laboratorní technologie

Transkript

1 Analyzátor Flexor a reagencie Lachema L. Šprongl V našich laboratořích jsou předchůdci automatického biochemického analyzátoru Flexor známi pod různými názvy. Nejznámější je asi název Selectra. Výrobcem zmodernizovaného analyzátoru je holandská firma Vital Scientific a nabízí ho pod názvem Vitalab Flexor. K dispozici jsou 3 varianty s různou kapacitou a vzhledem. Popis testovaného analyzátoru: Testován byl střední typ - Vitalab Flexor E. Hlavní jednotkou systému je vlastní analyzátor, který obsahuje fotometrický modul a jednotku pracující s roztoky a vzorky. Analyzátor řídí oddělený počítač, v němž jsou shromažďována a archivována data z měření a který může komunikovat s laboratorním informačním systémem. Chladící jednotka zajišťuje stabilitu reagencií umístěných v přístroji. K vlastnímu přístroji je možno připojit jednotku Vitalab Dry ISE k zajištění měření hladin elektrolytů. Maximální výkon přístroje je testů za hodinu, v závislosti na počtu jedno- a dvoureagenčních metod. Systém je plně otevřený a dovoluje naprogramovat až 120 různých metod. Současně použitelných testů je maximálně 32. Přístroj má tedy 32 pozic pro reagencie, dále pak 51 pozic pro vzorky. Pipetovací objemy pro vzorky jsou 1 30 ul, pro prvou reagencii ul a pro druhou regencii ul, vždy s krokem 1 ul. Měření probíhá v plastových kyvetách, kterých je 48. Minimální měřící objem je 220 ul, maximální pak 400 ul. Zdrojem světla je halogenová lampa, měřit lze při následujících vlnových délkách: 340, 376, 405, 436, 505, 546, 578 a 620 nm. Testování: Byla provedena validace většiny metod ze spektra, které pro analyzátor může nabídnout výrobce reagencií PLIVA- Lachema Diagnostika s.r.o. K měření byl použit validační protokol vycházející z platného doporučení ČSKB k validacím. Protokol: Opakovatelnost: 20 měření v sérii na 2 hladinách (u některých metod na 3 hladinách). Použity byly jak komerční kontrolní materiály, tak pooly vzorků z laboratoře. Spočítán byl průměr, SD a CV. Mezilehlá nepřesnost: Měřeno po dobu 10 dnů, každý den 2 série s časovým rozestupem minimálně 4 hodiny. Byly použity stejné vzorky jako pro opakovatelnost, stanoven průměr, SD a CV. Mez detekce: Změřil se 20 krát v sérii blank, vypočetla se směrodatná odchylka výsledků měření. Trojnásobek směrodatné odchylky přepočítaný pomocí kalibračního faktoru na koncentraci daného analytu je považován za mez detekce. Platí: LD = 3 s bl. Mez stanovitelnosti: Mez stanovitelnosti byla vyjádřena jako LQ = 9,12 s bl, (hodnota nejistoty = 10 %). Linearita: Jako vzorky byly použity pacientské vzorky. Základem byl vzorek o nulové koncentraci měřeného analytu, označený jako L (low) a vzorek o extrémně vysoké koncentraci, která je v oblasti předpokládané horní meze pracovního rozsahu měření, označený jako H (high). Připravila se řada 5 vzorků: vzorek 1 jen H vzorek 2 75 % H + 25 % L vzorek 3 50 % H + 50 % L vzorek 4 25 % H + 75 % L vzorek 5 jen L Každý vzorek se změřil třikrát. Následně byly vypočítány průměrné hodnoty každého ze tří měření a byl sestrojen graf. Do odchylky výsledku 10 % od teoretické hodnoty byla metoda považována za lineární. Porovnání: Bylo změřeno 40 vzorků pacientů, vždy 16 s patologickými hodnotami a 24 s fyziologickými hodnotami. Porovnávací metodou bylo měření na analyzátoru ADVIA 1650 s odpovídajícími reagenciemi (Siemens Healthcare Diagnostics). Každý vzorek se oběma metodami analyzoval 2 krát, a to jako 2 různé vzorky ve 2 různých bězích (tj. ne hned za sebou). Doba měření byla 5 dní, k vyhodnocení byla použita lineární regresní analýza podle Passing-Babloka a vždy sestrojeny Bland-Altmanovy grafy. Interference: Testoval se vliv kvality séra hemoglobin, triacylglyceroly a bilirubin. Pro testy na hemoglobin a bilirubin byly použity roztoky čistých látek (Sigma), pro vliv triacylglycerolů byl použit roztok Intralipid (tuková emulze pro parenterální výživu, výrobce Baxter). Podobným postupem jako pro měření linearity byla připravena řada koncentrací interferentu, maximální koncentrace byla 10x vyšší než testovaná maximální koncentrace. K poolu séra pak byly přidány jednotlivé koncentrace interferentu vždy 0,9 ml séra a 0,1 ml roztoku interferentu. Ze sestrojeného grafu závislosti koncentrace analytu na koncentraci interferentu pak bylo patrné, do jaké koncentrace daného interferentu nepředstavuje odchylka více než 10 % od původní hodnoty a tudíž není měření ovlivněno interferující látkou. 17

