Bc. Štěpánka Havlíková

Transkript

1 U N I V E R Z I T A K A R L O V A V P R A Z E P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a Studijní program: Klinická a toxikologická analýza Bc. Štěpánka Havlíková Voltametrické stanovení chloramfenikolu a chlorambucilu na amalgámových elektrodách Voltammetric Determination of Chloramphenicol and Chlorambucil on Amalgam Electrodes D i p l o m o v á p r á c e Vedoucí diplomové práce: RNDr. Jan Fischer, Ph.D. Praha 2015

2 Tato diplomová práce vznikla v rámci Univerzitního výzkumného centra UNCE /304018/2012 Supramolekulární chemie. Poděkování za její finanční podporu patří Grantové agentuře České republiky (projekt P206/12/G151). Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, je možné pouze po písemném souhlasu Karlovy univerzity v Praze. V Praze dne

3 Poděkování Ráda bych poděkovala svému školiteli RNDr. Janu Fischerovi, Ph.D. za odborné vedení, všestrannou pomoc a cenné připomínky k mé diplomové práci. Také velice děkuji svým rodičům za umožnění studia na vysoké škole a za podporu během celého studia

4 Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá stanovením chloramfenikolu a chlorambucilu metodami diferenční pulzní voltametrie (DPV), DC voltametrie (DCV), cyklické voltametrie (CV) a adsorpční rozpouštěcí voltametrie (AdSV) na meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě (m-agsae). V první části práce byly pro stanovení chloramfenikolu nalezeny optimální podmínky a za těchto podmínek byly proměřeny kalibrační závislosti a následně určeny meze stanovitelnosti. Sledován byl vliv ph v prostředí Brittonova Robinsonova pufru. Jako optimální prostředí pro stanovení chloramfenikolu na m-agsae metodou DCV bylo zvoleno ph 7 a při stanovení metodou DPV bylo zvoleno ph 8. Při těchto zvolených podmínkách byly proměřeny kalibrační závislosti v rozmezí mol l 1. Při stanovení chloramfenikolu metodou DCV bylo dosaženo meze stanovitelnosti 2, mol l -1. Při stanovení chloramfenikolu metodou DPV bylo dosaženo meze stanovitelnosti 2, mol l 1 v destilované vodě, 2, mol l -1 v říční vodě a 4, mol l -1 v pitné vodě. Dále byly prostudovány elektrochemické vlastnosti chloramfenikolu metodou cyklické voltametrie v prostředí BR pufru o ph 2, 6, 8, 12 a objasněn mechanismus redukce chloramfenikolu na m-agsae na základě dostupné literatury. Chloramfenikol byl stanoven v léčivu Spersadex na m-agsae metodou DPV v prostředí BR pufru o ph 8. Ve druhé části práce byly zkoumány podmínky pro stanovení chlorambucilu na meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě pomocí CV a DPV. Prostředí chloridu draselného o koncentraci 0,2 mol l 1 a methanolu v poměru 1:1 bylo zvoleno jako optimální. Při tomto zvoleném prostředí byl sledován vliv regeneračních potenciálů na stabilitu signálu chlorambucilu pomocí DPV. Bohužel se nepodařilo nalézt vhodné podmínky pro stanovení chlorambucilu na m-agsae

5 Abstract This diploma thesis is focused on the determination of chloramphenicol by differential pulse voltammetry (DPV), DC voltammetry (DCV), cyclic voltammetry (CV) and adsorptive stripping voltammetry (AdSV) on a meniscus modified silver solid amalgame electrode (m-agsae). For the determination of chloramphenicol the optimum conditions were found and under these conditions concentration dependences were measured and then limits of quantification were determined. The influence of ph of BR buffer was tested. For determination of chloramphenicol by DCV ph 7 was chosen as an optimum background and ph 8 was chosen as an optimmum for DPV determination. Under these conditions linear dependences were obtained in the concentration range of mol l -1. The limit of detection of chloramphenicol by DCV was mol l -1. The limit of detection of chloramphenicol by DPV was mol l 1 in distilled water, mol l 1 in river water and mol l 1 in drinking water. Electrochemical behavior of chloramphenicol was studied by cyclic voltammetry in BR buffer with ph 2, 6, 8, 12 and then mechanism of reduction of chloramphenicol was propose based on available literature. Chloramphenicol was determined in drug Spersadex by DPV in BR buffer with ph 8. The optimal conditions for determining of chlorambucil were studied by CV and DPV. Potassium chloride 0.2 mol l 1 with methanol in ration 1:1 was choosen as optimum for determination of chlorambucil. The influence of regeneration potentials was studied by DPV under this condition. However the optimal conditions for determination of chlorambucil on the m-agsae were not found

6 Předmětová hesla: Analytická chemie Elektrochemie Klíčová slova: DC voltametrie Diferenční pulzní voltametrie Cyklická voltametrie Adsorpční rozpouštěcí voltametrie Rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda Chloramfenikol Chlorambucil Objective word: Analytical Chemistry Electrochemistry Key words: DC voltammetry Differential pulse voltammetry Cyclic voltammetry Adsorptive stripping voltammetry Mercury menisus modified silver solid amalgam electrode Chloramphenicol Chlorambucil - 6 -

7 Seznam použitých zkratek a symbolů specifická absorbance A absorbance AdSV adsorpční rozpouštěcí voltametrie BR pufr Brittonův Robinsonův pufr BDDFE borem dopovaná diamantová filmová elektroda c molární koncentrace [mol.l -1 ] CAP chloramfenikol CV cyklická voltametrie DCV DC voltametrie DPV diferenční pulzní voltametrie E 1/2 E acc E p EPGCE HMDE HPLC CHL I p I v půlvlnový potenciál [mv] potenciál akumulace [mv] potenciál píku [mv] elektroda ze skelného uhlíku s elektrochemickou předúpravou povrchu visící rtuťová kapková elektroda vysokoúčinná kapalinová chromatografie chlorambucil proud píku [na] proud vlny [na] LOQ mez stanovitelnosti [mol.l -1 ] m-agsae rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda p a ph p k SMDE SWV RSD t acc anodický pík záporný dekadický logaritmus aktivity oxoniových inotů katodický pík statická rtuťová kapková elektroda square wave voltametrie relativní směrodatná odchylka doba akumulace [s] - 7 -

8 Obsah 1 Úvod Cíl práce Studované látky Chloramfenikol Užití a biologické účinky Metody stanovení Chlorambucil Užití a biologické účinky Metody stanovení Rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda Aplikace rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrody Experimentální část Reagencie Aparatura Pracovní postupy Voltametrické stanovení chlorambucilu na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě Cyklická voltametrie Diferenční pulzní voltametrie Voltametrické stanovení chloramfenikolu na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě DC Voltametrie Vliv ph Kalibrační závislosti Diferenční pulzní voltametrie Vliv ph Kalibrační závislosti Stanovení chloramfenikolu v pitné a říční vodě pomocí diferenční pulzní voltametrie Cyklická voltametrie

9 4.4 Adsorpční rozpouštěcí voltametrie Stanovení chloramfenikolu ve vzorku léčiva Spersadex Závěr Literatura

