Stanovení enzymů

Transkript

1 Stanovení enzymů Všechny enzymy přítomné v živých organismech jsou produkovány intracelulárně, ale místo jejich působení se velmi často nachází mimo produkční buňku. K tomuto místu jsou enzymy dopravovány tělními tekutinami. Proto se k jejich stanovení používá zpravidla krevní sérum nebo plasma, někdy moč a poměrně vzácně žaludeční a duodenální šťáva, mozkomíšní mok, exsudáty a transudáty. Ke stanovení aktivity některých enzymů je možné používat i bioptické vzorky tkání, ale tyto techniky již nepatří k rutinním postupům. Protože krev je v klinické enzymologii nejčastěji používaným materiálem, dělíme v ní obsažené enzymy na specifické a nespecifické. Specifické enzymy mají v krvi své místo účinku (např. enzymy systému srážení krve thrombin, plasminogen). Nespecifické enzymy mají místo účinku mimo krev a ve zdravém organismu jsou v krvi obsaženy jen v malém množství. Při onemocnění, nebo poškození produkčních orgánů a tkání dochází ke zvyšování hladiny odpovídajících enzymů v krvi. Někdy je ale zvýšená hladina nespecifických enzymů v krvi způsobená intenzivní svalovou práci, nebo genetickými dispozicemi. Nespecifické enzymy můžeme dále dělit na sekreční enzymy (např. lipasy, α-amylasa, kyselá fosfatasa) a buněčné enzymy (laktátdehydrogenasa, aminotrasferasy, alkalická fosfatasa atd.). Stanovení aktivity nespecifických enzymů je používáno pro diagnostiku. Tab : Přehled diagnosticky významných enzymů enzym zdroje diagnostická aplikace alaninaminotransferasa játra, kosterní svaly, srdce onemocnění jaterního parenchymu aldolasa kosterní svaly, srdce onemocnění svalů alkalická fosfatasa játra, kosti, placenta, ledviny onemocnění kostí a jater amylasa slinné žlázy, pankreas, ovaria onemocnění pankreatu aspartátaminotransferasa játra, kosterní svaly, srdce, onemocnění jaterního parenchymu, ledviny, erythrocyty infarkt myokardu, svalové nemoci kreatininkinasa kosterní svaly, mozek, srdce, infarkt myokardu, svalové nemoci hladké svalstvo kyselá fosfatasa prostata, erythrocyty karcinom prostaty a její kostní metastázy glutamátdehydrogenasa játra onemocnění jaterního parenchymu γ-glutamyltransferasa játra, ledviny jaterní karcinom, alkoholismus laktátdehydrogenasa srdce, játra, kosterní svaly, infarkt myokardu, hemolýza,

2 erytrocyty leukémie, onemocnění jater lipasa pankreas onemocnění pankreatu L-alaninaminotransferasa (ALT) a L-aspartátaminotransferasa (AST) ALT katalyzuje transaminační reakci L-alaninu s 2-oxoglutarátem za vzniku pyruvátu a L-glutamátu. Pyruvát je dále redukován laktátdehydrogenasou na laktát za současné oxidace NADH na NAD +. AST katalyzuje obdobnou reakci L-aspartátu s 2-oxoglutarátem za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu. Oxalacetát je dále redukován malátdehydrogenasou na malát za současné tvorby NAD +. Tvorba NAD + je spektrofotometricky měřitelná při 340 nm a je přímo úměrná aktivitě ALT resp. AST. Reakce se provádí v TRIS pufru (ALT má optimální ph = 7,15, AST ph = 7,65) při teplotě 37 C. Stanovení ALT a AST se provádí v čerstvém, nehemolytickém séru, plazma se nedoporučuje. ALT a AST jsou při 4 C stabilní až 7 dnů. Měření ALT se provádí v TRIS pufru, obsahujícím: L-alanin, NADH, pyridoxal-5 fosfát a laktátdehydrogenasu. Reakční směs se temperuje alespoň 5 min na 37 C a reakce se zahájí přídavkem roztoku 2-oxoglutarátu v TRIS pufru. Měření AST se provádí v TRIS pufru, obsahujícím: L-aspartát, NADH, pyridoxal-5 fosfát, malátdehydrogenasu a laktátdehydrogenasu. Reakční směs se temperuje alespoň 5 min na 37 C a reakce se zahájí přídavkem roztoku 2-oxoglutarátu. Změna absorbance se v obou případech sleduje kontinuálně asi 1 min po krátké fázi prodlevy. Změna absorbance se vypočítá z lineární části křivky a aktivita ALT v µkat/l se vypočte podle vzorce platného i pro výpočet aktivity AST: Aktivita ALT (AST) = A/min. (V ) / (630. vz. d. 60) Kde A/min je průměrná změna absorbance za minutu, V je celkový objem reakční směsi v kyvetě v ml, 10 6 je převod ml na m 3, 630 je molární absorpční koeficient NADH při 340 nm v m 2 /mol, vz je objem vzorku v ml, d je délka kyvety v mm a 60 je přepočet min na s. Fyziologické hodnoty při 37 C pro ALT jsou 0,22-0,73 µkat/l, pro AST 0,18-0,66 µkat/l. Patologické zvýšení hodnot ALT na padesátinásobek a AST na čtyřicetinásobek jsou typické pro akutní virovou hepatitidu a akutní hypoxii, chronická hepatitida a cirhóza vykazují zvýšení dvoj- až čtyřnásobné u ALT i AST. Obstrukční ikterus zvyšuje ALT až osmkrát a AST až šestkrát, akutní toxické poškození jater chlorovanými uhlovodíky zvýší ALT i AST maximálně třicetkrát. Zvýšené hodnoty ALT i AST byly rovněž zjištěny při svalových onemocněních, po infarktu myokardu a při progresivní svalové dystrofii.

