Diplomová práce. Vyhodnocení kvalitativních parametrů nativních ejakulátů u psů

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA ÚSTAV CHOVU A ŠLECHTĚNÍ ZVÍŘAT Vyhodnocení kvalitativních parametrů nativních ejakulátů u psů Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Radek Filipčík, Ph.D. Vypracovala: Bc. Jana Netušilová Brno 2011

2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vyhodnocení kvalitativních parametrů nativních ejakulátů u psů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

4 Na tomto místě bych ráda poděkovala svému vedoucímu diplomové práce Ing. Radkovi Filipčíkovi, Ph.D. za konzultace, cenné rady a odborné vedení v průběhu zpracování diplomové práce. Dále děkuji svým rodičům a příteli, kteří mě podporovali finančně i morálně v průběhu celého studia na této univerzitě. V neposlední řadě bych ráda poděkovala všem majitelům psů, kteří byli ochotni zapůjčit své psy pro uskutečnění odběrů, bez kterých bych nezískala potřebné informace nutné pro zpracování této diplomové práce. Diplomová práce byla řešena s podporou grantu Interní grantové agentury AF MENDELU TP2/2010.

5 Abstrakt Cílem diplomové práce je vyhodnocení objemu, barvy, konzistence ejakulátu, obsahu přimísenin, aktivity a koncentrace spermií u nativních ejakulátu psů při zohlednění věkové a hmotnostní kategorie, typu výživy, ustájení, frekvence, místa a pořadí odběru. Hodnocení bylo provedeno u 23 psů, přičemž u každého psa byly provedeny 3 odběry ejakulátu. V rámci sledovaných ukazatelů byl prokázán statisticky průkazný (P<0,01) vliv věku psů v době odběru a vliv počtu chovaných psů v domácnosti na množství odebraného ejakulátu, respektive na koncentraci spermií. Hmotnost psa souvisela nejen s objemem získaného semene, ale také s aktivitou spermií. Místo a pořadí odběru mělo vztah k délce přípravy psa na odběr. Délka přípravy psa závisela také na formě výživy, kdy psi krmeni pouze granulemi potřebovali průkazně delší čas na přípravu odběru, nicméně jejich ejakulát dosahoval lepších kvalitativních parametrů. Frekvence odběru ovlivňovala koncentraci a aktivitu spermií v ejakulátu. Klíčová slova: pes, ejakulát, spermie Abstract The aim of the thesis is the evaluation of volume, colour, consistence of ejaculate, content of impurities, motility and concentration of spermatozoa in native canine ejaculate with taking into account their age, weight, type of nutrition, stabling, frequence, place and sequence of collection. The samples of the ejaculate were obtained from 23 dogs, three samples of semen collection were collected from each dog. In terms of the observed parameters, the age of dogs at the time of the collection had the significant (P<0,01) influence and the influence of number of dogs which are kept at home on the volume of collected ejaculate, or sperms concentration. The dog weight was not related only to the volume of collected semen, but also with the sperm motility. The place and sequence of the collection had a relation to the lenght of dog preparation for the collection. The lenght of dog preparation depended on the form of nutrition, when the dogs which are fed only with granules needed significantly longer time to prepare for the collection, but their ejaculate had better quality of parameters. Concentration and motility of sperms in the ejaculate were influenced by the frequency of collection. Key words: dog, ejaculate, sperm

6 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Pohlavní orgány samců (Organa genitalia masculina) Varlata (testes) Nadvarlata (epididymy) Chámovod (ductus deferens) Pyj (penis) Předkožka (preputium) Pomocné svaly Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accesoriae) Měchýřkovité žlázy Předstojná žláza Bulbouretrální žlázy Ejakulát Spermie Funkce spermií Stavba spermie Semenná plazma Sekret přídatných pohlavních žláz Vlastnosti a složení ejakulátu... 22

7 3.3 Metody získávání ejakulátu Průběh odběru psa Hodnocení psího ejakulátu Makroskopické hodnocení Objem ejakulátu Barva Pach Cizí přimíseniny Mikroskopické hodnocení Aktivita Motilita Koncentrace spermií ph ejakulátu Stanovení živých a mrtvých spermií Parametry nativního ejakulátu psů MATERIÁL A METODIKA VÝSLEDKY A DISKUSE Hodnocení konzistence, barvy a obsahu přimísenin v ejakulátech psů ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM TABULEK... 75

8 1 ÚVOD Jako téma své diplomové práce jsem si zvolila psy z důvodu jejich zvyšující se obliby u lidí věkově a profesně rozdílných skupin v průběhu několika posledních let. Zaměřila jsem se konkrétně na jednu oblast - na reprodukci psů. Dá se říci, že důležitost a zájem o reprodukci rok od roku stoupá a tato skutečnost se nevztahuje pouze na reprodukci zvířat, ale i na lidskou populaci. Soustředila jsem se zejména na kvalitu psího ejakulátu a spermie v něm obsažených. Bez důkladného vyšetření ejakulátu jednotlivých psů by chovatelé nezjistili, zda jejich vynikající psi jsou schopni plodit potomky, kteří vynikají požadovanými vlastnostmi jejich rodičů. Dávno již pes není zdaleka jen obyčejnou součástí každodenního života mnoha osamělých lidí či rodin v podobě věrného přítele, u kterých až tolik nezáleží na jejich povahových rysech a schopnostech. Existují situace a případy, kdy psi a zejména jejich vlastnosti jsou nenahraditelné a nepostradatelné. Mnohá plemena jsou využívána policií, hasiči, záchranáři při své práci. Ať již pomáhají hledat zmizelé osoby, osoby uvězněné pod sutinami domu, sněhem nebo díky svému vynikajícímu čichu dokáží objevit ukryté drogy. Neméně důležitou roli hrají psi v životě nevidomých lidí či handicapovaných lidí, ať už se jedná o psychické či fyzické postižení. Tito psi jsou speciálně cvičeni již od věku štěněte pro plnění denních úkolů, jako je otvírání ledničky, přinášení částí oblečení, podání telefonu a dalších věcí. V případě nevidomých lidí se psi, využívaní k těmto účelům, stávají náhradníma očima jejich majitelů a mezi nimi a psem se vytváří velmi pevné pouto. Psí vlastnosti jako je oddanost, obětavost, trpělivost a náklonnost se využívají k tzv. canisterapie. Laický překlad tohoto termínu může znít léčba psem. Každý pes však není pro tyto typy prací vhodný a nemá v sobě zakódovány ty potřebné vlastnosti. Právě díky reprodukci je možné zajistit rozšíření popřípadě uchování požadovaných vlastností, a to v podobě genetického materiálu (spermatu) jedinců oplývajících těmito vlastnostmi. Díky metodám používaných při vyšetření ejakulátu jsme schopni určit kvalitu ejakulátu, na které z víceméně větší části závisí úspěšný výsledek procesu oplození. Zvýšená pozornost se věnuje především celkovému počtu spermií v ejakulátu, jejich koncentraci a aktivitě. Výsledky vyšetření mohou sloužit jako podklady pro rozhodování, zda dané sperma použít jako nativní k inseminaci nebo zda jej zmrazit, a tím umožnit jeho použití v případě potřeby i za několik let. 8