2 18 Výtěžnost a pravdivost: K pacientskému vzorku o známé nízké koncentraci se přidalo jednak 10 % objemu vzorku o známé vysoké koncentraci, a jednak 10 % nulového kalibrátoru. Takto se připravilo 5 dvojic vzorků, měřilo se v dubletu. Spočítána byla výtěžnost R v procentech. Testováno bylo celkem 34 metod, a to jak pro stanovení v séru, tak pro stanovení v moči. Měření bylo rozděleno do 4 etap. Etapa 1: Aplikace pro měření v séru pro albumin, celkovou bílkovinu, celkový a přímý bilirubin, glukózu, cholesterol, kreatinin (Jaffé metoda a enzymatická metoda), kyselinu močovou, močovinu, triacylglyceroly, anorganický fosfor, chloridy, vápník a přímé měření HDL a LDL cholesterolu. Etapa 2: Aplikace pro měření v moči pro celkovou bílkovinu, kreatinin (Jaffé metoda a enzymatická Tabulka 1-1 metoda), kyselinu močovou, močovinu, glukózu, anorganický fosfor, chloridy, vápník a amylázu. Etapa 3: Aplikace pro měření v séru pro amylázu, ALP, AST, ALT (metoda s AMP), GMT, CK, LD, pankreatickou amylázu, cholinesterázu a CKMB Etapa 4: Aplikace pro IgA, IgG, IgM, CRP, RF, ASLO a HbA1c Celé testování probíhalo v období červen září Výsledky: Většina výsledků je prezentována v následujících tabulkách. Grafické výstupy zde nelze prezentovat vzhledem k počtu testovaných metod, jsou ale k dispozici u autora sdělení. Opakovatelnost: Tabulky 1-1 až 1-4 analyt jednotka průměr SD CV Albumin g/l 42,61 0,83 1,96 32,15 0,48 1,51 Celková bílkovina g/l 67,05 1,32 1,97 53,42 1,01 1,88 Bilirubin celkový μmol/l 24,30 0,88 3,62 87,4 2,67 3,06 Bilirubin přímý μmol/l 12,42 0,55 4,41 38,12 1,44 3,79 Cholesterol mmol/l 2,66 0,05 1,85 5,42 0,09 1,71 Kreatinin enzymaticky μmol/l 99,65 3,13 3,14 406,9 10,12 2,49 KreatininJaffé μmol/l 116,1 2,31 1,99 347,9 9,63 2,77 Kyselina močová μmol/l 275,7 5,85 2,12 697,9 14,12 2,02 Močovina mmol/l 7,40 0,15 2,05 26,83 0,76 2,81 Triacylglyceroly mmol/l 1,32 0,03 2,15 2,40 0,05 2,24 Fosfor mmol/l 1,21 0,02 1,78 2,05 0,06 2,01 Chloridy mmol/l 89,3 1,72 1,92 111,6 2,16 1,94

