživatelem. Technologie magnetických částic umožňuje purifikaci vysoce kvalitních nukleových kyselin, které jsou prosty proteinů, nukleáz a dalších nečistot Purifikované nukleové kyseliny jsou pak připraveny k použití v dalších aplikacích, jako jsou amplifikace nebo jiné enzymatické reakce. QIAsymphony SP provádí všechny kroky purifikační procedury. V jednom běhu je možné zpracovat až 96 vzorků v sadách do 24 kusů. U protokolů pro tkáně, FFPE tkáně, buněčné kultury a bakterie je vyžadováno ruční předzpracování vzorku. Princip procedury Technologie QIAsymphony kombinuje rychlost a efektivitu purifikace nukleových kyselin na bázi silikagelu s pohodlnou manipulací s magnetickými částicemi (Obr. 1, str. 5). Purifikační procedura je navržena tak, aby zajistila bezpečné a opakovatelné zacházení s potenciálně infekčními vzorky a skládá se ze 4 kroků: lýza, vazba, promývání, a eluce (viz diagram na str. 6). Uživatel si může vybrat z různých elučních objemů. 4 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

5 Obal tyče Magnetická tyč Pomalý pohyb nahoru a dolů pro sběr magnetických částic Rychlý pohyb nahoru a dolů pro uvolnění magnetických částic Magnetická tyč Přenos Obal tyče Reagent 1 a magnetické částice Reagent 2 a magnetické částice Jamka 1 Jamka2 Obr 1. Schéma principu QIAsymphony SP. QIAsymphony SP zpracuje magnetické částice obsahující vzorek následujícím způsobem: Magnetická tyč, chráněná obalem, je vložena do jamky, která obsahuje vzorek a přitáhne magnetické částice. Obal magnetické tyče je pak umístěn nad jinou jamku a magnetické částice jsou uvolněny. QIAsymphony SP používá magnetickou hlavu, která obsahuje soustavu 24 magnetických tyčí a je tak možné zpracovat až 24 vzorků najednou. Kroky 1 a 2 jsou během zpracování vzorků prováděny několikrát. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012 5

6 QIAsymphony DSP DNA procedura Krev a buffy coat Tkáň a buňky Externí lýza Lyzát, vazebný pufr a magnetické částice přeneseny do kazet na zpracování Přenos lyzátu na QIAsymphony Lyzát, vazebný pufr a magnetické částice přeneseny do kazet na zpracování vzorků DNA se váže na magnetické částice Magnetická separace Promytí Magnetická separace Čistá, vysoce kvalitní DNA 6 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

7 Poskytovaný materiál Obsah soupravy Souprava QIAsymphony DSP DNA Kit Mini Midi Katalogové číslo Počet testů * RC Reagentová kazeta 2 2 ER PL Stojánek na enzymy (Enzyme Rack) Propichovací víčko (Piercing Lid) ATE Pufr ATE (20 ml) 20 ml 20 ml RSS Opakovaně použitelná přelepovací sada (Reuse Seal Set) 2 2 Příručka 1 1 * Pro přípravu 96x1000 ul nebo 144x400 ul. Obsahuje guanidinové soli. Není kompatibilní s dezinfekcemi obsahujícími bělidlo. Viz bezpečnostní informace na straně 6 Obsahuje konzervační prostředek azid sodný. Opakovaně použitelná přelepovací sada (RSS) obsahuje 8 přelepovacích proužků. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012 7

8 Požadovaný materiál, který není dodáván se soupravou Při práci s chemikáliemi vždy noste vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Další informace získáte v příslušných bezpečnostních listech (MSDS), které jsou k dostání u dodavatele produktu. Kazety na zpracování vzorků (Sample Prep Cartridges), 8-jamkové (kat. č ) Kryty na 8 tyčí (8-Rod Covers) (kat. č ) Filter-Tips, 200 µl and 1500 µl (cat. nos and ) Testovací zkumavky (např. 2 ml testovací zkumavky se šroubovacím uzávěrem, Sarstedt kat. č nebo bez uzávěru, kat. č , nebo Sarstedt kat. č ). Kompatibilní primární a sekundární formáty zkumavek a destiček jsou uvedeny na Eluční zkumavky nebo destičky. Kompatibilní formáty elučních zkumavek a destiček jsou uvedeny na Fosfátový pufr (PBS, může být vyžadován k ředění vzorků) Míchačka (Vortexer) Volitelné: RNáza A bez DNázy (pokud je vyžadována DNA bez RNA) Další materiál potřebný pro tkáně a lidskou krev (virová DNA) je uveden na 8 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

