VLIV APLIKACE ROSTLINNÝCH EXTRAKTŮ NA MIKROBIOLOGICKOU ČISTOTU PLODOVÉHO KOŘENÍ Diplomová práce

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství VLIV APLIKACE ROSTLINNÝCH EXTRAKTŮ NA MIKROBIOLOGICKOU ČISTOTU PLODOVÉHO KOŘENÍ Diplomová práce Vedoucí diplomové práce Ing. Gabriela Růžičková, Ph.D. Vypracovala Bc. Barbora Staňková Brno 2009

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv aplikace rostlinných extraktů na mikrobiologickou čistotu plodového koření vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně, dne Podpis

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji své vedoucí diplomové práce Ing. Růžičkové, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při řešení zadané problematiky a za vždy ochotné jednání. Poděkování patří i Ing. Kalhotkovi, Ph.D. za odbornou pomoc a umožnění mikrobiálních rozborů na Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin. Děkuji i Kateřině Soukupové za spolupráci při laboratorních pracích a všem ostatním, kteří se podíleli na zkvalitnění této práce. Zvláštní dík náleží mé rodině za veškerou podporu při studiu.

4 ABSTRAKT Diplomová práce se zabývala výzkumem účinnosti aplikace rostlinných extraktů, u nichž byla prokázána antimikrobiální aktivita, na plody fenyklu (Foeniculum vulgare var. vulgare Mill.) v průběhu skladování. Tato metoda je alternativou metodám - sterilace vodní parou a ozařování ionizujícím zářením - běžně užívaným k ošetření plodového koření před zpracováním či skladováním pro odstranění stávající mikrobiální kontaminace a bránící vzniku nové. Plody fenyklu byly ošetřeny vodnými extrakty z kmínu kořenného (Carum carvi L.) a perily křovité (Perilla frutescens L.) a lihovými extrakty z: aksamitníku rozkladitého (Tagetes patula L), dobromysli obecné (Origanum vulgare L.), kmínu kořenného (Carum carvi L.), konopí setého (Cannabis sativa L.) a vlaštovičníku většího (Chelidonium majus L.). Po 1., 2., 3., 4., a 8. týdnu skladování bylo plotnovou metodou hodnoceno množství plísní a kvasinek a celkový počet mikroorganismů. Výsledky ukázaly, že extrakty z rostlin inhibují růst a množení především plísní a kvasinek, přičemž mezi nejvíce účinné extrakty patří: lihový extrakt z aksamitníku rozkladitého, lihový extrakt z kmínu kořenného, lihový extrakt z konopí setého a lihový extrakt z vlaštovičníku většího. Celkový počet mikroorganismů byl významněji limitován lihovým extraktem aksamitníku rozkladitého, lihovým extraktem kmínu kořenného a lihovým extraktem konopí setého. Klíčová slova: kořeninové rostliny, Foeniculum vulgare var. vulgare Mill., rostlinné extrakty, antimikrobiální aktivita, patogenní mikroorganismy, potravinářský průmysl. ABSTRACT Thesis was delt with research of the effectiveness of application plant extracts, which has been demonstrated antimicrobial activity, to the fruits of fennel (Foeniculum vulgare var. vulgare Mill.) during storage. This method is alternative to some methods - steam sterilization and irradiation with ionizing radiation - commonly used to treat spices before processing or stocking to remove the microbial contamination and preventiv the emergence of new ones.

5 Fennel fruits were treated aqueous extracts of caraway (Carum carvi L.) and of perila (Perilla frutescens L.) and spirituous extracts: marigold (Tagetes patula L.), oregano (Origanum vulgare L.), caraway (Carum carvi L.), hemp (Cannabis sativa L.) and celandine (Chelidonium majus L.). After the 1., 2., 3., 4., and the 8. week stocking using the plate method was evaluated the quantity of fungi and yeasts and the total number of microorganisms. The results showed that these extracts from plants inhibit the growth and the propagation of fungi and yeasts, while the most effective extracts are spirituous extract of marigold, spirituous extract of caraway, spirituous extract of hemp and spirituous extract of celandine. The total number of microorganisms was significantly limited: spirituous extract of mangold, spirituous extract of caraway and spirituous extract of cannabis. Key words: spices, Foeniculum vulgare var. vulgare Mill., plant extract, antimicrobial aktivity, patogenic microorganisms, food industry.

6 OBSAH 1 ÚVOD. 8 2 CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED VYMEZENÍ POJMU KOŘENÍ Plodové koření PĚSTOVÁNÍ KOŘENINOVÝCH ROSTLIN OBCHOD S KOŘENINOVÝMI ROSTLINAMI KVALITA KOŘENINOVÝCH ROSTLIN Legislativní opatření pro kvalitu koření Smyslové a fyzikální požadavky na koření Mikrobiologická čistota koření Mykotoxiny ZPŮSOBY ÚPRAVY KOŘENÍ Chemické ošetření Ošetření vodní parou Ozařování potravin ionizujícím zářením Aplikace rostlinných extraktů a silic Silice Extrakty Antimikrobiální účinky vybraných druhů rostlin 24 4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍCH VZORKŮ Charakteristika rostlinného materiálu... 28

7 Ošetření vzorků koření STANOVENÍ MIKROORGANISMŮ V PLODECH FENYKLU Příprava kultivačního média (agaru) METODA STANOVENÍ OBSAHU SILIC METODY STATISTICKÉHO HODNOCENÍ 32 5 VÝSLEDKY PRÁCE OBJEM APLIKOVANÉHO EXTRAKTU NA PLODY FENYKLU MIKROBIOLOGICKÁ ČISTOTA PLODŮ FENYKLU V PRŮBĚHU SKLADOVÁNÍ Plísně a kvasinky Celkový počet mikroorganismů (CPM) STANOVENÍ OBSAHU SILICE V PLODECH FENYKLU EKONOMICKÉ ZHODNOCENÍ METODY APLIKACE ROSTLINNÝCH EXTRAKTŮ 56 6 DISKUZE A ZÁVĚR 58 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY PŘÍLOHY... 67

