Růst a vývoj rostlin - praktikum MB130C78

Transkript

1 Růst a vývoj rostlin - praktikum MB130C78 Blok 3 Role aktinového cytoskeletu v morfogenezi rostlinných buněk - analýza fenotypu

2 Úlohy: 1. Kvantifikace počtu zkroucených a správně tvarovaných trichomů u prvních pravých listů jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 2. Stanovení permeability povrchu listů pomocí barvení rutheniovou červení u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 3. Stanovení délek hlavního kořene a hypokotylu u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 4. Analýza a porovnání fenotypů jednoduchých a dvojitých mutantů z úloh Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových nukleátorů v rostlině.

3 Čím je ovlivňována morfogeneze u rostlin? Vnější a vnitřní faktory Mezi vnitřní faktory ovlivňující morfogenezi rostlin patří: směrované buněčné dělení směrovaný buněčný růst signalizace fytohormony reorganizace buněčných stěn turgor vakuolárního systému směrovaný endomembránový transport reorganizace cytoskeletu

4 Morfogeneze rostlinných orgánů Příklady změněné morfogeneze listu u mutací v transkripčních faktorech z rodin YABBY a KNOX (Chan Man Ha et al., 2010)

5 Morfogeneze rostlinných orgánů Příklady změněné morfogeneze kořene reagujících na rostlinné hormony v médiu a změnu světelných podmínek růstu Kořeny rostoucí na světle Kořeny rostoucí ve tmě Příklady změněné morfogeneze kořenového systému u mutací v proteinech spojených s nukleací aktinového cytoskeletu WT arp3 Benito lab

6 Morfogeneze rostlinných buněk Difúzní a vrcholový tip růstu buněk (Guerroero et al., 2015)

7 Morfogeneze trichomů Dobře studovatelné buňky listové pokožky na kterých je popisována buněčná morfogeneze Mutanti (A) etr2-3 (B) gl3 (C) etr2-3 gl3 (D) spy-5 (E) etr2-3 spy-5 (F) gl2 (G) etr2-3 gl2 (H) fas1 (I) etr2-3 fas1 (J) try (K) try etr2-3 (L) try fas1-1 (Plett et al., 2009)

8 Cytoskelet v rostlinné buňce Rostlinný cytoskelet je tvořen vysoce dynamickou trojrozměrnou sítí proteinů, která je základní složkou všech eukaryotických buněk a u rostlin sestává se vzájemně propojených sítí mikrotubulů a aktinových filament. light-sheet mikroskopie pokožkové buňky děložního listu A.t mikrotubulární cytoskelet -TUA5-mCherry aktinový cytoskelet - FABD2-GFP spojení obrázků - porovnání (Ovečka et al., 2015)

9 Role cytoskeletu v morfogenezi buněk (Mathur a Hulskamp 2002)

10 Role cytoskeletu v morfogenezi pokožkových buněk listu mikrotubuly aktin (Panteris et al., 2005)

11 Role cytoskeletu v morfogenezi trichomů aktinová síť v trichomu (Hulskamp 2004) (Mathur a Hulskamp 2002)

12 Role cytoskeletu v prodlužování kořene a hypokotylu Buňky hypokotylu rostoucího ve tmě s označeným cytoskeletem (Sampathkumar et al., 2011) Aktinový cytoskelet v elongujících buňkách kořene A.t. (Reusche, M., Teichmann/Friml lab) aktin mikrotubuly merged Aktinový cytoskelet (zeleně) v elongujících buňkách hypokotylu A.t. (Daher, FB, Sainsbury lab), buněčné stěny označeny PI (červeně).

13 Nukleace aktinového cytoskeletu Rostliny mají 2 nukleátory aktinu: Arp2/3 komplex a forminy

14 Nukleace aktinu ARP2/3 komplexem ARP2/3 komplex tvoří sedm podjednotek (ARP2, ARP3 A ARPC1-ARPC5) Komplex ARP2/3 rozvětvuje síť stávajících aktinových filament Actin Filament Initiation: Arp2/3 complex. Manual of Cellular and Molecular Function, The National University of Singapore, Republic of Singapore, Illustrators: Pham Thi Phuong Thao a Theng Tze Yin Meryl

15 Nukleace aktinu forminy Forminy nukleující aktin tvoří dimery a katalyzují vznik přímých (nevětvících se) aktinových vláken (Gould et al., 2011) Actin filaments: Formin-mediated nucleation. Manual of Cellular and Molecular Function, The National University of Singapore, Republic of Singapore, 2009 Illustrator: Theng Tze Yin Meryl.

16 Nuklelátory aktinu v živočišné buňce Mutace ve forminech či u podjednotek ARP2/3 komplexu je ve většině případech pro živočišné buňky letální. (Shrnuto v: Pollard 2007) Porovnání nukleace aktinových filament pomocí ARP2/3 komplexu a forminů V živočišných buňkách je 10x méně forminů než Arp2/3 komplexu. Profilin - váže se na globulární aktin, reguluje rovnováhu nukleátorů aktinu upřednostňováním forminů před Arp2/3 komplexem při nukleaci nových aktinových vláken. (Suarez et al., 2014)

17 Rostliny mutantní ve forminech souhrn fenotypů Forminy se u různých organismů účastní polarizovaného buněčného růstu a sekrece (Cvrčková 2012). U rostlin jsou proto často cílem výzkumu forminů kořenové vlásky, pylové láčky, epidermální buňky a trichomy. Nadprodukce forminu 1 způsobuje deformace při růstu pylové láčky tabáku. Vzhledem k velikosti rodiny proteinů s formin-like sekvencí, která je rozmanitější než u živočišných buněk, byla zatím fenotypicky charakterizována jen malá část forminů. Pokožkové buňky děložních listů u mutanta ve forminu 1 mají prohloubenou laločnatost buněk (Rosero et al., 2016)

18 Rostliny mutantní v Arp2/3 komplexu souhrn fenotypů Obecně se fenotypové projevy při mutacích v genech pro podjednotky ARP2/3 komplexu týkají především těch buněk a pletiv, které mají komplexnější tvary (trichomy, buňky epidermis) a jejichž morfogeneze a růst tedy vyžadují dobrou koordinaci vnitrobuněčných procesů a modelování a růst buněčné stěny (Shrnuto v Mathur et al., 2005) WT arpc4 Pokožkové buňky děložního listu se značeným aktinem (FABD2- GFP) mají méně výraznou laločnatost. (Mathur et al., 2005)

19 PRAKTIKUM - ÚLOHY

20 Úlohy: 1. Kvantifikace počtu zkroucených a správně tvarovaných trichomů u prvních pravých listů jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 2. Stanovení permeability povrchu listů pomocí barvení rutheniovou červení u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 3. Stanovení délek hlavního kořene a hypokotylu u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 4. Analýza a porovnání fenotypů jednoduchých a dvojitých mutantů z úloh Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových nukleátorů v rostlině.

21 ÚLOHA 1 fenotyp zkroucených trichomů

22 ÚLOHA 2 fenotyp permeability listu

23 ÚLOHA 3 fenotyp délky kořene a hypokotylu

24 ÚLOHA 4 Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových nukleátorů v rostlině Projev mutace wt arpc5 fh1-1 fh1-1/arpc5 Průměrný počet trichomů na list (číslo) Zkroucené trichomy (ano/ne) Permeabilita listů (ano/ne) Průměrná délka hypokotylu (číslo) Průměrná délka kořene (číslo) Tab. 1: Příklad tabulky fenotypů.