9 Ve své práci jsem svoji pozornost proto zaměřila na jednotlivé ukazatele, kterými jsou délka odběru, objem ejakulátu, aktivita a koncentrace spermií a snažila jsem se zjistit, zda jsou tyto ukazatele nějakým způsobem ovlivňovány heterogenními faktory. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo vyhodnotit makroskopické (objem, barvu, konzistenci, obsah přimísenin) a mikroskopické (aktivitu a koncentraci spermií) ukazatele kvality nativních ejakulátu psů při zohlednění věkové a hmotnostní kategorie, typu výživy, ustájení, frekvence, místa a intervalu odběru. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Pohlavní orgány samců (Organa genitalia masculina) Varlata (testes) Stejně jako nadvarlata (epididymy) jsou uložena v šourku (scrotum), tedy mimo tělní dutinu. Šourek je vak, který vznikl vychlípením břišní stěny. Pod kůží se nachází svaloelastická vrtsva (tunica dartos), která je pevně spojená s kůží a v mediální rovině vytváří přepážku rozdělující šourkovou dutinu na dvě poloviny (Kliment a kol., 1983). Na povrchu šourku je kůže porostlá jemnými chlupy, jen u berana a kozla je ochlupení husté. Pro své kontraktilní schopnosti může tunika dartos reagovat na změny teploty prostředí. V chladném prostředí se smršťuje, a tím zmenšuje plochu odparu z povrchu šourku. Naopak v teplém prostředí ochabuje, čímž se odpařovací plocha šourku zvětšuje. Je to termoregulační mechanismus, který udržuje v šourku teplotu o 3-4 ºC nižší než v konečníku. Tato teplota je nutná pro správný vývoj spermií ve varleti (Komárek a kol., 1971). Varlata jsou párovým orgánem ve tvaru rotačního elipsoidu s rozdílnou délkou (Věžník a kol., 2004). Většinou mají zhruba vejčitý tvar, pouze u psa je kulovitý (Kliment a kol., 1983). Jejich základní funkcí je funkce sekreční produkce spermií a funkce inkreční tvorba pohlavních hormonů androgenů (Věžník a kol., 2004). Na povrchu varlat je tenká serózní blanka vnitřnostní pobřišnice, pod níž leží tuhá blána z fibrózního vaziva nazývána bělavá blána (tunica albuginea)(komárek a kol., 1971). Z této vrstvy vychází do nitra parenchymu, který vyplňuje varlata, septa (trabeculae) neboli vazivové přepážky, které rozdělují parenchym na menší úseky (Reece, 1998). Tyto úseky se označují jako pyramidové lalůčky (Komárek a kol., 1971). Lalůčky jsou vyplněné intersticiem, tj. řídkým pojivem a stočenými semenotvornými kanálky, kterých je v každém lalůčku dva až tři (Kliment a kol., 1983). Tyto slepě začínající kanálky jsou velmi jemné trubičky složené v četné kličky (Komárek a kol., 1971). Tloušťka jednoho kanálku se pohybuje od µm, délka od 0,5 do 0,8 m, někdy až 1,5 m. Stěnu semenotvorných kanálků tvoří vnější základní blanka, na kterou se připojuje semenotvorný epitel. Je to vícevrstevný epitel, který obsahuje dva druhy buněk Sertoliho a spermiogenní buňky. (Kliment a kol., 1983). Sertoliho podpůrné buňky jsou somatické buňky, 11

12 které nasedají na bazální membránu a vmezeřují se mezi buňky spermiogenetického epitelu. Vytváří jakousi bariéru, která zabraňuje rekognoskaci autoantigenů spermatocytů a spermatid (Věžník a kol., 2004). Výběžky Sertoliho buněk obklopují spermatidy a spermatocyty a zajišťují intimní kontakt mezi všemi vývojovými stádii spermií. Odtud název podpůrné (Reece, 1998). Svoji sekreční činností produkují tekutinu vyplňující lumen semenotvorných kanálků (Věžník a kol., 2004). Tyto kanálky rozdělují na dvě části, na vnější bazální část, která umožňuje kontakt s intersticiální tekutinou a poskytuje prostor pro zárodečné epitelové buňky, tzv. bazální kompartment. Druhá část je vnitřní, ve které jsou prostory mezi Sertoliho buňkami, které komunikují centrálně s lumenem kanálku, tzv. adluminální kompartment (Reece, 1998). Prostory mezi kličkami semenotvorných kanálků jsou vyplněny řídkým vmezeřeným vazivem, které obsahuje Leydigovy buňky. Těmto buňkám je připisována tvorba pohlavního hormonu (Komárek a kol., 1964). Kromě Leydigových buněk, které se rozmnožují mitoticky a zdržují se ve skupinách okolo krevních vlásečnic, obsahuje intersticiální vazivo také běžné vazivové buňky, nervy a krevní cévy (Kliment a kol., 1983). Varlata se v embryonálním období vyvíjí v dorzální části břišní dutiny, odkud sestupují do šourku. Sestup se uskutečňuje pomocí vazivového pásu, který se upíná na kůži v místě budoucího šourku. U přežvýkavců se sestup uskutečňuje před porodem, u hřebce a kance v čas porodu, u masožravců za kratší či delší dobu po porodu. Může se stát, že na jedné nebo obou dvou stranách varlata do šourku nesestoupí, a v tomto případě hovoříme o abdominálním (břišním) kryptorchizmu, pokud varlata zůstanou v dutině břišní. Pokud zůstanou v tříselném kanálu, mluvíme o kryptorchizmu ingvinálním (tříselném)(kliment a kol., 1983) Nadvarlata (epididymy) Na povrch varlat intimně nasedají nadvarlata. Nadvarle (epididymis) je tvořeno víceméně jedním stočeným kanálkem (ductus epididymis). Lze na něm rozeznat tři části. První částí je hlava nadvarlete (caput epididymis)(věžník a kol., 2004). Tvoří ji vývodných kanálků, které vystupují z varletní sítě a opouštějí varle na jednom jeho pólu. Tyto kanálky se postupně slévají do společného nadvarletního vývodu, jehož husté meandrovité kličky vytvářejí tělo a ocas nadvarlete (Komárek a kol., 1971). Sem se spermie a varletní tekutina dostávají skrze vývodné kanálky z rete testis (Reece, 1998). Dalšími částmi je již zmíněné tělo (corpus 12