8 1 ÚVOD Koření doprovází lidskou populaci už po tisíciletí. Také v současné moderní společnosti se tato přísada do pokrmů těší stále větší oblibě a bez větších obtíží je možné si obstarat koření z nejrozličnějších koutů světa. Plodové koření, pod nímž se rozumí rostlinné druhy jako kmín kořenný, fenykl obecný, koriandr setý a anýz vonný, náleží do velmi rodově i druhově rozmanité skupiny rostlin označované jako léčivé, aromatické a kořeninové rostliny - LAKR. Přesně definovat skupinu LAKR není jednoduchý úkol, jelikož jedna rostlina může být zahrnuta zároveň do léčivých rostlin, aromatických rostlin i kořeninových rostlin, a to díky účinným látkám (produktům primárního a sekundárního metabolismu) obsažených v rostlině v různém množství. Obsahové látky jsou zodpovědné za chuť, vůni i za léčivé či fyziologicky funkční vlivy na živý organismus. Důležité je, aby tyto látky byly přítomny v co nejvyšší kvalitě a nebyly znehodnoceny, ať už před samotnou sklizní rostliny nebo v průběhu zpracování či skladování. Největší hrozbou je mikrobiální kontaminace produktů - tedy i koření - určených ke konzumaci. Bakterie a mikroskopické vláknité houby (běžně označované jako plísně) v napadených potravinách uvolňují toxické metabolity, jež mohou způsobit lehčí až velmi závažná onemocnění. Potraviny, koření není výjimkou, je proto nutné před spotřebou upravit tak, aby se zamezilo růstu a množení nežádoucích mikroorganismů. U koření jsou nejvýznamnější metody dekontaminace sterilace vodní parou a ozařování ionizujícím zářením dovolující zachovat organoleptické vlastnosti koření. Mezi spotřebiteli však ozařování ionizujícím zářením vzbuzuje jisté pochybnosti o kvalitě a nezávadnosti potravin, ačkoli se podle literárních zdrojů jedná o naprosto bezpečnou metodu. Alternativní metodou pro udržení mikrobiální čistoty potravin by mohla být aplikace rostlinných extraktů a silic. Řada rostlin má totiž antibakteriální a antifungální účinky a různé studie v této oblasti vykazují uspokojivé výsledky s možností užití rostlinných extraktů a silic k ošetření potravin. Výzkum kladů a záporů výše zmíněné metody na kvalitu plodového koření, konkrétně fenyklu obecného, v průběhu skladování a také ekonomické zhodnocení této metody byly předmětem diplomové práce. 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo: 1. Zajištění vzorků plodového koření - fenyklu obecného (Foeniculum vulgare var. vulgare Mill.) ze zpracovatelského podniku. 2. Dle literárních zdrojů výběr perspektivních druhů rostlin vykazujících antimikrobiální účinky a zakoupení či připravení jejich extraktů. 3. Aplikování extraktů ve vhodné koncentraci na zvolený objem koření, následné usušení hmoty a skladování. 4. Hodnocení mikrobiologické čistoty (celkový počet mikroorganismů, počet plísní a kvasinek) vhodnou metodikou u neošetřených a ošetřených vzorků po zvolené době skladování. 5. Statistické zhodnocení výsledků a vyslovení závěrů. 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Vymezení pojmu koření Pod termínem koření se obecně rozumí části rostlin (kořeny, oddenky, kůra, listy, nať, květy, plody, semena), které charakteristickým způsobem stimulují současně chuťový i čichový smysl, a slouží tak k úpravě celkového dojmu potravin (vyhláška č. 331/1997 Sb.). V hierarchii třídění potravin řadíme koření mezi pochutiny. To jsou poživatiny, jež nemají sytící schopnosti (mají jen zanedbatelnou energetickou hodnotu), avšak propůjčují pokrmům senzorické vlastnosti. V čerstvém stavu nebo sušené, často již v nepatrném množství, se vyznačují silnou charakteristickou vůní, barvou či palčivou a dráždivou chutí vyvolanou nejrůznějšími obsahovými látkami (např. silice, glykosidy, alkaloidy, pigmenty) (DUŠEK et al., 2008). Kořeninové rostliny se používají prakticky ve všech odvětvích potravinářského průmyslu, zejména při úpravě a konzervaci masa a uzenin, při konzervování zeleniny a ovoce, v cukrářství, v pekárenství, v likérnictví a ve výrobě nápojů. Nezastupitelný význam mají i ve farmaceutickém průmyslu jako léčiva či k chuťové korekci některých léků a v kosmetickém průmyslu (VALÍČEK, 2005; STARÝ, 1997; DUŠEK et al., 2008) Plodové koření Tato diplomová práce byla výhradně zaměřena na plodové koření, jehož zástupci jsou především druhy z čeledi Apiaceae: kmín kořenný (Carum carvi L.), fenykl obecný (Foeniculum vulgare Mill.) a koriandr setý (Coriandrum sativum L.). Oblastí zájmu je suchý nepukavý plod - dvojnažka, nažka - jehož hlavní a nejcennější obsahovou látkou je silice (kmín kořenný - až 30 ml v 1 kg, fenykl obecný sladký - až 20 ml v 1 kg, fenykl obecný pravý - až 40 ml v 1 kg, koriandr setý - až 3 ml v 1 kg) (DUŠEK et al., 2008), dále flavonoidy, kumariny, tuky, bílkoviny, sacharidy a další (VALÍČEK, 2007). 3.2 Pěstování kořeninových rostlin Pěstování kořeninových rostlin má dlouholetou tradici ve světě, v Evropě i České republice, ať už počátečním impulzem bylo využití v léčitelství, či gastronomické 10

11 požadavky obyvatelstva. V současnosti nejvýznamnější evropské pěstované druhy kořeninových rostlin jsou kmín kořenný, koriandr setý, fenykl obecný a anýz vonný. V ČR s ohledem na letitou tradici kultivace, šlechtění a výzkumu zaujímá specifické postavení kmín kořenný patřící nejen mezi rozhodující kořeninové rostliny, ale i důležité komodity českého zemědělství a také významné položky zahraničního obchodu s kořením (BRANŽOVSKÝ et al., 2007). Tabulka 3.1 Vývoj ploch a produkce kmínu v ČR podle sdružení ČESKÝ KMÍN a ČSÚ Rok Sklizňová Produkce Výnos v t.ha -1 plocha v ha v tunách , , , ,69 Další druhy kořeninových rostlin, např. fenykl obecný a koriandr setý, se v ČR pěstují už jen v rozsahu jednotek či desítek hektarů. Vypovídající a relevantní přehled o pěstebních plochách konkrétních druhů kořeninových rostlin není v současné době dostupný, jelikož se statistiky celé komoditě LAKR (léčivé, aromatické a kořeninové rostliny) věnují pouze okrajově a řadí ji společně s dalšími skupinami rostlin do kategorie ostatní plodiny (BRANŽOVSKÝ et al., 2007). Podle informací organizace The European Herb Growers Association (Europam) byl v roce 2004 sběr a kultivace vybraných zástupců kořeninových rostlin v členských a přistupujících státech Evropské unie následovný - viz Tabulka 3.2 Tabulka 3.2 Produkce kořeninových rostlin v EU Latinské jméno České jméno Celková plocha kultivace [ha] Carum carvi L. kmín kořenný Coriandrum sativum L. koriandr setý Celkový pěstitelů/ sběračů počet 11

12 Foeniculum Mill. vulgare fenykl obecný Vývoj produkčních ploch, sklizně a výnosu kořeninových rostlin pěstovaných v ČR ukazuje, na základě údajů Českého statistického úřadu, Tabulka 3.3. Tabulka 3.3 Sklizeň kořeninových rostlin v letech Rok Sklizňová plocha v Produkce v tunách Výnos v t.ha -1 ha , , , , Obchod s kořeninovými rostlinami Vývoz koření z ČR z dlouhodobého horizontu stále mírně klesá. V letech 2004 a 2005 se výrazně snížil objem vyvezeného koření v důsledku klesajícího trendu vývozu hlavní exportní položky - kmínu. V roce 2006 došlo k opačné situaci a kmín se svým 47,3% podílem představoval nejvýznamnější exportní položku. Koření z ČR směřuje nejvíce na Slovensko, do Německa, Polska a Nizozemska (BRANŽOVSKÝ et al., 2007). Tabulka 3.4 Vývoj vývozu koření z ČR v tunách (BRANŽOVSKÝ et al., 2008) Plodina fenykl (Foeniculum 27,1 20,3 8,9 93,2 vulgare Mill.) kmín (Carum carvi 1638,6 701,5 913,2 1151,2 L.) koriandr (Coriandrum sativum L.) 48,7 40,7 133,2 175,6 12

13 Dovoz koření do ČR zaznamenává každoročně mírný nárůst. Nejvýznamnějšími importéry koření jsou Španělsko, Vietnam, Polsko a Rakousko (BRANŽOVSKÝ et al., 2008). Tabulka 3.5 Vývoj dovozu koření do ČR v tunách (BRANŽOVSKÝ et al., 2008) Plodina fenykl 77,2 75,7 75,2 90,5 (Foeniculum vulgare Mill.) kmín (Carum 443,3 502,7 395,5 157,1 carvi L.) koriandr 195,2 110,3 200,5 138,6 (Coriandrum sativum L.) 3.4 Kvalita kořeninových rostlin Kvalita rostlinných surovin je velmi důležitým ukazatelem pro další využití a zpracování. Kromě smyslových požadavků (např. vzhled, barva, vůně) a fyzikálních požadavků (např. příměsi, vlhkost) je velký důraz kladen na požadavky mikrobiologické (např. přítomnost mykotoxinů) a chemické (především obsahové látky) (vyhláška č. 331/1997 Sb.; vyhláška č. 53/2002 Sb.). Účinné látky a další výše zmíněné vlastnosti rostlinných surovin jsou ovlivňovány celou řadou faktorů. V prvé řadě sem patří genetický základ, podnebí (teploty, srážky, sluneční záření, proudění vzduchu, nadmořská výška), půda a její úrodnost, výživa rostlin, zařazením v osevním postupu, ochrana proti chorobám, škůdcům a plevelům. Samotná sklizeň, sušení a skladování rostlinných surovin hraje také významnou roli (ŠTOLCOVÁ, 2006) Legislativní opatření pro kvalitu koření Drogy pro potravinářské účely podléhají požadavkům stanoveným v potravinářské legislativě. Kontrolním orgánem je Státní zemědělská a potravinářská inspekce (BRANŽOVSKÝ et al., 2007). 13