9 Varování a bezpečnostní opatření Pro diagnostické použití in vitro Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech (MSDS). Jsou k dispozici na internetu v pohodlném a kompaktním formátu PDF na adrese kde můžete nalézt, prohlížet a vytisknout MSDS pro každou QIAGEN soupravu a její komponenty. POZOR: NEPŘIDÁVEJTE bělidlo nebo roztoky kyselin přímo do odpadu z testování vzorků Pufry v reagentové kazetě obsahují guanidinové soli, které mohou v kombinaci s bělidlem vytvořit vysoce reaktivní směsi. Pokud se kapalina, obsahující tento pufr, rozlije, použijte k čištění vhodné laboratorní saponáty a vodu. Pokud rozlitá kapalina obsahuje potenciálně infekční prvky, použijte k čištění nejprve laboratorní saponáty a vodu a poté 1% (v/v) chlornan sodný. Následující bezpečnostní fráze platí pro komponenty QIAsymphony DSP DNA souprav. QSL1 Xn Obsahuje guanidin-hydrochlorid: škodlivé a dráždivé. Bezpečnostní věty:* R22-36/38, S QSB1 F, Xn Obsahuje isopropanol a guanidin thiokyanát: vysoce hořlavé, škodlivé, dráždivé. Bezpečnostní věty:* R11-20/21/ , S /37/39-46 QSW1 F, Xn Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012 9

10 Obsahuje etanol a guanidin thiokyanát: vysoce hořlavé, škodlivé, dráždivé. Bezpečnostní věty: R /38, S /37/39-46 QSW2 F Obsahuje etanol: vysoce hořlavý. Bezpečnostní věty:* R11, S7-16 Proteinase K Xn Obsahuje proteinázu K: sensibilizátor, dráždivé. Bezpečnostní věty:* R36/37/38-42/43, S /37 24h informace v případě pohotovosti Informace v případě pohotovosti v angličtině, němčině a francouzštině jsou k dispozici 24 hodin denně zde: Poison Information Center Mainz, Germany Tel: * R11: Vysoce hořlavé; R20/21/22: škodlivé při vdechnutí, styku s kůží a požití; R22: škodlivé při požití; R32: Při kontaktu s kyselinou se uvolňuje vysoce toxický plyn; R36: Dráždí oči; R36/38: dráždí oči a pokožku; R36/37/38: dráždí oči, pokožku a dýchací cesty; R42/43: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování a styku s kůží; S7: Uchovávejte obal těsně uzavřený; S13: Udržujte mimo dosah jídla, pití a krmiva; S16: Udržujte mimo dosah zdrojů vzplanutí Zákaz kouření; S23: Nevdechujte výpary; S24: Zabraňte kontaktu s pokožkou; S26: V případě kontaktu s očima okamžitě vypláchněte množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc; S36: Používejte ochranný oděv; S36/37: Dráždí oči a dýchací cesty; S36/37/39: Používejte ochranný oděv, rukavice a ochranu obličeje a očí; S46: Při spolknutí okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte obal či etiketu. 10 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

11 Skladování a manipulace s reagenty Soupravy QIAsymphony DNA by měly být skladovány při pokojové teplotě (15 25 C). Magnetické částice skladované při této teplotě zůstávají aktivní. Reagentové kazety neskladujte při teplotách nižších než 15 C. Soupravy QIAsymphony DSP DNA obsahují roztok proteinázy K, připravený k použití, který je možné skladovat při pokojové teplotě. Při správném skladování je sada stabilní do data trvanlivosti, které je uvedeno na krabici soupravy. Částečně použité kazety (RC) mohou být skladovány maximálně 2 týdny, což umožňuje nákladově efektivní opakované použití činidel a pružnější zpracování vzorků. Pokud je reagentová kazeta (RC) použita částečně, ihned po skončení běhu protokolu vyměňte víko vaničky s magnetickými částicemi a reagentovou kazetu (RC) uzavřete pomocí uzavíracích proužků (Reuse Seal Strips), abyste zabránili odpařování. Aby se předešlo vypařování, musí být kazeta (RC) otevřena maximálně 15 hodin (včetně trvání běhů) při maximální okolní teplotě 30 C. Pokud budou v jednotlivých dávkách nízké počty vzorků (<24), prodlouží se doba, po kterou je kazeta otevřena a zvýší se potřebné objemy pufru, což může mít za následek snížení celkového počtu možných zpracovaných vzorků na kazetu. Zabraňte vystavení kazet (RC) UV záření (např. používané při dekontaminaci), neboť záření může zrychlit stárnutí kazet (RC) a pufrů. Poznámka: Nálepka na krabici QIAsymphony DSP DNA soupravy označuje datum exspirace soupravy. Ukazuje datum trvanlivosti celé soupravy, výsledkové dokumenty pouze data trvanlivosti kazet (RC). Skladování a manipulace se vzorky Zabraňte tvoření pěny ve vzorcích nebo na nich. V závislosti na počátečním materiálu může být nutné předzpracování vzorku. Vzorky by měly být před zahájením běhu vytemperovány na pokojovou teplotu (15 25 C). Více informací o automatizované proceduře (včetně informací o zkumavkách, které lze použít se specifickými protokoly) a specifickém předzpracování vzorků naleznete na odpovídajícím protokolovém listu, který je dostupný na Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