13 epididymis) a ocas (cauda epididymis) nadvarlete. Proximální část hlavy nadvarlete je významně aktivní, jak sekrečně tak resorbčně a zabezpečuje další postup spermií kinocíliemi cylindrického epitelu (Věžník a kol., 2004). Kinocílie kmitají směrem ke kanálku nadvarlete (Kliment a kol., 1983). Dochází zde ke značné resorpci tekutiny ze semenotvorných kanálků. Hlavní funkce nadvarlete je však především ve shromažďování a ukládání spermií do zásob (Reece, 1998). Zde také spermie zcela dozrávají a získávají schopnost pohybu (Věžník a kol., 2004). Spermie si zde uchovávají životnost a oplozovací schopnost především díky tomu, že je tu nižší hladina kyslíku a vyšší hladina oxidu uhličitého. Látkový metabolismus spermií je tedy snížen na minimum (Komárek a kol., 1971) Chámovod (ductus deferens) Nadvarlata přechází do chámovodu (ductus deferens), který je tvořen sliznicí, svalovinou a serozou. Po výstupu z ocasu nadvarlete prochází šourkovou dutinou, tříselným kanálkem, břišní dutinou a dostává se do pánevní dutiny až na dorzální plochu močového měchýře (Věžník a kol., 2004). V břisní dutině je spolu s varletní tepnou, žílou, nervem, lymfatickými cévami a svalem, vnitřním zdvihačem varlete, (musculus cremaster internus) obalen útrobním listem poševního obalu (tunica vaginalis propria). Tento celý útvar se nazývá semenný provazec. Po průchodu semenného provazce vnějším a vnitřním prstencem tříselného kanálu se oddělí chámovod a vstoupí do pánevní části uretry (Reece, 1998). Zakončení chámovodu vytváří žláznatý úsek nazývaný jako ampule chámovodu, která vylučuje sekret stimulující metabolismus spermií (Věžník a kol., 2004) Ampule chámovodu je z hlediska druhu a velikosti rozdílná. Nevyskytuje se u kance a psa (Reece, 1998) Pyj (penis) Pyj je orgánem, který svojí anatomií zabezpečuje přenos spermatu do pohlavních cest samice (Věžník a kol., 2004). Kořen penisu odstupuje pomocí dvou ramen od kaudální hrany sedací kosti a přechází v tělo penisu zakončené žaludem (Reece, 1998). Právě žalud pyje (glans penis) udává rozmanitost ve tvaru pyje. Glans penis je nejvýrazněji utvořen u hřebce a psa. Naopak žalud pyje býka a malých přežvýkavců je nevýrazný. Uprostřed žaludu pyje je jamka (fossa glandis), kde vyčnívá výběžek močové trubice. U psa je glans penis rozdělen na dva úseky, jež jsou vyztuženy pyjovou kostí (os penis). Kaudálněji uložená část žaludu tvoří uzly 13

14 (bulbus glandis). Tyto uzly mohutně zduří pro kopulaci (Věžník a kol., 2004). Zvětšení způsobí delší zadržení penisu v pochvě feny během koitu (Reece, 1998). Nervové centrum pro erekci se nachází v nejkaudálnější části spinální míchy (Věžník a kol., 2004). Erekce je způsobena zvýšením tlaku krve uvnitř dutinek v topořivých tělesech penisu a je výsledkem většího přítoku krve než odtoku (Reece, 1998). Pomocí funkčních změn při erekci lze rozdělit penis na několik typů. Zvětšení a prodloužení penisu při erekci je založeno buďto na překrvení kavernózních topořivých těles. Tento typ topořivých těles se nachází u psa a hřebce. Nebo je zvětšení založeno na vyrovnání esovitého zakřivení penisu bez jeho významného zbytnění, jako je to u přežvýkavců. U kance jsou tyto typy na jedné stejné úrovni, tzn., že při erekci dochází jak k zbytnění penisu, tak k vyrovnání zakřivení. Ke konečné erekci a zduření penisu u psa dochází až po jeho zasunutí (Reece, 1998) Předkožka (preputium) Předkožka je ochranný obal kraniálního konce pohlavního údu (Kliment a kol., 1983). Je to kožní pouzdro v podobě toulce, do kterého je pyj vtahován po koitu pomocí hladkosvalového zatahovače pyje (Komárek a kol., 1971). Uvnitř je předkožka vystlána sliznicí, která obsahuje velké mazové žlázy a rozvětvené klubkovité tubulózní žlázy. Smíšený produkt těchto žláz spolu s odloupnutými buňkami předkožky vytváří předkožkový maz (smegma) specifického zápachu (Kliment a kol., 1983) Pomocné svaly Přímou souvislost se samčími pohlavními orgány mají také pomocné svaly. M. urethralis prstencovitě obklopuje pánevní část močové trubice. Je to vůlí ovladatelný uzávěr močové trubice, který zabraňuje odtoku moči z močového měchýře. M. bolbocavernosus je pokračováním předchozího svalu. Nachází se za Cowperovými žlázami, při postupném stahování od kaudálního ke kraniálnímu konci vytlačuje obsah močové trubice. M. ischiocavernosus je silný krátký sval, který přitlačuje kořen pohlavního údu k pánvi. Zdvihá pohlavní úd a tím brání odtoku žilné krve z topořivých těles. Mm. ischiourethrales jsou tři svaly, které vytahují močovou trubici z pánve a při erekčním 14

15 hromadění krve v topořivých tělesech pohlavního údu tlačí na Cowperovy žlázy. M. retractor penis je sval, který je také ovladatelný vůlí zvířete. Zatahuje pohlavní úd po koitu do předkožky (Kliment a kol., 1983) Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accesoriae) Jsou uloženy v pánevní oblasti (Věžník a kol., 2004) Jsou tvarově i velikostně druhově rozdílné a některé mohou u některých živočichů chybět. Jedná se o ampule chámovodu, měchýřkovité žlázy, které jsou u hřebce označovány jako semenné váčky, dále prostata a bulbouretrálnní žlázy (Reece, 1998) Měchýřkovité žlázy Jsou uloženy na horní ploše močového měchýře vedle ampulí chámovodu, s nimiž mohou ústit jednak společně, jako je to v případě býka a hřebce, nebo samostatně jako je to u kance. U psa a kocoura nejsou vyvinuty. Sekret těchto žláz obsahuje cukry, které jsou zdrojem energie pro spermie, dále bílkoviny, volné AK, kyselinu mléčnou a další (Věžník a kol., 2004) Předstojná žláza Neboli prostata je svalově žláznatý orgán, který obepíná močovou trubici (Věžník a kol., 2004). Mají ji všechna domácí zvířata, nápadně je utvářena především u psa. Její zvětšení může být příčinnou obstrukce průtoku močí urethrou (Reece, 1998). Právě benigní hyperplazie prostaty je velmi běžná u starších psů (Cochran et al., 1981) Bulbouretrální žlázy Jsou párově založeny žlázy u močové trubice (Věžník a kol., 2004). Jsou uloženy nejkaudálněji ze všech přídatných pohlavních žláz (Reece, 1998). Sekret těchto žláz je zásaditý, tvoří ochranu spermií tím, že neutralizují zbytky kyselé moči v uretře (Věžník a kol., 2004). Tyto žlázy nejsou opět u psa vytvořeny (Reece, 1998). 15