3 analyt jednotka průměr SD CV Vápník mmol/l 2,14 0,04 1,80 3,42 0,07 1,98 Glukóza mmol/l 5,14 0,09 1,83 14,86 0,32 2,18 HDL cholesterol mmol/l 1,74 0,03 1,82 0,90 0,013 1,53 LDL cholesterol mmol/l 5,07 0,08 1,56 2,43 0,05 1,92 Tabulka 1-2 (moče) analyt jednotka průměr SD CV Celková bílkovina mg/l 220 7,12 3,23 642,4 14,8 2,31 Glukóza mmol/l 1,66 0,09 5,71 Kreatinin enzymaticky 17,11 0,45 2,68 mmol/l 6,11 0,14 2,33 13,11 0,31 2,39 Kreatinin Jaffé mmol/l 6,22 0,11 1,84 13,05 0,26 2,03 Kyselina močová mmol/l 0,555 0,022 3,91 1,095 0,057 5,18 Močovina mmol/l 225 5,0 2,22 385,9 8,41 2,18 Fosfor mmol/l 8,93 0,28 3,15 19,42 0,66 3,40 Chloridy mmol/l 183,3 2,81 1,54 108,3 2,77 2,56 Vápník mmol/l 1,72 0,054 3,01 2,66 0,09 3,51 Amyláza μkat/l 0,92 0,03 3,50 2,68 0,066 2,43 19

4 20 Tabulka 1-3 analyt jednotka průměr SD CV Amyláza μkat/l 1,23 0,015 1,25 3,13 0,037 1,19 ALP μkat/l 1,15 0,019 1,66 3,36 0,049 1,45 AST μkat/l 0,78 0,014 1,82 2,43 0,032 1,33 ALT μkat/l 0,77 0,014 1,79 2,00 0,027 1,37 GMT μkat/l 0,76 0,029 3,78 3,65 0,047 1,29 CK μkat/l 2,58 0,073 2,82 8,76 0,158 1,71 LD μkat/l 2,45 0,06 2,45 4,12 0,07 1,67 pankreatická amyláza μkat/l 0,60 0,018 3,06 1,72 0,034 2,02 Cholinesteráza μkat/l 98,5 1,67 1,69 53,14 1,15 2,16 CK-MB μkat/l 0,69 0,013 1,91 17,07 0,22 1,31 Tabulka 1-4 analyt jednotka průměr SD CV IgA g/l 1,27 0,027 2,20 2,36 0,05 1,99 3,45 0,07 2,02 IgG g/l 8,25 0,20 2,44 16,47 0,31 1,90 IgM g/l 0,60 0,012 2,06 1,09 0,024 2,21 CRP mg/l 13,05 0,45 3,49 33,2 1,18 3,55 RF IU/ml 13,64 0,38 2,81 27,07 0,69 2,54 59,66 1,45 2,43 ASLO IU/ml 112,9 1,90 1,68 197,6 6,86 3,47 235,2 6,21 2,64 HbA1c % 3,09 0,056 1,79 11,4 0,18 1,57