3 Kreatinkinasa (CK) Tento enzym katalyzuje reverzibilní fosforylaci kreatinu (Crea) pomocí ATP za vzniku kreatinfosfátu (CreaP). Optimální ph pro reakci Crea + ATP = CreaP + ADP je 9,0 a pro obrácenou reakci CreaP + ADP = Crea + ATP je 6,7. Při neutrálním ph má kreatinfosfát podstatně vyšší fosforylační potenciál než ATP a proto při tomto ph probíhá obrácená reakce (tj. tvorba ATP z CreaP a ADP) dva až šestkrát rychleji než tvorba kreatinfosfátu. Obě reakce vyžadují přítomnost Mg 2+, který je obligátním aktivátorem kinas. CK je složena ze dvou podjednotek: B (brain mozek) a M (muscle sval), které se vzájemně kombinují na tři isoenzymy označované CK-1 (BB), CK-2 (MB) a CK-3 (MM), typické pro některé orgány. Tab : Výskyt isoenzymů CK v lidských orgánech v % orgán aktivita CK v orgánu (µkat/g fyziologické váhy) CK-1 (%) CK-2 (%) CK-3 (%) kosterní sval 41,7 0,06 1,1 98,9 mozek 9,3 97,3 2,7 0 srdce 7,9 1,3 20,0 78,7 prostata 1,9 94,0 0 6,0 Po elektroforetickém rozdělení na agaru, agaróze, nebo acetátcelulose se aktivita isoenzymů stanovuje nejčastěji pomocí obrácené reakce, kde ATP sledem reakcí poskytne NADPH detekovatelný při 340 nm, případně fluorescenčně, nebo NADPH redukuje tetrazoliovou sůl (NBT, MTT resp. INT) za tvorby barevného formazanu, což lze využít při detekci jednotlivých enzymů po elektroforéze. Další metody dělení isoenzymů využívají iontově-výměnnou chromatografii nebo imunochemické postupy. Stanovení aktivity CK je založeno na reakci CreaP + ADP, vzniklý ATP fosforyluje D- glukosu za katalýzy hexokinasou na D-glukosa-6-fosfát a ten je glukosa-6- fosfátdehydrogenasou pomocí NADP + oxidován na 6-fosfoglukonát a NADPH + H +. Rychlost tvorby NADPH je při nadbytku všech reakčních komponent přímo úměrná aktivitě CK. Pro aktivaci CK a pro odstranění vlivu sérové glutathionreduktasy se přidává N- acetylcystein a pro snížení aktivity sérové adenylátkinasy je přidáván AMP, nebo diadenosinpentafosfát (AP 5 A). Stanovení CK se provádí v čerstvém, nehemolytickém séru, odděleném od krevního koláče do 2 h po odběru. Plazma pro stanovení může být pouze

4 heparinizovaná a EDTA; fluoridová a citrátová se nedoporučuje, stabilizátory inhibují aktivitu CK. CK je při 4 C stabilní 1 den, vzorek je nutno chránit před světlem. Měření CK se provádí v imidazolacetátovém pufru obsahujícím: EDTA, magnesiumacetát, N-acetylcystein, ADP, AMP, AP 5 A, D-glukosu, NADP +, hexokinasu a D- glukosa-6-fosfátdehydrogenasu. Směs se temperuje přibližně 2 min na 37 C a následně se přidá roztok CreaP. Po krátké fázi prodlevy se přibližně 1 min zaznamenává změna absorbance při 340 nm. Z lineární části křivky se aktivita CK vypočte podobně jako u AST. Fyziologické hodnoty CK při 37 C pro muže jsou 0,40-3,25 µkat/l a pro ženy 0,30-2,83 µkat/l. Patologické zvýšení hodnoty CK až 25-krát signalizuje akutní infarkt myokardu, progresivní svalová dystrofie zvyšuje CK deset- až stokrát, cerebrální trauma zvyšuje CK dvakrát, ale i vysoká svalová námaha zvyšuje CK až dvacetkrát. Kreatinkinasa MB (CK-MB) Stanovení isoenzymu CK-MB je založeno na imunoinhibiční reakci. Přidáním polyklonální CK-M protilátky se inhibuje celková aktivita isoenzymu CK-MM a polovina aktivity CK-MB. Neinhibovaná poloviční aktivita isoenzymu CK-MB odpovídající složce B se měří spektrofotometricky jako u měření celkové aktivity CK. Metodika předpokládá, že aktivita isoenzymu CK-BB je ve vzorku nulová. Ke stanovení CK-MB se používá čerstvé, nehemolytické sérum, plazma se nedoporučuje. V případě podezření na infarkt myokardu se doporučuje provádět odběry a měření CK-MB při příjmu a dále po 6, 12 a 24 h. Měření se provádí při 37 C v obdobné reakční směsi jako u celkové CK, ve které je ale již kreatinfosfát a anti-lidská polyklonální CK-M protilátka. Po přidání séra a promíchání se po 5 min inkubace odečítá změna absorbance po dobu nejméně 1 min. Aktivita CK-MB v µkat/l je počítána jako u AST, ale výsledek se násobí dvěma. Hodnota 2 je násobný faktor, kterým se aktivita podjednotky B převádí na aktivitu isoenzymu CK-MB. Fyziologické hodnoty CK-MB jsou u dospělých při při 37 C do 0,4 µkat/l, tj. asi 6 % celkové CK. Při infarktu myokardu aktivita CK-MB začíná růst již po 4 6 h, maximální hodnoty CK-MB je dosaženo dříve než u celkové CK (za h) a procentický podíl CK- MB na celkové CK vzrůstá až na 30 %. Laktátdehydrogenasa (LD) Tento enzym katalyzuje oxidaci L-laktátu na pyruvát za spoluúčasti NAD +, který je akceptorem odebíraných protonů. Reakce je vratná a rovnováha je silně posunuta k tvorbě laktátu při ph = 7,4 7,8; zatímco oxidace laktátu na pyruvát probíhá při ph = 8,8 9,8. Stanovení LD se provádí v nehemolytickém séru, nebo heparinizované plazmě či EDTA;