16 3.2 Ejakulát Ejakulát je viskozní, nažloutlá šedobílá tekutina, která se skládá ze dvou základních částí. Z buněčné části, tj. spermií a z části tekuté čili semenné plazmy (Marvan a kol., 2007). Vytváří se od doby pohlavního dospívání ve varletním ústrojí (spermie) a v přídatných pohlavních žlázách (semenná plazma) samců (Kliment a kol., 1983). Největší podíl ejakulátu tvoří voda (90-98% celkové váhy). Z anorganických látek obsahuje Na, K, Cl, P, Ca a S. Z organických zase bílkoviny, tuky, cukry (Komárek a kol., 1964). Semeno má druhově specifickou barvu, pach, konzistenci. Také množství ejakulátu při ejakulaci druhově značně kolísá. Přežvýkavci mají obecně malý objem ejakulátu, avšak vysokou koncentraci spermií. Na rozdíl všežravci, šelmy a lichokopytníci mají poměrně velký objem ejakulátu s nízkou koncentrací spermií (Marvan a kol., 2007) Spermie Buněčná část tedy spermie jsou nejdůležitější složkou ejakulátu (Jelínek, Koudela a kol., 2003). Jsou to samčí pohlavní buňky vytvářející se v semenotvorných kanálcích ( Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Na jejich objevení se podílel Leeuwenhoekův žák Ham v roce Sám Ham samotné spermie považoval za jakési primitivní zárodky, které v ejakulátu parazitují. Až doposud je občas používán název spermatozoon (latinský název animalculum seminis ) tzv. semenná zvířátka. Teprve až v roce 1780 Spallanzani pomocí umělé inseminace dokázal prokázat oplozovací schopnost ejakulátu. Tuto schopnost však nepřisuzoval samotným spermiím, ale semenné plazmě. Až teprve v roce 1824 Prévost a Dumas dokázali, že oplozovací schopnost mají právě spermie (Gamčík, Kozumplík a kol. 1992). Doba nutná pro kapacitaci spermií je 7 hodin (Mahi and Yanagamachi, 1976). Pohyblivost a schopnost oplození jsou hlavními společnými znaky. Tvar a velikost spermií jsou druhově rozdílné. Velikost spermií se pohybuje v rozmezí od 50 do 80 µm. Díky přítomnosti sexchromozomu jsou v hmotnosti nepatrné rozdíly. Spermie, které mají malý heterochromozom Y (androspermie) jsou lehčí než spermie s větším heterochromozomem X (gynospermie) (Jelínek, koudela a kol., 2003) 16

17 Funkce spermií Fyziologické vlastnosti spermií jsou dány jejich morfologickou strukturou a cytochemickým složením, které podmiňují tři základní funkce: 1, Svým aktivním pohybem, ale i za pomoci děložních stahů, se dostávají na místo oplození vajíčka do horní třetiny vejcovodu. 2, Aktivně pronikají do oocytu II. řádu přes obaly (zonu pellucidu a coronu radiatu) 3, Přenášejí otcovský dědičný materiál na potomka (Kliment a kol., 1983) Stavba spermie Nepoškozená normální spermie se skládá ze dvou hlavních částí hlavičky a bičíku. a) Hlavička: Ze stran je zploštělá, na apikálním konci širší a v místě spojení s bičíkem se zužuje (Kliment a kol., 1983). Základním materiálem hlavičky je jádro (nukleoplazma), ve kterém se nachází otcovský dědičný materiál (chromozomy). Chromatin je homogenně rozprostřený v jádře a je uzavřen jadernou membránou. Jádro se po proniknutí spermie do vajíčka při oplození rozpadne na chromatinová vlákna. Další částí hlavičky je akrozom. Je to cytoplazmatický útvar, který jako čepice pokrývá přední polovinu hlavičky a je ukončen ekvatoriálním segmentem (Rob, Stehlík, Nechuta, 1980) Je dobře barvitelný (Jelínek, Koudela a kol., 2003). Skládá se z vnitřní a vnější membrány a uvnitř obsahuje akrozomový materiál. (Rob, Stehlík, Nechuta, 1980). Je složený z mukopolysacharidů a obsahuje velké množství enzymů. Tyto enzymy zejména hyaluronidáza a akrozin mají nepostradatelnou roli při pronikání spermií do vajíčka a při jeho oplození. Obsahuje také fruktozu, manózu, galaktozu, lipidy, kalium a kyselou a alkalickou fosfatázu. Největší význam má již zmíněná hyaluronidáza, která je s největší pravděpodobností lokalizována v blízkém povrchu hlavičky. Koncentrace tohoto enzymu je vysoká ve spermiích býka a králíka, v menší míře ve spermiích kance, psa a muže. Spermie ptáků hyaluronidázu neobsahuje vůbec (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Celá hlavička spermie je dlouhá 5-10 µm a její utváření je opět rozdílné (Jelínek, Koudela a kol., 2003) Hlavičky spermie kance, hřebce a psa jsou si ve svém tvaru podobné. Mají téměř pravidelný oválný tvar. Ve srovnání s hlavičkou spermie býka jsou avšak o něco málo užší, kratší a na 17

18 bázi hrubší (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Samotný tvar hlavičky je dán tvarem kondenzované nukleoplazmy. Výjimku tvoří mírně zdvižený a zhrubnutý apikální okraj, který je podmíněný zhrubnutím akrozomu. Tento útvar pojmenovaný apikální tělísko byl zjištěň při vyšetřování spermií býků, beranů a králíků. Na rozdíl od hlaviček spermií psů, hřebců a zajíců, kde toto zhrubnutí chybí (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). I přesto, že tvarová variabilita se vyskytuje nejen u různých druhů zvířat, ale také u jedinců v rámci jednoho druhu, tedy u jednotlivých samců, je s největší pravděpodobností tvar hlavičky geneticky kódován (Věžník a kol., 2004). Zadní část hlavičky pokrývá postakrozomální čepice (pars posterior), která obaluje zadní část jádra (Kliment a kol., 1983). Těsně přiléhá k jaderné i zevní cytoplazmatické membráně (Rob, Stehlík, Nechuta, 1980). Na bazální části hlavičky lze pozorovat konkávní vchlípení tzv. implantační rýhu. Do této rýhy je vklíněna hlavice bičíku a společně tvoří kloubní spojení hlavičky a bičíku spermie (Věžník a kol., 2004). b) Bičík Je tvořený 4 základními oddíly. Prvním oddílem je nejkratší část tzv. krček. Na něj navazuje spojovací (mitochondriální) oddíl, dále hlavní a celý bičík uzavírá koncový oddíl (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Délka celého bičíku se pohybuje od 50 do 70 µm (Jelínek, Koudela a kol., 2003). Bičík umožňuje spermiím pohyb a zprostředkovává jejich transport na místo oplození. Důležitou roli při tomto procesu má mitochondriální aparát, který tvoří energii (ATP adenozintrifosfát) a komplex axiálních vláken, kde se vytvořená energie přeměňuje na energii mechanickou (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Krček (centriolou - implantační oddíl) je z hlediska struktury a vývoje nejsložitější částí celého bičíku. Základ krčku tvoří 2 za sebou uspořádané centrioly (proximální a distální) (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Z proximálního centriolu je tvořena hlavice bičíku (Věžník a kol., 2004). Spojovací (mitochondriální) oddíl je charakterizován velkým počtem mitochondrií (Jelínek, Koudela a kol., 2003). Tyto mitochondrie tvoří pravotočivou šroubovici o závitech. Jedna mitochondrie tvoří přibližně tři čtvrtiny závitu (Věžník a kol., 2004). Distálním směrem je tento oddíl ohraničený Jensenovým prstencem, který se po podélných 18