5 Poznámka: Při měření většího počtu testů opakovaně ze stejných vzorků se prodlužuje doba, po kterou je vzorek v přístroji, a tím se zhoršuje opakovatelnost. Mezilehlá nepřesnost: Tabulka 2-1 až 2-4 Tabulka 2-1 analyt jednotka průměr SD CV Sigma Albumin g/l 41,98 0,85 2,03 5,9 30,7 0,62 2,01 5,9 Celková bílkovina g/l 66,74 1,31 1,97 4,6 51,48 1,03 2,00 4,5 Bilirubin celkový μmol/l 25,68 0,68 2,65 7,9 95,1 1,94 2,04 10,3 Bilirubin přímý μmol/l 13,22 0,49 3,75 40,14 1,87 4,65 Cholesterol mmol/l 2,61 0,05 1,92 5,2 5,27 0,10 1,84 5,4 Kreatinin enzymaticky μmol/l 95,3 2,34 2,45 6,1 379,4 7,25 1,91 7,85 KreatininJaffé μmol/l 107,6 4,53 4,21 3,6 338,2 12,2 3,59 4,2 Kyselina močová μmol/l 277,5 5,61 2,02 6,9 672,6 12,6 1,87 7,5 Močovina mmol/l 7,50 0,18 2,41 6,22 26,44 0,54 2,04 7,4 Triacylglyceroly mmol/l 1,34 0,03 2,16 6,9 2,36 0,05 2,16 6,9 Fosfor mmol/l 1,27 0,05 3,82 3,9 2,03 0,06 2,82 5,3 Chloridy mmol/l 89,7 1,8 1,99 3,5 111,8 2,31 2,06 3,4 Vápník mmol/l 2,12 0,04 1,98 5,1 3,25 0,077 2,34 4,3 Glukóza mmol/l 5,19 0,11 2,16 4,6 14,05 0,27 1,95 5,1 HDL cholesterol mmol/l 0,86 0,017 2,01 7,5 1,81 0,05 2, LDL cholesterol mmol/l 2,32 0,04 1,82 8,2 4,89 0,12 2,44 6,1 21

6 22 Tabulka 2-2 (moče) analyt jednotka průměr SD CV Sigma Celková bílkovina mg/l ,8 5, ,9 2,47 Glukóza mmol/l 1,50 0,088 5,93 3,7 16,21 0,45 2,76 7,9 Kreatinin enzymaticky mmol/l 6,04 0,10 1,65 14,5 12,8 0,21 1,67 14,5 Kreatinin Jaffé mmol/l 5,84 0,23 3,91 6,1 12,14 0,46 3,76 6,4 Kyselina močová mmol/l 0,593 0,04 6,78 3,8 1,11 0,046 4,17 6,2 Močovina mmol/l 206 9,28 4,51 3,8 355,5 11,57 3,26 5,2 Fosfor mmol/l 7,67 0,40 5,25 3,4 19,65 0,98 4,98 3,6 Chloridy mmol/l 102,6 2,54 2,48 5, ,94 2,83 4,9 Vápník mmol/l 1,68 0,06 3,81 4,7 2,51 0,46 3,78 4,8 Amyláza μkat/l 0,87 0,04 4,84 2,44 0,07 2,78 Tabulka 2-3 analyt jednotka průměr SD CV Sigma Amyláza μkat/l 1,22 0,04 2,98 7,1 3,08 0,05 1,57 13,4 ALP μkat/l 1,26 0,02 1,63 12,9 3,70 0,05 1,30 16,2 AST μkat/l 0,77 0,017 2,23 9,4 2,49 0,03 1,22 17,2 ALT μkat/l 0,77 0,017 2,16 9,7 2,01 0,02 1,04 20,2 GMT μkat/l 0,76 0,024 3,16 6,6 3,58 0,04 1,17 17,9 CK μkat/l 2,50 0,09 3,63 5,8 8,48 0,25 3,25 6,5 LD μkat/l 2,51 0,08 3,11 6,8 4,24 0,082 1,94 10,8 pankreatická amyláza μkat/l 0,58 0,026 4,42 4,8 1,66 0,058 3,50 6,0

