ELISA ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY. Tatiana Košťálová, Tereza Leštinová

Transkript

1 ELISA ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY Tatiana Košťálová, Tereza Leštinová Parazitologické laboratorní techniky, 26. listopadu 2014

2 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii

3 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard A B C D 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu A 1:50 A 1:100 A 1:200 A 1:400 B 1:50 B 1:100 B 1:200 B 1:400 C 1:50 C 1:100 C 1:200 C 1:400 StdB neřed. StdB 2 StdB 4 StdB 8 StdC neřed. StdC 2 StdC 4 StdC 8 StdD neřed. StdD 2 StdD 4 StdD 8 E A 1:800 B 1:800 C 1:800 StdB 16 StdC 16 StdD 16 F G H StdA StdA 0 Ab 0 Ab 0 Ab 0 Px 0 Ab 0 Px

4 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard vlastní vzorek nařeďte 1:50 do ředícího roztoku na vzorky tzn. 5 ul séra do 250 ul ředícího roztoku slepé vzorky připraveny v koncentraci 1:50 kontroly neředit 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu

5 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard vlastní vzorek nařeďte 1:50 do ředícího roztoku na vzorky tzn. 5 ul séra do 250 ul ředícího roztoku slepé vzorky připraveny v koncentraci 1:50 kontroly neředit 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu

6 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard ŘEDÍCÍ ŘADA 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 neřeď

7 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard ŘEDÍCÍ ŘADA 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 do jamek označených 1:100, 1:200, 1:400 a 1:800 (řada B-E) dejte po 100 ul ředícího roztoku na vzorky

8 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard ŘEDÍCÍ ŘADA 100 ul 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu 100 ul 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 do jamek označených 1:100, 1:200, 1:400 a 1:800 (řada B-E) dejte po 100 ul ředícího roztoku na vzorky do jamek 1:50 a 1:100 naneste po 100 ul vzorku

9 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard ŘEDÍCÍ ŘADA 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 do jamek označených 1:100, 1:200, 1:400 a 1:800 (řada B-E) dejte po 100 ul ředícího roztoku na vzorky do jamek 1:50 a 1:100 naneste po 100 ul příslušného vzorku v jamce 1:100 vzorek promíchejte vzorek 1:50 jsme naředili 1:1, tzn. teď je 1:100

10 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard ŘEDÍCÍ ŘADA 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu 100 ul 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 do jamek označených 1:100, 1:200, 1:400 a 1:800 (řada B-E) dejte po 100 ul ředícího roztoku na vzorky do jamek 1:50 a 1:100 naneste po 100 ul příslušného vzorku v jamce 1:100 vzorek promíchejte vzorek 1:50 jsme naředili 1:1, tzn. teď je 1:100 přeneste 100 ul z jamky 1:100 do jamky 1:200

11 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard ŘEDÍCÍ ŘADA 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu 100 ul 100 ul 100 ul 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 do jamek označených 1:100, 1:200, 1:400 a 1:800 (řada B-E) dejte po 100 ul ředícího roztoku na vzorky do jamek 1:50 a 1:100 naneste po 100 ul příslušného vzorku v jamce 1:100 vzorek promíchejte a přeneste 100 ul do 1:200 v jamce 1:200 vzorek promíchejte a přeneste 100 ul do 1:400 v jamce 1:400 vzorek promíchejte a přeneste 100 ul do 1:800 v jamce 1:800 vzorek promíchejte a odsajte 100 ul v jamkách A1 až E4 je je po 100 ul vzorku

12 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard A B C D 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu A 1:50 A 1:100 A 1:200 A 1:400 B 1:50 B 1:100 B 1:200 B 1:400 C 1:50 C 1:100 C 1:200 C 1:400 StdB neřed. StdB 2 StdB 4 StdB 8 StdC neřed. StdC 2 StdC 4 StdC 8 StdD neřed. StdD 2 StdD 4 StdD 8 E A 1:800 B 1:800 C 1:800 StdB 16 StdC 16 StdD 16 F G H StdA StdA 0 Ab 0 Ab 0 Ab 0 Px 0 Ab 0 Px

13 Průkaz protilátek proti Toxoplasma gondii A,B = slepý vzorek C = vlastní sérum Std = standard 0Ab = kontrola bez protilátek 0Px = kontrola bez konjugátu do jamek označených Std (B,C,D) rozřeďte příslušný standard, postupujte jako u vzorků do jamek označených StdA dejte po 100 ul standardu A do jamek označených 0Ab nebo 0Ab0Px dejte po 100 ul ředícího roztoku v jamkách A1 E6 a H1 H6 je po 100 ul roztoku inkubace 60 min ve 37 o C

14

15 ELISA specifická vazba protilátek na antigen, který je vázán na povrch inertního nosiče

16 ELISA VÝHODY poměrně snadné levné rychlé standardizovatelné vysoká citlivost objektivní vyhodnocení (kvantifikace) NEVÝHODY nutné správné metodické nastavení odlišení nespecifických výsledků (kontroly!!!!!!!!!)

