Albertov Comprehensive Days Michal Hoskovec. Infochemikálie Ústav organické chemie a biochemie AV ČR

Transkript

1 Albertov Comprehensive Days 2012 Neodolatelná vůně smrti Michal Hoskovec Infochemikálie Ústav organické chemie a biochemie AV ČR

2 Úvod - hrobaříci Mrchožroutovití (Coleoptera: Silphidae; 210 druhů): součást velké skupiny mrchožroutů ( scavengerů ) kteří hrají klíčovou roli v recyklaci mrtvých těl obratlovců v přírodních ekosystémech Čeled Silphidae: dvě podčeledi - Nicrophorinae (hrobaříci) a Silphinae (mrchožrouti) s rozdílným zdroji potravy Hrobaříci největšího rodu Nicrophorus vyhledávají čerstvé mrtvolky obratlovců zdroj potravy pro jejich potomstvo Nicrophorus ve střední Evropě: většinou specializace na mrtvolky malých hlodavců a hmyzožravců (myši, hraboši, myšice, rejsci)

3 Rod Nicrophorus (68 druhů celosvětově) N. vespilloides N. germanicus N. americanus N. vespillo

4 Reprodukce a vývoj 1. vyhledání mrtvolky 2. páření 3. přesun mrtvolky na místo vhodné k pohřbu 4. pohřeb - vlastní hloubení pohřební komory a pohřbení - tvarování mrtvolky do tzv. potravní koule - pokrytí potravní koule ochrannými antibakteriálními sekrety 5. kladení vajíček 6. rodičovská péče o larvy

5 Nalezení zdroje potravy a páření

6 Vytváření potravní koule

7 Péče o potomstvo

8 Nicrophorus navigace ke zdroji potravy úspěšná reprodukce vyžaduje čerstvou a jinými mrchožrouty neobsazenou mrtvolku to závisí kriticky na schopnosti brouka najít mrtvolku co možná nejrychleji po smrti daného zvířete mrtvolka je čerstvý voňavý chlebíček s uherákem a okurčičkou pro velký počet mrchožravých obratlovců (krkavcovití ptáci, jezevci, lišky ) a jejich hmyzí kompetitory hrobařící lokalizují mrtvolky pomocí chemoreceptorů na jejich kyjovitých tykadlech chemické složení TOS (těkavých organických sloučenin) emitovaných čerstvými mrtvolkami nebylo dostatečně popsáno nepřímé znalosti spekulují o roli sirných a dusíkatých TOS

9 Náš cíl: Identifikace infochemikálií emitovaných čerstvými mrtvolkami drobných obratlovců a lákajících hrobaříky rodu Nicrophorus Cílové druhy nejběžnější dva druhy evropských hrobaříků: Nicrophorus vespillo a Nicrophorus vespilloides

10 První krok Analýza emise TOS

11 Odběr vzorků SPME vlákno myš domáci(mus musculus; 10 ks) hraboš (Microtus agrestis; 3 ks) monitoring h každou 1 h CAR/PDMS vlákno Supelco expozice vlákna: 15 min start monitoringu: ihned post portem

12 LECO Pegasus IVD 1. vzorek 2. nástřik 3. 1D kolona (30 m, DB-5) 4. kryomodulátor 5. sekundární GC pec 6. 2D kolona (2 m, BPX-50) 7. transferline 8. iontový zdroj 9. letová trubice a iont. optika 10. detektor 11. řídící počítač

13 GC GC-TOFMS chromatogram S-TOS uvolňované z mrtvolky Mus musculus zobrazené na specifické hmotnosti 47 (CH 3 S ) Identifikované sloučeniny (via MS spektra standardů & 2D-retenční chování): 1. methanthiol (MeSH) 2. dimethylsulfid (DMS) 3. kontaminace (toluen) 4. methylthioacetát (MeSAc) 5. dimethyldisulfid (DMDS) 6. dimethyltrisulfid (DMTS) 7. dimethytetrasulfid (DMQS) CH 3 SH CH 3 -S-CH 3 CH 3 COSCH 3 CH 3 -SS-CH 3 CH 3 -SSS-CH 3 CH 3 -SSSS-CH 3