12 Procedura Automatická purifikace pomocí QIAsymphony SP Automatická příprava vzorků je díky QIAsymphony SP jednoduchá a pohodlná. Vzorky, reagenty, spotřební materiál a eluáty jsou odděleny v různých zásuvkách. Jednoduše před zahájením běhu do odpovídající zásuvky založte vzorky, reagenty dodávané ve speciálních kazetách a spotřební materiál ve stojáncích. Zahajte protokol a po zpracování odeberte vyčištěnou DNA z Eluate zásuvky. Instrukce k provedení naleznete v uživatelské příručce QIAsymphony SP. Poznámka: Volitelná údržba není pro činnost přístroje nutná, ale je vysoce doporučena pro snížení rizika kontaminace. Počet protokolů se neustále rozšiřuje a dodatečné QIAGEN protokoly je možné stáhnout zdarma na adrese: Zakládání reagentových kazet (RC) do zásuvky Reagents and Consumables Reagenty pro čištění DNA se nacházejí v inovativních reagentových kazetách (RC), (obr. 2). Každá vanička kazety obsahuje konkrétní reagent, jako jsou magnetické částice, lyzační pufr, promývací pufr nebo eluční pufr. Částečně použité kazety mohou být znovu uzavřeny pomocí přelepovacích proužků (Reuse Seal Strip) pro pozdější opakované použití, čímž se předchází vytváření odpadu ze zbylých reagentů na konci purifikační procedury. Propichovací víčko (PL) Stojánek enzymů (ER) Pouzdra na šroubovací zátky zkumavek s enzymy Přelepovací proužek Vanička s magnetickými částicemi Rám s vaničkami reagentů Držák reagentové kazety Obr 2. QIAsymphony reagentová kazeta. Reagentová kazeta obsahuje všechny reagenty pro běh protokolu. 12 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

13 Před začátkem procedury se ujistěte, že magnetické částice jsou zcela resuspendovány. Vyjměte vaničku s magnetickými částicemi z rámu kazety, silně ji vortexujte po dobu alespoň tří minut a vraťte ji před prvním použitím do rámu. Vložte kazetu do držáku na kazety. Vložte prázdný stojánek na enzymy do držáku na kazety. Před prvním použitím reagentové kazety (RC) na její povrch umístěte propichovací víčko (PL), (Obr. 3). Pozn.: Propichovací víčko je ostré. Při jeho vkládání na reagentovou kazetu (RC) buďte opatrní. Ujistěte se, že je víčko na kazetě (RC) správně orientováno. Po odstranění víka z vaničky s magnetickými částicemi a otevření stojánku s enzymy (šroubovací víčka mohou být uložena v určených pouzdrech, viz obr. 2) je kazeta následně založena do zásuvky Reagenty a spotřební materiál (Reagents and Consumables ). Propichovací víčko Obr. 3. Jednoduché sestavení reagentových kazet (RC). Částečně použité kazety (RC) mohou být skladovány pro další použití, viz Skladování reagencií na straně 11. Nakládání plastů do zásuvky Reagenty a spotřební materiál ( Reagents and Consumables ) Kazety na zpracování vzorků (Sample Prep Cartridges), kryty na osm tyčí (8-Rod Covers, obojí předplněno ve stojáncích) a jednorázové špičky s filtry (200 µl špičky dodávané v modrých stojáncích,1500 µl Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

14 špičky dodané v šedých stojáncích) se umístí do zásuvky Reagenty a spotřební materiál. Pozn.: Ujistěte se, že jsou před naložením do zásuvky Reagenty a spotřební materiál odstraněna víka krabiček. Pozn.: Špičky mají filtry pro prevenci křížové kontaminace. Pozice na držácích špiček na pracovní ploše QIAsymphony SP mohou být naplněny jakýmkoliv typem špiček. QIAsymphony SP typ špiček identifikuje během kontroly inventáře. Pozn.: Před zahájením dalšího běhu nedoplňujte stojánky se špičkami ani krabičky s kazetami na zpracování vzorků či kryty na tyče. QIAsymphony SP je schopen použít částečně použité stojánky a krabičky. Pro informace o potřebném spotřebním materiálu konzultujte odpovídající protokolový list, který je dostupný na Informace o objednávání plastového materiálu naleznete na straně 31. Založení odpadní ( Waste ) zásuvky Kazety na zpracování vzorků a kryty na tyče, použité během běhu jsou uloženy do prázdných krabiček v odpadní zásuvce. Ujistěte se, že odpadní zásuvka obsahuje dostatečné množství prázdných krabiček pro plastový odpad, vytvořený během běhu protokolu. Pozn.: Ujistěte se, že jsou před naložením do zásuvky Waste odstraněna víka krabiček. Pokud používáte krabičky od obalů na tyče na sběr použitých regentových kazet a krytů na tyče, ujistěte se, že jsou z krabiček odstraněny rozpěrky. Pytel na použité špičky musí být přichycen k přední straně odpadní zásuvky. Pozn.: Přítomnost pytle na použité špičky není systémem kontrolována. Před zahájením běhu protokolu se ujistěte, že je pytel správně přichycen. Další informace naleznete v uživatelské příručce dodané k Vašemu přístroji. Pytel na špičky vyprázdněte nejpozději po zpracování 96 vzorků, abyste tam předešli zablokování špiček. Odpadní nádoba sbírá odpadní kapaliny, které se vytvoří v průběhu purifikační procedury. Odpadní zásuvku je možné zavřít, pouze když je odpadní nádoba na svém místě. Odpadní kapaliny likvidujte v souladu s lokálními bezpečnostními a environmentálními pravidly. Neautoklávujte plnou odpadní nádobu. Vyprázdněte odpadní nádobu nejpozději po zpracování 96 vzorků 14 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