10 1 Úvod 1.1 Cíl práce Tato diplomová práce se zabývá vývojem metod pro voltametrické stanovení léčiv chloramfenikolu a chlorambucilu. Jejím cílem je nalézt vhodné podmínky pro stanovení a určit nejnižší mez stanovitelnosti těchto látek na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě (m-agsae). Dalším cílem je ověření použitelnosti metod v reálných matricích a ve vzorku léčiva. 1.2 Studované látky Chloramfenikol Chloramfenikol se řadí mezi širokospektrální antibiotika (obr. 1.1). Chloramfenikol byl izolován poprvé v roce 1948 ze Streptomyces Venezuelae Davidem Gottliebem. 1 Po řadu let se chloramfenikol používal jako levné a přitom vysoce účinné širokospektrální antibiotikum proti grampozitivním a gramnegativním bakteriím, riketsiím a spirochétám. 1,2 V tabulce 1.1 jsou uvedeny základní informace o chloramfenikolu. Chloramfenikol je bílý, šedobílý až žlutobílý jemný prášek či jemné krystaly, jehličky nebo protáhlé destičky. Je méně rozpustný ve vodě, ale více v ethanolu a v propylenglykolu. 3 Obrázek 1.1 Strukturní vzorec chloramfenikolu

11 Tab. 1.1 Základní informace triviální název systematický název chloramfenikol 2,2-dichlor-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1- (hydroxymethyl)-2- (4-nitrofenyl)ethyl]acetamid sumární vzorec C 11 H 12 C l2 N 2 O 5 CAS registrační číslo relativní molekulová hmotnost 323, Užití a biologické účinky Chloramfenikol je někdy zařazován do samotné skupiny amfenikolů. Amfenikoly se váží na ribozomy bakterií a inhibují aktivitu enzymu peptidyltransferázy. Dochází tak k zablokování prodlužování řetězce proteinu, a proto nelze připojit nové aminokyseliny. 4,5 Chloramfenikol je používán při léčbě těžkých pneumokokových a meningokokových infekcí. Dále se také používá k léčbě očních infekcí postihující rohovky nebo spojivky, k léčbě akutních infekcí zevního zvukovodu nebo infekce kůže. 4,6,7 Po perorální podání se rychle resorbuje a v organismu se rozděluje rovnoměrně, snadno prostupuje do likvoru, pleurálního prostoru i do placenty. Chloramfenikol je metabolizován v játrech, kde podléhá biotransformaci za tvorby konjugátů s kyselinou glukuronovou. Vylučován je převážně močí, pouze 5-15 % látky je vylučováno v nezměněné formě. 8 Při dlouhodobější terapii chloramfenikolem se může vyvinout těžké toxické poškození krvetvorné soustavy a to dvěma formami. První je tzv. agranulocytóza a trombocytopenická purpura, které jsou závislé na dávce a jsou reverzibilní. Druhá forma je tzv. aplazie a pancytopemie, nezávislá na dávce, často se smrtícím průběhem. U předčasně narozených dětí může dojít k tzv. grey syndromu, podle šedé barvy kůže. 5,9 Právě díky těmto závažným nežádoucím účinkům je použití chloramfenikolu v humánní a veterinární medicíně omezeno. Pro použití v potravinách živočišného původu je chloramfenikol zakázán na území celé Evropské unie a Spojených států amerických. 6,10 V zemích třetího světa je však stále používán. 2 Díky nízkým výrobním nákladů a poměrně vysoké účinnosti je tak chloramfenikol používán v živočišné výrobě a ve veterinární praxi jako doplňková látka pro podporu růstu. Bylo zjištěno, že určité množství reziduí antibiotik v lidských potravinách může vyvolat

12 alergické reakce a u některých citlivých jedinců celkově poškodit imunitní systém. 11 Přítomnost reziduí chloramfenikolu byla zjištěna v živočišných potravinách, které byly dováženy převážně z asijských zemí 12. Jednalo se zejména o potraviny, jako jsou např. drůbež, med, krevety nebo sušené mléko. 13, Metody stanovení Pro stanovení chloramfenikolu byla vyvinuta řada technik. Patří sem především kapalinová 15 a plynová chromatografie 16, UV spektrofotometie 17 nebo kapilární zónová elektroforéza s amperometrickou detekcí. 18,19 Dle dostupné literatury je vidět, že pro stanovení chloramfenikolu se nejvíce využívá chromatografických metod ve spojení s hmotností detekcí. 12,20 Chloramfenikol byl stanoven i mnoha elektroanalytickými metodami. 6, Separační metody Chloramfenikol byl stanoven metodou plynové chromatografie ve spojení s hmotností detekcí se zápornou chemickou ionizací (GC-NCI/MS) v játrech a svalech u drůbeže a prasat. Detekční limit byl 3, mol l 1. (cit. 16 ) Pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí (LC/MS) byl chloramfenikol stanoven ve včelím pylu. Stanovení nejprve předcházela dvoustupňová extrakce (SPE) a poté separace na C18 koloně s mravenčanem amonným v acetonitrilu jako mobilní fází. Mez detekce byla v rozmezí 2,5 3, mol l 1. (cit. 20 ) Pro stanovení reziduí chloramfenikolu v drůbežích játrech, ledvinách a ve svalech bylo využito metody kombinace HPLC s UV detekcí a imunochemickou metodou ELISA. Detekční limit pro chloramfenikol byl 2,5 ng g 1, největší množství chloramfenikolu bylo zjištěno v játrech 193 ± 15 ng g 1 a nejmenší množství bylo ve svalech 2,64 ± 0,2 ng g 1. (cit. 22 ) Pro další stanovení reziduí chloramfenikolu bylo využito kombinace chromatografických metod, kde plynová chromatografie (GC/MS) poskytovala screening reziduí chloramfenikolu a kapalinová chromatografie (LC/MS) vystupovala jako potvrzující metoda s detekčním limitem 1, mol l -1. (cit. 12 ) Pomocí kapilární zónové elektroforézy s amperometrickou detekcí byl chloramfenikol stanoven v očních kapkách s detekčním limitem 1, mol l 1.(cit. 19 ) Dále byl chloramfenikol stanoven s detekčním limitem 9, mol l 1 pomocí

