Nevlákenné nosiče pro tkáňové inženýrství (II. Materiály pro tkáňové inženýrství)

Transkript

1 Nevlákenné nosiče pro tkáňové inženýrství (II. Materiály pro tkáňové inženýrství) 9.přednáška Katedra netkaných textilií Fakulta textilní Technická univerzita v Liberci Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

2 Obsah přednášky: -Scaffold, jeho vlastnosti, funkce opakování -Technologie výroby scaffoldů - Vlákenné scaffoldy textilní technologie.opakování - Nevlákenné scaffoldy netextilní technologie - Představení jednotlivých technologií - Představení testování těchto scaffoldů in-vitro i in-vivo - Konkrétní příklady výroby a testování scaffoldů vybranými technologiemi.

3 Scaffoldy obecně Co je scaffold? Proč a jak ho používat? Úvodní opakování Z angličtiny dva významy Lešení = dočasné zařízení postavené kolem budovy pro pohodlí a zjednodušení práce zaměstnanců stavby. Nosná konstrukce pro pěstování buněk a tkání

4 Požadavky na scaffold obecné Úvodní opakování 1 FUNKCE SCAFFOLDU Nevyvolával zánětlivé reakce nebo toxické reakce in vivo. VLASTNOSTI SCAFFOLDU Musí být biokompatibilní, netoxický a nekarcinogenní. 2 Napomáhat v růstu 3-D tkáně. Specifický tvar 3-D scaffoldu. 3 Rovnoměrné velká hustota nasazených buněk. Vysoká pórovitost a propojení mezi póry. 4 Poskytnut vhodný povrch pro adhezi a rozprostření buněk. Optimální chemické a povrchové vlastnosti použitého polymeru. Velký specifický povrch. 5 Podpořit proliferaci a migraci buněk celým scaffoldem. Optimální velikost pórů umožňuje buňkám pohyb a komunikaci. Dynamické nasazení buněk. 6 Přímá orientace buněk. Regulovatelná orientace vláken uvnitř scaffoldu; chemická úprava povrchu. 7 Umožňuje přísun živin a odstranění odpadních látek ze scaffoldu. Vysoká porozita a propojení mezi póry; kromě toho elasticita materiálu. 8 Biologická vstřebatelnost scaffoldu. Rychlost degradace se rovná rychlosti formování tkáně. Produkty degradace polymeru nesmí být toxické ani podporovat zánět in vivo. 9 Zachovat si tvar in vivo s dostatečnou mechanickou pevností. Scaffold má podobné mechanické vlastnosti jako rozvíjející se tkáň.!!! Biocompatibilní, biodegradabilní (pro většinu aplikací ovšem ne pro všechny), 3D otevřená porézní struktura, vhodné mechanické vlastnosti, dobrá sterilizovatelnost, dostatečná doba do rozkladu (pro biodegradabilní materiály)

5 Jak vyrobit scaffold pro TI? Úvodní opakování Vlákenné nosiče Textilní technologie výroby Vlákenné sítě a metody pojení vláken (Fibre meshes or fibre bonding methods): Naplavování výroby NT mokrou cestou (Wet laid technology); Elektrostatické zvlákňování (Electrospinning); Výroba netkaných textilií suchou cestou (Nonwoven manufacturing); Tkaní, pletení, vyšívání výroba krajek Weaving; Knitting; Embroidery; Kompozitní materiály Composite materials; 5

6 Jak vyrobit scaffold pro TI? Nevlákenné nosiče pro tkáňové inženýrství Netextilní technologie Leaching method; Solvent casting; Phase separation; Melt moulding; Rapid prototyping (3D printing); Freeze drying: Emulsion freeze drying; Gas foaming; 6

