Materiály pro tkáňové inženýrství

Transkript

1 Materiály pro tkáňové inženýrství (II. Materiály pro tkáňové inženýrství) 4.přednáška Katedra netkaných textilií Fakulta textilní Technická univerzita v Liberci Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

2 1 FUNKCE SCAFFOLDU Nevyvolával zánětlivé reakce nebo toxické reakce in vivo. Scaffold Requirements VLASTNOSTI SCAFFOLDU Musí být biokompatibilní, netoxický a nekarcinogenní. 2 Napomáhat v růstu 3-D tkáně. Specifický tvar 3-D scaffoldu. 3 Rovnoměrné velká hustota nasazených buněk. Vysoká pórovitost a propojení mezi póry. 4 Poskytnut vhodný povrch pro adhezi a rozprostření buněk. Optimální chemické a povrchové vlastnosti použitého polymeru. Velký specifický povrch. 5 Podpořit proliferaci a migraci buněk celým scaffoldem. Optimální velikost pórů umožňuje buňkám pohyb a komunikaci. Dynamické nasazení buněk. 6 Přímá orientace buněk. Regulovatelná orientace vláken uvnitř scaffoldu; chemická úprava povrchu. 7 Umožňuje přísun živin a odstranění odpadních látek ze scaffoldu. Vysoká porozita a propojení mezi póry; kromě toho elasticita materiálu. 8 Biologická vstřebatelnost scaffoldu. Rychlost degradace se rovná rychlosti formování tkáně. Produkty degradace polymeru nesmí být toxické ani podporovat zánět in vivo. 9 Zachovat si tvar in vivo s dostatečnou mechanickou pevností. Scaffold má podobné mechanické vlastnosti jako rozvíjející se tkáň.!!! Biocompatibilní, biodegradabilní (pro většinu aplikací ovšem ne pro všechny), 3D otevřená porézní struktura, vhodné mechanické vlastnosti, dobrá sterilizovatelnost, dostatečná doba do rozkladu (pro biodegradabilní materiály)

3 Materiály pro výrobu scaffoldů Syntetické polymerní materiály Biodegradabilní Nebiodegradabilní PGA PVA, PEO, PVP PLA PHEMA PLGA PET PCL PVDF PLCL PDO Biodegradabilní PUR... PUR Handbook of pharmaceutical excipients Důležitá jsou také mechanické a biochemické vlastnosti polymerů.

4 Syntetické materiály Mechanická pevnost, odolnost Možnost modifikace tvaru a stupně degradace Hydrofobní povrch špatná adheze buněk Poly(α-hydroxy)kyseliny Esterové vazby odbourávány hydrolysou finální produkty mohou vyvolat zánětlivou reakci (vznikají kyselé produkty) PGA, PLA a jejich kopolymery nejvíce užívané: odbourávány v těla na CO 2 a H 2 O Polydioxanon (PDS) PCL-pomalejší degradace než PLA, PGA Poly(ortho) estery Polyanhydridy Polyfosfonáty Polyaminokyseliny Použití pro kontrolované uvolňování látek (léčiva, růstové faktory, enzymy)

5 Syntetické polymery pro tkáňové inženýrství 1. POLYESTERY Co jsou polyestery? Jsou to polymerní materiály, které obsahují esterovou skupinu Obecný vzorec esteru karboxylové kyseliny Velmi často je zkratkou PES a označením polyester označován polyetylentereftalát (PET), který je znám hlavně z textilního průmyslu a plastových lahví. Strukturní vzorec PET Drtivá většina biodegradabilních polymerů, které se v současnosti využívají a testují jako základní materiály pro tkáňové inženýrství pro výrobu scaffoldů, patří do skupiny právě polyesterů. Jsou to...

