NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY KAPILÁRNÍ KOLONY

Transkript

1 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY KAPILÁRNÍ KOLONY BLESKOVĚ ODPAŘUJÍCÍ (Vaporization Injection) Split Splitless On-Column CHLADNÉ (Cool Injection) nástřik velkých objemů (LVI) On-Column On-Column-SVE PTV

2 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY Bleskově odpařující ODPAŘENÍ RIZIKA: BACKFLASH a DISKRIMINACE (Obrázky: Allen K. Vickers, Agilent Technologies)

3 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY Bleskově odpařující BACKFLASH -při odpaření vzorek expanduje x - je-li objem par > objem lineru Minimalizace: objem lineru nastřik. objem expandující rozp. teplota nástřiku průtok nos. plynu - ztráty vzorku tlak na hlavu kolony - chvostující rozpouštědlo - cizí ghost píky (Obrázky: Allen K. Vickers, Agilent Technologies)

4 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY Bleskově odpařující DISKRIMINACE -nastříknutý vzorek vzorek vnesený na kolonu -způsobeno rozdílnou těkavostí složek vzorku - těkavost do kolony Důležité faktory: efektivní záhřev vzorku efektivní míchání par vzorku s m.f. umístění kolony v nástřiku diskriminace v nástřiku X ve stříkačce nutno dodržovat stejné podmínky (Obrázky: Allen K. Vickers, Agilent Technologies)

5 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY MANUÁLNÍ NÁSTŘIK FILLED NEEDLE COLD NEEDLE HOT NEEDLE * SOLVENT FLUSH * AIR FLUSH * *...nediskriminační (Obrázky: Allen K. Vickers, Agilent Technologies)

6 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY MANUÁLNÍ x AUTOMATICKÝ NÁSTŘIK MANUÁLNÍ AUTOSAMPLER PCB PLOCHA RSD(%) PLOCHA RSD(%) Průměr 13 % 2 %

7 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLIT (Obrázek: Hewlett-Packard (Agilent Technologies))

8 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY TYPY LINERŮ (Obrázek: Hewlett-Packard (Agilent Technologies)

9 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLIT SPLIT POMĚR : podle i.d. kolony a koncentrace vzorku 0,1 mm : 1 : 1000 min: 1 : 50 0,2-0,32 mm : 1 : 50-1 : 500 min: 1 : 10 0,53 mm : 1 : 5-1 : 50 min: 1 : 2 split poměrurčuje množství vzorku vnesené na kolonu split poměr poměr rozdělení vzorku Plocha píku Reálné Očekávané Split poměr (Obrázek: SGE,

10 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLIT SPLIT POMĚR : Ideální případ : vzorek zcela v plynné fázi a homogenně smíchán s nosným plynem Reálný případ : - vzorek se složkami nestejné těkavosti - neúplné odpaření -různá difůzní rychlost složek vzorku - kolísající split poměr = DISKRIMINACE (zkreslení složení) = NÍZKÁ OPAKOVATELNOST

11 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLIT SPLIT POMĚR: 1 : : 5 DB-1 (15m x 0.25mm x 0,25µm) (Obrázek: Hewlett-Packard (Agilent Technologies))

12 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLIT SPLIT POMĚR OVLIVŇUJE: -těkavost vzorku -nastřikovaný objem - typ rozpouštědla - technika nástřiku stříkačkou -teplota nástřiku - teplota kolony (rekondenzace vzorku - zóna sníženého tlaku, nasátí dalších par vzorku) -objem injektoru

13 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLIT OMEZENÍ DISKRIMINACE: - linery (skelná vata) - zvýšená teplota nástřiku - rychlý hot needle ZVÝŠENÍ REPRODUKOVATELNOSTI: - stejný nastřikovaný objem - stejné rozpouštědlo - technika vnitřního standardu - stejná počáteční teplota kolony POUŽITELNOST: - analyty eluující se před rozpouštědlem - vzorky špinavé - vysoké koncentrace analytů -při použití kolon s velmi malým i.d.

14 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS (Obrázek: Hewlett-Packard (Agilent Technologies))

15 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS (Obrázek: Hewlett-Packard (Agilent Technologies))

16 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS SPLITLESS PERIODA (t s ) experimentálně, závisí na: - vlastnostech rozpouštědla - vlastnostech analytů - objemu nástřikového prostoru -nastřikovaném objemu -nástřikové rychlosti - rychlosti nosného plynu V l objem lineru (ml) F průtok nosného plynu (ml/min) Teoreticky 1,5-2 násobek času potřebného k protečení nosného plynu nástřikovým prostorem

17 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS SPLITLESS PERIODA 1 min 8 min PLOCHA PCB 180: 100 % 116 %