7 Netextilní výroba scaffoldů VYMÝVÁNÍ ČÁSTIC - Leaching method (salt leaching) Vymývání částic Technika vymývání částic (particle leaching, salt leaching) je velmi populárním postupem používaným v tkáňovém inženýrství pro výrobu scaffoldů. Póry jsou tvarovány na základně částic tzv. porogenu, což mohou být částice solí, vosků nebo dokonce cukru. Vhodný polymer je rozpuštěn v rozpouštědle. Porogeny požadovaných vlastností, tvarů a rozměrů jsou umístěny do formy s přesně definovaným uspořádáním. Následně je do této formy naplněné porogenem nalit roztok polymeru. Dále dochází k odpaření rozpouštědla a vytvoření tuhého materiálu složeného z polymeru a částic porogenu. Finálním krokem je rozpuštění a vymytí porogenu s použitím vhodného rozpouštědla. Například voda je používána pro rozpouštění solí a cukrů užívaných jako porogen. Podle množství porogenu, jeho velikosti a tvaru je možné řídit vnitřní strukturu scaffoldů. V závislosti na typu použitého porogenu lze vytvořit strukturu s nepravidelnými póry, s póry ve tvaru koulí, nebo s póry vlákenného charakteru. 7

8 Netextilní výroba scaffoldů VYMÝVÁNÍ ČÁSTIC - Leaching method (salt leaching) 10% Poly-DL-lactic acid (PDLLA), chloroform, salt particles Size of pores 500μm, porosity more than 90% Porogen je inertní materiál přidaný do směsi, aby se dle něj vytvořily póry v konečném výrobku. Polymerní roztok + porogen (částice solí, vosků, cukru atd.). Tato směs je nalita do formy a po odstranění rozpouštědla vznikne pevný materiál. Následně jsou rozpuštěny částice porogenu. Porogen nesmí mít stejné rozpouštědlo jako použitý polymer! Only membrane can be produce with fully interconnected pores.

9 Netextilní výroba scaffoldů VYMÝVÁNÍ ČÁSTIC - Leaching method (salt leaching) Tato technika má svou modifikaci nazývanou formování taveniny (melt molding), kde je termoplastický polymerní prášek zamíchán s vhodným porogenem. Tato směs je umístěna například do teflonové formy a zahřáta nad teplotu tání polymerního materiálu. Po zahřátí je kompozitní struktura vystavena vlivu rozpouštědla porogenu. Vymytím porogenu dojde k vytvoření hotového porézního materiálu. Metoda formování taveniny se snaží eliminovat toxická rozpouštědla či toxické porogeny, které mohou stopově ve scaffoldu zůstat i po vymytí, a proto využívá jako porogen například želatinu. 9

10 Jako porogen jsou použity částice ledu, které jsou téměř kulovité po zmrazení vody přiváděné kapilárou do kapalného dusíku : a)80 hm% částic ledu b)90 hm% částic ledu Netextilní výroba scaffoldů VYMÝVÁNÍ ČÁSTIC - Leaching method Struktura scaffoldu (porozita) je řízena tvarem, velikostí a množstvím částic ledu a koncentrací polymeru v roztoku. Převzato z: Tateishi, T., Biodegradable porous scaffolds for tissue engineering, J Artif Organs (2002ú 5:

11 Netextilní výroba scaffoldů Solvent casting Tato technologie je založena na vypařování rozpouštědel z roztoků polymerních materiálů. Existují zde dva přístupy. (i)jeden je založen na ponoření formy do polymerního roztoku a poskytnutí dostatečného času k odpaření rozpouštědla. To vede k formování vrstvy polymerní membrány. (ii)druhý způsob je umístit polymerní roztok do formy a poskytnout dostatečný čas k odpaření rozpouštědla. Posléze je na povrchu formy vytvořena výsledná porézní membrána. Velmi jednoduchá, relativně levná technika, nevyžadující speciální nástroje a zařízení. Nicméně jsou zde využívána vysoce toxická rozpouštědla, která mohou denaturovat proteiny, další molekuly a buňky, neboť je tu možnost zůstatku stopových množství rozpouštědel uvnitř vytvořeného scaffoldu. To však může být překonáno pomocí kvalitního sušení za využití vakua pro dokonalé odstranění jakéhokoliv zůstatkového rozpouštědla z takto vytvořeného scaffoldu. Ovšem procesy odstraňování rozpouštědla jsou velmi časově náročné. 11

12 Netextilní výroba scaffoldů Solvent casting PCL + aceton Polymerní roztok (s vhodným rozpouštědlem). Roztok je dále nalit do formy a rozpouštědlo se nechá velmi pomalu odpařit. V průběhu odpařování jsou vytvořeny póry. 12