13 kapilární zónové elektroforézy s amperometrickou detekcí na mikrodeskové elektrodě z uhlíkového vlákna Elektroanalytické metody Chloramfenikol je látkou snadno redukovatelnou díky své struktuře obsahující nitroskupinu. Proto může být stanoven pomocí voltametrických a polarografických metod na vhodné pevné, pastové či rtuťové elektrodě. Chloramfenikol byl stanoven na elektrodě ze skelného uhlíku pomocí cyklické voltametrie v prostředí acetátového pufru o ph 5. Stanovení bylo provedeno v očních kapkách, ústní suspenzi a v prášku pro přípravu injekčního roztoku. Limit detekce byl 2, mol l 1. (cit. 6 ) Další stanovení chloramfenikolu bylo provedeno na elektrodě ze skelného uhlíku s elektrochemickou předúpravou povrchu elektrody za využití cyklické a square-wave voltametrie. Tato úprava vede ke zlepšení vlastností povrchu elektrody a má vliv na kinetiku elektrodových procesů. Stanovení bylo provedeno v acetátovém pufru o ph 5,3 s detekčním limitem mol l 1. Tato vyvinutá metoda byla jednoduchá, relativně rychlá a úspěšně aplikovaná ve farmaceutickém průmyslu pro stanovení chloramfenikolu v očních kapkách. 1 Metodou diferenční pulzní voltametrie byl chloramfenikol stanoven na čtyřech pastových uhlíkových elektrodách v rozsahu BR pufru v rozmezí ph V tomto případě byl zkoumán negativní vliv kyslíku na voltametrická měření a jeho odstranění přidáním siřičitanu sodného. Limit detekce byl mol l 1. V dalším případě byl chloramfenikol stanoven na mikroelektrodách z uhlíkových vláken pomocí square-wave voltametrie v prostředí fosfátového pufru o ph 7,8 s detekčním limitem 4, mol l 1. (cit. 23 ) Metodou lineární sweep voltametrie byl chloramfenikol stanoven na elektrodě ze skelného uhlíku modifikované niklem. Stanovení bylo provedeno v prostředí 0,1M NaOH s detekčním limitem mol l 1. (cit. 24 ) Chloramfenikol byl také studován na borem dopované diamantové filmové elektrodě metodou cyklické voltametrie a následně stanoven FIA s amperometrickou detekcí. Nejvyšší signál chloramfenikolu byl získán s fosfátovým pufrem o ph 6 v 1 % ethanolu s detekčním limitem mol l 1. Metoda byla navržena pro stanovení chloramfenikolu v očních kapkách a ve vzorku mléka

14 Na stacionární rtuťové elektrodě byl chloramfenikol stanoven pomocí squarewave voltametrie v prostředí acetátového pufru o ph 4 s detekčním limitem mol l 1. (cit. 26 ) Spektrometrické metody Spektrometrické metody jsou stále více využívané v biomedicínském a farmaceutickém průmyslu pro analýzu léčiv. Výhodou těchto metod je, že pro stanovení léčiva lze využít celý rozsah absorpčního spektra. To je vhodné především u stanovení složitých směsí analytů. Další výhodou je rychlost stanovení a obvykle není potřeba předchozí separace. Chloramfenikol lze stanovit měřením absorbance v ultrafialové i ve viditelné oblasti viditelného světla. 17 Pro stanovení chloramfenikolu ve viditelné oblasti byla vyvinuta metoda, při které bylo využito reakce chloramfenikolu a molybdenanu amonného. Limit detekce byl 1, mol l 1. (cit. 27 ) Chlorambucil Chlorambucil je cytostatikum s alkylujícím mechanismem účinku a řadí se mezi aromatické deriváty dusíkatého yperitu (obr. 1.2). První syntéza byla provedena roku 1953 britskými vědci pod vedením J.L.Everetta. Od roku 1961 se využívá jako léčivo Leukeran. Chlorambucil je používán při malingním lymfomu, chronické lymfocitární leukemie a u Hodgkinovy choroby. 28,29 V tabulce 1.2 jsou uvedeny základní informace o chlorambucilu. Chlorambucil je bílý, krystalický prášek, který je prakticky nerozpustný ve vodě. Dobře rozpustný je v acetonu nebo ethanolu 96 %. (cit. 3 ) Chlorambucil má nižší teplotu tání (64 66 C). Přesto že má chlorambucil nízkou rozpustnost ve vodě, snadno podléhá hydrolýze ve vodných roztocích

15 Tabulka 1.2 Základní informace triviální název systematický název chlorambucil (4-(4-[bis-(2- chlorethyl)amino]fenyl))butanová kyselina sumární vzorec C 14 H 19 Cl 2 NO 2 CAS registrační číslo relativní molekulová hmotnost 304,21 Obrázek 1.2 Struktura látky chlorambucilu Užití a biologické účinky Cytostatikum chlorambucil účinkuje jako alkylační činidlo. Tyto sloučeniny jsou velmi chemicky nestabilní. Mechanismus působení chlorambucilu spočívá v přenosu vysoce reaktivních alkylů na různé buněčné složky, zejména pak na DNA zdravých i maligních buněk. Navázáním alkylového radikálu na DNA dochází k inhibici procesů buněčného dělení. Tímto je dosažen požadovaný terapeutický účinek na maligní tkáň. Hlavním metabolitem chlorambucilu je o dva uhlíky kratší 4-[bis(2- chlorethyl)amino]fenyl octová kyselina (zkráceně označována PAAM z anglického phenylacetic acid mustard). Tato kyselina vzniká β-oxidací postranního řetězce kyseliny máselné. 5,29 Chlorambucil je především indikován při chronické lymfocytární leukemii (CLL). Toto onemocnění patří k nejčastější leukemii v západním světě. Tvoří 30% všech diagnostikovaných leukemií. Podstatou tohoto onemocnění je nahromadění B-lymfocytů s typickým imunofenotypem v periferní krvi, lymfatických uzlinách, kostní dřeni a dalších orgánech. 31 Dále je indikován k léčbě Hodgkinovy choroby, některých forem nehodgkinských lymfomů u karcinomu prsu, vaječníku a dělohy. Mezi

16 nejčastější vedlejší příznaky patří ztráta chuti k jídlu, nauzea a průjmy. Může dojít i k nekrózám v ledvinách a vývodných močových cestách. Asi po jednom až dvou týdnech terapie chlorambucilem dochází k poklesu počtu lymfocytů a granulocytů, později pak i počtu trombocytů a erytrocytů. Dále dochází k vypadávání vlasů a ochlupení, které se po dvou až třech měsících obnovuje i při pokračující léčbě. 5 V posledních letech se přísun nových cytostatik do klinické praxe značně omezil. Bylo sice zavedeno větší množství derivátů osvědčených cytostatik, ale jejich efektivita však většinou zásadním způsobem nepředčila původní, mateřské látky. Pouze ojediněle se objevily látky zcela nové struktury. Avšak velkému uplatnění se dostalo některým cytostatikům modifikovaným vazbou na různé nosiče. 32 Publikována byla studie, kde bylo využito kombinace chlorambucilu s estradiolem pro léčbu rakoviny prsu. Jedna z možných příčin vzniku rakoviny prsu u žen je pokles hormonální hladiny estradiolu. Vazba cytostatika na hormonální nosič tak může výrazně zvýšit účinnost léčiva. 33 Dalším možným způsobem modifikace jsou cytostatika enkapsulovaná do liposomů. Liposomy jsou lipidové partikule o velikosti asi 1 2 µm. Vnější lipidová vrstva je tvořena dvěma lipidovými vrstvami a vnitřním vodním prostorem. Cytostatikum je inkorporováno do vnitřního prostoru. Liposomy tak snadněji pronikají do tkáně nádoru. Této vazby bylo využito i u chlorambucilu, čímž se zvýšil jeho léčivý účinek a také chemická stabilita. 30, Metody stanovení Vývoj metody pro stanovení chlorambucilu záleží na biologické matrici a předpokládané koncentraci analytu ve vzorku. V dostupné literatuře jsou publikovány práce, které jsou zaměřeny na stanovení chlorambucilu pomocí separačních technik, je to především vysokoúčinná kapalinová chromatografie 34 nebo kapalinová chromatografie na reverzní fázi s hmotnostní detekcí. 35 Elektrochemické vlastnosti chlorambucilu byly studovány i pomocí elektroanalytických metod. 36,