14 TIC 47 Hraboš polní po 48 h (výhoda selektivního zobrazení na iontu 47)

15 Emise S-TOS myší mrtvolkou Během 144 hodin post mortem (průměr ploch 2D GC GC-TOFMS skvrn z 10 nezávislých analýz*) hodin p.m. MeSH DMS MeSAc DMDS DMTS DMQS den 6 * * * * * 0 12 *** ** *** ** * 0 18 **** *** *** *** ** 0 24 **** *** **** **** ** 0 36 **** *** *** **** ** 0 2. den 48 *** **** *** **** ** t 60 *** **** ** **** ** * 3. den 72 *** **** ** **** *** * 4. den 96 *** **** ** ***** *** * 5. den 120 ** *** * ***** *** * 6. den 144 ** *** * ***** *** ** 0 žádná látka, t stopy, * - velmi nízká koncentrace, ** - nízká/střední koncentrace, *** - střední koncentrace, **** - vysoká koncentrace, ***** - velmi vysoká koncentrace

16 TOS analýza - výsledky zcela čerstvé mrtvolky, stejně jako živá zvířata mají prakticky nulovou emisi přibližně od min po smrti začíná emise S-TOS (MeSH, MeSAc, DMS, DMDS, DMTS a u starších mrtvolek také DMQS) celkové množství S-TOS se se stářím mrtvolky zvyšuje zjištěné malé kvantitativní rozdíly emise S-TOS lze přisoudit individuálním rozdílům jednotlivých zdrojů (stáří zvířetem jeho hmotnost, strava či zdravotní stav) DMDS byl sloučeninou s největší abundancí, následován DMS, MeSH, MeSAc, DMTS a DMQS mimo výše uvedené sloučeniny jsme ve velmi starých mrtvolkách (> 3 dny) detekovali stopy jiných S-TOS, např. merkaptooctové kyseliny, methyl thiolpropanoátu, methylethyldisulfidu, 2,4-dithiapentanu, thiopivalové kyseliny a methyl(methylthio)methyldisulfidu kromě S-TOS, jsme v prvních 72 hodinách od smrti hlodavce nezjistili přítomnosr jiných předpokládaných produktů enzymatické/bakteriální degradace proteinů (skatolu, indolu, nižších i vyšších aminů et cetera)

17 Druhý krok GC-EAD a EAG

18 Tykadlo hrobaříka rodu Nicrophorus Hrobaříci mají kyjovitá tykadla, jejichž palička je tvořena zvětšenými a zploštělými antenomery pokrytými chemosenzory umožňujícími broukovi detekovat pach rozkládajících se mršin.

19 GC-EAD Klíčový zdroj informací ve výzkumu infochemikálií u hmyzu injekční port zesilovač FID záznam FID helium (nosný plyn) kapilární kolona pec chromatografu EAD zesilovač tykadlo hmyzu EAD záznam skleněná mikroelektroda naplněná solným roztokem EAD antenální preparace v detailu

20 SPME & GC-EAD Analýza myší emise a syntetických S-TOS A: FID záznam TOS uvolňujících se z 24 hodin staré mrtvolky myši B: FID záznam směsi Syntetických S-TOS C & D: EAD záznamy of GC-EAD analýz na samčích tykadlech N. vespillo a N. vespilloides Oba druhy vykazují téměř shodné odpovědi

21 EAG dose-response křivky S-TOS identifikované ve vůni smrti myší mrtvolky (u N. vespillo) 22 Nicrophorus vespillo MeSH DMS DMDS DMTS MeSAc EAG [mv] corrected dose [nmol/µl] Každý bod reprezentuje nezávislých 5 EAD záznamů. dávky µg/µl jsou přepočteny na nmol/µl a korigovány na různou těkavost sloučenin

22 EAG dose-response křivky S-TOS identifikované ve vůni smrti myší mrtvolky (u N. vespilloides) 16 Nicrophorus vespilloides MeSH DMS DMDS DMTS MeSAc EAG [mv] corrected dose [nmol/µl] Každý bod reprezentuje nezávislých 5 EAD záznamů. dávky µg/µl jsou přepočteny na nmol/µl a korigovány na různou těkavost sloučenin

23 Různé těkavosti S-TOS MeSH DMS DMDS DMTS MTA b.v. [ C] 6 a 37 a 110 a a 98 a p sat [kpa; 20 C] 165 a 53.2 a 2.93 a 0.49 b 4.25 b p R [20 C] c a CRC Handbook of Chemistry and Physics & NIST databáze b Stanoveno v naší laboratoři pomocí plynové chromatografie c p R : relativní těkavost (DMS jako standard; p R = p sat (x) /p sat (DMS) ) Testované sloučeniny se výrazně liší v tlacích nasycených par (a tím těkavosti) při pokojové teplotě Při porovnání biologické aktivity musíme s těmito rozdíly počítat