14 Základní charakteristika koření, požadavky na jakost a metody zkoušení koření jsou upraveny ve vyhlášce Ministerstva zemědělství č. 331/1997 Sb., kterou se provádí zákon č. 110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů pro koření, jedlou sůl, dehydratované výrobky a ochucovadla a hořčici; ve znění vyhlášky č. 419/2000 Sb., a příslušných platných českých technických předpisech - ČSN normách, dále v evropských a mezinárodních EN, ISO normách či ČSN ISO, ČSN EN, ČSN EN ISO normách (KOPEC, BALÍK, 2008). Normy nejsou závazné a dodržování jimi stanovených kritérií je dobrovolné. Výhodou je, že při obchodním styku a při výrobě se na ně lze odvolávat, přičemž se jimi následně musí účastníci dohody řídit. Za závaznou se rovněž považuje ČSN, EN, ISO, ČSN ISO, ČSN EN, ČSN EN ISO norma, pokud na ní zákon nebo vyhláška odkazuje (DRAŠNAROVÁ, BUCHTOVÁ, 2004). Kvalitou koření, produkcí a obchodem se zabývají i mezinárodní organizace. Nejvýznamnější z nich jsou The European Spice Association (ESA) a The American Spice Trade Association (ASTA) (DUŠEK et al., 2008) Smyslové a fyzikální požadavky na koření Tabulka 3.6 Smyslové požadavky na jakost podle vyhlášky č. 331/1997 Sb. Název koření Vlhkost v % hmotnosti nejvýše Celkový popel v % hmotnosti sušiny nejvýše Silice v % (ml/100g) v sušině nejméně 14 Popel nerozpustný v kyselině v % hmotnosti nejvýše Příměsi v % hmotnosti nejvýše Organ. Organ. Anorgan. vlastní cizí fenykl celý 12,0 10,0 1,0 2,0 3,0 2,0 2,0 fenykl 12,0 10,0 1,0 2, mletý kmín (tmavý) celý 13,0 8,0 2,5 1,5 1,0 2,0 2,0 kmín (tmavý) drcený kmín (tmavý) mletý kmín jednoletý (světlý) celý kmín jednoletý 13,0 8,0 1, ,0 8,0 1,0 1, ,0 9,0 1,5 2,0 1,0 2,0 2,0 12,0 9,0 1,

15 (světlý) drcený kmín jednoletý (světlý) mletý koriandr celý koriandr mletý 12,0 9,0 1, ,0 7,0 0,4 1,5 3,0 2,0 2,0 9,0 7,0 0,4 1, Tabulka 3.7 Fyzikální a chemické požadavky na jakost podle vyhlášky č. 331/1997 Sb. Název koření fenykl kmín (tmavý) celý Název rostliny fenykl (Foeniculum vulgare P. Miller var. vulgare kmín kořenný - dvouletá forma (Carum carvi L.) Část rostliny sušené plody sušené plody Vzhled Barva Vůně Chuť nažky rovné nebo slabě zakřivené, žebernaté podlouhlé, mírně zahnuté nažky, žebernatého povrchu žlutozelená až zelenohnědá světle hnědá až tmavě hnědá, se žlutými až okrovými žebry kořenná charakteristická kořenná, nasládlá kořenná mletý kmín jednoletý (světlý) celý kmín kořenný - jednoletá forma (Carum carvi L.) sušené plody nažky mají stejné charakteristi ky jako nažky dvouleté formy kmínu, pouze jsou větší žlutohnědá, světle hnědá až světle šedohnědá se světlejšími žebry, celkově světlejší než dvouletá forma charakteristická, avšak méně zřetelná než u dvouleté formy kořenná drcený, mletý koriandr koriandr (Coriandrum sativum L.) sušené plody drť nebo prášek se znatelným zrněním kulovité dvojnažky, hladké šedozelená, hnědozelená až hnědá světle hnědá, nazelenalá, žlutě načervenalá charakteristická příjemně aromatická kořenná charakteristicky kořenná 15

16 3.4.3 Mikrobiologická čistota koření Z kvalitativního hlediska je pro všechny druhy koření a suché kořenicí přípravky důležitá mikrobiologická čistota, jejíž limity dříve stanovovala vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení. Po zrušení této vyhlášky převzalo její úlohu Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny ve znění Nařízení komise (ES) č. 1441/2007. Toto nařízení však konkrétně o koření a kořenících směsích nepojednává ( 2008). Někteří zpracovatelé koření se tak stále řídí limity z vyhlášky č. 132/2004 Sb. a její normy si zabudovávají do systému HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point) (KALÁČKOVÁ, 2008). Podle Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 se mikroorganismy rozumí bakterie, viry, kvasinky, plísně, řasy, cizopasní prvoci, mikroskopičtí parazité helminti a jejich toxiny a metabolity. Kvalitativní a kvantitativní skladba mikroflóry je závislá na typu sklizených rostlin resp. jejich částí. Vyšší hodnoty počtu zárodků v mletém koření (až 10 7 v 1 g) jsou udávány např. u kmínu, černého pepře, nového koření a koriandru, naopak menší počty ( ) např. u fenyklu, estragonu a bílého pepře. Pokud jde o mikroskopické vláknité houby (plísně), vyšší počty zárodků byly prokázány např. u kmínu, koriandru a nového koření, a to u vzorků získaných standardním způsobem pěstování a posklizňového zpracování (DUŠEK et al., 2008). Potraviny nesmějí obsahovat mikroorganismy nebo jejich toxiny či metabolity v množství, jež představuje nepřijatelné riziko pro lidské zdraví (2073/2005/ES). Potraviny se na základě vyhlášky č. 132/2004 Sb. považují z mikrobiologického hlediska za zdravotně závadné, pokud: - byly překročeny nejvyšší mezní hodnoty počtu mikroorganismů, - obsahují toxické produkty mikroorganismů, - obsahují mikroorganismy a mikrobiální metabolity působící onemocnění z potravin, - vykazují nežádoucí změny způsobené mikrobiální činností, např. zápach, změnu barvy, netypický zákal, tvorbu plynu, změnu chuti, nebo projevují příznaky nežádoucího růstu mikroorganismů, např. viditelné kolonie, mycelium, maz. Mikrobiologické požadavky se stanovují jako přípustné hodnoty a nejvyšší mezní hodnoty. Přípustné hodnoty znamenají přijatelnou míru rizika a stanovují se pro 16