19 řezech jeví jako dva rovnoměrné trojúhelníky (Saacke, Almquist, 1964). Podkladem mitochondriálního oddílu a dalších oddílů bičíku je tzv. komplex osových vláken. V jeho středu jsou dvě dutá vlákna tzv. mikrotubuly. Ostatní vlákna jsou uspořádána do dvou koncentrických kruhů (Gamčík, kozumplík a kol. 1992). Vnitřní kruh je tvořen z devíti dvojtých vláken tzv. dublet. Jedno vlákno je vždy plné a druhé duté. První plné vlákno je označováno jako element A a druhé duté vlákno jako element B (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Z každého elementu A vybíhají směrem k elementu B sousední dublety dvě vztyčná ramena. Ramena jsou tvořena peptidy (dynein) s ATPázovou aktivitou. Uvolněná energie je přeměňována na bílkoviny (tubuliny) kontaktních vláken (Věžník a kol., 2004). Soubor osových vláken (dvě centrální mikrotubuly a 9 dublet) se nazývá axon. Vnější kruh tvoří opět devět vláken, která jsou vždy plná a o mnoho hrubší než vlákna předchozí. Nazývají se chordy (hladké). Jejich hrubost klesá distálním směrem (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Chordy jsou tvořeny z bílkovin s nízkou molekulární hmotností a obsahují poměrně velké množství triglyceridů. Aminokyselinové složení bílkovin je rozdílné od doposud známých kontraktivních bílkovin (Pedersen, Fawcett, 1976, Baccetti a kol., 1973). Hlavní oddíl také označován jako hladká část bičíku, nemá výrazné rozdíly ve stavbě, ale je kryta strukturálně zajímavou fibrozní pochvou, která je složena ze dvou longitudinálních elementů. Tyto elementy probíhají paralelně s osovými vlákny (Věžník a kol., 2004). Z elementů oběma směry vybíhá řada ramen, které obepínají osová vlákna a hladké chordy (Věžník a kol., 2004). Úkolem fibrozní pochvy je zabezpečit soudržnost osových vláken, jejich pevnost a pružnost při kmitání bičíku (Hancock, 1966). Pružnost zajišťuje pomocí své tvarové paměti (Věžník a kol., 2004). Hlavní oddíl je nejdelší část bičíku a měří 40 až 50 µm. Koncový (termální) oddíl se nachází v nejdistálnější části bičíku a měří kolem 4 µm (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976) Osová vlákna jsou obklopena pouze cytoplazmatickou membránou. Axon má rozdílnou strukturu. V dubletech je element A stejně jako element B dutý, takže axon je tvořen dvojicí mikrotubul (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Celá spermie je kryta cytoplazmatickou membránou (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Cytoplazmatická membrána je nepřerušovaná, dvouvrstevná, acidorezistentní, permeabilní a velmi citlivě reaguje na změnu osmotického tlaku. Je bohatá na cystin, arginin a histidin 19

20 (Kliment a kol., 1983). Hlavním úkolem cytoplazmatické membrány je chránit spermie před nepříznivými vlivy vnějšího prostředí a zároveň permeabilita cytoplazmatické membrány umožňuje látkovou výměnu spermií. Poznatek, že cytoplazmatická membrána u živých spermií nepropouští některá barviva jako je eozin a fluorochromy, dal možnost vzniku metodě vitálně letálního barvení, díky které lze rozlišovat mrtvé a živé spermie. Dalším důkazem, že je spermie mrtvá, je zvýšení permeability cytoplazmatické membrány spermie (Jelínek, Koudela, 2003). Tab. 1: Rozměry spermií (µm) Hlavička spermie kanec býk hřebec králík pes muž délka 8,73 9,11 6,27 8,46 6,49-7,06 4,0-5,0 šířka 4,63 5,05 3,21 4,7 3,77-4,46 2,5-3,5 Bičík spermie kanec býk hřebec králík pes muž spojovací část Hlavní část 10 14,8 8, , , ,5-40 Délka celé spermie 48,15 68,9-73,9 57,55-59,7 54,2 67,5-68,1 47,5-51,5 (Věžník a kol., 2004) Semenná plazma Semenná plazma je tvořena sekrety přídatných pohlavních žláz a na jejím složení se do jisté míry podílí i tekutina, která má svůj původ ve varleti, nadvarleti, chámovodu a v močové trubici (Marvan a kol., 2007). Tvorba semenné plazmy v přídatných pohlavních žlázách není plynulá, tvoří se a uvolňuje se reflektoricky ve chvíli odběru spermatu. 20

21 Její množství z velké části závisí na produkci testosteronu a na stupni pohlavního podráždění (Kliment a kol., 1983). Semenná plazma je tekutá složka ejakulátu specifického množství a barvy, konzistence a rozdílného ph, které se pohybuje v rozmezí od 6,2 až 7,5 (Jelínek, Koudela a kol., 2003). Semenná plazma podněcuje spermie k pohybu, poskytuje spermiím ochranu před nepříznivými vlivy prostředí. Obsahuje látky, které spermie využívají jako zdroje energie, a u zvířat s intrauterinním typem ejakulace jako má hřebec, kanec, pes tvoří velký objem ejakulátu prostředí. Tato vlastnost slouží pro pasivní transport spermií dělohou a relativně dlouhými děložními rohy samic ( Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Obsahuje minerální látky, bílkoviny, cukry, kyselinu citronovou a askorbovou a také velké množství enzymů. Mezi první enzymy patří kyselá a alkalická fosfáza. Kyselá fosfáza se vytváří v prostatě, a proto její vysoké hladiny byly zjištěny u druhů, kde sekret prostaty tvoří podstatnou část ejakulátu. Jako je tomu například u psů a mužů. Kyselá fosfáza je účinná při ph 5,5, kdy katalyzuje přeměnu fosfátu jak z betafosfoglycerolu, tak fosfokreatinu v glukozu. Alkalická fosfáza pochází ze semenných váčků a optimum její aktivity je při ph 9,0, i když je značně aktivní již při hodnotě ph 7,0. Alkalická fosfáza se podílí na vytváření fruktozy z krevní glukozy. Dalšími enzymy jsou 5-nukleotidáza, pyrofosfáza a kataláza, která bývá zjišťována v celém ejakulátu, který je kontaminován bakteriemi a je přítomen hnis, krev či epitel. Obsah katalázy je tedy podkladem pro hodnocení hygienické kvality odběru semene (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Semenná plazma také obsahuje biologicky aktivní složky například prostaglandiny, estrogeny a androgeny. I když může dojít k oplození spermií, které se nesetkaly se semennou plazmou, mají spermie v semenné plazmě větší oplozovací potenciál. Jak již bylo zmíněno, je v semenné plazmě několik prostanglandinů a má se za to, že napomáhají oplozování dvěma způsoby. Za prvé reagují s hlenem sliznice krčku a upravují jej pro průchod spermií. Za druhé mohou způsobovat kontrakce hladké svaloviny (Reece, 1998). Podíl semenné plazmy na celkovém objemu ejakulátu je rozdílný (Jelínek, Koudela a kol., 2003). U nižších živočichů a ptáků je podíl semenné plazmy na celkovém objemu malý oproti většině savců, u kterých semenná plazma tvoří až 70-98% ejakulátu (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). U býků se semenná plazma na celkovém objemu ejakulátu podílí 90-95%. U berana a kozla díky vysoké koncentraci spermií v ejakulátu je to jen 70-75%. Největší podíl semenné plazmy je u hřebce, kance a psa. Celých 95-98%. U psa se často třetí frakce nezachytí celá. U ptáků je převážná část ejakulátu tvořena spermiemi z důvodu toho, že u ptáků nejsou vyvinuty 21