7 analyt jednotka průměr SD CV Sigma Cholinesteráza μkat/l 94,8 2,34 2,47 8,5 49,87 1,17 2,34 8,9 CK-MB μkat/l 0,67 0,025 3,77 16,95 0,41 2,58 Tabulka 2-4 analyt jednotka průměr SD CV Sigma IgA g/l 1,29 0,04 3,28 7,3 2,35 0,08 3,26 7,4 3,41 0,11 3,13 7,7 IgG g/l 8,29 0,24 2,87 6,3 15,62 0,43 2,76 6,5 IgM g/l 0,62 0,03 4,51 5,8 1,14 0,05 4,46 5,8 1,86 0,07 3,13 8,3 CRP mg/l 13,96 0,56 3,96 6,1 35,55 1,12 3,15 7,6 58,1 1,73 2,98 8,1 RF IU/ml 12,94 0,40 3,11 30,35 0,94 3,08 59,75 1,31 2,19 ASLO IU/ml 110,05 2,70 2,45 193,6 5,39 2,78 233,3 8,49 3,64 HbA1c % 3,04 0,039 1,28 7,8 10,26 0,20 1,96 5,1 Výsledky pro meze detekce a stanovitelnosti, pro horní hranici linearity a pro výtěžnost a bias jsou shrnuty v tabulce č. 3, výsledky pro interference jsou shrnuty v tabulce č. 4 (jako horní hranice, kdy výsledek není ovlivněn interferentem). Tabulka 3 analyt jednotka mez detekce mez stanovitelnosti linearita výtěžnost (%) ALP μkat/l 0,04 0,13 20,0 96,3 CK μkat/l 0,05 0,17 18,0 101,4 CKMB μkat/l 0,033 0, ,9 T Bilirubin μmol/l 0,27 0, ,5 d Bilirubin μmol/l 0,40 1, ,4 Cholesterol mmol/l 0,03 0, ,7 TG mmol/l 0,04 0, ,0 Albumin g/l 0,22 0, ,5 ALT μkat/l 0,021 0,07 11,2 98,3 23

8 analyt jednotka mez detekce mez stanovitelnosti linearita výtěžnost (%) AMS μkat/l 0,03 0, ,8 ASLO IU/ml 4,8 14, ,8 AST μkat/l 0,04 0,13 7,8 99,8 Ca mmol/l 0,04 0,12 4,0 101,1 CB g/l 0,98 2, ,5 CB moč mg/l 4,2 12, ,1 Cl mmol/l 0,2 0, ,0 CRP mg/l 1,55 4, ,5 kreat enz. μmol/l 0,6 1, ,5 kreat Jaffe μmol/l 2,1 6, ,4 Glukóza mmol/l 0,02 0, ,9 GMT μkat/l 0,06 0, ,1 HbA1c % 0,14 0, ,3 HDL Chol mmol/l 0,02 0, ,2 LDL Chol mmol/l 0,03 0, ,4 Cholinesteráza μkat/l 1,75 5, ,9 IgA g/l 0,027 0, ,5 IgG g/l 0,16 0, ,1 IgM g/l 0,007 0, ,8 KM μmol/l 1,6 4, ,7 LD μkat/l 0,09 0, ,6 Močovina mmol/l 0,08 0, ,7 pams μkat/l 0,05 0, ,5 fosfor mmol/l 0,02 0,34 6,5 101,6 RF IU/ml 2,6 8, ,7 24 Tabulka 4 analyt jednotka hemoglobin g/l triacylglyceroly mmol/l ALP μkat/l 7, bilirubin mg/l CK μkat/l CKMB μkat/l T Bilirubin μmol/l x d Bilirubin μmol/l 5 20 x Cholesterol mmol/l 7, TG mmol/l 7,5 x 250 Albumin g/l 7, ALT μkat/l 2, AMS μkat/l 7, ASLO IU/ml

