a) Buněčná stěna b) Buněčné membrány c) Jádro d) Membránové struktury

Transkript

1 MBRO ) Architektura buňky 1 a) Buněčná stěna b) Buněčné membrány c) Jádro d) Membránové struktury Martin Fellner Laboratoř růstových regulátorů PřF UP v Olomouci a ÚEB AVČR

2 2 Odhalení struktury buňky: - elektronová mikroskopie - světelná mikroskopie Laserová konfokální mikroskopie, reportérové molekuly (fluorescenční barviva, fluorescenční proteiny - GFP) - chemie a mol. biologie Hmotnostní spektrometrie především studium buněčné stěny

3 a) Buněčná stěna 3 Architektura buněčné stěny List Zinnia - P-houbový parenchym, AS-vzduchové prostory usnadňují výměnu plynů. Epidermální buňky okvětního lístku Hledíku většího (Antirrhinum majus) odráží světlo a tím zvyšují jas květu. Xylémová tracheida s radiálními ztluštěninami zvyšují pevnost tracheidy při transportu vody.

4 Obrázek z transmisního elektronového mikroskopu spojení tří buněk 4 Primární buněčná stěna: - formuje kostru rostliny - určuje morfologii rostliny - dynamická, mění se - určuje rychlost a směr růstu Sekundární buněčná stěna: - pevnější, složitější struktura Střední lamela spojuje k sobě primární buněčné stěny jednotlivých buněk tvoří se při dělení buněk a roste při zvětšování buňky. Roh buněk je vyplněn na pektin bohatými polysacharidy; u starších buněk je materiál degradován a vzniká vzduchový prostor; G - Golgiho aparát, ER endoplazmat. retikulum, M mitochondrie, V vakuola

5 Primární buněčná stěna: 1. Celulóza Uloženo v matrix pektinových polysacharidů 2. Zesíťující glykany 3. Strukturní proteiny a fenylpropanoidy 5 1. Celulóza % DW buněčné stěny - řetězce 2 až 20 tisíc (1-4)-β-D-glukózových jednotek - uspořádané v mikrofibrilách (36 celulózových řetězců v 1 mikrofibrile) Kalóza polymer glukózy - glukózové jednotky mají vazbu (1-3)-β-D =>helikální tvar - netvoří mikrofibrily - výskyt: pylová zrna, pylová láčka, buň. přepážky v dělících se buňkách a buňkách napadených patogenem

6 2. Zesíťující glykany (dříve hemicelulóza) drží pohromadě celulózovou síť; tvoří vodíkové vazby s celulózou i spolu navzájem 6 Xyloglukan (XyG) Glukózová kostra Vedlejší řetězec z xylózy a arabinózy Xylózová kostra Vedlejší řetězec z kys. glukoronové Glukoronoarabinoxylan (GAX) Kostra z (1-4)-spojených xylózových jednotek + vedlejší řetězce z arabinózy a kyseliny glukoronové Vedlejší řetězec z arabinózy

7 Primární buněčná stěna krytosemenných Typ I a Typ II 7 Dvouděložné a polovina jednoděložných (množství celulózy = množství xyloglukanů) Jednoděložné skupiny Comelinoid (bromélie, palmy, trávy, zázvory; hlavně glukoronoarabinoxylany; u obilovin beta-glukany)

8 Polymery pektinové matrix tvoří druhou síť v primární buněčné stěně 8 Pektiny = heterogenní směs rozvětvených a vysoce hydratovaných polysacharidů bohatých na kyselinu D-galakturonovou Pektiny Homogalakturonan (HG) lineární řetězec kys. galakturonové Rhamnogalakturonan lineární řetězec střídajících se reziduí kys. galakturonové a rhamnózy Pektiny ovlivňují porozitu buněčné stěny a iontovou rovnováhu; pomáhají detekovat přítomnost symbiotických organizmů, patogenů a hmyzu; velice rozšířené v buněčné stěně plodů