5 fluoridovaná a oxalátová plazma se nesmí používat. LD je při 4 C stabilní 7 dnů, při laboratorní teplotě 1-3 dny. Vzorek se nesmí zmrazovat, protože by došlo k rozkladu jaterního isoenzymu. Měření LD se provádí při 37 C v TRIS pufru při ph = 9,0 s L-laktátem lithným, NAD + a KCl. Po přidání séra se reakční směs promíchá a po 30 s se odečítá změna absorbance 1 min. Aktivita LD µkat/l se vypočte podobně jako u AST. Fyziologické hodnoty LD při 37 C jsou pro děti od 1 roku do 15 let 3,0-8,4 µkat/l, pro muže od 16 do 60 let 3,3-7,0 µkat/l, pro ženy od 16 do 60 let 3,3-6,3 µkat/l; s vyšším věkem se obsah LD snižuje. Patologické zvýšení hodnoty LD dvakrát až osmkrát signalizuje akutní infarkt myokardu, maximum aktivity LD je dosaženo asi za 5 dnů, kdy hodnoty CK a AST jsou již normalizovány. Progresivní svalová dystrofie zvyšuje hodnoty LD dva- až pětkrát, infarkt plic zvyšuje hodnoty LD dva- až čtyřikrát. LD není pro jaterní parenchym specifická, přesto při akutní virové hepatitidě aktivita LD vzrůstá až třikrát, při infekční mononukleose se LD zvýší až pětkrát, při jaterní cirhóze, obstrukčním ikteru a onemocnění ledvin se LD zvyšuje dvakrát. Isoenzymy LD LD je složena ze čtyř podjednotek dvou typů: H (heart srdce) a M (muscle sval), které se vzájemně kombinují do pěti isoenzymů označovaných LD-1 (H 4 ), LD-2 (H 3 M), LD-3 (H 2 M 2 ), LD-4 (HM 3 ) a LD-5 (M 4 ). Jsou typické pro některé orgány a tkáně. Tab : Výskyt isoenzymů LD v % v lidských orgánech a tkáních orgán, tkáň LD-1 (%) LD-2 (%) LD-3 (%) LD-4 (%) LD-5 (%) srdce erytrocyty játra kosterní sval Jejich dělení se většinou provádí elektroforeticky na agarózovém gelu, nebo na acetátcelulózových membránách rutinním způsobem. Pro identifikaci isoenzymů se používá reakce s roztokem D,L-laktátu a NAD + v pufru o ph = 8,0 do kterého se gely, nebo membrány ponoří a při 37 C inkubují. Vzniklý NADH se detekuje fluorescenční denzitometrií po excitaci UV zářením (365 nm) nebo přímou denzitometrií po jeho redukčním působení na tetrazoliovou sůl za vzniku barevného formazanu. Klinicky se rozlišují tři elektroforetické obrazy a to: anodický zvýšení LD-1 a LD-2, který charakterizuje srdeční

6 postižení, infarkt ledvin, nádor ze zárodečných buněk, nebo svalovou dystrofii (včetně zvýšení LD-3), katodický - zvýšení LD-4 a LD-5, zde se jedná o hepatobiliární choroby, svalová postižení a karcinom prostaty včetně jiných nádorů a intermediární zvýšení LD-3, ten charakterizuje choroby lymforetikula, infekční mononukleosu, infarkt sleziny a maligní nádory. Isoenzym LD-1 (LD-1) Stanovení LD-l je založeno na poznatku, že 1,6-hexandiol specificky inhibuje aktivitu M podjednotek ostatních isoenzymů LD-2 až LD-5. Po jejich inhibici se aktivita LD-1 stanoví stejným způsobem jako aktivita celkové LD. Měření LD-1 se provádí v inhibičním diethanolaminovém pufru o ph 8,6 s přídavkem 1,6-hexandiolu. Po jeho přídavku k séru se isoenzymy inhibují 110 s a pak se přidá roztok L- laktátu lithného, NAD + a KCl v TRIS pufru o ph = 8,9. Směs se promíchá a po 30 s se odečítá změna absorbance 1 min. Aktivita LD-1 v µkat/l se vypočte jako u AST. Fyziologické hodnoty LD-1 při 37 C jsou pro dospělé 0,25 1,08 µkat/l, zvýšení hodnoty LD-1 signalizuje akutní infarkt myokardu, akutní myokarditidu resp. kardiogenní šok. Isoenzymy LD-1 a LD-2 (nesprávně hydroxybutyrátdehydrogenasa HBD) Isoenzymy LD-1a LD-2 mají ve srovnání s ostatními isoenzymy LD vysokou aktivitu k 2-hydroxybutyrátu, který je možno použít jako substrát místo L-laktátu. Jejich aktivita je pak často nesprávně označována jako hydroxybutyrátdehydrogenasa a měří se stejným postupem jako aktivita LD. Výpočet aktivity je totožný s výpočtem aktivity LD. Fyziologické hodnoty LD-1+ LD-2 pro dospělé jsou 1,2 3,0 µkat/l. Pro diagnostiku se používá převážně index LD/ LD-1+ LD-2, který má hodnoty 1,38 1,64 při infekčních chorobách, tromboembolických onemocněních a maligních nádorech, > 1,64 při hepatopatiích a < 1,3 při srdečním infarktu anebo intravazální či arteficiální hemolýze. Alkalická fosfatasa (ALP) Tento enzym je fosfohydrolasou monoesterů kyseliny fosforečné s ph optimem 8-10 a katalyzuje hydrolýzu mnoha fyziologických i syntetických fosfátů. V lidském organismu nalezneme až 17 isoenzymů a isoforem. Klinicky se rozlišují tři tkáňově specifické isoenzymy: střevní, placentární a placentárnímu podobný placental-like a jeden tkáňově nespecifický ubikvitní isoenzym zahrnující isoformy jaterní, kostní a ledvinovou. Stanovení ALP se provádí v nehemolytickém séru, nebo heparinizované plazmě. Aktivita ALP se ve