24 GC-EAD a EAG - výsledky všechny identifikované S-TOS jsou aktivní na tykadlech hrobaříků SPME & GC-EAD analýzy syntetických S-TOS vyvolávají EAD odpovědi při stejných retenčních časech jako látky z mrtvolek identické retenční časy a srovnatelná antenální aktivita přírodních a syntetických sloučenin potvrzují správnost jejich identifikace EAG odpovědi na S-TOS byly získány především z povrchu posledního antenomeru u obou druhů odpovědi z ostatních antenomerů nebyly dostačující pro EAD záznam EAG dose responses křivky prokázaly aktivitu všech testovaných sloučenin oba druhy mají podobnou citlivost k MeSH a DMDS, ale mírně se liší ve vnímání MeSAc, DMS a DMTS vysoké aktivity DMDS a DMTS při středních koncentracích pravděpodobně naznačují jejich význam v chemoinformačním kanálu mrtvolka scavenger

25 Třetí krok Biologické testy

26 Y-olfaktometr test s čerstvou myší mrtvolkou Testy s vybranými syntetickými složkami identifikovanými v mrtvolné emisi (DMS, DMDS a DMTS) 272 N. vespilloides a 259 N. vespillo bylo celkem testováno

27 Experimentalní podmínky olfaktometr: dvě skleněné Y-části (4 cm průměr, 30 cm délka) spojené spolu rameny ramena s kulovým prostorem (7 cm průměr) pro návnadu jsou výměnná pro zamezení kontaminace olfaktometr má vstup v kruhové arénce (35 cm průměr, 15 cm výška) do které jsou vypouštěni brouci testovaná návnada je umístěna náhodně v jednom rameni, druhé zůstává prázdné čištěný zvlhčený vzduch (100 ml/s) proudil do obou ramen, obohacený v prostoru s návnadou čichovým signálem aktivujícím brouky v arénce stimul: 24 h stará mrtvolka myši / 1 µl testované látky uzavřené v mikrovialce (500 µl) s vatou kontaminované častí olfaktometru měněny pro každý pokus Jedinci obou druhů (Nicrophorus vespillo a Nicrophorus vespilloides) byli vypouštěni do arénky po 1 h aklimatizaci v laboratoři

28 Výsledky biotestů AtraktivitaDMTS, DMDS, DMS a 1 staré myší mrtvolky pro hrobaříky N. vespillo a N. vespilloides stanovená laboratorně v Y-olfaktometru Sloupce znázorňují procento odpovídajících brouků na daný stimul. Čísla ve sloupcích udávají množství brouků v každém testu. 24 h staré mrtvolky myši byly vysoce atraktivní pro oba druhy obecně byly samice obou druhů úspěšnější ve srovnání se samci, ale statisticky významné to bylo pouze u N. vespillo (93.3 % samic a pouze 69.7% samců reagovalo na myší mrtvolku) u N. vespilloides byly rozdíly mezi pohlavímy méně výrazné (84.4% samic a 93.5% samců) u obou druhů vyvolaly syntetické návnady (1 µl DMTS, DMDS a DMS) odpovědi téměř srovnatelné s přírodní návnadou rozdíly mezi nimi nebyly statisticky významné.

29 Falešná vůně smrti arónovité rostliny (Araceae) emitují stejné S- TOS jako mrtvoly obratlovců a lákají jimi hmyz, především mouchy jako jsou bzučivky (Lucilia sp.) hadovkovité houby (Phallaceae) používají stejný falešný mrtvolný zápach k nalákaní hmyzu (opět much, ale i mrchožroutovitých brouků a chrobáků) atrahovaný hmyz pak zprostředkuje opylení či transport výtrusů Helicodiceros muscivorus vs. bzučivky rodu Lucilia Hadovka smrdutá (Phallus impudicus) vs. masařky rodu Sarcophaga

30 Kalinová B., Podskalská H., Růžička J., Hoskovec M.: Irresistible bouquet of death how are burying beetles (Coleoptera: Silphidae: Nicrophorus) attracted by carcasses Naturwissenschaften 96: (2009) Děkuji za pozornost.