13 Netextilní výroba scaffoldů Salt leaching + Solvent casting Například je možné kombinovat technologie solvent casting s technologií vymývání částic popisovanou výše. Stále je zde možnost vytvoření jen omezeně silných scaffoldů. Tato metoda je vhodná pro vytváření zejména velmi tenkých porézních materiálů membrán. 13

14 Netextilní výroba scaffoldů Salt leaching + Solvent casting Membrány vyrobené metodami SC a PL jsou pojeny dohromady pomocí potření povrchu membrány vhodným rozpouštědlem základního polymerního mateirálu a následně kontaktem povrchů membrán. Pro PLLA or PLGA je vhodným rozpouštědlem k laminaci membrán například chloroform. 14

15 Netextilní výroba scaffoldů Rapid prototyping - 3D tisk Rapid prototyping neboli rychlá výroba prototypů je technika vztahující se ke skupině technologí, které používají počítačem podporovaný design (CAD systémy) k vytvoření trojrozměrných objektů. Prototyp neboli model je navržen pomocí počítače, dále jsou data převedena to tiskárny pro trojrozměrný tisk, která tiskne navržený model. Toto je výhodné, pokud je navrhován a vytvářen tvarově komplikovaný objekt. Největší výhodou je značná úspora času a finančních prostředků potřebných ke komplexnímu vývoji nového typu scaffoldu. 15

16 Netextilní výroba scaffoldů Rapid prototyping - 3D tisk Rychlá výroba prototypů + CAD počítačem podporovaný design. Model scaffoldu navržen počítačem a následně využita 3D tiskárna pro vytvoření vlastního scaffoldu místo inkoustu polymerní roztok nebo tavenina. 16

17 Netextilní výroba scaffoldů Rapid prototyping - 3D tisk V současné době existuje nejméně pět technik využívaných pro výrobu scaffoldů založených na technice rapid prototyping: Stereolitografie počítačem řízený laserový paprsek je použit k vytvrzování kapalného polymeru a objekt je stavěn vrstvu po vrstvě. Selektivní laserové spékání počítačem řízený laserový paprsek je použit k tavení práškových materiálů a slynutí prášku v pevný objekt, který je tvořen vrstvu po vrstvě. Modelování laminovaných objektů počítačem řízený laserový paprsek je použit k vyřezávání tvaru vrstvy po vrstvě z polymerní fólie a tyto vrstvy jsou na sebe lepeny do formy 3D scaffoldu. Modelování ukládáním taveniny (fused deposition modeling FDM) polymer je vytlačován z trysky a veden k požadovanému místu díky řízení trysky počítačem. Každá vrstva je spojována s vrstvou předchozí, a to vždy před úplným ztuhnutím nanesené taveniny polymeru. Trojrozměrný tisk pojivo je tištěno skrz trysky na vrstvu prášku. Pojivem je prášek spojen v požadovaných místech a množství. Prášek je takto slepován vrstvu po vrstvě dokud není vytvořen celý trojrozměrný objekt. Výhodou tohoto přístupu je možnost vytváření biologicko-syntetických hybridních scaffoldů. Je zde totiž možnost tisknout biologické látky, jako jsou suspenze buněk či biomolekuly přímo s pojivem, a tím je přímo vnášet do vytvářeného scaffoldu. 17

18 Netextilní výroba scaffoldů Rapid prototyping - 3D tisk Rapid prototyping FDM 18

19 Netextilní výroba scaffoldů Rapid prototyping - 3D tisk Je možné kombinovat s vymýváním částic. 19

20 Netextilní výroba scaffoldů Rapid prototyping - 3D tisk Převzato z: Hollister, S., J.:Porous scaffold design for tissue engineering, Progress article Nature Materials, Vol.4, July

21 3D-Bioprinting 0DhBLEhdzk Once a tissue design is established, the first step is to develop the bioprocess protocols required to generate the multi-cellular building blocks also called bio-ink from the cells that will be used to build the target tissue. The bio-ink building blocks are then dispensed from a bioprinter, using a layer-by-layer approach that is scaled for the target output. Bio-inert hydrogel components may be utilized as supports, as tissues are built up vertically to achieve three-dimensionality, or as fillers to create channels or void spaces within tissues to mimic features of native tissue. The bioprinting process can be tailored to produce tissues in a variety of formats, from micro-scale tissues contained in standard multi-well tissue culture plates, to larger structures suitable for placement onto bioreactors for biomechanical conditioning prior to use.