18 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS ROZŠIŘOVÁNÍ NANÁŠENÉ ZÓNY: 1. V ČASE pomalý přenos par vzorku z inletu do kolony 2. V PROSTORU důsledek migrace kapalného vzorku kolonou (1 µl = cm) ZAOSTŘENÍ NANÁŠENÉ ZÓNY: jestliže k front > k rear K D vzroste, ß klesne (Rozdělovací poměr k = K D / ß)

19 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS ZAOSTŘENÍ NANÁŠENÉ ZÓNY: k front > k rear 1) STACIONÁRNÍ FÁZÍ - kolona musí být schlazena 2) ROZPOUŠTĚDLEM - teplota kolony o C pod bodem varu rozpouštědla kondenzace -dočasná s.f. s tlustým filmem = oblast s ß - záchyt analytů (s těkavostí podobnou rozp.) v úzkém pásu - programace teploty - postupné odpaření (ROZŠIŘOVÁNÍ PÁSU V PROSTORU - retenční gap)

20 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS ZAOSTŘENÍ NANÁŠENÉ ZÓNY: k front > k rear 3) TEPLOTNÍ ZAOSTŘENÍ - teplota kolony min 150 o C pod bodem varu nejtěkavějšího analytu, rozpouštědlo prochází, analyty kondenzují - programace teploty - postupné odpaření - často následuje zaostření STACIONÁRNÍ FÁZÍ 2) RETENČNÍ GAP kolona bez s.f. (k 0) minim. retence - redukce délky pásu (odpařování rozpouštědla) - na hlavě kolony zaostření ROZPOUŠTĚDLEM a STAC. FÁZÍ

21 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS ZAOSTŘENÍ ROZPOUŠTĚDLEM (Hexan,b.v. 68 o C) (Obrázky: Allen K. Vickers, Agilent Technologies)

22 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS POLARITA s.f. X POLARITA ROZPOUŠTĚDLA X POČÁTEČNÍ TEPLOTA KOLONY (DB-5) 1) MeOH, 60 o C 1 2) MeOH, 50 o C 2 3) HEXAN, 60 o C 3 GC/MSD SCAN, ftaláty

23 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY - SPLITLESS OPTIMALIZACE: - b.v. rozpouštědla min o 25 o C < b.v. nejtěkavějšího analytu -počáteční teplota kolony o C pod b.v. rozpouštědla - stejné nastřikované objemy POUŽITELNOST: - vzorky zředěné - vzorky relativněčisté

24 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY ON-COLUMN (Obrázek: Hewlett-Packard (Agilent Technologies))

25 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY ON-COLUMN Kapalný vzorek je bez předehřátí a smíchání s nosným plynem nanášen přímo do kolony. Výhody: - NÍZKÉ RIZIKO DEGRADACE analytů během nástřiku - ELIMINACE DISKRIMINACE Nevýhody: - KONTAMINACE systému netěkavými látkami - ROZŠIŘOVÁNÍ ZÓN V PROSTORU - riziko BACKFLASH - teplota kolony tlak par > tlak nosného plynu expanze v obou směrech široký pík rozpouštědla, memory efekty

26 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY ON-COLUMN KONTAMINACE systému netěkavými látkami RETENČNÍ GAP (umožní i nástřik větších objemů vzorků)

27 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY ON-COLUMN SNÍŽENÍ RIZIKA "BACKFLUSH": - teplota kolony bod varu rozpouštědla -nástřik rychlý, nepřerušovaný -nástřik malých objemů -větší průtok -přídavné chlazení v místě nástřiku - po nástřiku prudce zvýšit teplotu kolony POUŽITELNOST: - vzorky zředěné, čisté -přesné výsledky - analyty eluující se před rozpouštědlem nemohou být zaostřeny -malé nástřikové objemy

28 NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY SROVNÁNÍ SPLIT SPLITLESS ON-COLUMN 21 % 52 % 100 %

29 ELEKTRONICKÁ KONTROLA TLAKU (EPC) SPLIT, SPLITLESS, ON-COLUMN, (DETEKTOROVÉ PLYNY)

30 ELEKTRONICKÁ KONTROLA TLAKU (EPC) DŮVODY PRO POUŽITÍ EPC - TEPLOTNÍ PROGRAM : TEPLOTA RETENCE; DIFUZIVITA OPTIMUM LINEÁRNÍ RYCHLOSTI pro udržení konstantní účinnosti X TEPLOTA LIN. RYCHLOST PROGRAMACE TLAKU VÝHODY EPC: - Zlepšení reprodukovatelnosti RT - Zkrácení analýz - Snížení diskriminace a rozkladu termolabilních látek - Nástřik větších objemů (do 5 µl) - Zlepšení rozlišení (užší píky) Projeví se hlavně u krátkých kolon s velkým vnitřním průměrem