6 Syntetické polymery pro tkáňové inženýrství POLYESTERY PGA (polyglycolic acid) kyselina polyglykolová polymer kyseliny glykolové PLA (polylactic acid) kyseliny polymléčná polymer kyseliny mléčné PLGA (polyglycolic-co-lactic acid) kopolymer kyseliny glykolové a mléčné PCL (polycarpolactone) polykaprolakton PLCL (poly L-lactide-co-ε-caprolactone) kopolymer kyseliny mléčné a kaprolaktonu PDO (polydioxanone) polydioxanon a další Poly(3-hydroxybutyrate); Poly(3-hydroxyvalerate); Poly(valerolactone); Poly(tartronic acid); Poly( malonic acid)

7 POLYESTERY Kyselina polyglykolová Jedná se o tuhý termoplastický materiál s vysokou krystalinitou (46-50%). Skelný přechod 36 C; teplota tání 225 C. Kvůli vysoké krystalinitě není možné PGA rozpouštět ve většině organických rozpouštědel. Vyjímku tvoří vysoce fluorovaná organická rozpouštědla jako je například hexafluoro isopropanol. PGA je vysoce citlivé na hydrolitickou degradaci, proto je nutné pečlivě řídit výrobní podmínky. Degradace probíhá ve dou fázích: i) difuze vody do amorních oblastí a jednoduché hydrolytické štěpení řetězce na esterové skupiny; ii) druhá fáze je převážně degradací krystalických oblastí polymeru, které se stává dominantní ve chvíli, kdy je většina amorfních částí již rozrušena. Ačkoli je degradačním produktem vtřebatelná kyselina glykolová (přirozený metabolit), ve vysoké koncentraci může být lokálně způsobeno zvýšené okyselení a může dojít k poškození tkání (např zánětem). Za konečný osud kyseliny glykolové in-vivo je považován za konverzi na oxid uhličitý a vodu, s vyloučení z organismu přes dýchací systém. Ale kyselina glykolová může být vylučována i močí.

8 Kyselina polymléčná PLLA má krystalinitu okolo 37%, teplota skelného přechodu C a teplotu tání C Kyselina polymléčná existuje ve třech isomerických formách d(-), l(+) a dl. Poly(l)LA a poly(d)la jsou semikrystalické pevné látky, s podobnou ryhlostí hydrolytické degradace PGA. Pro většinu aplikací je (l) isomer PLA vybírán, protože je přednostně metabolizován v těle. PLA je více hydrofóbní než PGA a je odolnější vůči hydrolytickým útokům než PGA. PLA degraduje do formy kyseliny mléčné, která je normálně přítomná v těle. Produkty jsou finálně vylučovány jako voda a oxid uhličitý. Rychlost rozkladu PLA, je určena faktory, jako jsou parametry vytvořené struktury, krystalinita, molekulární hmotnost, morfologie, zatěžování, množství zbytkového monomeru, pórovitost a místo implantace.

9 Polykaprolakton PCL je jedním z nejpoužívanějších biodegradabilních syntetických polymerů v součaném tkáňovém inženýrství. Je to semikrystalický polymer s teplotou skelného přechodu okolo -60 C. Polymer má nízkou teplotu tání (59-64 C) a je kompatibilní s celou škálou dalších polymerů. PCL se rozkládá s mnohem menší rychlostí než PLA a proto se zejména využívá na dlouhotrvající implantované nosiče buněk či léků. Řízení rychlosti degradace může být ovlivňováno poměrem složek v kopolymeru např. PCL/PLA. Degradace PCL probíhá enzymaticky katalyzovanou hydrolýzou.

10 Kopolymer kyseliny mléčné a glykolové Poly(lactic-co-glycolic acid) Krystalinita PLGA se bude měnit v závislosti na poměru jednotlivých monomerů od plně amorfního až po plně krystalický polymer. Teplota skelného přechodu PLGA se pohybuje v rozmezí mezi C. PLGA kopolymery jsou užívány v tkáňovém inženýrství hlavně kostí. Uplatňují se ovšem zatím zejména jako šičí nitě. Rychlost rozpadu je dána i poměrem složek PLA a PGA v kopolymeru. Kopolymer kyseliny mléčné a kaprolaktonu Poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)

11 Polydioxanon Polydioxanon (PDO nebo PDS) nebo poly-p-dioxanonu je bezbarvý, krystalický, biologicky odbouratelný polymer. Teplota skelného přechodu v rozmezí od -10 do 0 C a krystalinita kolem 55%. Etherová skupina R-O-R v hlavním řetězci je zodpovědná za pružnost materiálu. PDOje degradován hydrolýzou, a konečné produkty jsou vylučovány především v moči, zbyteky jsou odstrněny zažíváním či vydechováním jako CO 2. Ring opening polymerization of p-dioxanone to polydioxanone

