IMUNOENZYMATICKÉ SOUPRAVY K DIAGNOSTICE SYSTÉMOVÝCH AUTOIMUNITNÍCH ONEMOCNĚNÍ

Transkript

1 IMUNOLOGIE Autoimunita IMUNOENZYMATICKÉ SOUPRAVY K DIAGNOSTICE SYSTÉMOVÝCH AUTOIMUNITNÍCH ONEMOCNĚNÍ Antinukleární protilátky (ANA) Protilátky proti extrahovatelným nukleárním antigenům (ENA) a soupravy jsou určeny ke stanovení specifických protilátek třídy IgG v lidském séru nebo plazmě

2 Úvod Stanovení antinukleárních protilátek má význam pro diagnostiku systémových autoimunitních onemocnění. Jde o skupinu autoprotilátek namířených proti orgánově nespecifickým buněčným antigenům, které jsou lokalizovány v buněčném jádře, případně cytoplazmě. Jejich průkaz může znamenat přítomnost systémového imunopatologického procesu. Zejména se jedná o tato onemocnění: Systémový lupus erythematodes (SLE), Sjögrenův syndrom (SS), sklerodermii, dále pak smíšené onemocnění pojiva (MCTD), systémovou sklerózu, polymyozitidu a dermatomyozitidu. Významnou samostatnou skupinu antinukleárních protilátek představují protilátky proti extrahovatelným nukleárním antigenům ENA (SS-A/Ro, SS-B/La, Sm, RNP, Scl-70 a Jo-1), jde především o ribonukleoproteiny a jaderné enzymy. Typizace specifických autoprotilátek je důležitým nástrojem v diferenciální diagnostice jednotlivých systémových autoimunitních onemocnění. Protilátky proti SS-A/Ro a SS-B/La se často vyskytují u pacientů se SS a SLE. Vysoce specifickým markerem a jedním z diagnostických kritérií pro SLE jsou protilátky proti Sm antigenu. U pacientů se SLE jsou často přítomny i protilátky proti RNP antigenu (součást komplexu Sm/RNP). Průkaz těchto protilátek je vysoce specifickým diagnostickým kritériem pro MCTD (zejména při absenci protilátek anti-sm). Další skupinu orgánově nespecifických autoimunitních onemocnění tvoří myozitidy. V jejich diagnostice se uplatňuje průkaz protilátek proti antigenu Jo-1. Protilátky proti antigenu Scl-70 a centromeře B jsou významné pro diagnostiku systémové sklerózy (zvláště jejích progresivních forem). Antinukleární protilátky zahrnují rovněž protilátky proti nukleovým kyselinám (ssdna, dsdna), komplexům nukleárních proteinů (DNP, RNP) a histonům. Použití souprav EIA ENA screen plus Screeningový test k průkazu protilátek proti ENA u systémových onemocnění pojiva EIA ENA (jednotlivé antigeny) Testy k průkazu protilátek proti jednotlivým antigenům ENA Diferenciální diagnostika systémových autoimunitních onemocnění BLOT-LINE ENA plus BLOT-LINE ANA Konfirmační test soupravy EIA ENA screen plus Diferenciální diagnostika systémových autoimunitních onemocnění typizace protilátek proti ENA Konfirmační test vyšetření Diferenciální diagnostika systémových autoimunitních onemocnění typizace protilátek proti nukleárním antigenům

3 Princip testu Souprava je založena na sendvičovém typu metody. Antigeny jsou přeneseny na nitrocelulózovou membránu pomocí mikrodispenzních metod. Sandwich HRP E P Po přidání substrátu vzniká reakcí s enzymem nerozpustný barevný produkt Anti-Hu IgG Enzymem konjugovaná sekundární protilátka se váže na primární protilátku IgG Specifická primární protilátka se váže na protein Specifický protein antigenu Ag Blokátor Mikrotitrační destička Strip Uživatelský komfort Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené reagencie Zaměnitelnost komponent Barevně značené stripy s odlamovacími jamkami CUT-OFF kontrola Semikvantitativní hodnocení výsledků (Index pozitivity-ip) Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené stripy Zaměnitelnost komponent Negativní a Pozitivní kontrola Kontrolní linie na stripu Možnost softwarového vyhodnocení