22 3D-Bioprinting This image is a cross-section of bioprinted human liver tissue demonstrating compartmentalization between the hepatocytes (shown as blue nuclei), endothelial cells (red), and hepatic stellate cells (green). 22

23 Netextilní výroba scaffoldů Výroba hydrogelů Hydrogely jsou zesíťované (stabilizované vůči rozpuštění ve vodě) hydrofilní polymery, které reprezentují velmi důležitou skupinu biomateriálů pro biotechnologické a medicínské použití. Hydrogely bobtnají díky své hydrofilitě při kontaktu s vodou, kterou absorbují ve velkém množství. Nedojde však k jejich rozkladu či rozpuštění díky zesíťování dané struktury (Nguyen 2002). To jim dává vlastnosti podobné měkkým tkáním. Ačkoliv jsou hydrogely zdánlivě neporézní materiály, díky pronikání vody do daného polymerního materiálu mohou do struktury hydrogelu proniknout i buňky a další důležité látky pro tvorbu konečného implantátu. Polymery, které přirozeně tvoří hydrogely jsou například algináty, modifikovaný polyethylen oxid, kyselina hyaluronová, fibrin atd. 23

24 Netextilní výroba scaffoldů Výroba hydrogelů Alginátové hydrogely různých tvarů.

25 Hydrogely Vznik makromolekulárních látek: 1)Postupnými reakcemi nízkomolekulárních látek (polyadice, polykondenzace) 2)Polymerační řetězová reakce, síťovací polymerace 3)Spojování reaktivních konců nízkomolekulárních polymerů (10 3 g/mol) 4)Zavedením příčných vazeb do vysokomolekulárních polymerů Síťování polymerů: fyzikální nebo chemické Stupeň zesíťování nám určuje počet zesíťovaných míst na primární hmotnostně průměrné makromolekule. Relativní míru stupně zesíťování nám udává síťovací index: γ = n M w Kde n je látkové množství zesíťovaných jednotek a M w střední molární hmotnost.

26 Hydrogely -V první fázi vzrůstají rozměry molekul a polydisperzita systému. - Při určitém stupni reakce dospěje systém do bodu gelace, ve kterém <M w > vzroste nade všechny meze a v systému se objeví první stopy nekonečné struktury: gelu. - Po překročení bodu gelace se systém skládá ze dvou částí: nekonečné struktury, gelu a z molekul konečné velikosti solu. Obě části jsou od sebe oddělitelné extrakcí. Gel je nerozpustný v rozpouštědle, pouze bobtná. -V dalším průběhu reakce obsah solu klesá a jeho molární hmotnost i polydisperzita se zmenšují. -V gelu vznikají tzv. elasticky aktivní řetězce sítě, které při deformaci nesou napětí a určují pružnost gelu a jeho rovnovážný stupeň nabobtnání.

27 Bod gelace je charakterizován vznikem nekonečně velké makromolekuly <M w >. Schema struktury vzniklé síťováním mono-disperzního polymeru v předgelačním stádiu. První stopy gelu se objeví tehdy, když alespoň jeden útvar v systému dosáhne nekonečných (makroskopických) rozměrů. Systém je v bodě gelace tehdy, existuje-li můstek od molekuly A k B a od ní cesta přes další příčnou vazbu k další primární makromolekule a tak dále až do nekonečna. Pravděpodobnost že daná jednotka je zesíťovaná určuje stupeň zesíťování.

28 Flory definoval bod gelace jako konverzi funkčních skupin (p), při které koeficient větvení dosáhne kritické hodnoty. Koeficient větvení α uvažoval jako pravděpodobnost, že se funkční skupina na jedné větvící jednotce spojí s funkční skupinou na jiné větvící jednotce prostřednictvím lineárního řetězce libovolné délky. kde r je stechiometrický poměr reagujících funkčních skupin, β je poměr počtu funkčních skupin v přítomných molekulách větvícího monomeru a celkového počtu stejného typu funkčních skupin ve všech molekulách na počátku reakce. 28