7 skladovaném séru časem zvyšuje, při laboratorní teplotě je změna aktivity během 4 h minimální. Měření aktivity ALP se provádí při 37 C v pufru (2-amino-2-methyl-1-propanol) s aktivátorem o ph = 10,4 ve kterém je dále 4-nitrofenylfosfát, acetát hořečnatý, síran zinečnatý a HEDTA (N-hydroxyethylethylendiamintetraoctová kyselina). Po smíchání se vzorkem se po krátké prodlevě měří při 405 nm změna absorbance. Aktivita ALP v µkat/l se vypočte podle vzorce: Aktivita ALP = A/min. (V ) / (1880. vz. d. 60) kde 1880 je molární absorpční koeficient 4-nitrofenolu při 405 nm v m 2 /mol, význam hodnot A/min, V, 10 6, vz, d a 60 viz AST. Fyziologické hodnoty ALP při 37 C pro muže mezi 20 a 50 lety jsou 0,88-2,13 µkat/l, nad 50 let 0,93-1,98 µkat/l a pro ženy mezi 20 a 50 lety 0,7-1,63 µkat/l, nad 50 let 0,88-2,35 µkat/l. Patologické zvýšení hodnoty ALP dvakrát až pětkrát signalizuje extra- i intrahepatální cholestázu, dále primární biliární cirhózu, nebo virovou hepatitidu. Podobná zvýšení ALP mohou dále souviset s onemocněním kostí, např. rachitis, osteomalacie a Pagetova choroba nebo s primárními a sekundárními nádory kostí (osteosarkom resp. metastázy karcinomu prostaty). K potvrzení diagnosy se dále provádí separace a kvantifikace isoenzymů ALP. Nejčastější metodou je elektroforéza na acetátcelulózových membránách pokrytých agarovým gelem s identifikačním systémem obsahujícím 1-naftylfosfát, sůl Fast blue BB a TRIS-borátový pufr (ph = 9,5), obsahující ještě MgCl 2. Elektroforézu je možné provádět i na škrobových deskách, agaru a v polyakrylamidovém gelu. Nejvyšší anodickou pohyblivost má jaterní isoenzym, střední pohyblivost má kostní isoenzym a nejblíže katodě se nachází střevní isoenzym. Kvantifikace se provádí přímou denzitometrií. Zdravá populace má obsah jaterního isoenzymu %, kostního isoenzymu % a střevního isoenzymu < 20 %. U dětí se nalézá až 85 % kostního isoenzymu, u těhotných se nachází až 50 % placentárního isoenzymu. K rozdělení isoenzymů se také používá tepelná nebo chemická inaktivace. Zahřátím na 56 C po dobu 10 min se zcela inaktivuje kostní isoenzym. Pomocí L-fenylalaninu (konc. 5 mmol/l) lze inhibovat střevní a placentární isoenzym; homoarginin a levamisol inhibují jaterní a kostní isoenzymy. Kyselá fosfatasa (ACP) Tento název zahrnuje skupinu isoenzymů, které jsou stejně jako ALP fosfohydrolasou monoesterů kyseliny fosforečné, ale s ph optimem 7,00 a nižším. Klinicky nejdůležitějším je