4 Antigeny EIA ENA screen plus směs nativních a rekombinantních antigenů: Ro52/SS-A, Ro60/SS-A, La/SS-B, RNP-A, RNP-C, RNP 68, SmB, SmD, Scl 70, Jo-1 a centromera B EIA SS-A EIA SS-A/Ro60 EIA SS-A/Ro52 EIA SS-B EIA Sm vysoce purifikovaný nativní antigen SS-A/Ro60 (60 kda) a rekombinantní antigen SS-A/Ro52 (52 kda) vysoce purifikovaný nativní antigen SS-A/Ro60 (60 kda) rekombinantní antigen SS-A/Ro52 (52 kda) směs nativního a rekombinantního antigenu SS-B/La směs rekombinantního antigenu SmB a nativního antigenu SmD EIA U1RNP směs rekombinantních antigenů RNP A, RNP C a RNP 68 EIA Scl-70 EIA Centromere EIA Jo-1 směs nativního a rekombinantního antigenu Scl-70 směs rekombinantních antigenů CENP B a CENP A rekombinantní antigen Jo-1 BLOT-LINE ENA plus rekombinantní nukleární antigeny: Ro52/SS-A, Ro60/SS-A, La/SS-B, RNP-A, RNP-C, RNP 68, SmB, SmD, Scl 70, Jo-1 a centromera B BLOT-LINE ANA rekombinantní nukleární antigeny: Ro52/SS-A, Ro60/SS-A, La/SS-B, RNP-A, RNP-C, RNP 68, SmB, SmD, Scl 70, Jo-1, centromera B, centromera A, PmScl, PL-7, PL-12, ribozomální protein P0, PCNA a histony BLOT-LINE ANA BLOT-LINE ENA plus Kontrolní linie Cut off Start Jo-1 PL-7 PL-12 PmScl CENP-A CENP-B Scl-70 Ro-52 Ro-60 La RNP-A RNP-C RNP-68 SmB SmD P0 PCNA Histones Polymyozitida, Dermatomyozitida Systémová sklerodermie SS, SLE, Neonatální LE, AV blok SLE, MCTD SLE Kontrolní linie Cut off Start Jo-1 CENP-A Scl-70 Ro-52 Ro-60 La RNP-A RNP-C RNP-68 SmB SmD

5 Jo-1 Antigen Histidyl-t RNA syntetáza Onemocnění polymyozitida dermatomyozitida indikuje zvýšené riziko plicní fibrózy PL-7 Threonyl-tRNA syntetáza polymyozitida dermatomyozitida antisyntetázový syndrom (myozitida, intersticiální plicní fibróza, artritida) PL-12 Alanyl-tRNA syntetáza Raynaudův syndrom PmScl 11 jaderných polypeptidů polymyozitida dermatomyozitida systémová skleróza CENP B CENP A Centromera B protein Centromera A protein Raynaudovův syndrom, CREST syndrom systémová skleróza, kožní forma (limitovaná forma bez výskytu antigenu Scl70) Scl-70 DNA Topoisomeráza I systémová skleróza (specifický marker) překryvný syndrom polymyozitida - sklerodermie (vysoce specifický marker) Ro52 Ro60 Ro (SS-A) (ribonukleoproteinový komplex) Sjögrenův syndrom (primární, sekundární) SLE (izolovaný výskyt Ro60) neonatální LE syndrom (+ přítomnost Ro52 a La antigenu) La La (SS-B) (ribonukleoproteinový komplex) primární Sjögrenův syndrom SLE RNP-A RNP-C RNP-68 Antigeny U1-snRNP MCTD (zejm. izolovaný výskyt) SLE Sjögrenův syndrom systémová skleróza (v kombinaci s jinými protilátkami) SmB SmD Sm antigeny (ribonukleoproteinový komplex) SLE (vysoce specifický marker, až 99 %) P0 cytoplazmatický ribozomální fosfoprotein SLE PCNA přidružený protein DNA-polymerázy SLE histony histony 1 až 4, dimer H2A-H2B SLE, léky indukovaný LE systémová skleróza revmatoidní artritida