17 Separační metody V poslední době je čím dál větší pozornost věnována kontaminaci životního prostředí ze strany veterinárních a humánních léčivých přípravků. Jejich detekce vyžaduje velmi citlivé, přesné a specifické metody. Často jsou využívány separační metody ve spojení s hmotnostní detekcí. Jedna taková metoda byla navržena pro stanovení 19 cytostatik včetně chlorambucilu. Stanovení bylo provedeno pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí s detekčním limitem chlorambucilu mol l 1. (cit. 38 ) Další metoda pomocí kapalinové chromatografie s předchozí extrakcí (SPE) byla vyvinuta pro stanovení skupiny cytostatik v odpadních vodách. Detekční limit pro chlorambucil byl 4, mol l 1. (cit. 39 ) Pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s DAD a fluorescenční detekcí byla stanovena skupina cytostatik. Detekční limit pro chlorambucil byl 6, mol l 1. (cit. 40 ) Pro samotné stanovení chlorambucilu v léčivém přípravku byla navržena metoda HPLC na reverzní fázi s amperometrickou detekcí. Hodnota detekčního limitu byla 3, mol l 1.(cit. 34 ) Pro stanovení chlorambucilu a jeho hlavního metabolitu PAAM (z angl. phenylacetic acid mustard) v lidské plasmě a séru byla vyvinuta metoda HPLC na reverzní fázi s hmotnostní detekcí. Stanovení bylo vhodné a citlivé pro koncentrační rozmezí 1,3 2, mol l 1 pro obě studované látky Elektroanalytické metody Elektrochemické vlastnosti chlorambucilu byly studovány pomocí adsorpční rozpouštěcí voltametrie na statické rtuťové elektrodě (SMDE) v prostředí acetátového pufru o ph 5,4. Zde byl pozorován signál látky při potenciálu 1,3 V (vs Ag/AgCl), ale nebyl objasněn mechanismus příslušné elektrochemické reakce. Detekční limit byl mol l 1. Pomocí cyklické voltametrie byl studován vliv interferujích látek na stanovení chlorambucilu. Vyvinutá metoda je jednoduchá, rychlá a dostatečně citlivá pro stanovení v klinických vzorcích. 41 Oxido-redukční vlastnosti chlorambucilu v přítomnosti 4-chlor-butyronitrilu byly studovány pomocí cyklické voltametrie na platinové elektrodě. Jako optimální prostředí byl zvolen 0,1 mol l 1 fosfátový pufr o ph = 7. (cit. 36 )

18 1.3 Rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda Používání pracovních elektrod na základě kovové rtuti je v polarografii a v metodách od ní odvozených stále považováno za nejlepší z hlediska reprodukovatelnosti výsledků měření. Bohužel, kvůli obavám z toxicity kovové rtuti, se rozsah jejího použití jako elektrodového materiálu buď zmenšuje, nebo se tento druh elektrod zakazuje úplně. Je to jeden z důvodů, proč se v posledních letech hledají a vyvíjejí nové elektrodové materiály, které by nahradily rtuť. Zároveň by tyto materiály měly co nejvíce odpovídat konceptu tzv. zelené analytické chemie. Nejvíce těmto požadavkům odpovídají elektrody z pevných a pastových amalgámů. Dle stavu povrchu amalgámové elektrody tak máme k dispozici např. leštěnou pevnou amalgámovou elektrodu neobsahující rtuť, leštěnou elektrodu pokrytou rtuťovým filmem, leštěnou elektrodu pokrytou rtuťovým meniskem, pastové nebo kompozitní elektrody. Podle základních vlastností lze amalgámové elektrody rozdělit do dvou hlavních skupin. Buď může být amalgám tvořen kovem nebo kovy v případně vícesložkových amalgámů (např. Au, Ag, Ir), který je elektrochemicky méně aktivní než rtuť. Nebo je amalgám tvořen více elektrochemicky aktivním kovem než rtuť. 42 Příprava pevných amalgámových elektrod je poměrně jednoduchá a lze je připravit v každé laboratoři. Do vhodné skleněné trubičky se napěchuje do dolní části jemný prášek kovu (např. Au, Ag, Cu) vysoký asi 0,5 1 cm. Do horní části trubičky je zaveden platinový drátek, který slouží jako kontakt. Takto připravená elektroda se ponoří do kapalné rtuti a ponechá se v ní přes noc Tím se vytvoří mechanicky stabilní a netoxický amalgám (jak je dokázáno mnohaletými zkušenostmi při přípravě zubních plomb. 47 ) Vzniklý amalgám lze mechanicky vyleštit a tím tak připravit tzv. leštěnou stříbrnou pevnou amalgámovou elektrodu. Pro analytické účely je vhodnější rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda. 43 Pro úspěšnou aplikaci pevných amalgámových elektrod jsou nutné 3 základní kroky: amalgamace, aktivace a regenerace. 44 Amalgamace se provádí jednou za týden nebo i vícekrát, pokud je potřeba. Během měření může totiž dojít ke zhoršení citlivosti či reprodukovatelnosti. Není-li patrný meniskus kapalného amalgámu, je dobré provést amalgamaci znova. Obnova menisku spočívá v ponoření elektrody do kapalné rtuti. Aktivace elektrody se provádí vždy na začátku dne nebo po delším přerušení. Aktivací se z povrchu elektrody odstraňují oxidy a adsorbované látky. Zvyšuje se tím citlivost

19 a reprodukovatelnost pro další měření. Poslední krok regenerace se provádí v analyzovaném roztoku před měřením. Parametry regeneračních potenciálů mohou být předdefinované v programu analyzátoru nebo je lze měnit a nastavit v daném okně programu. Aby došlo k obnově povrchu elektrody, postačí většinou vložit na elektrodu asi po dobu sekund potenciál o mv pozitivnější, než je potenciál vylučování vodíku nebo rozklad základního elektrolytu. Při této hodnotě potenciálu se redukují oxidy kovů tvořících pevný amalgám a odstraňují se adsorbované látky. Zároveň však probíhá akumulace většiny kovů v analyzovaném roztoku. Provedením skokové změny potenciálu z negativních hodnot na pozitivnější se zabrání nekontrolovatelné akumulaci těchto kovů. Naakumulované kovy se tak rozpouštějí. Pozitivnější potenciál by však neměl dosáhnout takové hodnoty, aby docházelo k rozpouštění materiálu elektrody nebo k rozkladu základního elektrolytu. 44 Pevné amalgámové elektrody modifikované rtutí (meniskem nebo filmem) se z analytického hlediska jeví jako nejlepší. Díky jejich kapalnému povrchu, ideálně rovnému a stejnorodému, je tak vyloučen asi největší problém pevných elektrod jejich mechanická regenerace, často doprovázená špatnou opakovatelnosti měření. Obnovení povrchu pevných elektrod je umožněno pomocí analyzátoru, který je řízen počítačem. Tím je dovoleno dosáhnout RSD menší než 2 3 % při opakovaných měřeních a lze tak využít pevné amalgámové elektrody v průtokových systémech např. amperometrický detektor v HPLC. 44 Stříbrná pevná amalgámová elektroda byla vyvinuta v rámci výzkumu nových elektrod na Ústavu fyzikální chemie Jaroslava Heyrovského AV ČR. 45,46 Pro výrobu elektrod je stříbro jedním z nejpoužívanějších materiálů. Velmi důležité je, že stříbro rozpuštěné ve rtuti netvoří intermetabolické sloučeniny s jinými kovy. Pracovní rozsah potenciálů pevných stříbrných elektrod se nejvíce blíží k HMDE. Mohou tak být vhodnou alternativou za HMDE pro většinu analytických měření, práce s nimi je pohodlnější a lze je využít i pro měření v terénu. Shodné hodnoty proudu pozadí a potenciály DPV-píků na m-agsae a HMDE dovolují vzájemně přenášet a použít pracovní postupy dříve vypracované pro rtuťové elektrody