17 potraviny vyrobené ze zdravotně nezávadných surovin za dodržení stanovené technologie a s využitím systému kritických kontrolních bodů. Nejvyšší mezní hodnoty znamenají nepřijatelně vysokou míru rizika ohrožení zdraví lidí, zdravotní závadnost nebo zkažení potraviny a její nepoužitelnost pro účely lidské výživy. Překročení nejvyšších mezních hodnot znamená, že se jedná o potravinu zdravotně závadnou (vyhláška č. 132/2004 Sb.). Tabulka 3.8 Nejvyšší mezní hodnota bakteriálních původců onemocnění z potravin dle vyhlášky č. 132/2004 Sb. Mikroorganismus Nejvyšší mezní hodnota na g či ml Bacillus cereus 10 4 termotolerantní Campylobacter negat/25 Clostridium perfringens 10 4 Escherichia coli O 157 a další negat/25 * verocytotoxin produkující E. coli (VTEC) Listeria monocytogenes negat/25 * Salmonella spp. negat/25 * Shigella spp. negat/25 * koagulázopozitivní stafylokoky 10 4 Yersinia enterocolitica (suspektní negat/25 * patogenní kmeny) * požadavek nepřítomnosti mikroorganismů ve 25 g či 25 ml vzorku Tabulka 3.9 Přípustné hodnoty MO pro koření, směsi koření a suché kořenící přípravky dle vyhlášky č. 132/2004 Sb. Mikroorganismus Přípustná hodnota v 1g či 1 ml vzorku Escherichia coli

18 koagulázopozitivní stafylokoky 10 3 Clostridium perfringens 10 3 Salmonella spp. negat/10 * potenciálně toxinogenní plísně Aspergillus flavus, A.parasiticus, A. nimius * požadavek nepřítomnosti mikroorganismů v 10 g či 10 ml vzorku Tabulka 3.10 Nejvyšší mezní hodnoty pro toxické produkty mikroorganismů v potravinách dle vyhlášky č. 132/2004 Sb. Toxin Kategorie potravin Nejvyšší mezní hodnota stafylokokové enterotoxiny všechny potraviny negat. enterotoxin (C.perfringens) všechny potraviny negat. enterotoxin (B.cereus) všechny potraviny negat. verocytotoxin (E.coli) všechny potraviny negat. termostabilní hemolytický všechny potraviny negat. toxin (V.parahaemolyticus) botulotoxin všechny potraviny negat. Tabulka 3.11 Mikrobiologické limity pro koření ve státech EU (GÖRNER, VALÍK, 2004) Mikroorganismus Doporučený limit Výstražný limit salmonely - neg. v 25g Staphylococcus aureus 10 3 KTJ.g KTJ.g -1 Bacillus cereus 10 4 KTJ.g KTJ.g -1 Escherichia coli 10 4 KTJ.g -1 - sulfidredukující klostrídie 10 4 KTJ.g KTJ.g -1 plísně 10 5 KTJ.g KTJ.g -1 18

19 Mykotoxiny Pro mykotoxiny vyskytující se v koření a kořenících přípravcích neexistují v současné době zákonem předepsané normy, ačkoli se jedná o velmi nebezpečné látky narušující zdraví lidí i zvířat. Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity řady druhů mikroskopických vláknitých hub (VELÍŠEK, 1999) označovaných nesprávně, avšak všeobecně vžitým termínem, plísně (NEDĚLNÍK; MORAVCOVÁ, 2005). Obecně se jedná o poměrně stabilní strukturně odlišné organické sloučeniny o nízké molekulární hmotnosti a nebílkovinné povahy nerozkládající se v průběhu zpracování vůbec, či v závislosti na druhu mykotoxinu a podmínkách prostředí pouze částečně. Mykotoxiny se vytvářejí v myceliu, vzácněji ve sporách, a většinou rychle penetrují do substrátu (OSTRÝ, 2006). Ke kontaminaci může docházet v průběhu vegetace, po sklizni, během skladování a zpracování (POLIŠENSKÁ et al., 2008). Produkce mykotoxinů v samotných potravinách je ovlivněna celou řadou faktorů: - vlhkost (pro produkci mykotoxinů aflatoxinů a ochratoxinu A více jak 85% vlhkost), - množství spor toxinogenních plísní, - teplota (aflatoxiny a ochratoxin A - teplota blízká optimální teplotě pro růst plísní, zearalenon - teplota nižší, než je optimální teplota růstu produkční plísně), - konkurenční mikroflóra a mikrobiální interakce, - substrát a přítomnost CO 2 /O 2, - doba inkubace, - mechanické poškození a poškození hmyzem. Základem pro prevenci výskytu mykotoxinů v rostlinných produktech je dodržování zásad Správné zemědělské praxe, Správné surovinové praxe, Správné výrobní praxe a Správné laboratorní praxe (DUŠEK et al., 2008). V současnosti je známo téměř 350 mykotoxinů. Toxinogenní plísně mohou produkovat jeden i více toxinů a stejný toxin může být produktem zástupců několika rodů toxinogenních plísní. Z hlediska kontaminace koření mykotoxiny mají největší význam houby rodu Aspergillus, Penicillium a Fusarium (POLIŠENSKÁ et al., 2008). Mykotoxiny vykazují řadu negativních toxických účinků, a to karcinogenitu, mutagennost, teratogenitu, estrogenitu, neurotoxicitu, imutotoxicitu a další (OSTRÝ, 2006). 19

20 3.5 Způsoby úpravy koření Nečistoty (kamínky, rostlinné zbytky, prachové částice) a také mikroorganismy je nezbytné před dalším zpracování koření odstranit. Mechanické čistění nemusí být vzhledem ke značnému výskytu mikroorganismů dostatečné, a tak se přistupuje k dalšímu ošetření Chemické ošetření Je v současnosti zastaralý a nevhodný způsob, a to díky vysoké toxicitě chemických látek, které byly pro tento způsob používány, např. etylenoxid, fosfin (KALÁČKOVÁ, 2008) Ošetření vodní parou Umožňuje řízené snížení celkového počtu mikroorganismů u koření, sušených bylin, sušených hub, sušené zeleniny a ořechů, přičemž chuť, vůně a barva jsou minimálním způsobem pozměněny. Výhodou je její netoxičnost a poměrně levné provedení, proto tento způsob účinně nahrazuje chemické ošetření ( 2009). Vodní parou mohou být odstraněny i zbytky fosfinu z materiálů, které jím byly dříve ošetřeny. Dalším vývojovým stupněm této metody je ošetření suchých materiálů sytou parou za vakua či přetlaku (KALÁČKOVÁ, 2008). Moderní technologii parní sterilace potravin vyvinula francouzská společnost REVTECH. Její metoda užívá páru pro její schopnost eliminovat bakterie a čistou elektrickou energii k ohřátí sterilovaného produktu. Přístroj obsahuje dvě REVTECH zařízení, a to na přehřátou páru a na sušení a chlazení materiálu okolní teplotou ( 2009). Jiné know-how využívající parní sterilační procesy vyvinula a patentovala francouzská společnost ETIA. Jejich zařízení Safesteril v sobě kombinuje rovněž dva důležité prvky - Spiraljoule (elektrický spirálový přenašeč tepla pro sterilaci) a Frigomix (spirálový chladič) ( 2009). 20

21 Obr. 3.1 Přístroj na sterilaci parou společnosti REVTECH ( 2009) Obr. 3.2 Safesteril společnosti ETIA ( 2009) Ozařování potravin ionizujícím zářením Metoda je též označována jako suchá pasterizace a patří mezi moderní metody snižování počtu mikroorganismů v potravinách. Potravina ošetřená za stanovených podmínek ionizujícím zářením si zachovává své nutriční a senzorické vlastnosti. Chuť, vůně, barva i textura potraviny zůstávají nezměněny. Organismy jsou ničeny v důsledku 21