22 přídatné pohlavní žlázy s výjimkou malých kloakálních žláz (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976) Sekret přídatných pohlavních žláz Jak již bylo zmíněno, semenná plazma je tvořena sekrety přídatných pohlavních žláz i vývodných cest. Prvním sekretem je sekret nadvarlat, který je řídký a čirý. Tento sekret obsahuje velké množsví K iontů a oxidu uhličitého. Chudý je však na ionty Na a Cl, a také na fruktozu a kyselinu citronovou. Hodnota ph sekteru nadvarlat je 5,6-6,6. Druhým sekretem, který se podílí na složení semenné plazmy, je sekret ampulí chámovodu. Tento sekret má ph 6,0 a u psa a kance nejsou ampule chámovodu téměř vyvinuty. Velmi významný je sekret prostaty. Je to řídká, průzračná kapalina s výjimkou králíka (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Na celkovém objemu ejakulátu se sekret prostaty podílí různou měrou. U býka ze 4-6%, u berana 2-3%, u hřebce 25-30%, u kance kolem 30%, u mužů je to v rozmezí od 13-32% a nejvíce se podílí u psa, kde tvoří 85-90% objemu ejakulátu. PH sekretu prostaty je druhově opět rozdílné. U býka, muže a psa je mírně kyselé, kolem 6,5. U hřebce se pohybuje ph kolem 7-7,2 a kance 7-8. Chemické složení sekretu je více prozkoumáno u muže a psa než u ostatních hospodářských zvířat. Sekret prostaty psa: 1% bílkovin, 30-40% lipidů, celkový dusík je z 50-60% vázán v bílkovinách, z 20% v polypeptidech a z 10-15% v nebílkovinných sloučeninách. Přítomnost volných AK byla zjištěna u muže, psa, ale i býka a nejvíce v krysí prostatě. V sekretu psa bylo také zjištěno méně než 30 mg% k citrónové. Sekret prostaty psa obsahuje na 100 ml asi 28 K.A.j. kyselé fosfatázy. U dospělého muže je to několikanásobně více, až K.A.j. (Mann, 1954). Zvláštností u sekretu prostaty je také její vysoký obsah Zn (zhruba kolem 60mg%). Tímto faktem se odlišuje od ostatních tělních tekutin. U muže, psa, králíka a morčete byla v prostatě zjištěna i přítomnost adrenalinu (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976) Vlastnosti a složení ejakulátu Během ejakulace dochází k vypuzování zralých spermií z ocasu nadvarlete a ampule chámovodu do vývodných pohlavních cest. Zde se setkávají se sekrety přídatných pohlavních 22

23 žláz a v tomto okamžiku dochází k vlastnímu pohybu spermií a jejich naředění. Proces ejakulace neprobíhá u všech druhů stejně rychle. U přežvýkavců, hlodavců, ptáků vrcholí ejakulační reflex jednorázovou ejakulací, která trvá 2-4 sekundy. U kance, hřebce a masožravců dochází k ejakulaci fázové, která trvá od 2 do 20 minut. U hospodářských zvířat dochází k tzv. bleskové ejakulaci, při které se tvoří ejakuláty s relativně malým objemem a vysokou koncentrací spermií. Na druhé straně samci s dlouhou dobou ejakulace produkují ejakuláty s velkým objemem a nízkou koncentrací spermií (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Při ejakulaci může být sperma produkováno v tekuté nebo polotekuté formě. Ejakulát psa, přežvýkavců a ptáků má charakter tekutý. Na rozdíl od spermatu kance, hřebce, králíka, hlodavců a hmyzožravců obsahuje navíc hlen či rosolovitá zrna, která tvoří po kopulaci v pohlavních orgánech samice zátku (bouchon vagina). Zátka brání zpětnému výtoku semene (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Ejakulát psa je relativně řídký a skládá se ze tří frakcí. První frakce tzv. předspermiová je většinou tvořena sekrety bulbouretrálních žláz, jejichž úkolem je úprava ph uretry (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Jedná se o průhlednou, vodnatou tekutinu. Objem této frakce je 0,25 až 2 ml (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Druhá spermiová frakce je tvořena sekrety nadvarlete, z tohoto důvodu je bohatá na spermie (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Objem druhé frakce kolísá od 0,5 až 5 ml (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Průměrná délka vypuzování této frakce může být kratší při odběru spermatu do umělé vagíny než při ručním odběru (Christiansen, 1984). Poslední pospermiová frakce v rozmezí objemu od 3 do 40 ml obsahuje sekret z prostaty. Objem každé výše uvedené frakce se mění dle velikosti a plemenné příslušnosti psa (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976). Psí a kocouří ejakulát neobsahuje fruktozu a kyselinu citronovou, protože těmto živočichům scházejí měchýřkovité žlázy (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). 3.3 Metody získávání ejakulátu Metod, kterými je možné získat ejakulát, je poměrně velké množství. Přehled nejvhodnějších metod pro jednotlivé druhy hospodářských zvířat je uveden v tabulce 2. 23

24 Tab. 2: Metody získávání ejakulátu druh býk Metoda získávání umělá vagína, elektroejakulace, masáž měchýřkovitých žláz (ojediněle) beran, kozel umělá vagina, elektroejakulace kanec hřebec pes kožešinová zvířata králík kohout kačer umělá vagína, manuální metoda, elektroejakulace umělá vagína masturbace penisu, umělá vagína, elektroejakulace masturbace penisu, elektroejakulace umělá vagína kondom fixovaný na kloaku, masáž mělké části břicha, elektroejakulace elektroejakulace, masáž mělké části břicha (Gamčík, Kozumplík a kol., 1976) Průběh odběru psa Psi jsou sexuálně aktivní po celý rok. Možné vlivy sezóny jsou minimální. U většiny plemen je předpokládaný nástup pohlavní dospělosti u psů průměrně 0-2 měsíce dříve než u fen, často ve věku 9-12 měsíců ( Stabenfeldt and Shille, 1977). Nejvíce běžnou metodou pro odběr ejakulátu u psa je ruční stimulace. Za ideálních podmínek je tato procedura vykonávána v přítomnosti hárající feny. Je nezbytné, aby jakékoliv rozptylování nebo postupy, které by měly vést k úzkosti, byly eliminovány nebo minimalizovány. Strach a bolest neumožní psu dosažení úplné erekce a ejakulace. U plachých psů lze pro zlepšení kvality ejakulátu použít před odběrem hru s pánem. Z počátku je psí penis silně masírován přes předkožku na úrovni bulbu glandis až do okamžiku částečné erekce. Předkožka se rychle stáhne za bulbus glandis a na penis je v tomto místě stále vyvíjen pevný tlak, a to stlačením penisu mezi ukazováčkem a palcem (Kutzler, 2005). Pokud je ten, kdo odebírá pravák, není vhodné, aby prováděl odběr z levé strany, držel psí penis pravou rukou a sběrnou nádobu v levé. Také není nutné manipulovat s penisem tam a sem. Toto počínání může být příčinou ztráty erekce. Vzhledem ke kontrakcím svalů močové trubice je zabráněno žilnému návratu z kavernozního 24