9 9 Monomery homogalacturonanu (HG) spojeny apiózou => dimer mrg-ii = monorhamnogalacturonan Dimery mrg-ii spojeny borem přes apiózu => drg-ii-b = rhamnogalacturonan Rhamnogalacturonan II complex Monorhamno-galacturonan (rhamnogalacturonan II) Další funkce bóru: - inkorporace proteinů, pektinů a prekurzorů do CW (intina) - určování velikosti pórů v CW (buněčné kultury) (1999)

10 3. Strukturní proteiny nepolysacharidová složka, tvoří třetí síť v buněčné stěně Typu I; kontrola prodlužování buněčné stěny a interakce pylu z bliznou 10 1) Glykoproteiny bohaté na hydroxyproliny Extensin tvar tyčky, odpovědný za rigiditu buň. stěny 2) Glykoproteiny bohaté na proliny 3) Proteiny bohaté na glycin 4) Glykoproteiny bohaté na threoniny 5) Arabinogalaktanové proteiny z 95% tvořeny cukry; zakotveny v plazmatické membráně prostřednictvím fosfatidylinositolové kotvy; důležité pro signalizaci Buněčná stěna Typu II - málo strukturních proteinů, neobsahují extensin, bohaté na threonin a fenolické složky = fenylpropanoidy Fenolické složky = kys. hydroxyskořicová, spojuje polysacharidy s proteiny

11 Nová buněčná stěna vzniká během buněčného dělení 11 Golgiho vezikuly s glykoproteiny a necelulózovými polysacharidy míří k dělícímu vřeténku fúzují a vytváří fragmozómy. Fragmozómy rostou směrem ke stěně sousední buňky, kde fúzují z plazmatickou membránou oddělení obsahu dvou dceřiných buněk.

12 Golgiho vezikuly přinášejí necelulózní komponenty. Celulózové mikrofibrily jsou syntetizovány enzymem celulóza syntázou (CESA) (enzym vestavěný do plazmatické membrány). Celulózové mikrofibrily jsou vytlačovány z plazmatické membrány do buněčné stěny. 12 Během vývoje buňky zvětšují délku 20 50x. Buněčná stěna se rovněž zvětšuje musí být rozvolněna a doplněna o nový materiál (vliv auxinu).

13 CESA jsou organizovány do multiproteinových celulóza syntáza komplexů (CSCs). 13 Arabidopsis thaliana: 10 izoforem CESA CESA1, CESA3, CESA6 zapojeny v syntéze primární buněčné stěny CESA4, CESA7, CESA8 zapojeny v produkci sekundární buněčné stěny Pro normální produkci celulózy jsou potřeba nejméně tři CESA. Live-cell imaging (vizualizace živých buněk): CESA se pohybuje a distribuuje na plazmatické membráně a podléhá i intracelulárnímu transportu. Ko-lokalizace microtubulů cytoskeletu (červeně) s YFP:CESA6 (zeleně) v buňkách etiolovaných hypokotylů Paredez AR et al. (2006) Science 312:

14 Sekundární buněčná stěna ukládá se na vnitřní straně primární buněčné stěny 14 Funkce upevnit vodivý systém a strukturu Pevnost - celulózové mikrofibrily obsahují celulózu s vyšším stupněm polymerizace, zvýšená krystalizace mikrofibril a vyšší stupeň organizace mikrofibril. Složení a vzor ukládání sekundární stěny se u buněk liší: Bavlník: 98% celulóza Semenná pletiva: necelulózové polysacharidy Obilný endosperm: manany (polymery manózy) využívány jako zdroj energie během klíčení semen a raný růst rostlinky β-glukany pro lidskou obživu; snižuji hladinu krevního cholesterolu

