Antinukleární protilátky (ANA) Protilátky proti extrahovatelným nukleárním antigenům (ENA)

Transkript

1 Antinukleární protilátky (ANA) Protilátky proti extrahovatelným nukleárním antigenům (ENA) Imunoenzymatické soupravy k diagnostice systémových autoimunitních onemocnění ELISA a IMUNOBLOT soupravy jsou určeny ke stanovení specifických protilátek třídy IgG v lidském séru nebo plazmě

2 ÚVOD Stanovení antinukleárních protilátek má význam pro diagnostiku systémových autoimunitních onemocnění. Jde o skupinu autoprotilátek namířených proti orgánově nespecifickým buněčným antigenům, které jsou lokalizovány v buněčném jádře, případně cytoplazmě. Jejich průkaz může znamenat přítomnost systémového imunopatologického procesu. Zejména se jedná o tato onemocnění: Systémový lupus erythematodes (), Sjögrenův syndrom (SS), sklerodermii, dále pak smíšené onemocnění pojiva (MCTD), systémovou sklerózu, polymyozitidu a dermatomyozitidu. Významnou samostatnou skupinu antinukleárních protilátek představují protilátky proti extrahovatelným nukleárním antigenům ENA (SS-A/Ro, SS-B/La, Sm, RNP, a Jo-1), jde především o ribonukleoproteiny a jaderné enzymy. Typizace specifických autoprotilátek je důležitým nástrojem v diferenciální diagnostice jednotlivých systémových autoimunitních onemocnění. Protilátky proti SS-A/Ro a SS-B/La se často vyskytují u pacientů se SS a. Vysoce specifickým markerem a jedním z diagnostických kritérií pro jsou protilátky proti Sm antigenu. U pacientů se jsou často přítomny i protilátky proti RNP antigenu (součást komplexu Sm/RNP). Průkaz těchto protilátek je vysoce specifickým diagnostickým kritériem pro MCTD (zejména při absenci protilátek anti-sm). Další skupinu orgánově nespecifických autoimunitních onemocnění tvoří myozitidy. V jejich diagnostice se uplatňuje průkaz protilátek proti antigenu Jo-1. Protilátky proti antigenu a centromeře B jsou významné pro diagnostiku systémové sklerózy (zvláště jejích progresivních forem). Antinukleární protilátky zahrnují rovněž protilátky proti nukleovým kyselinám (ssdna, dsdna), komplexům nukleárních proteinů (DNP, RNP) a histonům.

3 ELISA PRINCIP TESTU Souprava je založena na sendvičovém typu ELISA metody. Sandwich ELISA HRP Anti-Hu IgG IgG Ag Mikrotitrační destička PRACOVNÍ POSTUP ANTIGENY EIA ENA screen plus směs nativních a rekombinantních antigenů: Ro52/SS-A, Ro60/SS-A, La/SS-B, RNP-A, RNP-C, RNP 68, SmB, SmD, Scl 70, Jo-1 a centromera B EIA SS-A vysoce purifikovaný nativní antigen SS-A/Ro60 (60 kda) a rekombinantní antigen SS-A/Ro52 (52 kda) EIA SS-A/Ro60 vysoce purifikovaný nativní antigen SS-A/Ro60 (60 kda) EIA SS-A/Ro52 rekombinantní antigen SS-A/Ro52 (52 kda) EIA SS-B směs nativního a rekombinantního antigenu SS-B/La EIA Sm směs rekombinantního antigenu SmB a nativního antigenu SmD EIA U1RNP směs rekombinantních antigenů RNP A, RNP C a RNP 68 EIA směs nativního a rekombinantního antigenu EIA Centromere směs rekombinantních antigenů CENP B a CENP A EIA Jo-1 rekombinantní antigen Jo-1 Krok 1 2 Kroky testu Ředění vzorků séra/plazmy (1+100) Dávkování kontrol a ředěných vzorků 100 μl blank = prázdná jamka 3 Inkubace 30 min. při 37 C 4 Odsátí a promytí jamek 5 krát 5 Dávkování Konjugátu 100 μl blank = prázdná jamka 6 Inkubace 30 min. při 37 C 7 Odsátí a promytí jamek 5 krát 8 Dávkování substrátu (TMB-Complete) 100 μl včetně blanku 9 Inkubace 15 min. při 37 C 10 Dávkování Zastavovacího roztoku 100 μl včetně blanku 11 Fotometrické měření při 450 nm VÝHODY SOUPRAV Vysoká diagnostická účinnost Dobrá reprodukovatelnost Vysoká dynamika testů Celková doba vyšetření 1,5 hodiny Vhodné pro otevřené automatické systémy Komplexní zákaznický servis POUŽITÍ SOUPRAV Screeningový test k průkazu protilátek proti ENA u systémových onemocnění pojiva Testy k průkazu protilátek proti jednotlivým antigenům ENA Diferenciální diagnostika systémových autoimunitních onemocnění UŽIVATELSKÝ KOMFORT Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené a zaměnitelné reagencie Barevně značené stripy s odlamovacími jamkami CUT-OFF kontrola, semikvantitativní hodnocení výsledků (Index pozitivity-ip) CHARAKTERISTIKY SOUPRAV ELISA Diagnostická citlivost Diagnostická specifita EIA ENA screen plus 96,1 % 97,9 % EIA SS-A 95,8 % 97,5 % EIA SS-A/Ro60 95,8 % 97,5 % EIA SS-A/Ro52 95,8 % 97,5 % EIA SS-B 97,9 % 97,9 % EIA Sm 97,4 % 98,2 % EIA U1RNP 97,7 % 98,2 % EIA 97,9 % 97,9 % EIA Centromere 96,4 % 97,9 % EIA Jo-1 95,5 % 97,9 %