15 Zakládání eluační ( Eluate ) zásuvky Do zásuvky Eluate vložte požadovaný eluční stojánek. Jelikož dlouhodobé skladování eluátů v eluační zásuvce může vést k odpařování eluátů, doporučujeme použití chladící pozice: použijte prostor Elution slot 1 s odpovídajícím chladícím adaptérem. Kontrola inventáře Před zahájením běhu přístroj zkontroluje, zda má v odpovídajících zásuvkách vloženo dostatečné množství spotřebního materiálu pro zadanou dávku. Příprava vzorku Soupravy QIAsymphony DSP DNA jsou navrženy pro automatické čištění celkové DNA z plné lidské krve, buffy coatu, tkání, formalinem fixovaných parafinových řezů (FFPE), buněčných a bakteriálních kultur, stejně tak jako virové DNA z plné lidské krve (Tab. 1, strana 16). Zabraňte tvoření pěny ve vzorcích. V závislosti na počátečním materiálu může být třeba předzpracování vzorků. Vzorky by měly být před zahájením běhu vytemperovány na pokojovou teplotu (15 25 C). Manuální předzpracování vzorků je požadováno u tkání, FFPE tkání, buněčných a bakteriálních kultur. Více informací o automatizované proceduře (včetně informací o zkumavkách na vzorky, které mohou být použity pro specifický protokol) a specifickém předzpracování vzorků naleznete na odpovídajícím protokolovém listu, který je dostupný na Výtěžky purifikované DNA Výtěžky DNA závisí na typu vzorku, počtu jaderných buněk ve vzorku, kvalitě počátečního materiálu a protokolu, použitém pro izolaci DNA. Eluce v menších objemech zvyšuje konečnou koncentraci DNA v eluátu, ale lehce snižuje celkový výtěžek DNA. Doporučujeme používat eluční objem určený pro zamýšlené následné aplikace. Soupravy QIAsymphony DNA kopurifikují RNA a DNA, pokud jsou obě obsaženy ve vzorku. Pokud je vyžadován vzorek DNA bez RNA, přidejte do vzorku před začátkem procedury RNázu A. Více informací najdete na protokolovém listu na Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

16 Skladování DNA Purifikovaná DNA může být skladována do 5 dní při 2 8 C. Pro dlouhodobé skladování, skladujte při 20 C nebo 80 C. 16 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

17 Tabulka 1. Přehled protokolů Objem Vzorek vzorku (l) Plná krev Eluční objem (l) 50, 100, , 200, , 400, 500 QIAsymphony SP Souprava protokol Mini Midi Midi DNA Blood 200 DSP DNA Blood 400 DSP DNA Blood 1000 DSP Buffy coat , 300, 400 Mini DNA Buffy Coat 200 DSP , 400 Midi DNA Buffy Coat 400 DSP Virová krev , 85, 110, 165 Mini VirusBlood 200 DSP Tkáň , 100, 200, 400 Mini Tissue LC 200 DSP , 200, 400 Mini Tissue HC 200 DSP Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

18 Protocol: Purifikace DNA Následující protokol je obecným protokolem pro použití souprav QIAsymphony DSP DNA. Detailní informace o každém protokolu, včetně objemů a zkumavek í naleznete v protokolových listech, které jsou dostupné na Důležité body před zahájením procedury Ujistěte se, že jste obeznámen s ovládáním QIAsymphony SP. Informace k jeho provozu naleznete v uživatelské příručce, která je s přístrojem dodávána. Volitelná údržba není nutná pro činnost přístroje, ale je vysoce doporučena pro snížení rizika kontaminace. Před zahájením procedury čtěte Důležité poznámky začínající na straně 4. Princip procedury Ujistěte se, že jste obeznámen s protokolovým listem, který odpovídá proceduře, kterou chcete provést (dostupné na Před prvním použitím reagentové kazety zkontrolujte, zda pufry QSL1 a QSB1 neobsahují sraženinu. Pokud je třeba, vyjměte vaničky s pufry QSL1 a QSB1 z reagentové kazety a inkubujte je po dobu 30 minut při 37 C s občasným protřepáním pro rozpuštění sraženiny. Ujistěte se, že jste vaničky vrátili do správných pozic. Pokud je reagentová kazeta již propíchnuta, ujistěte se, že je uzavřena pomocí přelepovacícho proužku a inkubujte celou reagentovou kazetu po dobu 30 minut při 37 C s občasným protřepáním ve vodní lázni. Vyhněte se silnému třepání reagentovou kazetou (RC), neboť hrozí vytvoření pěny, která může způsobit problémy při detekci hladiny kapaliny. Úkony před zahájením procedury Před začátkem procedury se ujistěte, že magnetické částice jsou zcela resuspendovány. Silně vortexujte vaničku s magnetickými částicemi po dobu alespoň tří minut. Ujistěte se, že na je reagentové kazetě umístěno propichovací víčko a že víčko z vaničky s magnetickými částicemi bylo odstraněno, nebo pokud používáte částečně použitou kazetu, ujistěte se, že byly odstraněny přelepovací proužky (Reuse Seal Strips). 18 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