22 reakcí volných OH radikálů uvnitř buněk s basemi a cukry DNA. Ionizací se porušuje vazba cukr-fosfát, čímž se ztrácí schopnost dělení buněk, a tedy i jejich množení (MICHALOVÁ, 2004). Problematika ozařování potravin, tzn. podmínky ozařování potravin a surovin, nejvyšší přípustná dávka záření a způsob označení ozáření na obalu, je řešena vyhláškou Ministerstva zdravotnictví č. 133/2004 Sb. Nejvyšší přípustná celková průměrná absorbovaná dávka záření (NPD) pro koření, kořenící přípravky a sušené byliny je 10 kgy. Tuto dávku jako zdravotně nezávadnou potvrdila i Světová zdravotnická organizace (WHO), Evropská vědecká komise pro potraviny (ECSCF) (OSTERHOLM, 2004), Organizace pro potraviny a zemědělství (FAO) a Mezinárodní agentura pro atomovou energii ( 2008). V ČR se již od roku 1992 dekontaminací a dezinsekcí potravin a potravinářských surovin pomocí ozařování zabývá společnost ARTIM spol. s r.o. provádějící tyto práce v souladu se zákonem č. 110/1997 Sb. ve znění pozdějších předpisů, tj. v souladu s předpisy EU. Ošetření se týká především koření (zejména koření dováženého z tropických a subtropických zemí, ale i z domácí produkce), extraktů z koření, sušené zeleniny a ovoce, jiných suchých plodů (hub), léčivých rostlin a čajů. Dávka záření se určuje podle skutečného znečištění a obvykle se pohybuje hluboko pod povolenou hranicí. Mikrobiální dekontaminace u celých plodů fenyklu a kmínu je standardní dávkou 3-7 kgy ( 2008). Obr. 3.3 Mezinárodní symbol používaný pro označení potravin ošetřených ionizací ( 2008) Aplikace rostlinných extraktů a silic Řada léčivých a kořeninových rostlin s úspěchem vykazuje antimikrobiální a antioxidační vlastnosti díky obsahovým látkám, z nichž nejvýznamnější pozici zaujímají silice. Ty samostatně nebo v kombinaci s jinými silicemi prokazatelně 22

23 inhibují růst mikroorganismů. Antimikrobiální aktivita je ovlivněna koncentrací použité silice, teplotou inkubace, substrátem a velikostí inokula. Užití silic je však pro udržení mikrobiální čistoty v potravinách limitováno kvůli ovlivňování organoleptických vlastností potravin. Východiskem je aplikace rostlinných extraktů, které již chuť a vůni tolik nemění (PETER, 2004) Silice Z chemického hlediska jsou silice složité směsi těkavých (VELÍŠEK, 2002), lipofilních, často vonných (KYSILKA, 2006) látek vznikajících pouze ve vyšších rostlinách jako produkty sekundárního metabolismu (LAWRENCET, 2001). Nejčastěji jsou tvořeny terpeny, aldehydy, alkoholy, ketony, fenoly a estery (KYSILKA, 2006). Silice se hromadí ve všech možných typech rostlinných orgánů: v plodech (kmín, koriandr, fenykl), květech (heřmánek), listech (máta, meduňka), kůře (skořicovník), oddencích (puškvorec, kurkuma) a kořenech (andělika) (SVOBODA et al., 2000). Hlavní funkce v rostlinném organismu je obrana proti býložravcům, hmyzu, obratlovcům, houbám, bakteriím, virům a pro hojení ran (GREENWAY, SVOBODA, 2003). Nejčastější metodou izolace silice z rostlinného materiálu je destilace s vodní parou (především u silic ze semen, stonků, listů, dřeva, kořenů apod.) (VELÍŠEK, 2002). Pro získání silice lepší čichové jakosti se uplatňuje metoda extrakce rostlinného materiálu nepolárními rozpouštědly, např. petroletherem. Postup je ale nákladnější než destilace s vodní párou, a tak se k metodě přistupuje pouze v případech potřeby zachování původního aroma silice, např. pro kosmetiku či parfumerii (BUČKOVÁ, 2000) Extrakty Extrakty jsou produkty kapalné (kapalné extrakty a tinktury), polotuhé (zahuštěné extrakty) nebo tuhé (suché extrakty) konzistence získané z rostlinných drog (SLOVENSKÝ LIEKOPIS, 2003). V extraktech jsou přítomny nejen silice, ale i alkaloidy, třísloviny, hořčiny, saponiny, glykosidy a další chemické sloučeniny (ČESKÝ LÉKOPIS, 2005). Extrakty se připravují vhodnými metodami za použití etanolu nebo jiných vhodných rozpouštědel. Před samotnou extrakcí se mohou míchat různé šarže rostlinné drogy, jež ovšem musí kvalitativně vyhovovat příslušnému článku lékopisu. Ve specifických 23

24 případech se extrahovaný materiál může podrobit předběžné úpravě, např. rozemletí, inaktivaci enzymů. Voda použitá při přípravě extraktů musí splňovat kvalitativní parametry a musí být testována na přítomnost bakteriálních endotoxinů (SLOVENSKÝ LIEKOPIS, 2003) Antimikrobiální účinky vybraných druhů rostlin Bylo prokázáno, že extrakty ze semen kopru vonného (Anethum graveolens L.) a koriandru setého (Coriandrum sativum L.) omezovaly růst houbových patogenů Alternaria alternata a Fusarium solani. Silice z fenyklu obecného (Foeniculum vulgare Mill.) regulovala populace Streptococcus aureus a Bacillus subtilis (PETER, 2004). Lihový extrakt a silice z kmínu kořenného (Carum carvi L.) vykazovaly při pokusech baktericidní i fungální účinky (DAMASIUS et al., 2007; SIMIC et al., 2008). U citralu - hlavní složky silice meduňky lékařské - byl při studiích pozorován silný fungitoxický účinek (ARAUJO et al., 2003). Tabulka 3.12 Antimikrobiální aktivita vybraných druhů rostlin Rostlina Účinné látky Aktivita proti Aktivita proti bakteriím houbovým patogenům bazalka pravá (Ocimum vodný extrakt Escherichia coli basilicum L.) (TUCHILA et al., 2008) bazalka pravá (Ocimum basilicum L.) lihový extrakt Streptococcus cricetus (TUCHILA et al., 2008) bazalka pravá (Ocimum silice (linalool) Escherichia coli Aspergilus niger basilicum L.) (HECTOR et al., 2002), Ascophaera apis (PETER, 2004) bazalka pravá lihový extrakt Candida albicans (Ocimum basilicum L.), (TUCHILA et al., 24

25 saturejka zahradní (Satureja hortensis L.) 2008) hřebíčkovec kořenný (Syzygium aromaticum [L.] Merr. et Perry) koriandr setý (Coriandrum sativum L.) koriandr setý (Coriandrum sativum L.), dobromysl obecná (Origanum vulgare L.), bazalka pravá (Ocimum basilicum L.) máta peprná (Mentha piperita L.), dobromysl obecná (Origanum vulgare L.) meduňka lékařská (Melissa officinalis L.) rozmarýna lékařská (Rosmarinus officinalis silice Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa silice silice Listeria monocytogenes, Streptococcus aureus, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica (PETER, 2004) silice silice silice Bacillus cereus, Escherichia coli, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae (HECTOR et al., 2002) Ascophaera apis Aspergillus niger (PETER, 2004) Aspergillus ochraceus (PETER, 2004) Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii, Pichia membranifaciens, Dekkera anomala, Yarrowia lipolytica (ARAUJO et al., 2003) Aspergillus parasiticus 25

26 L.) Pseudomonas (RASOOLI; aeruginosa, FAKOOR, 2008) Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes (KRAJCOVA et al., 2008; FAKOOR; RASOOLI, 2008) saturejka horská silice Escherichia coli (Satureja montana L.) O15TH7, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes serovar 4b, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium (ROTA et al., 2004) saturejka zahradní lihový extrakt Staphylococcus (Satureja hortensis L.) aureus (TUCHILA et al., 2008) saturejka zahradní vodný extrakt Streptococcus (Satureja hortensis L.) cricetus (TUCHILA et al., 2008) šalvěj lékařská (Salvia silice Staphyloccocus Candida albicans officinalis L.) aureus (DAMJANOVIAE- 26