29 Hydrogely Po překročení bodu gelace se systém rozdělí na sol/gel. Hmotnostní zlomek zesíťovaných jednotek v solu je obecně menší než v gelu. Těsně za bodem gelace je koncentrace zesíťovaných jednotek v gelu právě dvakrát větší než v solu či celém systému. V gelu se tedy příčné vazby tvoří přednostně. Teprve při velkém stupni zesíťování, kdy už je obsah solu malý se počet zesíťovaných jednotek solu blíží nule. Polymerní gel vzniká samovolným bobtnáním polymerní sítě ve vhodném rozpouštědle. V případě, že rozpouštědlem je voda, vzniká polymerní hydrogel. Míšení polymerních řetězců s molekulami rozpouštědla musí být energeticky výhodné. Volná energie bobtnajícího systému klesá až dosáhne svého minima, které odpovídá rovnovážnému stupni nabobtnání V případě, že se polymerní síť určena k přípravě hydrogelu skládá ze složek lišící se značně svou afinitou k vodě (hydrofilicitou), zachování topologie sítě během jejího bobtnání ve vodě může vést k fázové separaci složek v měřítku nanometrů tj. tvorbě nanofázově separovaných hydrogelů.

30 Netextilní výroba scaffoldů Příklady jednotlivých technologií Polymer Technologie Velikost pórů (um) PLA Salt leaching PLGA/PEO Porogen leaching PLGA/PVA Salt leaching Porozita (%) Kys.hyaluronová (HA) Salt leaching kolagen/ha Freeze drying Silk fibroin Freeze drying 15-50* 99 * Salt leaching Gas foaming Převzato z: V. Karageorgiou, D. Kaplan / Biomaterials 26 (2005)

31 Netextilní výroba scaffoldů Zpěňování mechanické Zpěňování polymerních roztoků do formy tuhé pěny a její následné vysušení vede k vytvoření scaffoldu s propojenými póry dostatečných velikostí. Velikost pórů jednoznačně závisí na koncentraci polymeru ve zpěňovaném roztoku. Čím je vyšší koncentrace polymeru v zpěňovaném roztoku, tím je výsledná velikosti pórů menší (Lanza 2000). Zpěňování je většinou prováděno mechanickým způsobem. Nevýhodou tohoto procesu je, že polymerních roztoků ochotných k vytváření stabilní pěny bez přídavků povrchově aktivních látek je omezené množství. Jedním takovým polymerem je například želatina. Zesíťované pěny z vepřové (nalevo) a hovězí (napravo) želatiny vyráběné jako scaffoldy pro kolenní chrupavkové náhrady. 31

32 Netextilní výroba scaffoldů Zpěňování mechanické Vodorozpustné materiály vyžadují následnou stabilizaci vůči vodě následně po zpěnění a vysušení. 32

33 Netextilní výroba scaffoldů Zpěňování plynem gas foaming Zpěňování plynem (Supercritical fluid-gassing nebo gas foaming) je metoda převzata pro výrobu scaffoldů, tak jak byla používána po desetiletí v obalové technice a farmaceutickém průmyslu. Je založena na skutečnosti, že polymery mohou být plastifikovány (měkčeny) pomocí vysokého tlaku okolního plynu (například dusíku či oxidu uhličitého). Viskozita polymeru klesá, když plyn difunduje dovnitř a rozpouští se v polymeru. Tato metoda byla vyvinuta za účelem vyhnout se používání toxických rozpouštědel a pevných porogenů. Jako porogen je zde využit plyn. Nejprve je vytvořen vzorek z vhodného polymeru (například lisováním do vyhřívané formy). Následně je tento vzorek vložen na několik dní do komory, kde je vystaven účinku vysokého tlaku určitého plynu. Tlak v komoře je postupně snižován až na atmosférickou hodnotu. 33

34 Netextilní výroba scaffoldů Zpěňování plynem gas foaming Scaffold z polymeru kyseliny mléčné vyrobený technologií foam gassing s pomocí plynu oxidu uhličitého. Měřítko 200 m. Je založena na skutečnosti, že polymery mohou být plastifikovány (měkčeny) pomocí vysokého tlaku okolního plynu (například dusíku či oxidu uhličitého). Viskozita polymeru klesá, když plyn difunduje dovnitř a rozpouští se v polymeru. 34