19 Ujistěte se, že zkumavky se enzymy jsou jsou otevřeny. Pokud jsou vzorky označeny kódy, nastavte je ve stojánku tak, aby byly směrem ke čtečce čárových kódů na levé straně QIAsymphony SP. Více informací o zkumavkách kompatibilních se specifickými protokoly, naleznete na odpovídajícím protokolovém listu, který je dostupný na Více informací o minimálním množství vzorku v primárních a sekundárních zkumavkách pro specifické protokoly naleznete na odpovídajícím protokolovém listu, který je dostupný na Tato informace také uvádí, jaké zkumavky mohou být použity s různými protokoly. Procedura 1. Zavřete všechny zásuvky a kryt. 2. Zapněte QIAsymphony SP, a počkejte, dokud se neobjeví obrazovka Sample Preparation a neskončí inicializační procedura. Vypínač se nachází na levém spodním rohu QIAsymphony SP. 3. Zalogujte se do přístroje. 4. Ujistěte se, že zásuvka Waste je správně připravena a proveďte kontrolu inventáře Waste zásuvky, včetně skluzu pro špičky a tekutého odpadu. Pokud je třeba, vyměňte odpadní pytel na špičky. 5. Vložte požadovaný eluční stojánek do zásuvky Eluate. 96jamkovou destičku neumisťujte do prostoru Elution slot 4 Pokud mají být eluáty chlazeny, použijte prostor Elution slot 1 s odpovídajícím chladícím adaptérem. Ujistěte se, že 96jamková destička je správně orientována, protože nesprávné umístění by mohlo způsobit zpřeházení vzorků v následné analýze. 6. Vložte požadované reagentové kazety a spotřební materiál do zásuvky Reagents and Consumables. 7. Proveďte kontrolu inventáře zásuvky Reagents and Consumables. 8. Vložte vzorky do odpovídajícího držáku na vzorky a poté je vložte do zásuvky Sample. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

20 9. Pro Virus Blood aplikace: zkumavky, obsahující směs interní kontroly a pufru ATE, vložte do prostoru A zásuvky Sample. Více informací o přípravě směsi a použití interní kontroly naleznete v odpovídajícím protokolovém listu na Pomocí dotykového displeje zadejte požadované informace o každé dávce vzorků, která bude zpracována. Zadejte následující informace: Informace o vzorcích (v závislosti na použitých stojáncích na vzorky). Protokol, který má být spuštěn ( Assay Control Set ) Eluční objem a výstupní pozici Pro Virus Blood aplikace: Zkumavky, které obsahují interní kontrolu Po zadání informace o dávce se změní status z LOADED na QUEUED. Jakmile je jedna dávka takto zadána do fronty, objeví se tlačítko Run. 11. Zmáčkněte tlačítko Run pro zahájení purifikační procedury Všechny kroky zpracování jsou plně automatizované. Na konci běhu protokolu se status dávky změní z RUNNING na COMPLETED. 12. Vyjměte eluční stojánek obsahující purifikované nukleové kyseliny ze zásuvky Eluate. DNA je připravena k použití nebo může být skladována při 2 8 C, 20 C, or 80 C. Doporučujeme, aby eluční stojánky byly vyjmuty z Eluate zásuvky ihned po dokončení běhu. V závislosti na teplotě a vlhkosti může dojít na elučních destičkách, které budou po skončení běhu ponechány v QIAsymphony SP, ke kondenzaci nebo odpařování. Magnetické částice běžně nejsou přeneseny do eluátů. Pokud k přenosu dojde, magnetické částice v eluátech většinu následných aplikací neovlivní. Pokud je třeba magnetické částice před provedením následných aplikací odstranit, je nutné, aby byly destičky či zkumavky, obsahující eluáty, vloženy do vhodného magnetu a eluáty poté přeneseny do čisté zkumavky (viz dodatek, strana 27). Pro každou eluční destičku je vytvořen výsledný dokument. 20 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

21 13. Pokud je reagentová kazeta jen částečně použita, zavřete ji pomocí uzavíracích proužků Reuse Seal Strips a zavřete zkumavky s proteinázou K ihned po ukončení běhu, abyste zabránili odpařování. Poznámka: Více informací o skladování částečně použitých reagentových kazet (RC), naleznete v sekci Skladování a manipulace s reagenty, strana Chyba! Záložka není definována Zlikvidujte použité zkumavky, destičky a odpad v souladu s místními bezpečnostními nařízeními. Viz strana 9 - bezpečnostní opatření. 15. Vyčistěte QIAsymphony SP. Dodržujte instrukce o údržbě v uživatelské příručce, která je dodávána s přístrojem. Pravidelně čistěte zachytávač kapek, abyste minimalizovali nebezpečí křížové kontaminace. 16. Zavřete zásuvky přístroje a vypněte QIAsymphony SP. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

22 Návod pro řešení problémů Tento návod může pomoci při řešení jakýchkoliv problémů, které mohou nastat. Více informací naleznete v sekci Často kladené dotazy (FAQ) na našem centru technické podpory: Vědci v QIAGEN Technical Services rádi zodpoví jakékoliv dotazy ohledně informací a protokolů v této příručce nebo technologií přípravy vzorku a analýzy (kontaktní informace naleznete na zadním obalu nebo navštivte Komentáře a návrhy Obecná manipulace Chybová hláška zobrazena na dotykovém displeji Pokud je chybová hláška zobrazena při běhu protokolu, konzultujte uživatelskou příručku, dodanou spolu s přístrojem Sraženina ve vaničce reagentu v otevřené kazetě a) Odpaření pufru Nadměrné odpařování může vést ke zvýšené koncentraci soli v pufrech. Znehodnoťte reagentovou kazetu. Ujistěte se, že jsou pufrové vaničky částečně použitých kazet zavřeny pomocí přelepovacích proužků (Reuse Seal Strips), pokud nejsou právě používány pro purifikaci. 22 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