12 POLYESTERY Gunatillake, P,A., Adhikari, R.: Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering, European Cells and Materials, Vol , pg.11 E = extrusion, IM = injection moulding, CM = compression moulding, SC = solvent casting,

13 Syntetické polymery pro tkáňové inženýrství POLYESTERY Poznámka: CHIRURGICKÉ NITĚ VSTŘEBATELNÉ (BIODEGRADOVATELNÉ) PGA, PLA, PDO, PCL NEVSTŘEBATELNÉ PET

14 Materiály pro výrobu scaffoldů Přírodní materiály Alginát Kolagen (želatina) Elastin Fibroin Kyselina hyaluronová Chitosan (chitin) Přírodní hedvábí (silk fibroin) Cellulose Jistá biokompatibilita, komerční dostupnost, snadné získání, ovšem problémy s legislativou při zavádění na trh. 14

15 Biologické materiály Kolagen typ I Hlavní složka pojivové tkáně člověka zajišťující mechanickou podporu a flexibilitu tkáně (kůže, kosti) Fylogeneticky stálá sekvence aminokyselin a helikální struktura nevyvolává imunologickou odezvu organismu Možnost modifikace (crosslink s PEO, RGD sekvence) GAGs Lineární polysacharidy Při vazbě na bílkoviny tvoří proteoglykany základní součást ECM Př.: kyselina hyaluronová (HA), chondroitinsulfát, dermatansulfát, keratansulfát, heparansulfát, heparin Nejčastěji využívána HA snadná chemická modifikace, náhrada chrupavky Chitosan Deacetylovaný derivát chitinu Osteoblasty, chodnrocyty (ve směsi s PEO) Polyhydroxybutyrát (PHB) Produkován mikroorganismy ve stresových podmínkách Nejčatěji jako kopolymer s kyselinou hydroxyvalerovou (HVA)

16 Přírodní materiály pro tkáňové inženýrství Hlavní složky přizené ECM (extracelulární matrice), jejich výskyt a funkce v těle. Sell, S., A., et al.: Te Use of Natural Polymers in Tissue Engineering, Polymers 2010, 2, pg.524

17 Kyselina hyaluronová je základní součástí synoviální (kloubní) tekutiny, maziva kloubů. Bez ní by naše klouby nemohly fungovat tak snadno, jak obvykle fungují. Navíc synoviální tekutina slouží jako poduška a jako zdroj živin pro buňky chrupavky, která se musí pravidelně obnovovat. Zdravý mladý jedinec vytváří kyselinu hyaluronovou z glukosaminů, které přijímá v potravě. KH tvoří jednu z hlavních složek mezibuněčné hmoty. Je součástí pojivových, epiteliálních a nervových tkání. Ve velkém množství se nachází v očním sklivci, synoviální tekutině a kůži. Rovněž tvoří slizovité obaly vajíček některých organizmů. Je přirozenou součástí lidského těla. Zajišťuje dokonalou hydrataci naší pokožky, je obsažena v našem oku, je součástí vaziva. Díky ní se naše klouby mohou hladce pohybovat. Právě proto, že se tato látka v našem těle přirozeně vyskytuje a je pro spoustu jeho funkcí nezbytná, nachází kyselina hyaluronová mnohostranné uplatnění ve farmaceutickém průmyslu. 17

18 Biologické materiály Chitosan Deacetylovaný derivát chitinu Osteoblasty, chodnrocyty (ve směsi s PEO) Dobré antibakteriální vlastnosti. Rozpustný v kyselinách. Špatná zvláknitelnost a reprodukovatelnost. Assoc. Prof. Karoline Schauer, Drexel University, Philadelphia. Polyhydroxybutyrát (PHB) Produkován mikroorganismy ve stresových podmínkách Nejčatěji jako kopolymer s kyselinou hydroxyvalerovou (HVA)