35 Netextilní výroba scaffoldů Zpěňování plynem gas foaming Největší výhodou této techniky je, že polymer může být zpracován za normálních teplot, což dovoluje inkorporaci léčiv citlivých na vyšší teploty a biologická činidla. Další výhodou je vysoká výsledná porozita, a to až 90%, s póry o velikosti m. Je možné použít například PLGA jako polymer vhodný pro lisování a CO 2 jako plyn difundující za vysokých tlaků do struktury tohoto biodegradabilního polymeru. Z hlediska vnitřní struktury polymerních materiálů je zřejmé, že je možné použít pouze polymerní materiály s velkým amorfním podílem. Dalším omezením je skutečnost, že pouze % pórů je jednoznačně propojených. To může být překonáno opět pomocí kombinace s jinou technologií, například s technologií vymývání částic. 35

36 Netextilní výroba scaffoldů Freeze drying lyofilizace (sušení za mrazu) Mrazové sušení (freeze-drying) je metodou, kdy je odstraňováno rozpouštědlo díky jeho sublimaci. Mrazové sušení emulzí je založeno na nemísitelnosti dvou kapalin jako např. vody a oleje. Takováto dvojice kapalin musí tvořit ve vztahu k použitému polymeru pár rozpouštědlo-nerozpouštědlo, tedy jedna z kapalin polymer rozpouští a druhá nikoliv. Polymer je rozpuštěn v rozpouštědle, k roztoku je pak přidáno nerozpouštědlo a celá směs je dokonale míchána až do vytvoření kvalitní emulze. Tato emulze je následně nalita do formy a prudce zchlazena okolní velmi nízkou teplotou (cca -80 C) nebo pomocí kapalného dusíku. Zmrazená směs potom podstupuje proces sušení za mrazu, aby došlo k odstranění jak rozpouštědla tak nerozpouštědla. 36

37 Netextilní výroba scaffoldů Freeze drying lyofilizace (sušení za mrazu) Mrazové sušení (freeze-drying) je metodou, kdy je odstraňováno rozpouštědlo díky jeho sublimaci. 37

38 Netextilní výroba scaffoldů Freeze drying lyofilizace (sušení za mrazu) Výhody tohoto procesu spočívají v získání výsledných materiálů s vysokou porozitou (více než 90%) a propojenými póry o velikosti m. To je nezbytné z hlediska dodávání živin, odvodu metabolitů, růstu buněk atd. Sušení za mrazu je velmi citlivé z hlediska reprodukovatelnosti, zásahů obsluhy a vlivu použitých zařízení. Metoda sušení za mrazu může být kombinována také s jinými technologiemi pro získání lepších vlastností výsledného scaffoldu, zejména z hlediska dostatečné porozity. Scaffold z PCL/PLA materiálu vyroben pomocí kombinace technologií sušení za mrazu a vymývání částic (v tomto případě NaCl). 38

39 Netextilní výroba scaffoldů Separace fází Oproti technice sušení za mrazu je separace fází (phase separation technology) založena na mísitelnosti páru rozpouštědlonerozpouštědlo pro použitý polymer. Nejprve je opět polymer rozpuštěn ve vhodném rozpouštědle. Následně je polymerní roztok vložen do reservoáru s nerozpouštedlem a polymer je tím vysrážen do podoby porézního scaffoldu. 39

40 Netextilní výroba scaffoldů Separace fází Tato technika je značně využívána ve farmaceutickém průmyslu pro výrobu mikrokuliček a umožňuje vnitřní včlenění léčiv, čímž je vytvářen materiál pro řízené dodávání léčiv. Změnami výrobních parametrů je možné ovlivňovat výslednou strukturu z hlediska velikosti pórů. Jde o změny systému rozpouštědlo-nerozpouštědlo, změnu koncentrace polymerního roztoku, změnu teploty a samozřejmě o přídavky vhodných příměsí. Podobně jako u techniky sušení za mrazu je i tato technologie velmi citlivá na zásahy obsluhy a vlivy použitých zařízení 40

41 Netextilní výroba scaffoldů Separace fází 41

42 Medical Materiály Textiles pro tkáňové Tissue Engineering inženýrství - MTI Kombinace textilních a netextilních scaffoldů Pěny v kombinaci s pletenými scaffoldy 42

43 Kombinace textilních a netextilních scaffoldů Pěny v kombinaci s netkanými scaffoldy 43