20 patří: Mezi hlavní technické a uživatelské přednosti pevných amalgámových elektrod - široký rozsah pracovních potenciálů; - elektrochemická obnova povrchu elektrod modifikovaných rtutí; - neomezená životnost elektrod (po dobu 8 let nebyla prakticky zaznamenána žádná změna vlastností) a snadné uvedení do provozu i po přestávce několika měsíců; - elektrody z pevných amalgámů jsou zcela netoxické - aplikace elektrod do mobilních laboratoří a snadná zabudovatelnost do průtokových systémů; - při přípravě elektrod využitelnost kovů, které nelze zatavit do skla (Ag,Cu), čímž odpadá nutnost použití speciálních lepidel - možnost volby vhodného tvaru a rozměru elektrod a jednoduchá konstrukce Aplikace rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrody Rtuťovým meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda byla využita pro stanovení kationtů, především těžkých kovů. Stanovení kovových iontů je důležitou součástí monitoringu životního prostředí, sledování výskytu škodlivých látek a biogenních prvků v tělních tekutinách atd. Pomocí m-agsae bylo provedeno stanovení As 3+, Cd 2+, Cr 3+, Cu 2+, Fe 3+, In 3+, Mn 2+, Ni 2+, Pb 2+, Sn 2+, Tl 1+, Zn 2+. (cit. 44,48 ) Anodická rozpouštěcí voltametrie (ASV) na m-agsae byla použita pro analýzu směsi kationtů Cu 2+, Zn 2+, Cd 2+, Pb 2+, Tl 2+. Při práci s m-agsae lze použít delší akumulační čas než na HDME (až 1 hodina) a tak zvýšit citlivost analýzy. 49 Stanovení aniontů na m-agsae může proběhnout různými elektrochemickými procesy, jako je redukce (IO 3, Nb 5+ ), katalytické jevy (NO 3 ), chemisorpce v kombinaci s následujícím katodickým scanem (Cl, Br, I, CNS ) nebo adsorpce (Cr 6+ ). Na m-agsae bylo také provedeno stanovení jodičnanů v kuchyňské soli. 44,48 Pro analýzu organických látek patří voltametrická měření k těm velice citlivým, nevyžadujícím složitou a drahou techniku. Například mez stanovitelnosti na úrovni 10 8 až 10 9 mol l 1 je běžná pro stanovení adeninu, guaninu, cysteinu i cystinu. m-agsae

21 byla úspěšně použita pro studium DNA. m-agsae byla využita pro detekci enzymatického nebo chemického štěpení DNA v roztoku nebo na povrchu elektrody, dále pro detekci zlomů na řetězci DNA vyvolané ionizujícím zářením. 49 Pomocí meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrody byla provedena celá řada analýz nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků (NPAH) a nitrobenzenů (1-nitronaftalen, 2-nitronaftalen, 2-nitrobifenyl, nitrobenzen, 2-nitrofenol, 1,5-dinitronaftalen), dále karcinogenní látka 3-nitrofluorathen. 48,50 Na m-agsae byly metodou DPV stanoveny pesticidní látky, jako pendimethalin, 2-methyl-4,6- dinitrofenol, oxyfluorfen, bifenox. 49 Léčiva proti rakovině jako doxorubicin, carmustin, flutamid a lomustin byla také úspěšně stanovena pomocí m-agsae. 49 V metodě průtokové injekční analýzy byla m-agsae využita ve wall jet uspořádání pro detekci 4-nitrofenolu a 5-nitrochinolinu. 49 U chromatografické metody HPLC nachází m-agsae uplatnění jako amperometrický detektor na výstupu z kolony. Pro měření vzácných nebo drahých látek s pomocí AgSAE byla zhotovena tříelektrodová cela na velmi malé objemy vzorku, což je vhodné např. pro studium DNA

22 2 Experimentální část 2.1 Reagencie Zásobní roztok chloramfenikolu (>více než 99 %, Sigma-Aldrich, Praha, ČR) o koncentraci mol l 1 byl připraven rozpuštěním přesně naváženého množství dané látky ve 25 ml deionizované vody. Zásobní roztok chlorambucilu (Sigma-Aldrich, Praha, ČR) o koncentraci mol l 1 byl připraven rozpuštěním přesně naváženého množství dané látky v 10 ml methanolu (Lachner, Neratovice, ČR). Roztoky o nižších molaritách byly připravovány přesným ředěním zásobních roztoků dané látky pomocí methanolu, pufru nebo neionizované vody. Zásobní roztok chloramfenikolu byl uchováván ve tmě za laboratorní teploty. Již dříve bylo zjištěno, že zásobní roztok chloramfenikolu je stálý déle než jeden měsíc. 51 Roztok chlorambucilu byl připravován každý den čerstvý. Brittonovy Robinsonovy pufry (BR pufr) o příslušné hodnotě ph byly připraveny smísením 0,2 mol l 1 NaOH (Penta, Praha, ČR) s roztokem obsahujícím kyselinu fosforečnou (Lachema, Brno, ČR), boritou (Lachema, Brno, ČR) a octovou (Lachema, Brno, ČR) každá o koncentraci 0,04 mol l 1. Acetátový pufr byl připraven rozpuštěním vypočteného množství octanu sodného (Lachema, Brno, ČR) v 50 ml deionizované vody. Přidáním 0,02 mol l 1 kyseliny octové (Lachema, Brno, ČR) se tento roztok upravil na požadované ph. Všechny uvedené chemikálie pro přípravu tlumivých roztoků byly čistoty p.a. Roztok chloridu draselného (Lachner, Neratovice, ČR), čistota p.a., o koncentraci 0,2 mol l 1 byl připraven rozpuštěním přesně naváženého množství látky ve 100 ml. Pro přípravu vodných roztoků byla používaná deionizovaná voda (Millipore Q-plus systém, Millipore, USA). Pro stanovení chloramfenikolu v pitné vodě byla dne odebrána voda z vodovodu v budově chemických kateder přírodovědecké fakulty UK Praha, Hlavova 8, Praha 2. Pro stanovení chloramfenikolu v říční vodě byla dne odebrána voda z řeky Vltavy, Náplavka, Praha 2. Léčivo Spersadex (šarže , Laboratoires THEA, Clermont-Ferrand, Cedex 2, Francie, Novartis s.r.o., Praha, Česká republika) oční kapky, roztok, 5ml. Složení léčiva: chloramphenicolum 5 mg a dexamethasoni natrii phosphas 1 mg v 1 ml roztoku, benzalkonium-chlorid, makrogol 400, glyceromakrogolricinoleát, dinatrium-edetát, roztok hydroxidu sodného, voda