4 IMUNOBLOT PRINCIP TESTU POUŽITÍ SOUPRAV Antigeny jsou přeneseny na nitrocelulózovou membránu pomocí mikrodispenzních metod. E P Po přidání substrátu vzniká reakcí s enzymem nerozpustný barevný produkt Enzymem konjugovaná sekundární protilátka se váže na primární protilátku Specifická primární protilátka se váže na protein BLOT-LINE ENA plus Konfirmační test soupravy EIA ENA screen plus Diferenciální diagnostika systémových autoimunitních onemocnění typizace protilátek proti ENA BLOT-LINE ANA Konfirmační test ELISA vyšetření Diferenciální diagnostika systémových autoimunitních onemocnění typizace protilátek proti nukleárním antigenům Ag PRACOVNÍ POSTUP Specifický protein antigenu Blokátor Membrána UŽIVATELSKÝ KOMFORT Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené stripy Zaměnitelnost komponent Negativní a Pozitivní kontrola Kontrolní linie na stripu Možnost softwarového vyhodnocení Krok Kroky testu 1 Dávkování Univerzálního roztoku 2 ml CHARAKTERISTIKY SOUPRAV 2 Smáčení stripů 10 min. při lab. teplotě Imunoblot Diagnostická citlivost Diagnostická specifita 3 Odsátí BLOT-LINE ENA plus 96,6 % 97,5 % 4 Ředění vzorků séra/plazmy 1:51 (30 μl + 1,5 ml) BLOT-LINE ANA 96,6 % 97,4 % 5 Dávkování kontrol a ředěných vzorků 1,5 ml 6 7 Inkubace 30 min. při laboratorní teplotě Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min. 8 Dávkování Konjugátu 1,5 ml 9 10 Inkubace 30 min. při laboratorní teplotě Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min. VÝHODY SOUPRAV Identický pracovní postup Jednoduchá interpretace a reprodukovatelnost výsledků Vysoká diagnostická účinnost Vhodné pro automatické systémy Komplexní zákaznický servis 11 Dávkování substrátového roztoku (BCIP/NBT) 1,5 ml Inkubace 15 min. při laboratorní teplotě Odsátí a promytí v destilované vodě 2 krát 2 ml po 5 min. 14 Nalepení a vyhodnocení stripů

5 ANTIGENY BLOT-LINE ANA rekombinantní nukleární antigeny: Ro52/SS-A, Ro60/SS-A, La/SS-B, RNP-A, RNP-C, RNP 68, SmB, SmD, Scl 70, Jo-1, centromera B, centromera A, PmScl, PL-7, PL-12, ribozomální protein P0, PCNA, dsdna a histony BLOT-LINE ENA plus rekombinantní nukleární antigeny: Ro52/SS-A, Ro60/SS-A, La/SS-B, RNP-A, RNP-C, RNP 68, SmB, SmD, Scl 70, Jo-1 a centromera B BLOT-LINE ANA BLOT-LINE ENA PLUS Control line IgG Start Jo-1 PL-7 PL-12 PmScl CENP-A CENP-B Ro52 Ro60 La RNP-A RNP-C RNP-68 SmB SmD P0 PCNA dsdna Histone Polymyozitida Dermatomyozitida Systémová sklerodermie SS,, Neonatální LE, AV blok, MCTD Control line IgG Start Jo-1 CENP-B Ro52 Ro60 La RNP-A RNP-C RNP-68 SmB SmD