23 b) Skladování reagentové kazety Komentáře a návrhy Skladování reagentové kazety při teplotách pod 15 C může vést k tvorbě sraženin. Pokud je třeba, vyjměte vaničky, obsahující pufry QSL1 a QSB1 z reagentové kazety a inkubujte je ve vodní lázni o teplotě 37 C po dobu 30 minut s občasným protřepáním pro rozpuštění sraženiny. Ujistěte se, že je vanička vrácena zpět do správné pozice. Pokud je kazeta (RC) již propíchnutá, ujistěte se, že je zavřená pomocí uzavíracích proužků (Reuse Seal Strips), a inkubujte celou kazetu ve vodní lázni* o teplotě 37 C po dobu 30 minut s občasným protřepáním. Nízký výtěžek DNA a) Magnetické částice nebyly plně resuspendovány b) Zmrzlé vzorky krve nebo buffy coaty nebyly po rozmrznutí důkladně promíchány Před zahájením procedury se ujistěte, že se magnetické částice plně resuspendovaly. Před použitím silně vortexujte po dobu alespoň 3 minut. Zmrzlé vzorky rychle rozmrazte pomocí jemného míchání, abyste zajistili důkladné promíchání. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

24 c) Nekompletní lýza vzorků Komentáře a návrhy Před použitím zkontrolujte, zda pufry QSL1 a QSB1neobsahují sraženiny. Pokud je třeba, vyjměte vaničky, obsahující pufry QSL1 a QSB1, z reagentové kazety a inkubujte je ve vodní lázni o teplotě 37 C po dobu 30 minut s občasným zatřesením pro rozpuštění sraženiny. Pokud je kazeta již propíchnutá, zavřete ji pomocí přelepovacích proužků (Reuse Seal Strips), a inkubujte celou kazetu ve vodní lázni* o teplotě 37 C po dobu 30 minut s občasným protřepáním. d) Nekompletní digesce vzorků tkání e) Ucpání špičky nerozpustným materiálem f) Špatná příprava buffy coatu při použití buffy coat protokolu g) Nízký počet leukocytů ve vzorku plné krve jako vychozím materiálu pro přípravu buffy coatu h) Nekompletní lyze kultivovaných buněk, tkání a bakterií Zajistěte kompletní digesci tkáně tím, že prodloužíte čas inkubace s proteinázou K. Nerozpustný materiál nebyl odstraněn ze vzorku před zahájením QIAsymphony purifikační procedury. V případě potřeby použijte předzpracování jak je popsáno v příslušném protokolovém listu, např. pro viskózní vzorky. Protokolové listy naleznete na Zajistěte efektivní sběr leukocytů. Při používání protokolu pro buffy coat, zvyšte objem použité plné krve a udržte konstantní objem sbíraných leukocytů. Pokud je lyzát viskózní nebo obsahuje nerozpustný materiál. 24 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

25 i) Ztráta peletu během FFPE předzpracování pomocí kombinace xylen/ethanol Komentáře a návrhy Pozorně vzorek sledujte během předzpracování. DNA nemá dobré výsledky v následných aplikacích a) V následných aplikacích je použito nedostatečné množství DNA Kvantifikujte purifikovanou DNA spektrofotometrickým měřením absorbance při 260 nm (viz příloha, strana 29). b) V následných aplikacích je použito příliš velké množství DNA Přebytečná DNA může inhibovat některé enzymatické reakce. Kvantifikujte purifikovanou DNA spektrofotometrickým měřením absorbance při 260 nm (viz příloha, strana 29). Poměr A260/A280 purifikované DNA je nízký Záznam absorbance při 320 nm nebyl odečten od záznamů při 260 nm a 280 nm Aby byla zohledněna přítomnost magnetických částic v eluátu, je třeba vzít záznam absorbance při 320 nm a odečíst jej od záznamů při 260 nm a 280 nm (viz příloha, strana 29). Kontrola kvality V souladu s QIAGEN ISO certifikovaným systémem managementu kvality je každá šarže QIAsymphony DSP DNA Mini and Midi soupravy * Zajistěte, aby byl přístroj pravidelně kontrolován, udržován a kalibrován dle instrukcí výrobce. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