23 2.2 Aparatura Všechna voltametrická měření (DPV voltametrie, DC voltametrie, cyklická voltametrie a AdSV) byla provedena na sestavě Mini and Microelectrode System UMµE (ETP-21-10) se softwarem Polar.Pro verze 5.1, firma Polaro Sensors, Praha, ČR. Software pracoval v operačním systému Windows XP. Jednotlivá měření byla prováděna ve tříelektrodovém zapojení, ve kterém byla použita argentchloridová elektroda (3 mol l 1 KCl, Eco Trend Plus, ČR) jako referentní a jako pomocná elektroda byla použita platinová drátková elektroda (Eco Trend Plus, ČR). Pracovní elektrodou byla meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda č o průměru disku 0,5 mm vyrobená firmou Polaro Sensors, Praha, ČR (obr 2.1). Pro měření s HMDE byla použita pracovní rtuťová elektroda od firmy Polaro Sensors, Praha, ČR. Při měření DPV byly na elektrodu vkládány pulsy o šířce 100 ms a modulační amplitudě -50 mv. Není-li uvedeno jinak, rychlost nárůstu potenciálu byla 20 mv s -1 při DPV, DCV i CV. Přesná hodnota ph byla měřena digitálním ph-metrem Jenway 4330 (Jenway Essen, Velká Británie) s kombinovanou skleněnou elektrodou (typ , Jenway LTD, Essex, Velká Británie). Kalibrace ph-metru byla prováděna standardními vodnými pufry za laboratorní teploty. Spektrofotometrická měření byla prováděna na přístroji Agilent Technologies 8453 (Agilent, USA), který je určený k proměření roztoků v UV/VIS oblasti spektra v rozsahu nm. Spektrofotometr je řízen pomocí počítačového programu UV- VisibleChemStation, verze Všechna měření byla prováděna v křemenných kyvetách měrné tloušťky 10 mm

24 Obrázek 2.1 Meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda: elektrických kontakt (1), skleněná kapilára (2), tuhý stříbrný amalgám (3), rtuťový meniskus (4) (cit. 52 ) 2.3 Pracovní postupy Meniskem modifikovaná stříbrná pevná amalgámová elektroda procházela vždy třemi základními operacemi: 1) Amalgamace: ponoření elektrody do kapalné rtuti na dobu asi 15 sekund a mírné zamíchání, tím se vytvořil rtuťový meniskus. Amalgamace se prováděla vždy na začátku dne. 2) Elektrochemická aktivace: aktivace spočívala v tom, že elektroda byla ponořena do míchaného roztoku chloridu draselného o koncentraci 0,2 mol l 1, který nebyl probubláván dusíkem, při vloženém potenciálu - 2,2 V po dobu 300 s. Aktivace byla prováděna vždy po amalgamaci elektrody nebo po jedné hodině při dlouhodobějším měření. 3) Regenerace: tento krok byl prováděn přímo v měřeném roztoku při současném bublání dusíkem a míchání roztoku. Bylo použito skokové střídání kladnějšího konstantního potenciálu E reg1 a zápornějšího konstantního potenciálu E reg2 v intervalech 0,1 s a po dobu 30 s. Elektrochemická regenerace končila vždy při zápornějším potenciálu. Regenerace byla prováděna jen v některých případech. Při voltametrických měřeních chloramfenikolu bylo do 10 ml odměrné baňky

25 odpipetováno příslušené množství roztoku studované látky ve vodě, poté byl roztok doplněn BR pufrem o daném ph až po rysku. Při stanovení chlorambucilu bylo do 10 ml odměrné baňky odpipetováno příslušné množství roztoku studované látky v methanolu, přidán methanol do celkového objemu 5 ml a následně byl roztok doplněn 0,2 mol l 1 chloridem draselným, acetátovým pufrem nebo BR pufrem o příslušném ph po rysku. Takto připravený roztok byl po promíchání převeden do polarografické nádobky. Před voltametrickým měřením byl čerstvě připravený roztok probubláván dusíkem po dobu 5 minut a zbaven tak přítomnosti kyslíku. Následně byl proveden záznam voltametrické křivky. Před každým dalším voltametrickým záznamem byl roztok probubláván jen 15 s. Křivky základního elektrolytu byly měřeny třikrát a křivky se studovanou látkou byly měřeny pětkrát. Všechna měření se prováděla za laboratorní teploty. Při voltametrickém stanovení chloramfenikolu v pitné a říční vodě bylo k 9 ml vzorku matrice vody s potřebným množstvím zásobního roztoku chloramfenikolu přidán jeden 1 ml BR pufru o ph 8 na celkový objem 10 ml. Při stanovení chloramfenikolu ve vzorku léčiva Spersadex byl nejprve připraven zásobní roztok léčiva tak, že bylo odpipetováno 645 µl roztoku očních kapek do odměrné baňky a doplněno po rysku na 10 ml deoinozovanou vodou. Následně bylo odpipetováno do odměrné baňky 400 µl tohoto zásobního roztoku léčiva a doplněno do 10 ml po rysku BR pufrem o ph 8. Takto připravený roztok byl převeden do polarografické nádobky a byl proveden voltametrický záznam. Po té bylo přímo k roztoku přidáno ve třech krocích vždy 200 µl zásobního roztoku chloramfenikolu o koncentraci mol l 1 a proveden záznam křivky mezi jednotlivými přídavky. Takto byla provedena metoda standardního přídavku s přidanými objemy zásobního roztoku standardu chloramfenikolu 200µl, 400µl, 600µl. Změna objemu měřeného roztoku byla následně zahrnuta do výpočtu. Očekávaná koncentrace léčiva ve vzorku byla mol l 1. Kontrola stanovení obsahu chloramfenikolu ve vzorku léčiva byla provedena pomocí UV spektrometrie dle českého lékopisu. 3 V lékopisu je stanovení obsahu popsáno následovně: 0,100 g se rozpustí ve vodě a zředí se na 500 ml. 10 ml tohoto roztoku se zředí vodou na 100 ml. Měří se absorbance v maximu při 278 nm. Vypočítá se obsah chloramfenikolu za použití specifické absorbance (, která má hodnotu 297 (cit. 3 ). Stanovení obsahu bylo provedeno námi navrženým způsobem,

26 protože náš vzorek léčiva nebyl v pevném stavu, ale v kapalném stavu. Dle lékopisu byla vypočítána koncentrace vzorku léčiva po zředění, která byla 6, mol l 1. Tato koncentrace byla určena k měření pomocí UV spektrometrie. Pro dosažení této koncentrace bylo odebráno do 10 ml baňky 40 µl roztoku očních kapek Spersadex a doplněno po rysku destilovanou vodou. Takto připravený roztok byl změřen pomocí UV spektrometrie při vlnové délce 278 nm a jako slepý vzorek byla použita destilovaná voda. Absorbance naměřeného roztoku vzorku léčiva při vlnové délce 278 nm byla dosazena do uvedeného vzorce: kde c je získaná koncentrace vzorku léčiva v g l 1, A je naměřená absorbance vzorku léčiva a l je délka kyvety. Vyhodnocení voltametrických křivek bylo odlišné dle použité techniky. Při diferenční pulzní voltametrii byl potenciál odečten v lokálním maximu píku. Hodnota proudu byla odečtena od spojnice minim po stranách píku. U DC voltametrie byla při vyhodnocování vlny (někdy přecházející do tvaru píku) prodloužena lineární část záznamu před nástupem a po nástupu vlny. V polovině výšky vlny byl odečten půlvlnový potenciál. Hodnota proudu při tomto potenciálu byla odečtena mezi tečnami ke křivce vzniklých prodloužením lineární částí vlny. Při cyklické voltametrii byl signál píku vyhodnocen jako u DC voltametrie dle výše popsaného postupu. Mez stanovitelnosti byla vyhodnocena na základě výpočtu desetinásobku směrodatné odchylky proudu dvaceti opakovaných měření studované látky o koncentraci nejnižšího bodu kalibrační přímky. 53 V grafech jsou zobrazeny body jako aritmetický průměr pěti a více měřených křivek studované látky. Dále jsou zobrazeny chybové úsečky jako intervaly spolehlivosti na hladině významnosti α = 0,05. V některých případech byl pro zpracování naměřených dat použit Studentův test odlehlosti výsledků. Výše zmíněné statistické zpracování bylo prováděno pomocí výpočtů a funkcí v programu Excel MS Office