15 Ligniny směs fenylpropanoidů sekundární metabolity; častá součást sekundární buněčné stěny pevná a odolná stěna 15 Suberin podobný ligninu, hydrofóbní charakter; epidermální buňky stonků, korkových buněk, povrch poraněných buněk Kutin polymer mastných kyselin propojených estery; listy a povrch stonků; bariéra proti fúzi vodních par Vosky estery dlouhořetězcových mastných kyselin a alkoholů; syntetizovány v ER

16 b) Buněčné membrány 16 Protoplast je obklopený plazmatickou membránou Plazmatická membrána udržuje elektrochemické prostředí uvnitř buňky Plazmatická membrána - dvojvrstva polárních molekul lipidů spojených s řadou proteinů Fosfolipidy Glykolipidy Steroly Amfipatické molekuly: - hydrofóbní ocásky - hydrofilní (polární) hlavička Hydrofóbní ocásky mastné kyseliny, atomů uhlíku Nasycená mastná kyselina Nenasycená mastná kyselina

17 Hydrofilní (polární) hlavička obsahuje fosfátovou skupinu; hlavička glykolipidů obsahuje cukr 17 Fosfolipidy Steroly hydrofóbní uhlovodíková kostra a jednoduchá hydrofilní hydroxylová skupina (cholesterol) Lipidy ve vodě spontánně tvoří dvojvrstvy; hydrofóbní ocásky odpuzují vodu a interagují spolu

18 18 Integrální proteiny hydrofilní a hydrofóbní doména; někdy připojeny cukry Periferní proteiny interagují s lipidy a proteiny prostřednictvím solných můstků, hydrogenních vazeb, elektrostatických interakcí Zakotvené proteiny připojeny k dvojvrstvě pomocí lipidových kotev

19 19 Membránové proteiny: specifické transportéry (kanály, pumpy) přenos signálu (receptory) enzymatická katalýza (syntéza celulózy) strukturní funkce Membránové proteiny definují specificitu každého membránového systému Nepolární molekuly snadno difundují hydrofóbním jádrem dvojvrstvy Hydrofilní polární molekuly a ionty difundovat nemohou H 2 O výjimka, polární, je schopna difundovat membránou (malá molekula) Lipidy : proteiny : karbohydrátové řetězce 2 : 2 : 1

20 Plazma membrána tvoří hranici mezi živým protoplastem a vnějším prostředím 20 Plasmodezmata cytoplazmatické kanály (40-50 nm); propojují rostlinné buňky

21 21 Prostřednictvím plasmodezmat buňky sdílí plazmatickou membránu Ionty a malé molekuly (do 800 Da) volně difundují z buňky od buňky pomocí plasmodezmat Buňky jsou schopny zvyšovat velikost plasmodezmat (až pro molekuly do 10 kda) = Cytoplazmatické pouzdro

22 22 Maule AJ et al. (2012) Frontiers in Plant Science 3: 1-5 Syntéza kalózy enzym glykosyl syntáza (kalóza syntáza) (CalS1, CalS8 nově objevené geny, 2016) Degradace kalózy enzym β-1-3-glukanáza Signály spouštějící expresi genů zapojených v ukládání či degradaci kalózy: - stress (viry) indukce polypeptidu PDCB1 akumulace kalózy - ROS (reaktivní kyslíkové radikály) ovlivňují lokální redoxní stav nebo stav buňky Update 2016 Lim G-H et al. (2016) Cell Host & Microbe 19: Viry kódují proteiny, které manipulují s PD zvětšují velikost průchodu PD => usnadňují pohyb virových jednotek z buňky do buňky. Permeabilita PD je regulována PD-localizing proteins (PDLPs): ztráta funkce PDLP5 zvětšení prostupnosti PD, overexprese PDLP5 zmenšení prostupnosti PD

23 c) Jádro 23 Prominentní organela; 3 10 µm; většina genetické informace buňky N jádro NU jadérko; syntéza ribozomální RNA, úprava RNA a spojování s proteiny vznikají ribozomální podjednotky, které jsou transportovány do cytoplazmy NE - jaderná obálka; dvě dvojvrstvy oddělené lumenen (perinukleární prostor); obsahuje jaderné póry Chromatin komplex DNA a proteinů; vytváří chromozomy; v nedělící se buňce (interfáze) je chromatin ve formě vláken vytváří síť, dochází k transkripci genů a syntéze DNA.