8 prostatický isoenzym, jehož přítomnost v krvi signalizuje kostní metastázy rakoviny prostaty. Tento isoenzym je L(+)-tartarát labilní a jeho stanovení se provádí z rozdílu celkové a zbytkové aktivity ACP stanovené v přítomnosti vínanu. Další isoenzymy jsou: kostní, trombocytový, jaterní a erytrocytární. Stanovení ACP se provádí v nehemolytickém séru. ACP je při běžném ph séra málo stabilní, přídavek 10 µl acetátového pufru na 1 ml séra zvýší její stabilitu při 2 8 C na 3 dny. Měření celkové aktivity ACP se provádí při 37 C v citrátovém pufru o ph = 5,4, ke kterému se přidá roztok α-naftylfosfátu a stabilního diaza Fast Red TR (diazotovaný 2-amino- 5-chlortoluen). Po smíchání se vzorkem se po 3 min prodlevě měří při 405 nm změna absorbance. Aktivita ACP v nkat/l se vypočte podle vzorce: Aktivita ACP = A/min. (V ) / (1470. vz. d. 60) kde 1470 je molární absorpční koeficient diazobarviva při 405 nm v m 2 /mol, význam hodnot A/min, V, 10 6, vz, d a 60 viz AST a 10 3 je přepočet µkat/l na nkat/l. Měření neprostatické aktivity ACP se provádí stejným způsoben jako měření celkové aktivity ACP. Citrátový pufr obsahuje mimo α-naftylfosfátu a stabilního diaza ještě vínan sodno-draselný. Výpočet se provede stejně a zjištěná aktivita se označí jako ACP neprostatická. Aktivita prostatické ACP se vypočte: ACP prostatická = ACP celková - ACP neprostatická Starší metoda používala podobně jako u měření aktivity ALP 4-nitrofenylfosfát. Jiná metoda používá jako substrát dvojsodnou sůl thymolftaleinfosfátu v pufru o ph = 5,4. Po smísení se sérem směs reaguje určitou dobu (obvykle 30 min) při 37 C a reakce se zastaví přidáním roztoku uhličitanu sodného a absorbance reakční směsi se měří při 595 nm. Současně se připraví i reakční blank smísením roztoku uhličitanu sodného a pufrovaného roztoku dvojsodné soli tymolftaleinfosfátu se sérem. Aktivita ACP se vypočte z rovnice pro celkovou ACP (3920 je molární absorpční koeficient thymolftaleinu při 595 nm v alkalickém prostředí v m 2 /mol). Fyziologické hodnoty ACP při 37 C jsou pro muže mezi 15 až 90 lety nkat/l, pro ženy mezi 15 až 90 lety nkat/l. Patologické zvýšení hodnoty ACP dva- až pětkrát signalizuje osteolýzu, osteolytický sarkom, kostní metastázy karcinomu prostaty a jiných orgánů, Pagetovu chorobu a Gaucherovu chorobu. K potvrzení diagnosy se dále dále provádí separace a kvantifikace isoenzymů ACP nejčastěji pomocí chemické inhibice. Trombocytový a erytrocytární isoenzym jsou inhibovány formaldehydem, nikoliv L(+)-tartarátem. Prostatický isoenzym je selektivně inhibován L(+)-tartarátem, kostní isoenzym je tartarátresistentní a k jeho stanovení se jako substrát stále používá 4-nitrofenylfosfát.

9 Fyziologické hodnoty prostatického isoenzymu při 37 C jsou pro muže mezi 15 až 90 lety < 60 nkat/l, pro ženy mezi 15 až 90 lety < 56 nkat/l. γ-glutamyltransferasa (GMT) Tento enzym katalyzuje přenos γ-glutamylové skupiny z γ-glutamylpeptidů na jiné peptidy, na L-aminokyseliny nebo na vodu. Pro stanovení aktivity GMT se jako substrát používá L-γ-glutamyl-4-nitroanilid, který je GMT štěpen na přenášený L-γ-glutamyl a 4- nitroanilin, jehož koncentrace je přímo úměrná aktivitě GMT. GMT je obsažena ve všech tkáních, kde je vázaná v buněčné membráně, vyšší obsah GMT mají játra a žlučovody, tenké střevo, ledviny a pankreas. Její stanovení se provádí v nehemolytickém séru nebo heparinizované resp. EDTA plazmě. Aktivita GMT je v séru, nebo v plazmě stabilní 7 dnů při 4 C. Metoda měření aktivity GMT používá jako substrát L-γ-glutamyl-3-karboxy-4- nitroanilid, který je rozpustnější a stabilnější než dříve používaný L-γ-glutamyl-4-nitroanilid. Reakční směs při 37 C v TRIS pufru (ph = 8) má složení: glycylglycin, MgCl 2 a L-γglutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid; při 405 nm se sleduje změna absorbance po dobu 1 min. Aktivita GMT = A/min. (V ) / (950. vz. d. 60) kde 950 je molární absorpční koeficient 5-amino-2-nitrobenzoátu při 405 nm v m 2 /mol, význam hodnot A/min, V, 10 6, vz, d a 60 viz AST. Fyziologické hodnoty GMT při 37 C pro děti od 1 roku do 15 let jsou 0,14 0,40 µkat/l, pro muže od 15 do 60 let 0,14 0,92 µkat/l, pro ženy od 15 do 60 let 0,14 0,63 µkat/l a pro dospělé osoby od 60 do 90 let 0,15 0,92 µkat/l. Patologické zvýšení hodnoty GMT dva- až pětkrát indikuje akutní virovou hepatitidu bez komplikací; až desetinásobné zvýšení je typické pro akutní virovou hepatitidu s cholestázou. Chronická aktivní hepatitida se projevuje až šestinásobným zvýšením, chronická alkoholová toxická hepatitida má zvýšení až desetinásobné stejně jako obstrukční ikterus a akutní toxické poškození jater jedy. Jaterní metastázy způsobují mírné zvýšení GMT, steatosa jater zvyšuje GMT dvakrát, karcinom hlavy pankreatu zvyšuje GMT pětkrát a infarkt myokardu dvakrát. Pro diferenciální diagnostiku intrahepatální cholestázy se při hodnotách GMT nad 1,6 µkat/l současně zjišťuje hodnota ALT, která umožňuje rozlišení steatosy, hepatitidy a cirhózy od metastáz a cholecystitidy. Glutamátdehydrogenasa (GMD)