27 3 Voltametrické stanovení chlorambucilu na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě 3.1 Cyklická voltametrie V prvním kroku byl chlorambucil studován pomocí cyklické voltametrie na visící rtuťové kapající elektrodě (HMDE). Při tomto měření bylo využito některých pracovních podmínek, které byly převzaty z již dříve publikované práce. 41 Bylo využito stejného prostředí (acetátový pufr ph 5,4), pracovní elektrody, ale pro naše měření byla zvolena jiná koncentrace chlorambucilu. V původní práci pracovali s koncentrací chloramfenikolu mol l 1, my jsme zvolili s ohledem na citlivost koncentraci chlorambucilu mol l 1. Cílem bylo ověření prostředí acetátového pufru o ph 5,4 a potenciálu redukčního píku 1,3 V (vs Ag/AgCl) chlorambucilu, jak bylo uvedeno v cit. 41 a pokusit se použít tyto podmínky pro stanovení pomocí m-agsae. V roztoku chlorambucilu o koncentraci mol l 1 v prostředí v methanolu a acetátového pufru o ph 5,4 v poměru 1:1 na HMDE, byly měřeny tři cykly v potenciálovém rozsahu od 0 mv do 1800 mv a zpět. Ve všech třech cyklech se objevil v první směru pík při potenciálu 1492 mv. Za stejných podmínek bylo měření provedeno na m-agsae, kde se však signál látky podařilo obtížně zachytit v okraji potenciálového okna při potenciálu 1535 mv. V porovnání s prací (cit. 41 ) byl náš signál látky zachycen při významně zápornějším potenciálu. Mechanismus redukce chlorambucilu na HDME v praci (cit. 41 ) nebyl objasněn a ani se nám nepodařilo jednoznačně navrhnout redukční mechanismus reakce odpovídající našemu signálu. Chlorid draselný byl zvolen jako další možné prostředí pro stanovení chlorambucilu. V roztoku chlorambucilu o koncentraci mol l 1 v methanolu v prostředí chloridu draselného o koncentraci 0,2 mol l 1 v poměru 1:1 na m-agsae, bylo měřeno pět cyklů v potenciálovém rozsahu od 100 mv do 1650 mv a zpět. Pět cyklů bylo prováděno proto, aby se systém dostal do ustáleného stavu. Ve všech pěti cyklech se objevil v prvním směru pík při potenciálu 1212 mv. Voltamogram posledního cyklu je uveden na obr Studovaná látka poskytovala v prostředí chloridu draselného dobře vyhodnotitelný signál

28 -1000 I, na E, mv 1 Obrázek 3.1 Cyklický voltamogram chlorambucilu (c = mol l 1 ) ve směsi methanol-0,2 mol l 1 chlorid draselný v poměru 1:1 (2) a základní elektrolyt (1). Měřeno na m-agsae. 3.2 Diferenční pulzní voltametrie Technikou diferenční pulzní voltametrie byly hledány optimální podmínky pro stanovení na m-agsae. Byl sledován vliv ph na chování chlorambucilu v prostředí BR pufru o ph 2 až 12. Při studiu vlivu ph na chování chlorambucilu (c = mol l 1 ) v prostředí BR pufru o hodnotě ph 2 až 12 a v metanolu (1:1) nebyl zaznamenán žádný signál studované látky. Pomocí DPV roztok chlorambucilu o koncentraci mol l 1 v methanolu v prostředí chloridu draselného v poměru 1:1 poskytoval jeden pík při potenciálu 1284 mv. Proto pro další měření chlorambucilu byla zvolena směs methanolu a chloridu draselného (c = 0,2 mol l 1 ) jako optimální prostředí. Na obr. 3.2 je znázorněn DP voltamogram chlorambucilu (c = mol l 1 ) ve směsi BR pufr o ph 7 a methanol v poměru 1:1 a ve směsi methanol-chlorid draselný (c = 0,2 mol l 1 ) v poměru 1:1. V dalším kroku měření DPV byla studována stálost signálu chlorambucilu (c = mol l 1 ) ve směsi methanol-chlorid draselný (c = 0,2 mol l 1 ) v poměru 1:1. Nejprve byla studovaná látka měřena bez regenerace a následně s regeneračními

29 potenciály E reg1 = 100 mv a E reg2 = 1650 mv, po té s potenciály E reg1 = 200 mv a E reg2 = 1650 mv, dále s potenciály E reg1 = 200 mv a E reg2 = 2300 a v poslední řadě s potenciály E reg1 = 200 mv a E reg2 = 2500 mv. Při opakovaném měření bez regenerace docházelo ke zmenšení signálu a k posunu píku na ose ve směru zápornějších potenciálů. S vloženými regeneračními potenciály byl signál látky poněkud neostrý až rozmytý. Také docházelo k posunu píku na ose ve směru zápornějších potenciálů. Signál látky se po měření často obtížně dostával do původního stavu, proto bylo nutné opakovat amalgamaci elektrody. Závěrem je nutno konstatovat, že nebyly nalezeny vhodné podmínky pro stanovení chlorambucilu na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě. Byly sice nalezeny podmínky, za nichž tato látka poskytovala voltametrické píky, ale stabilita a opakovatelnost signálu byla nízká, proto se jevila jako nevhodná pro analytické stanovení. I, na 50 na E, mv Obrázek 3.2 DP voltamogram chlorambucilu (c = mol l 1 ) ve směsi BR pufr o ph 7 a methanol v poměru 1:1 (1) a základní elektrolyt (2) spolu s DP voltamogramem chlorambucilu (c = mol l 1 ) ve směsi methanol-0,2 mol l 1 chlorid draselný v poměru 1:1 (3) a základní elektrolyt (4). Měřeno na m-agsae, rychlost skenu 20 mv s