9 analyt jednotka hemoglobin g/l triacylglyceroly mmol/l AST μkat/l 2, Ca mmol/l bilirubin mg/l CB g/l 7, Cl mmol/l CRP mg/l kreat enz. μmol/l 7, kreat Jaffe μmol/l Glukóza mmol/l GMT μkat/l 7, HbA1c % x HDL Chol mmol/l LDL Chol mmol/l Cholinesteráza μkat/l IgA g/l 10 7, IgG g/l 10 7, IgM g/l 10 7,5 750 KM μmol/l 7, LD μkat/l 2, Močovina mmol/l 7, pams μkat/l 7, fosfor mmol/l RF IU/ml Porovnání metod: Korelační koeficienty se pro jednotlivé metody pohybovaly od 0,820 do 1,0. Hodnoty r a hodnoty koeficientů a a b jsou uvedeny v tabulce 5. Grafy, jak bylo zmíněno dříve, nelze vzhledem k prostoru prezentovat. Tabulka 5 Analyt Hodnota r Hodnota a Hodnota b ALP 0,994 1,016 0,001 CK 1,0 1,053 0,01 CKMB 0,996 0,99-0,018 T Bilirubin 0,976 1,072-2,92 d Bilirubin 0,958 1,389 1,66 Cholesterol 0,991 1,005-0,129 TG 0,992 1,0-0,01 Albumin 0,992 0,981 1,83 ALT 0,990 0,966-0,024 AMS 0,994 1,0-0,020 ASLO 0,999 0,958-1,97 25

10 26 Analyt Hodnota r Hodnota a Hodnota b AST 0,994 1,037 0,034 Ca 0,987 1,0-0,085 CB 0,993 0,988-0,89 CB moč 0,996 1,0 9,0 Cl 0,820 1,0 0 CRP 0,994 1,045 0,51 kreat enz. 0,997 1,168-17,8 kreat Jaffe 0,998 1,087-0,90 Glukóza 0,997 1,0-0,20 GMT 0,999 0,984 0,10 HbA1c 0,991 1,010-0,308 HDL Chol 0,994 0,963 0,053 LDL Chol 0,991 0,943 0,340 Cholinesteráza 0,961 1,003-2,63 IgA 0,992 0,901 0,048 IgG 0,992 0,909 0,447 IgM 0,937 1,077-0,011 KM 0,995 0,962 3,00 LD 0,999 0,880 0,034 Močovina 0,996 1,00 0,50 pams 0,991 0,925-0,055 fosfor 0,986 0,923 0,00 RF 0,995 0,927-0,264 Závěr Testované reagencie v kombinaci s testovaným přístrojem vyhovují požadavkům na ně obecně kladeným. Validace proběhla podle současně platného doporučení pro laboratoře klinické biochemie. Pro všechny metody jsou hodnoty sigma pro mezilehlou nepřesnost vyšší než 3 a pohybují se v rozmezí 3,4 20,2. (Podle Westgarda jsou metody se sigma nad 3 ještě vyhovující, metody s hodnotami nad 4,5 jsou naprosto bezproblémové. Hodnoty nad 6 znamenají špičkovou kvalitu metody.) Pod hodnotou 4,5 jsou metody pro stanovení chloridů v séru, kreatininu v séru metodou Jaffé a fosforu v moči. Pro jednu hladinu jsou hodnoty pod 4,5 pro stanovení kyseliny močové, močoviny a glukózy v moči a fosforu v séru. Vlastní přístroj je velmi jednoduchý k obsluze, programové vybavení vyhovuje současným požadavkům. Oceníte zejména jeho spolehlivost a společně s diagnostickými přípravky Lachema i ekonomický provoz. Samozřejmě svou konstrukcí a vlastnostmi je určen pro střední a menší laboratoře. Dále může sloužit jako záložní přístroj ve větších laboratořích, nebo jako doplňkový analyzátor pro specifické metody (např.: imunoturbidimetrické metody). Literatura: Příbalové letáky uvedených metod Manuál pro práci s analyzátorem Flexor-E. Bedřich Friedecký, Luděk Šprongl, Josef Kratochvíla: Validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích J.O. Westgard: Basic Method Validation, 3rd. Edition, 2008, Westgard QC Inc., Madison Materiály CLSI: C24-A3: Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions EP05-A2 : Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods

11 EP06-A: Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach EP07-A2: Interference Testing in Clinical Chemistry EP09-A2: Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples EP10-A3: Preliminary Evaluation of Quantitative Clinical Laboratory Measurement Procedures EP15-A2: User Verification of Performance for Precision and Trueness EP17-A: Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation EP21-A: Estimation of Total Analytical Error for Clinical Laboratory Methods 27