27 VRATNICA et al., 2008) šalvěj lékařská (Salvia extrakt Bacillus cereus, officinalis L.) Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes (KRAJCOVA et al., 2008) tymián obecný silice Escherichia coli (Thymus vulgaris L.) O15TH7, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes serovar 4b, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium (ROTA et al., 2004) Pozn. Mikrobiologická účinnost silic a extraktů z rostlin byla zkoumána hlavně na čistých kulturách mikroorganismů či na potravinách typu: maso, mléko, sýry, saláty, dresinky atd. (TASSOU et al., 2004). Není však známo, že by se silice a extrakty aplikovaly přímo na plodové koření pro zjištění inhibujícího efektu na mikroorganismy. 27

28 4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Příprava zkušebních vzorků Charakteristika rostlinného materiálu V roce 2008 byly od firmy Leros s.r.o. Praha - Zbraslav zakoupeny pro pokusné účely plody fenyklu obecného (Foeniculum vulgare var. vulgare Mill.) ošetřené parní sterilací a neošetřené. Ošetřený plod fenyklu Foeniculi amari fructus toto - fenyklový plod celý - odpovídající požadavkům Českého lékopisu 2005, dodaný v papírových pytlích o netto hmotnosti 15 kg. č.p. - č.s Plod fenyklu byl ošetřen parní sterilací a v pokusech sloužil jako kontrolní vzorek. Neošetřený plod fenyklu Foeniculi amari fructus toto - fenyklový plod celý - vyhovující kritériím Českého lékopisu 2005, dodaný v papírových pytlích o netto hmotnosti 15 kg. č.p. - č.s. 1256a Neošetřený plod fenyklu byl využíván pro vlastní aplikaci rostlinných extraktů a jako kontrolní vzorek. Neošetřený i ošetřený fenykl v papírových pytlích byl uložen ve skladu při relativní vlhkosti 60 % a teplotě nepřesahující 20 C Ošetření vzorků koření Na neošetřené vzorky plodu fenyklu byly aplikovány vybrané extrakty z rostlin (vodné a lihové), u nichž dle literárních zdrojů byla prokázána antimikrobiální aktivita. K pokusům byly použity tyto rostlinné extrakty: - vodný extrakt kmín kořenný (Carum carvi L.) - plod (dále jen kmín vodný) - vodný extrakt perila křovitá (Perilla frutescens L.) - nať - z perily typu červenolistá a zelenolistá (dále jen perila červená vodný a perila zelená vodný) - lihový extrakt aksamitník rozkladitý (Tagetes patula L.) - nať (dále jen aksamitník lihový) 28

29 - lihový extrakt dobromysl obecná (Origanum vulgare L.) - nať (dále jen dobromysl lihový) - lihový extrakt kmín kořenný (Carum carvi L.) - plod (dále jen kmín lihový) - lihový extrakt konopí technické seté (Cannabis sativa L.) - nať (dále jen konopí lihový) - lihový extrakt vlaštovičník větší (Chelidonium majus L.) - nať (dále jen vlaštovičník lihový) Tabulka č. 4.1 Antimikrobiální aktivita vybraných druhů rostlin Rostlina Účinné látky Aktivita proti bakteriím aksamitník methanolový rozkladitý (Tagetes extrakt patula L.) dobromysl obecná silice (karvakrol) Candida albicans, (Origanum vulgare C. krusei, C. L.) tropicalis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Salmonella enterica (de SOUZA et al., 2008) perila křovitá perillaldehyd Escherichia coli, (Perilla frutescens L.) (KANG et al, 1992) Staphylococcus aureus (IBRAHIM et al., 1994) Aktivita houbovým patogenům proti Botrytis cinerea, Pythium ultimum (MARES et al., 2004) Candida albigans (PETER, 2004), Aspergilus flavus, A. parasiticus, A. terreus, A. ochraceus, A. fumigatus, A. niger (CARMO et al., 2008) U kmínu kořeného (Carum carvi L.), konopí setého (Cannabis sativa L.) a vlaštovičníku většího (Chelidonium majus L.) je také prokázána, na základě literárních zdrojů, antimikrobiální aktivita (SIMIC et al., 2008; LACOBELLIS et al., 29

30 2005; GARCIA et al.,2006; KOKOŠKA et al.,2002; NOVÁK et al., 2001). Výše zmíněné rostlinné extrakty, kromě vodného extraktu perila křovitá, byly zakoupeny ve společnosti PRVNÍ JÍLOVSKÁ, a.s. - divize EXAR v plastovém balení o objemu 2 l. Podle údajů této společnosti byly rostlinné extrakty připraveny v těchto poměrech (droga/vyluhovadlo v kg): aksamitník lihový - 1:8 dobromysl lihový - 1:8 kmín lihový - 1:4 kmín vodný - 1:4 konopí lihový - 1:7,5 vlaštovičník lihový - 1:8 Vodný extrakt perila červená a zelená byl připraven v poměru 1 : 8 (droga/vyluhovadlo v kg) dle Českého lékopisu 2005 přímo v laboratoři Ústavu pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství. Pracovní postup aplikace rostlinných extraktů na plodové koření 1. V laboratoři byla po dobu 60 minut rozsvícena UV lampa pro zajištění sterilního pracovního prostředí. 2. Veškeré pracovní pomůcky (podnosy, lžíce, ruční maloobjemový mlžič atd.) byly vydezinfikovány 70% etanolem. 3. Zavařovací láhve se šroubovacím víkem o objemu 0,5-0,7 l využívané pro uskladnění zkušebních vzorků plodu fenyklu byly vymyty čisticím prostředkem SAVO (chlornan sodný) a vydezinfikovány 70% etanolem. 4. Na zkušební vzorky plodu fenyklu o hmotnosti 250 g rozložených na podnose byl ručním maloobjemovým mlžičem rovnoměrně aplikován vždy 100% vodný či lihový rostlinný extrakt prokazující antimikrobiálními účinky. Po ošetření byl povrch plodů fenyklu na dotyk vlhký. 5. Byl stanoven objem postřikové kapaliny a vzorky koření byly umístěny do sušárny s aktivní cirkulací vzduchu po dobu minut a teplotě 50 ºC. 6. Vzorky plodu fenyklu byly skladovány v podmínkách odpovídajícím skladování ve zpracovatelských podnicích (relativní vzdušná vlhkost 60 % a teplota 20 ºC). 30

31 4.2 Stanovení mikroorganismů v plodech fenyklu Ve vzorcích plodu fenyklu byly sledovány počty plísní a kvasinek a celkové počty mikroorganismů (CPM) (tentokrát již bez plísní a kvasinek). Vzorky byly při mikrobiologickém stanovování zpracovávány metodou oplachu s následným využitím desetinného ředění a kultivačním vyšetřením plotnovou metodou. Kolonie plísní a kvasinek a celkového počtu mikroorganismů byly odečítány po stanovené inkubační době, tedy - počty plísní a kvasinek na agaru Chloramfenikol při 25 ºC za 125 hodin, celkový počet mikroorganismů na agaru PCA při 30 ºC za 72 hodin. Pracovní postup 1. V očkovací místnosti byla po dobu 20 minut nechána zářit UV lampa pro zajištění sterilního pracovního prostředí. 2. Všechny pracovní pomůcky (podnos, lžíce, laboratorní váhy) byly řádně vydezinfikovány 70% etanolem a laboratorní nádobí (pipety, zkumavky s destilovanou vodou, Erlenmayerovy baňky s destilovanou vodou) a alobalové váženky byly vysterilovány v parním sterilizátoru při 121 C po dobu 20 minut. 3. Z uskladněného zkušebního vzorku plodu fenyklu bylo odváženo 20 g. Navážka byla nasypána do Erlenmayerovy baňky a umístěna na 10 minut na třepačku. Ze vzniklého smyvu plodů koření byl pipetou odebrán roztok o objemu 1 ml, který byl napipetován přímo na plotnu (Petriho miska) či do zkumavky k 9 ml destilované vody. V ostatních připravených zkumavkách, rovněž obsahujících 9 ml destilované vody, následovalo desetinné ředění až do požadované hodnoty. Pro každé pipetování byla použita jiná pipeta. Nejčastější hodnoty ředění byly na 10-1, 10-2, 10-3 a 10-4, výjimečně 10-5 a Do Petriho misek - řádně označených - byl napipetován roztok o objemu 1 ml příslušného ředění a zalit agarem Chloramfenikol či PCA dle druhu vyšetření. Po zalití, důkladném promíchání roztoku a agaru krouživým pohybem a ztuhnutí agaru byly Petriho misky obráceny dnem vzhůru a uloženy do biologického termostatu. 4. Po inkubaci vzorku v biologickém termostatu se provedl na plotnách odečet množství kolonií plísní a kvasinek a kolonií celkového počtu mikroorganismů. 5. Množství kolonií plísní a kvasinek a kolonie celkového počtu mikroorganismů byly dle jednotlivých ředění přepočítány na skutečné hodnoty v KTJ.g