19 Kolagen Kolagen je skleroprotein (protein vláknitého tvaru), extracelulární, ve vodě nerozpustná bílkovina, která je základní stavební hmotou pojivových tkání. Tvoří % všech proteinů v těle savců, ve formě kolagenních vláken je složkou mezibuněčné hmoty. V současnosti je známo nejméně 27 rozdílných typů kolagenů. Kolagenové choroby tj. choroby charakteristické patologickými či degradačními formami kolagenu postihují např. srdce, cévy, svaly a kůži. Samotný kolagen hraje důležitou roli i při stárnutí organismu. Molekula kolagenu je tvořena hlavně aminokyselinami glycinem, prolinem, hydroxyprolinem a hydroxylysinem. Poslední dva vznikají posttranslační modifikací prolinu a lysinu za účasti kyseliny askorbové vitaminu C. Kolagen se skládá z řetězců alfa 1 a alfa 2, které se jen málo liší pořadím aminokyselin. Řetězce tvoří trojitou spirálu, která se označuje jako tropokolagen. Je to základní jednotka kolagenu, dlouhá přibližně 256 nm.

20 Kolagen Existuje celá řada typů, nejdůležitější je kolagen typu I, II, III, IV, a V. Nejrozšířenější je typ I, představuje 90 % kolagenu v organismech, je přítomen v pokožce, šlachách, kostech a zubech. Typ II se vyskytuje v chrupavkách. Typ III je kolagen embryonálního vývoje, později je nahrazen typem I. Typ IV se vyskytuje v bazální membráně epitelů. Kolagen typu V je charakteristický pro stěnu krevních cév. Kolagen I: Tento typ je nejdůležitějším a nejrozšířenějším typem kolagenu, který má i široké průmyslové využití. Je základem např. hemostatické plsti, chirurgických nití, kolagenových membrán, dále pak je součástí řady potravinových doplňků či kosmetických přípravků proti stárnutí pleti.kolagen typ I tvoří typická 1-20 µm dlouhá kolagenní vlákna. Hlavní výskyt v lidském těle: kost, kůra vaječníku, pleura, perineurium, subserosa žlučníku, tuková tkáň, tunica adventitia cév (i kapilár), vazivová chrupavka, závěsný aparát zubu. Kolagen II: Jsou 20 nm dlouhé fibrily (neagregují ve vlákna). Hlavní výskyt v lidském těle: hyalinní a elastická chrupavka (i vazivová), tunica media (okolo hladkých svalových buněk)

21 Kolagen Želatina je získávána teplotní denaturací kolagenu Zahříváním kolagenu ve vodě dochazí ke kompletní denaturaci rozvolnění helixové struktury kolagenu uvolněním vodíkových můstků. Materiály používané k výrobě želatiny: 27% kosti, 28% hovězí šlachy, 44% prasečí kůže, 1% jiný zdroj. 21

22 Celulóza Polysacharid který je sám o sobě v lidském organismu nedegradabilní Problém s rozpustností NMMO (Nmethylmorpholine N-oxide, DMAc/LiCl, 1-ethyl-3- methylimidazolium acetate, DMSO, ) Cellulose acetate dobře rozpustný a zvláknitelný elektrostaticky Oxidized cellulose degradabilní v lidském organismu, hemokoagulační, problémy se zvláknitelností a uchováváním Nanocelulóza rostlinná nebo bakteriální CMF cellulose micro fibrils CNF cellulose nano fibrils CNC cellullose nano crystals

23 Silk fibroin Fibroin je druh bílkoviny tvořené Bourcem morušovým ve formě hedvábí. Bourec produkuje vlákno složené ze dvou hlavních bílkovin (sericin a fibroin). Sericin je lebkavý materiál, který obklopuje pevná vlákna fibroinu. 23

24 Textilní výroba scaffoldů Elektrostatické zvlákňování Lidský vlas Bavlněné vlákno

25 Jirsák, O. Sanetrník, F. Lukáš, D. Kotek, V. Marinová, L. Chaloupek, J. (2005) WO A Method of Nanofibres Production from A Polymer Solution Using Electrostatic Spinning and A Device for Carrying out The Method. E general r r R r 2 R Er cos 1 2 r r R 2Ecos

26 33 m/min

27 Textilní výroba scaffoldů Elektrostatické zvlákňování

28 Elektrostatické zvlákňování extrémně zředěných roztoků k tzv. perličkovému efektu. Viskoelastické síly v trysce jsou příliš malé k udržení vlákenné struktury. Rayleighova nestabilita V extrému = elektrospraying (např. voda)