24 Vnější membrána jaderné obálky je pokračováním ER a obsahuje ribozómy 24

25 Update 2018 Klíčové elementy zapojené v dynamice jádra Groves NR et al. (2018) Plant Physiology 176: Proteiny jaderné obálky zapojené v dynamice jádra SUN = Sad-1/UNC-84 proteins WIP = WPP domain-interacting proteins (KASH proteiny) WIT = WPP domain-interacting tail-anchored proteins (KASH proteiny) CRWN1 = Crowded Nuclei1

26 Jadérko je obaleno heterochromatinovou skořápkou obsahující NADs 26 NAD = nucleolus-associated chromatin domains NOR = nucleolus organizer regions

27 Jáderný pór se skládá až z 30 nukleoporinů 27 Nups nukleoporiny

28 LINC = Linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (spojovač nukleoskeletu a cytoskeletu (u rostlin popsány zcela nedávno) 28 LINC jsou složeny z proteinů KASH na vnější jaderné obálce (ONM) a proteinů SUN na vnitřní jaderné obálce (INM). Vzájemně interagují v lumenu jaderné obálky a lumen přemosťují. SINE = SUN-Interacting nuclear envelope protein KASH proteiny: WIPs = WPP-domain interacting proteins; WITs = WPP-domain interacting tail-anchored proteins

29 d) Membránové struktury 29 Extenzivní, navzájem propojená série organel, která je zodpovědná za syntézu, úpravu a ukládání makromolekul. Transport mezi kompartmenty: - sekretované molekuly k povrchu buňky - vakuolární proteiny do vakuoly - membránové proteiny a lipidy z místa syntézy do dalších částí endomembránového systému

30 Endoplazmatické retikulum (ER) 30 Prostorová síť kontinuálních tubulů a zploštělých váčků - propojují jadernou obálku, prochází cytoplazmou a dávají základ PM; 16 domén Funkce: - syntéza, zpracování a rozdělování proteinů; i syntéza lipidů; - v ER jsou kotvící místa pro aktinová filamenta cytoskeletu - zásobárna Ca 2+ a regulace koncentrace Ca 2+ - senzor buněčných stresů - lešení pro vazbu různých signálních proteinů, např. TF upoutané na membránu - rezervoár receptorů pro rostlinné hormony - rostlinné ER je uspořádáno i ve fragmoplastu - dává vznik buněčné destičce a umožňuje vznik plasmodezmat

31 Proteiny zapojené ve tvarování membrán ER Arabidopsis Update 2014 Stefano G et al. (2014) Curr Opinion Plant Biol 22: HVA22 - homology proteinů Yop1 funkce neznámá RTNLB - homology proteinů retikulonů - overexprese => sevření lumenu ER, přeměna ER listu do tubulu RHD3 funkční homolog atlastinů; GTPáza - zprostředkuje fúzi membrán in vitro; GTPáza = hydroláza hydrolyzuje guanosintrifosfát (GTP) na guanosindifosfát (GDP) důležité v signalizaci: G-proteiny, elongační faktory) RL2 RHD3 specifický pro semena ko-precipituje s RTNLB13; současná exprese RL2 a RTNLB13 vede ke změně sítě ER Ztráta RHD3 nebo overexprese RHD3 s defektní GTPázovou doménou způsobuje vytváření aberantní morfologie ER. Specifické následky ve funkční homeostáze ER a ztráty integrity sítě organel.