17 ELISA = navázání antigenu (Ag) na dno a stěny destičky pomocí vazebného roztoku s vysokým ph 100 ul inkubace přes noc ve 4 o C

18 ELISA PROMÝT = zbytek povrchu zablokovat neutrální bílkovinou (např. BSA, sérum); zamezí se tak vazbě vzorku nespecificky na povrch destičky 100 ul inkubace 1 hod v 37 C

19 ELISA PROMÝT = vazba protilátek (Ab) ze séra na navázaný antigen; ředící roztoky mají fyziologické ph pozitivní negativní 100 ul inkubace 1 hod v 37 o C

20 ELISA PROMÝT = vazba protilátek (sekundární Ab) konjugovaných s enzymem na primární protilátku ze vzorku (různá specifita, různé enzymy) IgG člověk křenová peroxidáza (Px) IgG1 myš alkalická fosfatáza (AP) IgG2b králík IgG2c pes IgG3 kočka IgG4 ovce IgE osel IgM kráva IgA koza křeček potkan opice

21 ELISA PROMÝT = vazba protilátek (sekundární Ab) konjugovaných s enzymem na primární protilátku ze vzorku (různá specifita, různé enzymy) pozitivní negativní 100 ul inkubace 1 hod v 37 o C

22 ELISA PROMÝT = vazba protilátek (sekundární Ab) konjugovaných s enzymem na primární protilátku ze vzorku (různá specifita, různé enzymy) pozitivní negativní 100 ul inkubace 1 hod v 37 o C

23 ELISA PROMÝT = substrátový roztok o nízkém ph reaguje s enzymem na sekundární protilátce za vzniku rozpustného barevného produktu alkalická fosfatáza PNPP (p-nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) ~10 ng/well křenová peroxidáza OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) ~7 pg/well TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) ~6 pg/well ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt) ~250 pg/well

24 ELISA PROMÝT = substrátový roztok o nízkém ph reaguje s enzymem na sekundární protilátce za vzniku rozpustného barevného produktu pozitivní negativní 100 ul inkubace ve tmě v pokojové teplotě až do objevení reakce

25 ELISA PROMÝT = substrátový roztok o nízkém ph reaguje s enzymem na sekundární protilátce za vzniku rozpustného barevného produktu pozitivní negativní 100 ul inkubace ve tmě v pokojové teplotě až do objevení reakce

26 ELISA ZASTAVENÍ = slabá kyselina (např. 10% H 2 SO 4 ) pozitivní negativní 100 ul měří se optická densita / absorbance při dané vlnové délce (dle substrátu)

27 ELISA ZASTAVENÍ = slabá kyselina (např. 10% H 2 SO 4 ) měří se optická densita / absorbance při dané vlnové délce PNPP = ~10 ng/well OPD = ~7 pg/well TMB = ~6 pg/well ABTS = ~250 pg/well = žlutá = 405 nm = oranžová = 492 nm = žlutá = 450 nm = zelená = 410/650 nm množství protilátek OD / absorbance titry = max ředění séra, kdy je výsledek ještě poz. AU (arbitrary units) = počet jednotek protilátky 100 AU = OD referenčního séra cut-off hranice, od které je výsledek brán jako pozitivní např: průměr neg. + 3 SD ± 20% = šedá zóna hraničních vzorků

28 ELISA DŮLEŽITÉ typ destičky složení roztoků ph roztoků délka a teplota inkubace ředění antigenu, vzorku, konjugátu délka vyvolávání dodržovat STÁLE STEJNÉ podmínky vzorky testovat v dubletech / tripletech metodické kontroly

29 ELISA DŮLEŽITÉ sensitivita, specifita, reprodukovatelnost sensitivita specifita % pozitivních výsledků mezi pacienty % negativních výsledků mezi zdravými jedinci Kvalitní test by měl mít vysokou sensitivitu a současně i vysokou specifitu. Žádný test nemá sensitivitu a specifitu 100%.

30 ELISA metodické kontroly + Ag 0Ab +Px neváže se konjugát přímo na antigen?

31 ELISA metodické kontroly neváže se konjugát přímo na antigen? neobsahuje antigen Px / AP aktivitu? + Ag 0Ab 0Px

32 ELISA metodické kontroly neváže se konjugát přímo na antigen? neobsahuje antigen Px / AP aktivitu? neváže se konjugát na neutrální bílkovinu? 0Ag 0Ab +Px

33 ELISA metodické kontroly neváže se konjugát přímo na antigen? neobsahuje antigen Px / AP aktivitu? neváže se konjugát na neutrální bílkovinu? jaké je pozadí reakce? 0Ag 0Ab 0Px = BLANK +Ag 0Ab 0Px = BLANK

34 ELISA metodické kontroly neváže se konjugát přímo na antigen? neobsahuje antigen Px / AP aktivitu? neváže se konjugát na neutrální bílkovinu? jaké je pozadí reakce? kontroly pozitivní, negativní, hraniční pozitivní negativní kalibrační křivka

35 zvýšení citlivosti ELISA vazba Ab+biotin avidin/streptavidin+px/ap nejsilnější známá vazba biotin = vitamin H 1 Ab = mnoho biotinu avidin = s vysokou specifitou a afinitou váže 2 biotinové zbytky streptavidin = 4 vazebná místa pro biotin

36 Specifita konjugátu ELISA Protein A IgG IgG1 IgG2b IgG2c IgG3 IgG4 IgE IgM IgA člověk myš králík pes kočka ovce osel kráva koza křeček potkan opice Protein G Protein A/G Protein L protein A obsahuje Ig-vázající domény váže především savčí IgG protilátky s vysokou afinitou lidské IgG1 a IgG2 myší IgG2a a IgG2b váže i lidské IgM, IgA, IgE a myší IgG3 a IgG1 NEváže lidské IgG3 a IgD a myší IgM, IgA a IgE

37 modifikace ELISA přímá ELISA nepřímá ELISA sendvičová ELISA antigen protilátka antigen

38 sendvičová ELISA -těhotenský test

39 modifikace ELISA protilátku lze konjugovat s enzymy (HRP, AP) fluorochromy (FITC, PE, ) koloidní částice (zlato, latex) biotin luminol Imunofluorescence Imunoblot (dot, western) FACS Imunohistochemie Chemiluminiscence aj.

40

41 ELISA = vazba protilátek (sekundární Ab) konjugovaných s enzymem na primární protilátku ze vzorku 4 4 promýt promývacím roztokem konjugát NEŘEDIT, je v pracovní koncentraci po 100 ul konjugátu do každé jamky vyjímka!!! jamky H5 a H6 = metodické kontroly místo konjugátu dát ředící roztok na vzorky v jamkách je po 100 ul roztoku inkubace 30

42

43 Toxoplasma gondii - epidemiologie zoonóza DH: kočkovitá šelma MH: teplokrevní obratlovci včetně člověka (rezistentní - koně a krávy) 1/3 lidstva infikována (kosmopolitní) infekce: špinavé ruce, voda nedostatečně tepelně upravené maso (ovce, prase, koza, králík) kongenitálně transplantace reaktivace při imunosupresi (AIDS)

44 Toxoplasma gondii - životní cyklus

45 Toxoplazmóza v ČR

46 Toxoplazmóza v ČR

47 Toxoplasmóza u těhotných žen akutní fáze infekce u těhotné ženy toxoplasma v buňkách placenty schopná penetrovat do plodu přenos cca ve 30% případů 6% (13. týden) 72% (36. týden) infekce plodu v 1. trimestru = vyšší poškození Infekce plodu v 3. trimestru = pravděpodobnější, ale s malými následky

48 ELISA: anti-t. gondii protilátky Hlavní antigen 30 kda SAG-1 (povrchový glykoprotein) Sensitivní a specifická metoda IgM = akutní infekce 2 týdny až 9-12 měsíců IgA = akutní infekce přetrvávají 6-9 měsíců IgE = akutní infekce max 6 měsíců IgG = chronická fáze 2 měsíce po infekci, přetrvávají dlouho

49 ELISA: anti-t. gondii protilátky Hlavní antigen 30 kda SAG-1 (povrchový glykoprotein) Sensitivní a specifická metoda IgM = akutní infekce 2 týdny až 9-12 měsíců IgA = akutní infekce přetrvávají 6-9 měsíců IgE = akutní infekce max 6 měsíců IgG = chronická fáze 2 měsíce po infekci, přetrvávají dlouho

50 IMUNOBLOT: anti-t. gondii protilátky recomline Toxoplasma IgM nitrocelulózová membrána s naviazanými rekombinantnými proteínmi T. gondii IgM - akutní infekce 2 týdny až 9-12 měsíců

51 IMUNOBLOT: anti-t. gondii protilátky

52

53 ELISA = substrátový roztok o nízkém ph reaguje s enzymem na sekundární protilátce za vzniku rozpustného barevného produktu 5 promýt promývacím roztokem substrát NEŘEDIT, je v pracovní koncentraci po 100 ul substrátu do každé jamky v jamkách je po 100 ul roztoku Inkubace 15 min ve tmě v pokojové teplotě

54 ELISA NEPROMÝVAT, ZASTAVIT přidat 100 ul zastavovacího roztoku v jamkách je po 200 ul roztoku ELISA READER = 450 nm

55

56

57