10 Tento enzym katalyzuje oxidační deaminaci glutamátu na 2-oxoglutarát za spoluúčasti NAD +, který je akceptorem odebíraných protonů a vody, která rychle hydrolyzuje primárně vzniklý 2-iminoglutarát. Reakce je vratná, rovnováha je silně posunuta k tvorbě glutamátu, ale fyziologicky je preferována reakce opačná. Protože tato reakce probíhá působením GMD přednostně v jaterních mitochondriích a ostatní orgány a tkáně mají aktivitu GMD podstatně nižší (svaly 80-krát nižší, ledviny 10-krát nižší) je stanovení aktivity GMD relativně specifické pro játra. Postup pro stanovení aktivity GMD využívá tvorbu glutamátu, která je doprovázená spotřebou NADH a úbytek jeho koncentrace je přímo úměrný aktivitě GMD. Stanovení se provádí v nehemolytickém séru nebo plazmě s vyloučením fluoridované. Den před odběrem se nesmí požívat alkohol. Aktivita GMD je v séru, nebo v plazmě stabilní 7 dnů při 4 C, při 20 C až 4 týdny. Metoda měření aktivity GMD se provádí v TRIS pufru (ph = 8) ve kterém je dále: amoniumacetát, triethanolamin, ADP, LD, NADH a vzorek. Reakce se zahájí přídavkem roztoku 2-oxoglutarátu v pufru a při 340 nm se sleduje změna absorbance po dobu 1 min. Aktivita GMD v µkat/l se vypočte podobně jako u AST. Fyziologické hodnoty GMD při 37 C jsou pro děti < 0,06 µkat/l, pro muže < 0,12 µkat/l a pro ženy < 0,08 µkat/l. Patologické zvýšení hodnoty GMD na 90-násobek indikuje akutní selhání jater (otrava muchomůrkou zelenou); až 9-násobné zvýšení je typické pro akutní virovou hepatitidu s cholestázou. Chronická aktivní hepatitida a jaterní cirhóza v aktivní fázi se projevují čtyř- až pětinásobným zvýšením, obstrukční ikterus a jaterní tumory způsobí zvýšení až desetinásobné. Diagnostická sensitivita je poměrně nízká (0,48), ale výrazné zvýšení GMD oproti mírně zvýšeným ALT a AST (poměr ALT + AST / GMD 20) jednoznačně znamená nekrotické onemocnění jater. Cholinesterasa (CHS) Pod tímto označením jsou zahrnuty dvě skupiny isoenzymů nazývaných acetylcholinacetylhydrolasa = cholinesterasa (CHS), štěpící přednostně acetylcholin a butyrylcholinesterasa nebo-li acylcholinacylhydrolasa, někdy nazývaná i pseudocholinesterasa (ACHS, štěpící butyrylcholin, sukcinylcholin i acetylcholin). Tyto enzymy se dále liší místem syntézy, CHS je enzymem neuronálním syntetizovaným v mozku a v presynaptických nervových zakončeních. Funkce CHS je omezena na neuroneuronální a neuromuskulární synaptické prostory, kde rozkládá neurotransmiter acetylcholin. ACHS je enzymem syntetizovaným v játrech a vylučovaným do krve. Ke stanovení aktivity ACHS se jako substrát používá většinou butyrylthiocholin jodid, který je ACHS štěpen na butyrát a

11 thiocholin jodid, který dále reaguje s 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoovou kyselinou (DTNB) za vzniku barevného 5-merkapto-2-nitrobenzoátu měřitelného při 410 nm, nebo thiocholin jodid redukuje Fe 3+ v hexakyanoželezitanu draselném na Fe 2+ a pokles absorbance se měří při 405 nm. Stanovení se provádí v nehemolytickém séru nebo heparinizované resp. EDTA plazmě. Aktivita ACHS je v séru stabilní až 17 dnů při 4 C, při 20 C až 3 měsíce. Měření aktivity ACHS se provádí ve fosfátovém pufru (ph = 7,6) ve kterém je DTNB a vzorek. Reakce se zahájí přídavkem roztoku butyrylthiocholin jodidu a mezi 30 a 90 s se sleduje změna absorbance. Aktivita ACHS v µkat/l se vypočte z rovnice: Aktivita ACHS = A/min. (V ) / (1360. vz. d. 60) kde 1360 je molární absorpční koeficient 5-merkapto-2-nitrobenzoátu při 410 nm v m 2 /mol, význam hodnot A/min, V, 10 6, 630, vz, d a 60 viz AST. Aktivita ACHS se také stanovuje s butyrylcholinem jako substrátem a bezbarvým Ellmanovým činidlem tj. 5,5 -dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina), kdy vzniká žlutý smíšený disulfid, který měříme při 410 nm. Fyziologické hodnoty ACHS při 37 C jsou pro děti do 15 let µkat/l, pro muže 66,7 210,4 µkat/l a pro ženy 85,2 195,4 µkat/l, těhotné ženy, nebo ženy užívající kontraceptiva mají aktivitu CHS v rozmezí µkat/l. Zvýšení hodnot CHS je velmi neobvyklé, jaterní onemocnění jsou doprovázena patologickým snížením aktivity CHS. Snížení o 50 µkat/l indikuje jaterní tumory, pokles o 40 µkat/l je typický pro chronickou aktivní hepatitidu, nebo jaterní cirhózu; otravy organickými rozpouštědly nebo insekticidy jsou doprovázeny snížením aktivity CHS o µkat/l. α-amylasa (AMS) Stanovení AMS patří k nejstarším stanovením aktivity enzymů. Chromogenní metody používají syntetické substráty AMS na bázi amylosy, amylopektinu, nebo oligosacharidů, které jsou chemicky modifikovány barvivy (Drimarene Red Z2B), nebo indikátory (fluorescein). Hydrolytickým působením AMS jsou tyto substráty štěpeny na malé barevné fragmenty, jejichž koncentrace je měřena denzitometricky. Tyto metody se používají pouze pro zviditelnění isoenzymů po elektroforéze. Sacharogenní metody měří množství redukujících cukrů vzniklých při hydrolýze škrobu AMS za určitou dobu a v ČR se nepoužívají. Metody s tzv. definovaným substrátem používají jako substrát modifikované oligosacharidy, které obsahují na redukujícím konci barevnou detekční skupinu a na opačném konci chránící uskupení, stabilní proti enzymům s exoamylolytickou aktivitou (4,6-ethyliden,