26 testována podle předurčených specifikací, aby byla zajištěna konzistentní kvalita produktů. Omezení Kriteria práce systému byla stanovena během evaluačních studií při purifikaci genomové DNA z plné lidské krve a buffy coatu, virové DNA z plné lidské krve stejně tak jako genomové DNA z tkání, bakteriálních a buněčných kultur a formalínem fixovaných parafinových řezů. Je odpovědností uživatele, aby si validoval výkon systému pro jakékoliv procedury ve své laboratoři, které nejsou pokryty evaluačními studiemi firmy QIAGEN. Pro minimalizaci nebezpečí negativního dopadu na diagnostické výsledky je třeba pro další aplikace používat adekvátní kontroly. Pro další validace jsou doporučeny směrnice Mezinárodní konference o harmonizaci technických požadavků (ICH) ve Validaci analytických postupů ICH Q2(R1): text a metodologie. Jakékoliv získané diagnostické výsledy se musí interpretovat v kontextu s ostatními klinickými nebo laboratorními nálezy. Reference QIAGEN udržuje rozsáhlou aktuální online databázi vědeckých publikací, které využívají QIAGEN produkty. Obsáhlé možnosti vyhledávání vám umožní najít články, které potřebujete buď pomocí jednoduchého vyhledávání podle klíčového slova, nebo specifikací aplikace, výzkumné oblasti atd. Kompletní seznam referencí naleznete v online databázi QIAGEN Reference Database na adrese případně kontaktujte technické služby QIAGEN nebo vašeho lokálního distributora. 26 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

27 Symboly <N> Obsahuje reagenty dostatečné pro <N> testů Použijte do Prostředek zdravotnické techniky pro diagnostiku in vitro Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiálu Komponenty Číslo Objem Teplotní meze Výrobce Používat pouze s Viz informace k použití Obsahuje Číslo jamky Isopropanol Proteináza K Guanidinium thiokyanát Guanidine hydrochlorid Pozor Ostrá hrana Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

28 Kontaktní informace S žádostmi o technickou pomoc a další informace se prosím obracejte na naše centrum technické podpory případě zavolejte jedno z oddělení technických služeb QIAGEN či lokální distributory (seznam naleznete na zadní straně nebo na adrese 28 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

29 Příloha: kvantifikace a určení čistoty DNA Kvantifikace DNA Koncentrace DNA by měla být určena měřením spektrofotometrem při 260 nm (A260). Hodnoty absorbance by měly při 260 nm být mezi 0,1 a 1,0, aby byly přesné. Absorbance 1 jednotky při 260 nm koresponduje s 50 µg DNA na 1 ml (A260 = 1 50 µg/ml). Pro ředění vzorků a kalibraci spektrofotometru použijte pufr ATE. Poměr mezi hodnotami absorbance při 260 nm a 280 nm poskytuje odhad čistoty DNA (viz Čistota DNA na straně 30). Změřte absorbanci při 320, 280, a 260 nm. Odečtěte hodnotu absorbance při 320 nm od záznamů při 260 a 280 nm pro korekci potenciálního pozadí. Pro výpočet DNA koncentrace a výtěžnosti použijte následují výpočet: Koncentrace DNA vzorku = 50 µg/ml x (A260 A320) x ředící factor. Celkové množství purifikované DNA = koncentrace x objem vzorku v mililitrech. V případě, že jsou magnetické částice přeneseny do eluátu a mohou ovlivnit následné aplikace (např. purifikovaná DNA je analyzovaná fluorescenčním kapilárním sekvencováním), musí být zkumavka s eluátem nejprve aplikována na vhodný magnetický separátor a eluát následně přenesen do čisté zkumavky (viz níže). Pokud je třeba magnetické částice odstranit, dejte zkumavku s DNA na vhodný magnetický separátor (např. QIAGEN 12-Tube Magnet, kat. č ), dokud nejsou magnetické částice separovány. Pokud je DNA v mikrotitračních destičkách, dejte je na vhodný separátor (např. QIAGEN 96-Well Magnet Type A, kat. č ), dokud nejsou magnetické částice separovány. Pokud není vhodný separátor k dispozici, centrifugujte zkumavku s DNA po dobu 1 minuty při maximální rychlosti v mikrocentrifuze, aby se oddělily všechny zbylé magnetické částice. Pozn.: Pro přesnou kvantifikaci DNA absorbancí při 260 nm doporučujeme ředění vzorku v odpovídajícím elučním pufru. Ředění vzorku vodou může vést k nepřesným hodnotám. Eluční pufr má vysokou absorbanci při 220 nm, což může vést k vysokým absorbančním hodnotám pozadí, pokud není spektrofotometr správně vynulován. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

30 Vypařování eluátu může zvyšovat riziko vlivu na změřenou hodnotu obzvláště pokud se použijí malé objemy neředěného eluátu. Dodatečný eluční pufr pro použití jako blank je dodáván v samostatné lahvičce se soupravami QIAsymphony DSP DNA. Čistota DNA Čistota se určí kalkulací poměru opravené absorbance při 260 nm k opravené absorbanci při 280 nm, tzn. (A260 A320)/(A280 A320). Čistá DNA má poměr A260/A280 v rozmezí hodnot Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