32 6. Plísně a kvasinky a celkový počet mikroorganismů ve vzorcích plodu fenyklu ošetřených extrakty z rostlin byly vyhodnocovány po 1., 2., 3., 4. týdnu a 8. týdnu od počátku skladování. Vzorky - ošetřený fenykl ze zpracovatelského podniku a neošetřený fenykl ze zpracovatelského podniku - sloužily jako vzorky kontrolní Příprava kultivačního média (agaru) Pro analýzu celkový počet mikroorganismů byl užit agar PCA (Plate count agar) od firmy Scharlau a pro plísně a kvasinky Chloramfenikol (Yeast extrakt glukose chloramphenicol agar) od firmy MERCK. Kultivační médium bylo připraveno dle návodu výrobce. Na přípravu 1 litru agaru bylo naváženo 23,5 g PCA nebo 40 g Chloramfenikolu. Směs byla rozmíchána v 1 litru destilované vody, ph metrem bylo zjištěno odpovídající ph roztoku, pro PCA ph 7,0 ± 0,2 a pro Chloramfenikol ph 6,6 ± 0,2 při 25 C, a rozlita do Erlenmayerových baněk. Následovala sterilace v parním sterilátoru při teplotě 121 C po dobu minut. 4.3 Metoda stanovení obsahu silice Obsah silice byl stanoven po 8. týdnu skladování u všech vzorků plodu fenyklu ošetřených rostlinnými extrakty a kontrolních vzorků o hmotnosti 10 g metodou destilace s vodní parou dle Českého lékopisu Destilace probíhala po dobu 90 minut. Po jejím ukončení byl z destilačního přístroje odečten počet dílků se silicí a následně obsah silice přepočten na 1 kg plodu fenyklu podle vzorce: počet dílků * 0,01 * 1000 (ml.kg -1 ) navážka (g) 4.4 Metody statistického hodnocení Vzhledem k povaze získaných dat, podmínkách skladování, množství ředění a dalších mnoha závislostech byla pro vyhodnocení experimentálních výsledků zvolena statistická metoda jednofaktorová analýza variance. Výsledky laboratorních pokusů vykazovaly ve svých hodnotách určitou proměnlivost. Tato proměnlivost byla důsledkem vlivu faktoru, který v pokusu sledujeme a náhodných vlivů způsobujících 32

33 proměnlivost výsledků pokusu opakovaného za stejných podmínek. Úkolem analýzy variance je rozčlenit celkovou proměnlivost materiálu na dílčí složky podle vlivu faktoru a na složku reziduální odpovídající náhodným vlivům. Pro následné testování v případech, kdy chceme znát konkrétní dvojice, mezi jimiž je průkazný rozdíl, byl použit Tukeyův HSD test a pro grafické vyhodnocení metoda konfidenčních intervalů konstruovaných kolem průměrů. U konfidenčních intervalů platí, že jestliže se na dané hladině významnosti nepřekrývají, lze vzorky považovat za statisticky odlišné, pokud se ovšem na hladině významnosti α = 0,05 překrývají, jedná se o rozdíly neprůkazné (STÁVKOVÁ, 1992). Statistika pro tuto diplomovou práci byla zpracována počítačovým programem STATISTICA CZ. Hlavní otázkou pro statistické vyhodnocení bylo, zda jsou rozdíly mezi ošetřeními v jednotlivých pokusných variantách, přičemž vliv na plísně a kvasinky a celkový počet mikroorganismů byl posuzován zvlášť. Pro vzorky, které v průběhu skladování zplesnivěly, byla stanovena umělá průměrná hodnota počtu plísní a kvasinek a celkového počtu mikroorganismů za účelem relevantního statistického vyhodnocení a co nejmenšího zkreslení konečných výsledků. Pro plísně a kvasinky byla tato hodnota a pro celkový počet mikroorganismů Dále byly graficky porovnány průměrné hodnoty počtu plísní a kvasinek a celkového počtu mikroorganismů u vzorků po 8. týdnu ošetření v jednotlivých variantách s mezní hodnotou možného výskytu plísní a kvasinek a celkového počtu mikroorganismů povolenou v potravinách. Mezní hodnota pro plísně a kvasinky v potravinách je 10 5, pro celkový počet mikroorganismů (vyjma plísní a kvasinek) 10 4 (GÖRNER, VALÍK, 2004). 33

34 5 VÝSLEDKY PRÁCE 5.1 Objem aplikovaného extraktu na plody fenyklu Na vzorky neošetřeného plodu fenyklu o hmotnosti 250 g byly aplikovány rostlinné extrakty vykazující antimikrobiální účinky v tomto objemu - viz Tabulka 5.1 Tabulka 5.1 Objem postřikové kapaliny Rostlinný extrakt Objem postřikové kapaliny v ml 1. varianta kmín vodný 70 perila červená vodný 75 perila zelená vodný varianta aksamitník lihový 65 dobromysl lihový 85 konopí lihový 65 vlaštovičník lihový varianta aksamitník lihový 50 kmín lihový 50 konopí lihový 75 perila červená vodný 52 Průměrná spotřeba rostlinného extraktu na 1 kg plodu fenyklu činila 257 ml. 5.2 Mikrobiologická čistota plodů fenyklu v průběhu skladování Pro vyhodnocení experimentálních výsledků byla použita statistická metoda jednofaktorová analýza variance - faktorem bylo ošetření. Hlavní testovanou otázkou bylo, zda existují rozdíly mezi ošetřeními po 1., 4. a 8. týdnu ošetření v jednotlivých pokusných variantách, přičemž vliv na plísně a kvasinky a celkový počet mikroorganismů byl posuzován zvlášť. Pro následné testování byl zvolen Tukeyův HSD test (α = 0,05) a pro grafické vyhodnocení metoda konfidenčních intervalů (α = 0,05) konstruovaných kolem průměrů. 34

35 Nulová hypotéza (Ho) = mezi ošetřeními není rozdíl Plísně a kvasinky Tabulka 5.2 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 1. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření 4 359, ,8166 Chyba , ,5676 Graf 5.1 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 1. týdnu ošetření 20 Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 1. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0, plísně ošetřený perilla zelená vodný kmín vodný neošetřený perilla červená vodný název vzorku Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Z Grafu 5.1 ale vyplývá, že nejnižší průměrná hodnota plísní a kvasinek ze vzorků ošetřených rostlinnými extrakty byla u vzorku kmín vodný. Z pohledu všech vzorků byl nejúčinnější kontrolní vzorek ošetřený, nejméně efektivní potom kontrolní vzorek neošetřený. 35

36 Tabulka 5.3 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 4. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření ,4 *** Chyba ,1 *** udávají statisticky velmi vysoce průkazný rozdíl Tabulka 5.4 Průměrné hodnoty počtu plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve 4. týdnu ošetření Faktor Plísně a kvasinky ošetřený 10,474 a neošetřený 51,334 a Ošetření kmín vodný 2,898 a perila červená vodný 9,482 a perila zelená vodný 922 b Graf 5.2 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 4. týdnu ošetření 1200 Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 4. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0, plísně (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený perilla zelená vodný kmín vodný neošetřený perilla červená vodný název vzorku 36