32 3 typy ER membrán 32 1) Drsné ER má ribozómy; syntéza proteinů 2) Hladké ER bez ribozómů; 3) Jaderná obálka

33 Translace jaderných mrna začíná v cytozolu na volných ribozomech. 33 Syntéza proteinů ukončena v ER. Translokace rozpustných proteinů do lumenu ER. Integrální proteiny inkorporovány do membrány ER Úprava proteinů (např. glykosylace), jejich modifikace, která ovlivňuje trojrozměrné uspořádání proteinu. Transport upravených proteinů prostřednictvím vezikul. Fúze s Golgiho cisternami Prolaminy (zásobní proteiny) se vyhýbají Golgiho aparátu. Jsou transportovány přímo do vakuol.

34 34 Membrány hladkého ER syntéza lipidů V hladkém ER je syntetizován i triacylglycerol (semena a pylová zrna) Triacylglycerol se akumuluje mezi vnitřní a vnější membránou v místech, která obsahují proteiny oleosiny. Oleosomy

35 35 V hladkém ER jsou syntetizovány monomery vosků a kutinů (velice dlouhé řetězce mastných kyselin) Transport monomerů vně buňky není znám. Hypotéza

36 Golgiho aparát (diktyozom) 36 - cysternový štosek (1µm) 5-8 cisteren - trans-golgiho síť (TGN) tubulární struktura spojená s Golgiho štoskem - Golgiho matrix vláknitá klec ohraničující štosky a TGN Funkce: - syntéza, modifikace, balení a rozdělování makromolekul určených pro export k buněčné stěně nebo k další organelám - modifikace vedlejších cukerných řetězců glykoproteinů a glykolipidů (cukerné řetězce specifikují interakci mezi plazmatickou membránou a buněčnou stěnou) - zodpovědný za syntézu nebo zesítění glykanů Počet štosků: 20 až 10 tisíc

37 37 Transport prostřednictvím Golgiho aparátu je směrovaný Produkty z ER jsou transportovány prostřednictvím cis, medial či trans cisteren do TGN. Z TGN vznikají 2 typy vezikul: - pokryté proteinem clathrinem transport do vakuoly - pokryté jiným typem proteinů transport do plazmatické membrány a buněčné stěny Vezikuly pokryté COP proteiny transport uvnitř Golgi a z Golgi do TGN Proteiny určené pro vakuoly obsahují specifické AK a jsou transportovány pomocí MVB multivezikulárních tělísek.

38 Vezikuly vyměňují materiál s okolím buňky exocytózou a endocytózou 38 Exocytóza membrána Golgiho vezikuly fúzuje s plazmatickou membránou a obsah se vyleje do buněčné stěny - doručení nových proteinů a lipidů k PM - doručení proteinů a polysacharidů do vnějšího prostředí Endocytóza vrácení membránových komponent pro recyklaci či degradaci - příjem extracelulárních molekul - import vezikul odvozených z PM a pokrytých clathrinem - import vezikul odvozených z PM do vakuoly se děje prostřednictvím MVB (multivezikulárních tělísek)

39 Vakuola 39 Tekutinou naplněné kompartmenty pokryté tonoplastem; 30-90% objemu buňky Dospělé buňky velké vakuoly Mladé buňky (např. meristematické) větší počet malých vakuol Vakuoly pochází z provakuol, které pučí z ER Funkce: - velká vakuola omezuje metabolicky aktivní cytoplazmu do tenké vrstvy, zvětšuje její povrch a tím maximalizuje výměnu plynů a živin Tradescantia vakuoly buněk vlásků na tyčinkách obsahují antokyany - uchovávání iontů a molekul: rezervoár protonů, org. kyselin a metabolicky aktivních iontů (Ca 2+ ), polysacharidů, lytických enzymů, těžkých kovů, obranných látek (taniny, kys. šťavelová, proteázy, nukleázy), pigmentů, proteinů (v semenech) Update 2018 Martinoia E et al. (2018) Plant Cell Physiol 59: