Stanovení koncentrace celkového IgE v séru

Transkript

1 Stanovení koncentrace celkového IgE v séru Návod na použití ELISA testu Objednací číslo Určení Třída Ig Substrát Formát EV E Lidské IgE IgE Ab-potažené mikrotitrační jamky 96 x 01 (96) Princip testu: ELISA kit umožňuje kvantitativní provedení in-vitro testu pro určení lidské protilátky třídy IgE. Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy polyklonální protilátkou proti lidskému IgE. V prvním reakčním kroku dochází v jamce k navázání IgE, které je obsaženo v ředěných vzorcích odebraných pacientům, na povrch jamky s navázanou protilátkou. K detekci navázaného IgE slouží druhá inkubace provedená s enzymem značenou protilátkou proti lidskému IgE ( enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Určení koncentrace IgE v séru se odečítá z kalibrační křivky sestrojené pomocí sér 1 až 4. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené anti IgE: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky, každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití) - Kalibrační séra 1 až 4, značené červeně s klesající koncentrací - Kalibrační sérum 1, 500 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1.3 ml, připravené k použití - Kalibrační sérum 2, 100 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1.3 ml, připravené k použití - Kalibrační sérum 3, 10 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1.3 ml, připravené k použití - Kalibrační sérum 4, 0 IU/ml (lidské IgG): 1 x 1.3 ml, připravené k použití - Pozitivní kontrolní sérum 1 (vysoká koncentrace IgE): 1 x 1.3 ml, připravené k použití. Značeno tmavě modře. - Pozitivní kontrolní sérum 2 (nízká koncentrace IgE): 1x 1.3 ml, připravené k použití. Značeno světle modře. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené myší protilátky proti lidskému IgE: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno fialově. - Vzorkový pufr: 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno světle modře. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný) - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití (1 N - kyselina fosforečná).. - Návod k provedení testů - Protokol s hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostická souprava musí být skladována při teplotě mezi +2 o C až +8 o C, nesmí být zmražena. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HbsAG, anti-hcv, anti- HIV a anti-hiv2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, 1

2 roztok chromogen-substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava a stabilita reagencií: Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a otevřete lepící ochranný obal (neodstřihávat). Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, tím zabráníte zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až +8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrace a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat! Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml přídavkem 45 ml vody pro 8 mikrotitračních desek. Pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 o C až +8 o C. Poznámka: Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 o C a před ředěním promíchejte. Chromogen-substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok. Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 10 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 100 µl séra k 900 µl vzorkového pufru a dobře promíchejte. Poznámka: Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu. 2

3 Pracovní postup Inkubace vzorku: (1. krok) Podle pipetovacího protokolu přeneste 100µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně promyjte každou jamku třikrát 300 µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamku vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky dnem vzhůru na filtrační papír. Inkubace konjugátu: (2. krok) Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgE) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je stejné jako předchozí. Inkubace substrátu: (3. krok) Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí, jako byl pipetován chromogen - substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce mezi 620 a 650 nm do 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol A C1 P3 P11 P19 B C2 P4 P12 P20 C C3 P5 P13 P21 D C4 P6 P14 P22 E PC1 P7 P15 P23 F PC2 P8 P16 P24 G P1 P9 P17 H P2 P10 P18 Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem analýzy sér od 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrační séra (C1 až C4), pozitivní kontrolní séra (PC1 a PC2) a všechny vzorky sér od pacientů byly inkubovány každý v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií. 3

4 Výpočet výsledků Kvantifikace: Křivka standardů, ze které se odečítá koncentrace IgE ve vzorcích sér, se sestrojí vynesením bod po bodu hodnot extinkce získaných z měření 4 kalibračních sér proti odpovídajícím jednotkám (lineární/lineární). Následující vynesení je příkladem typické kalibrační křivky. Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací IgE v sérech pacientů. IgE (IU/ml) Jestliže se výsledky hodnotí automatickými metodami, doporučujeme použít interpolaci kubického splinu, což umožňuje nejlepší přizpůsobení aktuální křivky (hodnotící program: Revelation Dynex). Jsou-li použity jiné programy, může kubický spline působit určité potíže.v těchto případech použijte interpolaci Akima. V případě interpolace bod k bodu s lineární extrapolací se musí brát do úvahy, že pro IgE koncentrace větší než 100 IU/ml se může projevit slabý posun v měřených hodnotách. Jestliže hodnoty extinkce vzorku leží nad hodnotami standardní křivky, doporučujeme, aby byl vzorek znovu otestován při ředění 1:20 a 1:100. Výsledek v IU/ml získaný ze standardní křivky pro tento vzorek se potom musí vynásobit 2 nebo 10. Při hodnocení ředění 1:10 se výsledky nenásobí! Charakteristiky testu Kalibrace: Kalibrace kontrolního séra se udává v mezinárodních jednotkách (IU) s použitím mezinárodního referenčního séra NIBSC 75/502 (Národní ústav pro biologické standardy a kontroly, Hertfordshire, Anglie). Toto sérum obsahuje podle definice 5000 IU/ml. Pro každou skupinu prováděných testů, musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a mezinárodní jednotky určené pro pozitivní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité testy. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a proto se musí opakovat. Závislost na teplotě: Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Avšak kalibrační séra jsou vystavena stejnému vlivu, a to s výsledkem, že tyto změny jsou povětšinou 4

5 kompenzovány ve výpočtu výsledků. Tato situace se bere následovně do úvahy při přizpůsobení času inkubace substrátu na pokojovou teplotu: Pokojová teplota 14 o C - 18 o C Pokojová teplota 19 o C - 23 o C Pokojová teplota 24 o C - 30 o C doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min Linearita: Linearita testu byla zkoumána pomocí série ředění sér pacientů s vysokými hladinami IgE. Následující obrázek ukazuje typickou linearitu vzorků zjištěnou na základě 4 sér pacientů. Detekční limit: detekční limit ELISA testu pro určení celkového IgE je 0.5 IU/ml. Reprodukovatelnost: reprodukovatelnost testu byla zkoumána určením koeficientů rozptylu (CV) uvnitř a mezi bloky za užití tří sér s hodnotami v různých bodech kalibrační křivky. Koeficienty rozptylu uvnitř bloku byly stanoveny z 20 měření a koeficienty rozptylu mezi bloky ze 4 měření provedených v šesti různých dnech. Koeficienty rozptylu uvnitř bloku, n=20 sérum Průměrná hodnota (IU/ml) CV (%) Koeficienty rozptylu mezi bloky, n=4 x 6 sérum Průměrná hodnota (IU/ml) CV (%)

6 Spolehlivost metody: K určení spolehlivosti výsledků byly uskutečněny tři testy, ve kterých byly použity vzorky se dvěma séry obsahujícími vysokou a nízkou koncentraci IgE, která byla smíchána v různých poměrech. Byla vypočítána teoretická koncentrace IgE a porovnána s naměřenými hodnotami koncentrace IgE: měření Nízký titr IgE Vysoký titr Vypočítané Naměřené Spolehlivost (ml) IgE (ml) (IU/ml) (IU/ml) Specifita a citlivost: ELISA test v této diagnostické soupravě zahrnuje vysoce specifické protilátky proti lidskému IgE. Nebyly určeny žádné křížové reakce s IgA, IgD, IgG a IgM. Hranice významnosti: Hodnota 100 IU/ml IgE je považována jako horní mez rozsahu hranice významnosti pro neatopické subjekty (Thomas, 1992). Pomocí kitu Euroimmun Total IgE ELISA byla provedena analýza sér z panelu 400 dárců krve. Hodnoty ukazují normální rozložení a odpovídají datům uvedeným v literatuře (Klink a další, 1990). Možnost, že nějaké subjekty v tomto panelu by mohly trpět alergií, nebyla prověřena. Proto je zastoupení vzorků s koncentrací IgE vyšší než 100 IU/ml četnější. IgE se začíná tvořit od 11 týdne těhotenství. Jeho koncentrace kontinuálně narůstá, dosahuje maxima ve věku mezi 6 a 14 lety a potom klesá..hodnoty koncentrace IgE se u jednotlivců výrazně liší, u obou skupin, jak u jedinců s alergiemi, tak bez nich, je ovlivňována mnoha faktory (věk, pohlaví, atopický status, rasa, kouření). Normální hodnoty převzaté z literatury (Thomas,1992), které jsou uvedeny níže, slouží jen jako orientační. Doporučujeme, aby se v každé laboratoři a zemi určily hodnoty normálu koncentrace IgE. Věk novorozenci 1-6 měsíců 7.2 IU/ml 7-12 měsíců 12.7 IU/ml 1-5 let 60 IU/ml 6-9 let 155 IU/ml let 199 IU/ml Více než 16 let 100 IU/ml Horní hranice významnosti 1.2 IU/ml 6

7 Korelace ELISA testu s nefelometrií: S testem EUROIMMUN Total IgE ELISA byla zkoumána séra 43 pacientů (0 200 IU/ml IgE) a výsledky byly porovnány s nefelometrickým stanovením. 7

8 Klinický význam 1. Diagnostika pro alergie a atopie Diagnostika alergií vedle kožních provokačních testů a určení specifických IgE zahrnuje i měření celkové hladiny IgE. Avšak alergická senzitivita nemusí být ve všech případech doprovázena zvýšenými hodnotami celkových IgE (u dospělých více než 100 IU/ml), na druhé straně, snížená hladina IgE (u dospělých méně než 25 IU/ml) není pravidlem určujícím atopická onemocnění. V průběhu dlouhodobé hyposenzibilizační terapie nebo následkem eliminace alergenu se titr většinou snižuje. Určení celkové hladiny IgE je vhodné pro rozlišení mezi alergií a skutečným astmatem, mezi alergií a vasomotorickou rhinitidou a mezi atopickou a seboreagickou dermatitidou u dětí. Extrémně vysoké hladiny IgE (hladiny dosahující několik tisíc IU/ml) jsou nacházeny u lidí trpících atopickou dermatitidou. Mezi další nemoci s alergickým základem (a vysokými hladinami IgE) patří akutně opětně se zhoršující chronická kopřivka, akutně se zhoršující Quinckeho edém, gastrointestinální intolerance a nejasná vyrážková onemocnění. Měření hladin IgE se také provádí v diferenciační diagnostice eosinofilní plicní infiltrace, alergické aspergilózy, exogenní alergické alveolitidy (farmářské plíce, plíce chovatele holubů) a Churg-Straussova syndromu. 2. IgE a další nemoci Mezi nealergická onemocnění, která se také projevují vysoce zvýšenými hladinami IgE, jako onemocnění vyjmenovaná výše, patří mnoho forem helminthiáz, to znamená toxocariáza, ascariáza, schistostomóza, ankylostomiáza, leishmanióza a trichinóza. Avšak zvýšení není obvykle pozorováno v případě teniázy a oxouriázy. Hodnoty se většinou po úspěšném léčení vracejí na normální původní úroveň. Zvýšené titry IgE jsou pozorovány také u následujících nemocí: - Ekzematická a neexzematická dermatitida - IgE myelom - Akutní systémová Lupus erythematosus (SLE) - Obraná reakce hostitele k transplantované tkáni - Defekty T buněk (Wiskott-Aldrichův syndrom) - Popáleniny druhého a třetího stupně - Tumory v oblasti ucha, nosu a hrdla - Nemoci jater, zvláště pak jsou-li spojeny s užíváním nadměrného množství alkoholu - AIDS v pozdním stadiu se zřetelným dopadem na CD-4 pozitivní T-buňky IgE deficienci lze nalézt u : - hypoglobulinemie spojené s X-chromosomem - Těžké kombinované imunodeficience (SCID) - Ataxie teleangiectatica - Sinopulmonárních nemocí - V řídkých případech také u zdravých jedinců 8

9 ELISA k určení koncentrace celkového IgE Hodnoty pro LOT 00726p: Kalibrační séra: hodnota pro kalibrační sérum 1 (500 IU/ml): O.D Toleranční rozsah: O.D. >1.319 hodnota pro kalibrační sérum 2 (100 IU/ml): O.D Toleranční rozsah: O.D. >0.411 hodnota pro kalibrační sérum 3 (10 IU/ml): O.D Toleranční rozsah: O.D. >0.050 hodnota pro kalibrační sérum 4 (0 IU/ml): O.D Toleranční rozsah: O.D. >0.027 Pozitivní kontrola 1: kvantitativně: vysoká koncentrace hodnota: 309 IU/ml toleranční rozsah: IU/ml Pozitivní kontrola 2: kvantitativně: vysoká koncentrace hodnota: 50 IU/ml toleranční rozsah: IU/ml 9