31 ELEKTRONICKÁ KONTROLA TLAKU (EPC) NÁSTŘIK VYŠŠÍCH OBJEMŮ: N á s t ř i k : 1, 3, 5 µl (= 10, 30, 50 pg PCB v nástřiku) K o l o n a : DB-5 (60 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Relativní výtěžnost (%) = (A nástřik n µl / n * A nástřik 1 µl )*100 a) Konstantní tlak : 16 psi = 0,74 ml/min/60 o C, 0,33 ml/min/270 o C PCB 1 µl 3 µl 5 µl b) Konstantní průtok : 0,74 ml/min = 16 psi/60 o C, 28,2 psi/270 o C PCB 1 µl 3 µl 5 µl

32 ELEKTRONICKÁ KONTROLA TLAKU (EPC) NÁSTŘIK VYŠŠÍCH OBJEMŮ: c) Tlakový puls : 150, 200, 250 kpa po dobu splitless periody, dále konstantní průtok 0,74 ml/min 150 kpa 200 kpa 250 kpa PCB 1 µl 3 µl 5 µl 1 µl 3 µl 5 µl 1 µl 3 µl 5 µl

33 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ (LVI) DŮVODY : CITLIVOST 1 µl roztoku o koncentraci 1 ppm 50 µl roztoku o koncentraci 20 ppb 50 x větší citlivost ZJEDNODUŠENÍ PŘÍPRAVY VZORKU - odstranění nutnosti zakoncentrace (RVO) - snížení navážky MOŽNOST ON-LINE SPOJENÍ -přípravy vzorku s GC a GC/MS (např. SPE) -HPLC -GC

34 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ (LVI) PROBLÉMY: ŘEŠENÍ: Velké množství rozpouštědla Odstranění rozpouštědla před X analytickou kolonou Kolony, detektory (MSD) Rozšíření zóny vzorku Zaostřující techniky REALIZACE: COOL ON-COLUMN NÁSTŘIK (COC) COC S VÝSTUPEM PAR ROZPOUŠTĚDLA (COC - solvent vapor exit, COC-SVE) TEPLOTNĚ PROGRAMOVANÝ SPLIT/SPLITLESS NÁSTŘIK (Programmed Temperature Vaporizing Injector, PTV)

35 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ (LVI) TECHNIKA POŽADAVKY NÁSTŘIK OMEZENÍ COC 5-10m předkolona do 100 µl v koloně akumulace netěkavých látek COC-SVE předkolona SVE do 1 ml v koloně akumulace netěkavých látek PTV kontrolovaná rychlost nástřiku liner s náplní ( cryo-chlazení) do 1 ml ztráta těkavých látek

36 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ COC, COC-SVE Referenční vzorek minerálního oleje v hexanu, GC/FID: A) koncentrace 1 mg/ml, nástřik 1µl, COC B) zředěno 50x (=0,02 mg/ml), nástřik 50 µl, COC-předkolona C) zředěno 50x (=0,02 mg/ml), nástřik 50 µl, COC-SVE (F.David a kol. : poster na 18. Mezinárodním symposiu o kapilární chromatografii, , Riva del Garda, Itálie)

37 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ COC-SVE Odstranění rozpouštědlazapředkolonou, programování teploty kolony

38 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ COC-SVE -Nedochází ke ztrátě těkavých analytů -Pro čisté vzorky (kontaminovaná předkolona způsobuje chvostování píků)

39 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ PTV Odstranění rozpouštědla v nástřikovém prostoru, programování teploty nástřiku

40 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ PTV POŽADAVKY: - malý vnitřní objem injektoru pro usnadnění rychlého záhřevu - malý vnitřní objem insertu (stejný důvod), cca µl - insert naplněný skelnou vatou či jiným nosičem (zádrž kapalného vzorku) Jestliže rychlost nástřiku = rychlosti odpařování rozpouštědla, je možné nastřikovat jakékoliv množství vzorku (teoreticky) 1) sensor rozpouštědlanasplitovélinii, který dává informaci o rychlosti jeho vypařování a umožňuje odstranit předem určené množství 2) rychlost nástřiku je regulovatelná

41 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ PTV SPLIT SPLITLESS NÁSTŘIK (solvent split nástřik) -vzorek nastřikován do chladného injektoru s otevřeným splitem - rozpouštědlo a těkavé látky jsou unášeny nosným plynem do splitové linie - po uzavření splitu vyhřátí injektoru a přenos analytů do kolony Výhody/Problémy: - ztráta těkavých analytů (optimalizace náplně insertu, solvent efekt) - menší problémy s kontaminací kolony - není diskriminace v jehle a degradace termolabilních sloučenin (oproti klasickému Split/Splitless)

42 NÁSTŘIK VELKÝCH OBJEMŮ COC x PTV