30 4 Voltametrické stanovení chloramfenikolu na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě 4.1 DC Voltametrie Vliv ph Vliv ph na chování chloramfenikolu (c = mol l 1 ) při DCV na m-agsae byl sledován v prostředí BR pufru o příslušném ph v rozmezí hodnot Látka poskytovala jednu vlnu při ph 2. V rozmezí ph od 3 až 12 byly zaznamenány dvě vlny, z nichž první měla strmější nárůst a byla vyšší. Výsledné zaznamenané voltametrické křivky jsou na obr Půlvlnový potenciál první vlny lineárně klesal s rostoucím ph hodnot od 2 až po 12, jak je vidět na obr Metodou lineární regrese byl pro závislost půlvlnového potenciálu E 1/2 na ph v roztoku BR pufru v rozmezí 2 12 vypočten vztah: E 1/2 (mv) = 29,6 ph 332,4 (kolerační koeficient 0,9854) Potenciál druhé vlny se s rostoucím ph v podstatě neměnil. Grafické znázornění závislosti půlvlnových potenciálů E 1/2 a proudů vln I v na ph je znázorněno na obr. 4.2 a 4.3. Optimálním prostředím byl zvolen BR pufr o hodnotě ph 7, kde chloramfenikol poskytoval nejlépe vyhodnotitelnou vlnu s nejvyšší opakovatelností její výšky. Při tomto zvoleném prostředí byla provedena opakovaná měření bez a s regeneračními potenciály E reg1 = 0 mv a E reg2 = 1800 mv. Graficky je průběh regenerace znázorněn závislostí proudu vlny I v na pořadovém čísle měření N na obr Ze závislosti je vidět, že vývoj proudu vlny je klesající při vložení regeneračních potenciálů. Při regeneraci byla zjištěna RSD =10,5 % a bez regenerace byla hodnota RDS = 2,4 %

31 I, na na E, mv Obrázek 4.1 Voltamogramy chloramfenikolu (c = mol l 1 ) měřené technikou DCV na m-agsae v prostředí RB pufru o ph Hodnoty ph pufrů odpovídají číslům křivek v grafu E 1/2,mV ph Obrázek 4.2 Závislost půlvnového potenciálu E 1/2 chloramfenikolu (c = mol l 1 ) na ph roztoku. Měřeno technikou DCV na m-agsae v prostředí RB pufru o ph 2 12, první pík (1 ), druhý pík (2 )

32 -180 I v, na ph 2 Obrázek 4.3 Závislost proudu vlny I v chloramfenikolu (c = mol l 1 ) na ph roztoku. Měřeno technikou DCV na m-agsae v prostředí RB pufru, první pík (1 ), druhý pík (2 ) I V, na N Obrázek 4.4 Závislost proudu vlny I v chloramfenikolu (c = mol l 1 ) na pořadovém čísle měření (N) v prostředí BR pufru o ph 7, měřeno technikou DCV na m-agsae. S regenerací E reg1 = 1800 mv a E reg2 =0 mv, bez regenerace

33 4.1.2 Kalibrační závislosti V prostředí BR pufru o ph 7 byly proměřeny kalibrační závislosti chloramfenikolu v koncentračním rozmezí od mol l 1 až po mol l 1 metodou DCV na m-agsae. Naměřené kalibrační závislosti byly v celém koncentračním rozsahu lineární. Graficky jsou výsledné DC voltamogramy chloramfenikolu zobrazeny na obr. 4.5 (A) pro koncentrace v rozsahu (1 10) 10 5 mol l 1 a na obr. 4.6 (A) pro (1 10) 10 6 mol l 1. Závislost výšky vlny I v na koncentraci chloramfenikolu v rozmezí (1 10) 10 5 mol l 1 je znázorněna na obr. 4.5 (B) a pro koncentrační rozmezí (4 10) 10 6 mol l 1 na obr. 4.6 (B). Parametry kalibračních závislostí a mez stanovitelnosti jsou uvedeny v tab Pro kontrolu opakovatelnosti výšky vlny a určení meze stanovitelnosti za daných podmínek byla provedena opakovaná měření voltamogramů při nejnižší dosažené koncentraci mol l 1 (RSD = 5,0 %). Dosažená mez stanovitelnosti byla 2, mol l I, na -140 A I V, na -100 B E, mv c, mol.l 1 Obrázek 4.5 Voltamogramy chloramfenikolu měřené technikou DCV na m- AgSAE v prostředí BR pufru o ph 7. c (CAP): 0 (1), 10 (2), 20 (3), 40 (4), 60 (5), 80 (6), 100 (7) µmol l 1 (A). Závislost proudu vlny na koncentraci CAP v rozmezí µmol l 1. (B)

34 I, na A 5 na -12 I V, na B E, mv c, mol.l 1 Obrázek 4.6 Voltamogramy chloramfenikolu měřené technikou DCV na m-agsae v prostředí BR pufru o ph 7, c (CAP): 0 (1), 1 (2), 2 (3), 4 (4), 6 (5), 8 (6), 10 (7) µmol l 1 (A). Závislost proudu vlny na koncentraci CAP v rozmezí 4 10 µmol l 1. (B) Tabulka 4.2 Parametry kalibračních přímek pro stanovení chloramfenikolu metodou DCV na m-agsae v prostředí BR pufru o ph 7. koncentrace [mol l 1 ] úsek [na] směrnice [na mol 1 l] korelační koeficient LOQ [mol l 1 ] (1 10) ,18 1, ,9903 (1 10) ,27 1, ,9972 2,

35 4.2 Diferenční pulzní voltametrie Vliv ph Vliv ph na chování chloramfenikolu (c = mol l 1 ) při DPV na m-agsae byl sledován v prostředí BR pufru o příslušném ph v rozmezí hodnot Látka poskytovala jeden pík při ph 2. V rozmezí ph od 3 až 12 byly zaznamenány dva píky, z nichž první byl vyšší a měl ostřejší tvar. Výsledné zaznamenané voltametrické křivky jsou na obr Potenciál DPV píků lineárně klesal v rostoucím ph hodnot od 2 až po 12, jak je vidět na obr Metodou lineární regrese byl pro závislost potenciálu prvního píku E p na ph v roztoku BR pufru v rozmezí 2 12 vypočten vztah: E p (mv) = 35,6 ph 260,0 (kolerační koeficient 0,9871) Potenciál druhého píku se s rostoucím ph v podstatě neměnil. Grafické znázornění závislosti potenciálů píků E p a proudů píků I p na ph je znázorněno na obr. 4.8 a 4.9. Optimálním prostředím byl zvolen BR pufr o hodnotě ph 8, kde chloramfenikol poskytoval nejvyšší a nejlépe vyhodnotitelnou vlnu. Při tomto zvoleném prostředí byla provedena opakovaná měření chloramfenikolu (c = mol l 1 ) bez regenerace (RSD = 4,1 %) a s regeneračními potenciály E reg1 = 0 mv a E reg2 = 1800 mv (RSD = 3,7 %), E reg1 = 0 mv a E reg2 = 1900 mv (RSD = 1,6 %), E reg1 = 0 mv a E reg2 = 2000 mv (RSD = 4,9 %). Opakovatelnost signálu byla ověřena při nejnižší koncentraci chloramfenikolu (c = mol l 1 ) bez regenerace (RSD = 5,6 %) a s regenerací E reg1 = 0 mv a E reg2 = 1900 mv (RSD = 8,8 %), Graficky jsou průběhy regenerací znázorněny závislostí proudů píků I p na pořadovém čísle měření N na obr Ze závislostí je vidět, že vývoj proudů píků I p je stabilnější a citlivější bez vložení regeneračních potenciálů, proto byla další měření prováděna bez regenerace