12 4,6-isopropyliden, nebo 4,6-benzyliden). Takto upravený substrát se označuje jako EPS (ethyliden protected substrate). α-amylasa ze vzorku štěpí 4-nitrofenyl(α-G 1 )-4,6- ethyliden(g 7 )-D-maltoheptaosid (4-NP-EPS-G 7 ) za třetí, nebo čtvrtou glukosovou jednotkou a pomocný enzym α-glukosidasa tyto fragmenty rozštěpí na jednotlivé glukosové molekuly a odštěpí i navázaný 4-nitrofenol, jehož koncentrace je přímo úměrná aktivitě α-amylasy. Nevýhodou tohoto postupu je zjištění, že pankreatický isoenzym AMS štěpí tento substrát rychleji než slinný a to v poměru 1,8 : 1. Modifikace této metody používají jako substrát β- vázaný 2-chlor-4-nitrofenyl(β-G 1 )-4,6-ethyliden(G 7 )-D-maltoheptaosid, který je štěpen oběma isoenzymy AMS stejnou rychlostí; 2-chlor-4-nitrofenol je následně odštěpován β- glukosidasou a jeho molární absorpční koeficient je 1,8 krát vyšší než u 4-nitrofenolu, takže metoda je citlivější. Stanovení se provádí v nehemolytickém séru, plasma se nedoporučuje. Stanovení je možno provádět i v moči. AMS je stabilní enzym, její aktivita ve vzorku je stálá 7 dnů při laboratorní teplotě a 1 měsíc při 4 C. Měření aktivity AMS se provádí při 37 C v pufru o ph = 7,0 s rozpuštěným substrátem a pomocným enzymem α-glukosidasou, ke kterému se přidá vzorek. Po 1 min prodlevě se během další minuty měří změna absorbance při 405 nm. Aktivita AMS v µkat/l se vypočte podle vzorce: Aktivita AMS = A/min. (V ) / (1013. vz. d. 60) kde 1013 je molární absorpční koeficient 4-nitrofenolu při 405 nm při podmínkách reakce v m 2 /mol, význam hodnot A/min, V, 10 6, vz, d a 60 viz AST. Fyziologické hodnoty AMS při 37 C jsou pro děti mezi 6 týdny až 15 lety v rozmezí 0,30 2,2 µkat/l, pro dospělé mezi 15 až 60 lety jsou 0,30 2,30 µkat/l a pro dospělé mezi 60 až 90 lety 0,40 2,50 µkat/l. Patologické zvýšení hodnoty AMS třikrát až dvacetkrát indikuje akutní pankreatitidu bez komplikací, resp. s komplikacemi a chronickou obstrukční pankreatitidu. Perforovaný žaludeční, nebo duodenální vřed a perforace žlučníku zvýší aktivitu AMS až třikrát, dvojnásobné a nižší zvýšení AMS je projevem onemocnění žlučového traktu, diabetické ketoacidosy a glomerulární dysfunkce. Pankreatický isoenzym AMS (P-AMS) Pankreatický (P) a slinný (S) isoenzymy AMS je možno rozdělit a stanovit pomocí elektroforézy na acetátcelulózových foliích. Vzorek se smísí s CaCl 2 pro lepší rozdělení isoenzymů a dělí se při 300 V asi 1,5 h v ledem chlazené komoře. Folie se barví pomocí chromogenního systému Phadebas obsahujícího barvivo Drimarene Red Z2B 1 hod při 40 C a vyhodnocuje se denzitometricky.