31 Informace pro objednávky Produkt Obsah Kat. č. QIAsymphony DSP DNA Mini Kit (192) Obsahuje 2 reagentové kazety a stojánky s enzymy a příslušenství QIAsymphony DSP DNA Midi Kit (96) Související produkty Buffer ATL (4 x 50 ml) Buffer ABL (4 x 50 ml) Deparafinizační roztok (1 x 50 ml) Accessory Trough (10) Reagent Cartridge Holder (2) Tube Insert, 2 ml, sample carrier, Qsym Tube Insert, 11 mm, sample carrier, Qsym Tube Insert, 13 mm, sample carrier, Qsym Cooling Adapter, tubes, 2 ml, Qsym Obsahuje 2 reagentové kazety a stojánky s enzymy a příslušenství 4 x 50 ml pufr ATL pro použití v protokolech QIAsymphony pro tkáně 4 x 50 ml pufr ABL pro použití v protokolech QIAsymphony pro buněčné a bakteriální kultury 1 x 50 ml deparafinizační roztok pro použití v protokolech QIAsymphony pro FFPE Vaničky pro použití s QIAsymphony SP Držák na reagentové kazety pro použití s QIAsymphony SP Sekundární adaptér na zkumavky (pro 2 ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem) pro použití s QIAsymphony nosičem zkumavek Primární adaptér na zkumavky (11 mm) pro použití s QIAsymphony nosičem zkumavek Primární adaptér na zkumavky (13 mm) pro použití s QIAsymphony nosičem zkumavek Chladicí adaptér pro 2 ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Pro použití v Eluate zásuvce QIAsymphony Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

32 Produkt Obsah Kat. č. Cooling Adapter, EMT, Qsym Chladicí adaptér pro EMT stojánky. Pro použití v Eluate zásuvce QIAsymphony Adapter, tubes, 2 ml, Qsym Sample Prep Cartridges, 8-well (336) 8-Rod Covers (144) Filter-Tips, 200 µl (1024) Filter-Tips, 1500 µl (1024) Adaptér pro 2 ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Pro použití v Eluate zásuvce QIAsymphony 8-jamkové kazety na přípravu vzorků pro použití s QIAsymphony SP Obaly na osm tyčí pro použití s QIAsymphony SP Jednorázové filtrační špičky, ve stojánku; (8 x 128). Pro použití s QIAcube a QIAsymphony SP Jednorázové špičky s filtrem, ve stojánku; (8 x 128). Pro použití s QIAsymphony SP Tip Disposal Bags (15) Pytle na použité špičky pro použití s QIAsymphony SP Tube Magnet 96-Well Magnet Type A S-Blocks (24) Reuse Seal Set (20) Magnet pro separaci magnetických částic v 12 x 1,5 ml nebo 2 ml zkumavkách Magnet pro separaci magnetických částic v jamkách 96- jamkových destiček, 2 x 96- jamkové destičky FB 96-jamkové bloky s 2,2 ml jamkami, 24 v jednom balení Opakovaně použitelná přelepovací sada pro uzavírání částečně použitých reagentových kazet Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

33 Produkt Obsah Kat. č. Elution Microtubes CL (24 x 96) Nesterilní polypropylénové zkumavky (maximální kapacita 0,85 m, skladovací kapacita méně než 0,7 ml, 0.4 ml eluční kapacita); 2304 ve stojáncích po 96; včetně víček ve stripech QIAsymphony SP Modul QIAsymphony pro zpracování vzorků, 1-letá záruka na součástky a práciyear warranty on parts and labor Aktuální informace a produktově specifická odvolání naleznete v odpovídající QIAGEN příručce nebo manuálu. Manuály a příručky k sadám QIAGEN jsou k dispozici na adrese případně je možné kontaktovat technické služby QIAGEN nebo vašeho lokálního distributora. Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/

34 Ochranné známky: QIAGEN, QIAsymphony, (QIAGEN Group Omezená licenční smlouva Používání tohoto produktu znamení, že jakýkoliv kupující či uživatel souprav QIAsymphony DSP Virus/Pathogen souhlasí s následujícími podmínkami: 1. Soupravy QIAsymphony DNA mohou být používány výhradně v souladu s Příručkou souprav QIAsymphony DNA a je možné je používat pouze s díly, obsaženými v soupravě. neuděluje žádnou licenci podle žádného svého práva k duševnímu majetku na používání přiložených dílů těchto souprav s jakýmikoliv díly, které nejsou součástí těchto souprav, s výjimkami popsanými v Příručce souprav QIAsymphony DNA, a v dalších protokolech dostupnými na adrese 2. QIAGEN neposkytuje žádnou jinou záruku než výslovně stanovené licence v tom smyslu, že tyto soupravy a/nebo jejich použití nenarušuje práva třetích stran. 3. Tyto soupravy a jejich díly jsou licencovány k jednorázovému použití a nesmí být opakovaně používány, přepracovány ani opakovaně prodávány 4. QIAGEN specificky odmítá jakékoliv další výslovné nebo nepřímé licence s výjimkou těch, které jsou uvedeny výslovně. 5. Kupující a uživatel této sady souhlasí s tím, že neposkytne a nepovolí nikomu jinému provádět žádné kroky, které by mohly vést k nebo usnadnit jakékoliv výše zakázané činnosti. QIAGEN může vymáhat zákazy uvedené v této omezené licenční smlouvě u jakéhokoliv soudu a uhradí všechny své náklady na vyšetřování a soudní výdaje, včetně poplatků za právní pomoc, v rámci jakékoliv žaloby na prosazení této omezené licenční smlouvy nebo jakýchkoliv svých práv k duševnímu vlastnictví vůči sadě a/nebo jejím dílům. Aktualizované licenční podmínky získáte na stránkách QIAGEN, všechna práva vyhrazena. 34 Příručka k soupravám QIAsymphony DSP DNA 02/2012

35

36 Australia Orders Fax Technical Austria Orders Fax Technical Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) Sample & Assay Technologies