25 těla penisu. Krev zůstávající v dutinách kavernozní tkáně způsobuje zduření bulbus glandis a zvětšování (prodlužování) penisu. V návaznosti na vývoj úplné erekce se může pes pokusit demonstrovat svázání tím, že zvedne končetinu přes pravou paži odběratele (je-li odběratel pravák), ztopořený penis je otočený o 180º kaudálně. Odběratel by nadále měl udržovat tlak za bulbus glandis a jemně vytahovat penis kaudálně od psa. Otočení o 180º je možné díky zkroucení penisu těsně za bulbus glandis. Penis je v této části velmi elastický a kroucení nezpůsobuje žádné potíže (Grandage, 1972). Erekce začíná ihned po vytvoření tlaku za bulbus glandis. Následná ejakulace je způsobena stimulací sympatitických nervů penisu. Spermie a prostatická tekutina jsou vypuzovány peristaltickými kontrakcemi svalů močové trubice (Kutzler, 2005). Příležitostně může dojít k obrácení kůže na vnější vrstvě předkožky dovnitř a tento stav může způsobovat psovi bolest. V tuto chvíli pes potřebuje naši pomoc. Aplikací lubrikantu kolem otvoru předkožky, zabráníme přilepování se suché sliznice penisu a tím předejdeme obrácení předkožky (Kutzler, 2005). Odběr ejakulátu od psů je ovlivněn potřebou umělého oplodnění či kryokonzervací. Příležitostně, i když jsou k dispozici obě dvě pohlaví a fena je ve správné fázi estrálního cyklu, je požadováno umělé oplodnění, a to v důsledku přítomnosti vaginálních anomálií u fen (úzká vagína, vaginálně-vestibulární stažení, vaginální septa, hyperplazie). Více běžné je však umístění psů a fen odděleně ve vzdálených místech a dochází pouze k transportu ejakulátu psa. Takový transport je méně nákladný a méně stresující než přeprava psa nebo feny. Jak již bylo zmíněno, psí sperma je běžně sbíráno ke kryokonzervaci, která umožňuje majitelům psa zachovat genetický materiál jejich psa a umožňuje rozmnožování psa po té, co již není plodný nebo již zemřel (Kutzler, 2005). U fen inseminovaných čerstvě odebraným spermatem může být výše plodnosti na stejné úrovni jako při přirozené plemenitbě. V rozsáhlých studiích několika plemen bylo zjištěno, že správné načasování takovéto inseminace zajistilo až 84% úspěšného oplodnění (Linde-Forsberg and Forsberg, 1989). Při inseminaci se celé či pouze část frakcí bohatých na spermie deponuje do popředí pochvy kolem dorzálně-mediální rýhy pomocí plastových inseminačních pipet a stříkaček. Poté je doporučeno nadzdvihnutí zádě feny a ruční stimulace genitálií (Foote, 1964, Concannon and Battista, 1989). Přestože každý vzorek odebraného spermatu by měl být hodnocen, alespoň tedy progresivní pohyb vpřed za hlavičkou, celkový počet spermií a morfologie, před tím, než se použije pro umělé oplodnění nebo kryokonzervaci, jsou často veterináři nuceni sami odebírat psí sperma pro tyto účely. Starším psům, psům, kteří nebyli použiti k chovu několik 25

26 let, psům, kteří mají zaznamenány v minulosti neplodné chovy či malé velikosti vrhů, by měl být ejakulát hodnocen před každým dalším chovem. U psů s abnormální předkožkou, hematurií, krví v ejakulátu nebo jakýchkoliv jiných příznaků spojených s onemocněním prostaty, by měl být odebrán vzorek spermatu s podrobnějším zájmem o třetí frakci. Pouze první a druhá frakce psího ejakulátu jsou potřebné pro sperma používané pro kryokonzervaci a umělé oplodnění. Nicméně všechny tři frakce by měly být hodnoceny, jestliže jsou psi určeni k chovu nebo z důvodu zjevných důkazů reprodukčních chorob (Kutzler, 2005). Ve všech případech, kdy je v otázce plodnost, je důležité, aby byla ejakulace kompletní (Kutzler et al., 2003). Materiály potřebné pro odběr spermatu u psů závisí na používaných metodách a úrovni znalostí odběratele s tímto postupem. Ke shromáždění spermatu lze použít dvě sterilní zkumavky. Jednu pro zachycení první a druhé frakce a druhou zkumavku pro frakci třetí. Začátečníci mohou využít inseminační kužel, ke kterému je připojena 15 ml sterilní zkumavka, která eliminuje riziko, že žalostně málo kapek z frakce bohaté na spermie, bude ztraceno během ejakulace. Při odběru psího spermatu jsou velmi často používány latexové kužely (Freshman, 2002). Hlavní nevýhodou při používání latexových inseminačních kuželů je potřebná důkladná hygiena mezi jednotlivými odběry psů, včetně odstranění všech zbytků dezinfekčních prostředků a vody. Mimo toho, Althouse a kol. zjistili, že kontakt psího spermatu s latexovými rukavicemi po dobu 1 minuty má nepříznivý vliv na pohyblivost spermií. Zatímco kontakt spermií s vinylovými rukavicemi nebo pudrem měl minimální vliv na pohyblivost spermií (Althouse et al., 1991). Při odběru spermatu má pozitivní vliv přítomnost hárající feny. Přítomnost feny v estru zvyšuje pravděpodobnost, že nervozní psi či psi bez zkušeností s kopulačním aktem, budou ejakulovat při pokusu odběru spermatu. Nicméně i přítomnost submisivní feny v jakékoliv fázi estrálního cyklu může být užitečná. Komerčně dostupné jsou i syntetické hormony hárající feny nebo estrální poševní sekret od zdravé feny. Od feny negativní na Brucelu může být sekret zachován do gázové houby v mrazáku pro budoucí použití. Tyto feromony mohou být použity na gázu nebo na kořen ocasu. Sterilní bezspermický ve vodě rozpustný lubrikant by měl být aplikován na sliznici penisu, a to zejména za bulbus glandis po odběru spermií, aby se zabránilo inverzi předkožky. Odebrané sperma je třeba chránit před náhlými změnami teploty, vodou, desinfekčními prostředky a saponáty. Psí sperma není tak náchylné k chladovému šoku jako spermie jiných druhů (například skotu, koní), ale teplem mohou být spermie šokovány velmi lehce. Aby se 26