6 VÝSKYT AUTOPROTILÁTEK U JEDNOTLIVÝCH NEMOCÍ Jo-1 PL-7 PL-12 PmScl Antigen Histidyl-t RNA syntetáza Threonyl-tRNA syntetáza Alanyl-tRNA syntetáza 11 jaderných polypeptidů Onemocnění polymyozitida dermatomyozitida indikuje zvýšené riziko plicní fibrózy polymyozitida, dermatomyozitida antisyntetázový syndrom (myozitida, intersticiální plicní fibróza, artritida) Raynaudův syndrom polymyozitida dermatomyozitida systémová skleróza CENP B Centromera B protein Raynaudovův syndrom, CREST syndrom systémová skleróza, kožní forma CENP A Centromera A protein (limitovaná forma bez výskytu antigenu Scl70) Ro52 Ro60 La RNP A RNP C RNP 68 SmB SmD DNA Topoisomeráza I Ro (SS-A) (ribonukleoproteinový komplex) La (SS-B) (ribonukleoproteinový komplex) Antigeny U1-snRNP Sm antigeny (ribonukleoproteinový komplex) systémová skleróza (specifický marker) překryvný syndrom polymyozitida - sklerodermie (vysoce specifický marker) Sjögrenův syndrom (primární, sekundární) (izolovaný výskyt Ro60) neonatální LE syndrom (+ přítomnost Ro52 a La antigenu) primární Sjögrenův syndrom MCTD (zejm. izolovaný výskyt) Sjögrenův syndrom systémová skleróza (v kombinaci s jinými protilátkami) (vysoce specifický marker, až 99 %) P0 cytoplazmatický ribozomální fosfoprotein PCNA přidružený protein DNA-polymerázy dsdna dvouvláknová DNA (40-95 %) Histony histony 1 až 4, dimer H2A-H2B, léky indukovaný LE systémová skleróza revmatoidní artritida

7 KLINICKÁ DATA KLINICKÁ KORELACE EIA ENA SCREEN PLUS Dárci krve (n=227) kontrolní skupina Negativní 3 1 % Pozitivní % Pacienti se systémovým autoimunitním onemocněním (n=143) Diagnóza Testováno (n) Pozitivní (n) % pozitivit % Sjögrenův syndrom % Sklerodermie % Dermatomyozitida % Raynaudův syndrom % Nespecifikované systémové autoimunitní onemocnění % SHODA VÝDKŮ SOUPRAV EIA ENA SCREEN PLUS A BLOT-LINE ENA PLUS POROVNÁNÍ VÝDKŮ SKUPINY POZITIVNÍCH VZORKŮ A VZORKŮ DÁRCŮ KRVE Pozitivní vzorky (n = 380) poz Imunoblot neg % pozitivit Dárci krve (n = 227) poz Imunoblot neg % pozitivit EIA poz % neg % EIA poz % neg % % pozitivit 80 % 20 % korelace 90 % % pozitivit 4 % 96 % korelace 96 % DETEKCE PROTILÁTEK PROTI JEDNOTLIVÝM ANTIGENŮM VE SKUPINĚ PACIENTŮ S BLOT-LINE ANA 60 % 54 % 50 % 40 % 33 % 29 % 30 % 24 % 21 % 20 % 14 % 10 % 3 % 6 % 9 % 1 % 1 % 0% CENP B Ro52 Ro60 La RNP A RNP C RNP 68 SmD P0 dsdna

8 OBJEDNACÍ ÚDAJE ELISA IMUNOBLOT Kód Název soupravy Počet testů Kód Název soupravy Počet testů ENA096 EIA ENA screen plus 96 SSA096 EIA SS-A 96 ENAL20 BLOT-LINE ENA plus 20 ANAL20 BLOT-LINE ANA 20 Ro6096 EIA SS-A/Ro60 96 Ro5296 EIA SS-A/Ro52 96 SSB096 EIA SS-B 96 Sm0096 EIA Sm 96 RNP096 EIA U1RNP 96 Scl096 EIA 96 CEN096 EIA Centromere 96 Jo1096 EIA Jo-1 96 KONTAKT LLOYD S REGISTER LRQA LLOYD S REGISTER LRQA ISO 9001 ISO TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. Křižíkova 68, Brno, Česká republika Tel.: (209, 238) Fax: trade@testlinecd.com TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. je držitelem certifikátů ISO 9001:2008 a ISO 13485:2003 V06/2018