13 Další metoda využívá chemické inhibice S isoenzymu pomocí pšeničného proteinu při použití blokovaného substrátu 2-chlor-4-nitrofenyl(β-G 1 )-4,6-(3-oxo)-butyliden(G 5 )-Dmaltopentaosidu. Postup i výpočet P-AMS je obdobný jako u stanovení AMS. Imunochemická metoda využívá selektivní inhibici slinného isoenzymu pomocí dvou monoklonálních protilátek v preinkubační fázi a následné stanovení aktivity P-AMS pomocí 4-NP-EPS-G 7 podle postupu pro stanovení AMS. Měření aktivity P-AMS se provádí při 37 C v pufru o ph = 7,1 s rozpuštěným pomocným enzymem α-glukosidasou a monoklonálními protilátkami ke kterému se přidá vzorek. Po 3 min inkubace při 37 C se přidá roztok 4-NP-EPS-G 7 v pufru a po prodlevě 2 min se měří při 405 nm změna absorbance. Fyziologické hodnoty P-AMS v séru resp. plazmě při 37 C jsou pro děti mezi 1 rokem až 15 lety do 1,08 µkat/l a pro dospělé v rozmezí 0,28 1,92 µkat/l. Při stanovení v moči jsou normální hodnoty do 6,2 µkat/l. Zvýšení hodnoty P-AMS je diagnosticky specifické pro akutní a chronickou pankreatitidu a pro karcinom pankreatu. Často se kombinuje i se stanovením lipasy. Lipasa (LPS) Lipasa je glykoproteinový enzym katalyzující hydrolýzu triacylglycerolů na glycerol a mastné kyseliny. Pro dosažení plné katalytické aktivity je nutná přítomnost žlučových kyselin a kolipasy. Metodika stanovení aktivity lipasy se vyvíjela od základních titračních metod, které používaly čištěný olivový olej jako substrát a fenolftalein jako indikátor až po trioleinový substrát emulgovaný v hydroxypropyl-methylcelulose s přísadou kolipasy, CaCl 2 a ph statovou techniku měřící spotřebu alkalického titračního činidla při ph = 9,0 a 30 C. Toto uspořádání bylo ale přístrojově náročné a neuplatnilo se v rutinních laboratořích. Větší praktické použití mají jednodušší turbidimetrické metodiky, které měří změnu zákalu reakční směsi vyvolanou rozkladem micel obsahujících triacylglyceroly hydrolyzované lipasou. Jako substrát se používá triolein v TRIS pufru při ph = 8,8, v reakční směsi je dále deoxycholát, kolipasa a CaCl 2. V případě malého počtu požadavků se provádí manuální stanovení. Reakce se zahájí přídavkem séra, po 4 min inkubaci při 37 C se odečítá změna absorbance vzorku a standardu asi 5 min proti destilované vodě. Aktivita LPS = A vz /min / A st /min. c st kde A vz je absorbance vzorku, A st je absorbance standardu a c st je katalytická koncentrace standardu v µkat/l.

14 Spektrofotometrické metody mají komplikovanější chemický mechanismus, ale jsou všeobecně použitelné a přesné. Firma Beckman Instruments vyvinula pětistupňový enzymatický postup vycházející z 1,2-diacylglycerolu, který je LPS při ph = 8,7 hydrolyzován za přítomnosti kolipasy na 2-monoacylglycerol a ten je dále monoacylglycerol lipasou hydrolyzován na glycerol a mastnou kyselinu. Glycerol je kinasou a ATP fosforylován na L-α-glycerolfosfát a ten je dále oxidován kyslíkem za katalýzy glycerolfosfátoxidasou na dihydroxyacetonfosfát a H 2 O 2. H 2 O 2 oxiduje v poslední reakci katalyzované peroxidasou TOOS ( sodná sůl N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-mtoluidinu) v přítomnosti 4-aminoantipyrinu za vzniku barevného substituovaného chinonu, jehož koncentrace se měří při 550 nm. Značné zjednodušení přineslo použití syntetického substrátu obsahujícího barvivo methylresorufin a to: 6-methylresorufinylester kyseliny 1,2-O-dilauryl-rac-glycerol-3- glutarové, který je LPS štěpen na nestálý 6-methylresorufinyl poloester kyseliny glutarové a ten se spontánně hydrolysuje na purpurový 6-methylresorufin měřitelný při při 580 nm. Stanovení se provádí v nehemolytickém séru, nebo EDTA resp. heparinizované plasmě. LPS je stabilní enzym, její aktivita ve vzorku je stálá 24 h při laboratorní teplotě a 5 dnů při 2 8 C. Měření aktivity LPS se provádí při 37 C v GOOD pufru o ph = 8,0, který dále obsahuje thaurodesoxycholát, deoxycholát, kolipasu a CaCl 2. Po smísení se vzorkem se inkubuje 1 5 min a přidá se roztok výše uvedeného derivátu 6-methylresorufinu v jantaranovém pufru o ph = 4,0 obsahujícího ještě thaurodesoxycholát. Po 2 min inkubaci se přesně po prvé a druhé minutě odečte změna absorbance vzorku, standardu a blanku při 580 nm. Aktivita LPS se vypočte v µkat/l podle rovnice. Aktivita LPS = ( A vz /min - A bl /min) / ( A st /min - A bl /min). c st kde A vz je absorbance vzorku, A st je absorbance standardu, A bl je absorbance blanku a c st je katalytická koncentrace standardu v µkat/l. Fyziologické hodnoty LPS v séru resp. plazmě při 37 C jsou pro děti a dospělé v rozmezí 0,12-1,0 µkat/l. Troj- až osminásobné zvýšení hodnoty LPS je diagnosticky specifické pro akutní pankreatitidu. Mírné zvýšení LPS vyvolávají: karcinom pankreatu, virová hepatitida, Crohnova choroby a břišní tyfus. Literatura: 1. Kopáč J. Lékařská laboratorní diagnostika. Turnov : Tiskárna Polygraf, s.r.o., 2004, 815 s., ISBN není uvedeno.

15 2. Masopust, J. Klinická Biochemie - požadování a hodnocení biochemických vyšetření část I. Praha : Karolinum, 1998, 429 s., ISBN Masopust, J. Klinická Biochemie - požadování a hodnocení biochemických vyšetření část II. Praha : Karolinum, 1998, 395 s., ISBN X. 4. Burtis, C. A., Ashwood, E. R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3 rd Edition. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 1999, 1917 p., ISBN