27 zabránilo poškození spermií, mělo by být sperma uchováváno mezi tělesnou teplotou (37ºC) a teplotou pokoje (20ºC)(England, 1992). 3.4 Hodnocení psího ejakulátu Zhodnocení psího ejakulátu zahrnuje především stanovení objemu, barvy, vzhledu, koncentrace spermií, celkového počtu spermií v ejakulátu, procento pohyblivých spermií a procento normálních spermií (Johnston, 1991) Makroskopické hodnocení Toto hodnocení ejakulátu se provádí ihned po odběru ejakulátu. U odebraního spermatu se hodnotí objem, barva, konzistence, pach, popřípadě obsah cizích přimísenin (Louda a kol., 2001) Objem ejakulátu Je velmi variabilní a značně kolísá (Louda a kol., 2001) Závisí na druhu, plemenné příslušnosti, věku a hmotnosti zvířat, intenzitě pohlavního využívání a v neposlední řadě na stupni pohlavního vydráždění. Ale také na způsobu odběru, výživě, ročním období a zdravotním stavu (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Také z výsledků pokusů jiných autorů (Bane, 1954) vyplývá, že velikost objemu a koncentrace semene jsou podmíněny více geneticky než prostředím, v případě, že je odběr ejakulátu prováděn v patřičných intervalech. Objem se zjišťuje měřením v kalibrovaných válcích nebo vážením na laboratorní automatické váze (Louda a kol., 2001). Toto stanovení je nejzákladnější a nejsnazší vyšetření ejakulátu. Stanovuje se okamžitě po získání ejakulátu v odměrných nádobách nebo vážením. U býka, berana a muže je ejakulát získáván v plném rozsahu a objem se stanovuje z celkového množství. U kance a hřebce se odebírají jen frakce bohaté na spermie, frakce ejakulátu, která je produkována z bulbouretrálnních žláz, se neodebírá, spíše se odstraňuje. Objem ejakulátu je tedy stanoven jen z frakcí určených k využití. U psa je objem ejakulátu stanoven obdobným způsobem. U králíka je ejakulát odebrán jako celek, ale před stanovením objemu je hlenová zátka vyjímána. Nádoby na odměřování objemu mají být dvouplášťové nebo kryty izolačním obalem. Veškeré 27

28 pomůcky, s nimiž přijde semeno do styku, musí mít příslušnou teplotu. Pro semeno býka, hřebce, psa a králíka se doporučuje kontaktní teplota C, pro semeno kance C. Laboratorní prostředí má mít minimální teplotu C. U dospělých zvířat má mít objem ejakulátu nejnižší hodnoty u býka 4 ml, hřebce 20 ml, kance 100 ml a psa se objem výrazně mění dle plemene, ale minimálně má být objem 2 ml (Věžník a kol., 2004). Tab. 3: Kvalitativní parametry ejakulátu Objem ejakulátu Koncentrace spermií Druh Mezní hodnoty průměr Mezní hodnoty průměr cm 3 1 mm 3 pes 2,0-50, beran 0, kozel 0, hřebec 30, osel 10,0-80, kanec býk 2, lišák 0,2-4 1, muž 2,0-6,0 3, králík 0, kohout 0,2-1, krocan 0,2-1 0, kačer 0,1-1 0, houser 0,2-1,5 0, netopýr 0,

29 Barva Barva spermatu se posuzuje proti světlu (Louda a kol., 2001). Závisí na hustotě a konzistenci ejakulátu ( Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Hodnocení barvy je subjektivní. Čisté jasné vzorky neobsahují spermie. Zakalené či mléčné vzorky pravděpodobně spermie obsahují, ale vždy by měly být kontrolovány mikroskopicky. V některých případech, psí sperma s azoospermiemi, může produkovat nadměrné množství tukových kapének do vzorku dávající vzhled jako sperma normální (Leary, 1974). Vyhovující sperma má barvu bělavou, v některých případech šedobílou či mírně nažloutlou. Špatné sperma, které není vhodné k inseminaci, je barvy žlutozelené nebo zelené s příměsí hnisu, krve, moči nebo s nežádoucími mikroorganismy (Louda a kol., 2001). Mezi nejčastější příčiny hemospermií u psů je onemocnění prostaty a trauma penisu. U lidí mohou být hemospermie spojeny s močovými kameny, pohlavně přenosnými nemocemi, jako je syfilis a kapavka, nebo s léčbou antikoagulačními léky (Leary, 1974) Pach Posuzuje se čichem. Dobré sperma má slabý specifický pach, který svoji vůní připomíná pach kravského mléka. Sperma zelené barvy páchne močí. Hnilobný zápach svědčí o příměsi hnisu (Louda a kol., 2001) Cizí přimíseniny V ejakulátu to jsou nejčastěji chlupy, vazelína či nečistoty z předkožky. Při odběrech probíhajících venku se může v ejakulátu objevovat prach nebo písek. Při zánětech semenných váčků, pyje nebo varlat a předkožky je zjištěna v ejakulátu přítomnost hnisu. Dobré sperma má být prosté přimísenin (Louda a kol., 2001). Příležitostně mohou být právě chlupy z břicha a předkožky uvězněny mezi penisem a předkožkou při detumescenci a mohou způsobovat psovi bolest. 29

30 3.4.2 Mikroskopické hodnocení Aktivita Jeden z nejvýznamnějších ukazatelů oplozovací-fertilizační schopnosti čerstvého ejakulátu je pohyb, a to progresivní pohyb vpřed za hlavičkou. Je znakem funkční plnohodnosti spermií a vyjadřuje se v procentech. Hodnocen je charakter pohybu, určuje se směr a rozsah kmitů hlavičky spermie (Louda a kol., 2001). Pohyblivost spermií je vyjádřena jako procento z celkové pohyblivosti a progresivně pohyblivých spermií. V běžném psím ejakulátu je to mezi 70 a 90 % (Johnston et al., 2001, Iguer-Ovada and Verstegen, 2001), ačkoliv může být i nižší, a to zejména po delším období sexuálního klidu (Larsen, 1980). U ejakulátu, který je určen k přímé inseminaci či ke konzervaci, se požaduje minimální aktivita 70%. K posouzení aktivity se dříve používalo pětibodové stupnice: 5 bodů více než 90% spermií se pohybuje vpřed za hlavičkou 4 body 70-90% spermií se pohybuje vpřed za hlavičkou 3 body 50-70% spermií se pohybuje vpřed za hlavičkou 2 body 30-50% spermií se pohybuje vpřed za hlavičkou 1 bod do 30% spermií se pohybuje vpřed za hlavičkou K-spermie s kruhovým pohybem, N- spermie bez pohybu (Louda a kol., 1980). Při hodnocení motility se aplikuje kapka spermatu na čisté podložní sklíčko (Threlfall, 2003). Hodnotí se minimálně 3 zorná pole a odhadem se stanoví % zastoupení spermií, které se pohybují progresivně vpřed za hlavičkou (Louda a kol., 2001). Tento pohyb se pokládá za fyziologický pohyb, u některých spermií však také můžeme pozorovat jiné pohyby jako je pohyb okolo hlavičky, pohyb do kruhu, pohyb opačný, trhavý, kolísavý, pohyb na místě (oscilační) či nepohyblivost spermie (Gamčík, Kozumplík a kol., 1992). Psí spermie s normální hybností by měla přejít mikroskopické pole pohledu za 2-3 sekundy (Threlfall, 2003). Také se díváme na rychlost spermií v µm/s. U býka je to 80 µm/s, králíka 70 µm/s, hřebce 50 µm/s a kance se psem se spermie pohybují rychlostí 43 µm/s (Věžník a kol., 2004). V následující tabulce 4. jsou uvedeny rychlosti spermií u různých druhů dle různých autorů: 30