6 Pracovní postup Krok č. Kroky testu Krok č. Kroky testu 1 Ředění vzorků séra/plasmy (1+100) 1 Dávkování Univerzálního roztoku 2 ml 2 Dávkování kontrol a ředěných vzorků 100 µl blank = 100 µl ředicího roztoku vzorků 2 Smáčení stripů 10 min. při lab. teplotě 3 Inkubace 30 min. při 37 C 3 Odsátí 4 Odsátí a promytí jamek 5 krát 4 Ředění vzorků séra/plazmy (30 µl+1,5 ml) 5 Dávkování Konjugátu 100 μl včetně blanku 5 Dávkování kontrol a ředěných vzorků 1,5 ml 6 Inkubace 30 min. při 37 C 7 Odsátí a promytí jamek 5 krát 6 7 Inkubace 30 min. při lab. teplotě Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min. 8 Dávkování substrátu (TMB-Complete) 100 μl včetně blanku 8 Dávkování Konjugátu 1,5 ml 9 Inkubace 15 min. při 37 C 9 Inkubace 30 min. při lab. teplotě 10 Dávkování Zastavovacího roztoku 100 μl včetně blanku 10 Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min. 11 Fotometrické měření při 450 nm Výhody souprav Vysoká diagnostická účinnost Dobrá reprodukovatelnost Vysoká dynamika testů Celková doba vyšetření 1,5 hodiny Vhodné pro otevřené automatické systémy Komplexní zákaznický servis Identický pracovní postup Jednoduchá interpretace a reprodukovatelnost výsledků Vysoká diagnostická účinnost Vhodné pro automatické systémy Komplexní zákaznický servis 11 Dávkování substrátu (BCIP/NBT) 1,5 ml Inkubace 15 min. při lab. teplotě Odsátí a promytí v destilované vodě 2 krát 2 ml po 5 min. 14 Nalepení a vyhodnocení stripů Charakteristiky souprav Souprava Diagnostická citlivost Diagnostická specifita EIA ENA screen plus 96,1 % 97,9 % EIA SS-A 95,8 % 97,5% EIA SS-A/Ro60 95,8 % 97,5 % EIA SS-A/Ro52 95,8 % 97,5 % EIA-SSB 97,9 % 97,9 % EIA Sm 97,4 % 98,2 % EIA U1RNP 97,7 % 98,2 % EIA Scl-70 97,9 % 97,9 % EIA Centromere 96,4 % 97,9 % EIA Jo-1 95,5 % 97,9 % BLOT-LINE ENA plus 96,6 % 97,5 % BLOT-LINE ANA 96,6 % 97,4 %

7 Klinická data EIA ENA screen plus Dárci krve (n=227) kontrolní skupina Negativní 3 1 % Pozitivní % Pacienti se systémovým autoimunitním onemocněním (n=143) Diagnóza Testováno (n) Pozitivní (n) % pozitivit SLE % Sjögrenův syndrom % Sklerodermie % Dermatomyozitida % Raynaudův syndrom % Nespecifikované systémové autoimunitní onemocnění Shoda výsledků souprav EIA ENA screen plus a BLOT-LINE ENA plus porovnání výsledků skupiny pozitivních vzorků a vzorků dárců krve % Pozitivní vzorky (n = 380) poz neg % pozitivit Dárci krve (n = 227) poz neg % pozitivit EIA poz % neg % EIA poz % neg % % pozitivit 80 % 20 % Korelace 90 % % pozitivit 4 % 96 % Korelace 96 % Detekce protilátek proti jednotlivým antigenům ve skupině pacientů s SLE výsledky soupravy BLOT-LINE ANA (n=65) 60% 50% 40% 54 % 33 % 29 % SLE 30% 24 % 21 % 20% 14 % 10% 3 % 6 % 9 % 1 % 11% % 0% CENP B Scl70 Ro52 Ro60 La RNP A RNP C RNP 68 SmD P0 dsdna

8 IMUNOLOGIE Objednací údaje Kód Název soupravy Počet testů ENA096 EIA ENA screen plus 96 SSA096 EIA SS-A 96 Ro6096 EIA SS-A/Ro60 96 Kód Název soupravy Počet testů ENAL20 BLOT-LINE ENA plus 20 ANAL20 BLOT-LINE ANA 20 SwIm03 Immunoblot Software 1 ks Ro5296 EIA SS-A/Ro52 96 SSB096 EIA SS-B 96 Sm0096 EIA Sm 96 RNP096 EIA U1RNP 96 Scl096 EIA Scl CEN096 EIA Centromere 96 Jo1096 EIA Jo-1 96 Kontakt TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. Křižíkova Brno, Česká republika Tel.: (237, 238) Fax: trade@testlinecd.com TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. je držitelem certifikátů ISO 9001:2008 a ISO 13485:2003.