37 Komentář výsledků: Mezi ošetřeními byl velmi vysoce průkazný rozdíl, a to mezi vzorkem perila zelená vodný a ostatními vzorky. Nejvyšší účinnost vykazoval vzorek kmín vodný, zatímco vzorek perila zelená vodný svoji účinnost na plísně a kvasinky ztratil. Tabulka 5.5 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 8. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření ** Chyba ** udávají statisticky vysoce průkazný rozdíl Tabulka 5.6 Průměrné hodnoty počtu plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 v 8. týdnu ošetření Faktor Plísně a kvasinky ošetřený 0,122 a neošetřený 19,780 c Ošetření kmín vodný 5000 b perila červená vodný 0,694 a perila zelená vodný 5000 b Graf 5.3 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 8. týdnu ošetření 6000 Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzrocích po 8. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0, plísně (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený perilla zelená vodný kmín vodný neošetřený perilla červená vodný název vzorku 37

38 Graf 5.4 Graf průměrných hodnot vzorků po 8. týdnu ošetření v porovnání s mezní hodnotou 10 5 Pozn. Mezní hodnota 10 5 je označena oranžovou přímkou. Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními existoval vysoce průkazný rozdíl viz Tabulka 5.5. Vzorky kmín vodný a perila zelená vodný během skladování zplesnivěly, proto měly pro výstižnější statistické vyhodnocení přidělenu hodnotu Nejnižší hodnotu plísní a kvasinek ze vzorků ošetřených rostlinnými extrakty měl vzorek perila červená vodný. Graf 5.4 ukazuje, že mezní hodnotu 10 5 počtu plísní a kvasinek povolenou v potravinářství překročily pouze zplesnivělé vzorky kmín vodný a perila zelená vodný, tudíž by byly pro potravinářské účely nevyhovující. 2. varianta Tabulka 5.7 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 1. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření 5 396,212 79,242 *** Chyba ,038 12,335 Tabulka 5.8 Průměrné hodnoty počtu plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 v 1. týdnu ošetření Faktor Plísně a kvasinky ošetřený 0,2 a neošetřený 10,18 b 38

39 Ošetření aksamitník lihový dobromysl lihový konopí lihový vlaštovičník lihový 0,436 a 2,338 a 0,224 a 0,07 a Graf 5.5 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 1. týdnu ošetření Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 1. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0,95 plísně ošetřený neošetřený aksamitník dobromysl konopí vlaštovičník název vzorku Komentář výsledků: Mezi ošetřeními existoval velmi vysoce průkazný rozdíl, a to mezi kontrolním vzorkem neošetřený a ostatními vzorky. Nejvyšší působnost na plísně a kvasinky ze vzorků ošetřených rostlinnými extrakty vykazoval vzorek vlaštovičník lihový, nejnižší vzorek dobromysl lihový. Tabulka 5.9 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 4. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření , ,125 Chyba ,8 1410,95 39

40 Graf 5.6 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 4. týdnu ošetření 100 Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 4. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0, plísně ošetřený neošetřený aksamitník dobromysl konopí vlaštovičník název vzorku Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Z Grafu 5.6 ale vyplývá, že vliv rostlinných extraktů na omezení růstu a množení plísní a kvasinek byl vyšší než u kontrolního vzorku ošetřený. Tabulka 5.10 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 8. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření ** Chyba Tabulka 5.11 Průměrné hodnoty počtu plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 v 8. týdnu ošetření Ošetření Faktor ošetřený neošetřený aksamitník lihový dobromysl lihový konopí lihový vlaštovičník lihový Plísně a kvasinky 0,122 a 19,78 b 5000 c 0,492 a 0,032 a 0,108 a 40

41 Graf 5.7 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 8. týdnu ošetření 6000 Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 8. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0, plísně (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený neošetřený aksamitník dobromysl konopí vlaštovičník název vzorku Graf 5.8 Graf průměrných hodnot vzorků po 8. týdnu ošetření v porovnání s hraniční hodnotou 10 5 Pozn. Mezní hodnota 10 5 je označena oranžovou přímkou. Komentář výsledků: Mezi ošetřeními existoval vysoce průkazný rozdíl. Kontrolní vzorek ošetřený a vzorky dobromysl lihový, konopí lihový a vlaštovičník lihový byly statisticky vysoce rozdílné jako kontrolní vzorek neošetřený a vzorek aksamitník lihový. Zároveň kontrolní vzorek neošetřený byl vysoce průkazně rozdílný jako vzorek aksamitník lihový. Vzorek aksamitník lihový zplesnivěl, proto měl pro výstižnější statistické vyhodnocení přidělenu hodnotu Nejvyšší účinnost na plísně a 41

42 kvasinky měl vzorek konopí lihový. Graf 5.8 ukazuje, že, kromě vzorku aksamitník lihový, nebyla u ostatních vzorků překročena mezní hodnotu 10 5 počtu plísní a kvasinek povolená v potravinářství. 3. varianta Tabulka 5.12 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 1. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření 5 9,7395 1,9479* Chyba 24 13,1343 0,5472 * značí statisticky průkazný rozdíl Tabulka 5.13 Průměrné hodnoty počtu plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 v 1. týdnu ošetření Faktor Plísně a kvasinky ošetřený 0,2 a neošetřený 1,802 b aksamitník lihový 0,912 ab Ošetření kmín lihový 0,118 a konopí lihový 0,5 ab perila červená vodný 0,438 ab 42

43 Graf 5.9 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 1. týdnu ošetření 3,0 Počet plísní (tis. KTJ.g-1) ve vzorcích po 1. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0,95 2,5 2,0 plísně (tis. KTJ.g -1 ) 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0 ošetřený aksamitník lihový konopí lihový neošetřený kmín lihový perilla červená vodný název vzorku Komentář výsledků: Mezi ošetřeními existoval průkazný rozdíl, a to mezi kontrolním vzorkem neošetřený a kontrolním vzorkem ošetřený a vzorkem kmín lihový. Vzorek kmín lihový vykazoval (Graf 5.9 ) i nejnižší průměrnou hodnotu plísní a kvasinek. Tabulka 5.14 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 4. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření ,8 Chyba ,6 43

44 Graf 5.10 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 4. týdnu ošetření Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 4. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0,95 plísně (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený aksamitník lihový konopí lihový neošetřený kmín lihový perilla červená vodný název vzorku Komentář výsledků: Mezi ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Graf 5.10 ale ukazuje, že nejnižší průměrné hodnoty plísní a kvasinek byly u kontrolního vzorku ošetřený, z hlediska vzorků ošetřených rostlinnými extrakty byl nejvyšší efekt na plísně a kvasinky u vzorku aksamitník lihový. Tabulka 5.15 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 8. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření , ,92 Chyba , ,83 44

45 Graf 5.11 Průměrný počet plísní a kvasinek v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 8. týdnu ošetření 500 Počet plísní (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 8. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0, plísně (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený aksamitník lihový konopí lihový neošetřený kmín lihový perilla červená vodný název vzorku Graf 5.12 Graf průměrných hodnot vzorků po 8. týdnu ošetření v porovnání s hraniční hodnotou 10 5 Pozn. Mezní hodnota 10 5 je označena modrou přímkou. Komentář výsledků: Mezi ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Nejlepší účinky na plísně a kvasinky byly zaznamenány u kontrolního vzorku ošetřený a vzorku aksamitník lihový. Graf 5.12 ukazuje, že mezní hodnotu 10 5 plísní a kvasinek povolenou v potravinářství překročil jediný vzorek, a to perila červená vodný. 45

46 5.2.2 Celkový počet mikroorganismů (CPM) 1. varianta Tabulka 5.16 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po1. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření Chyba Graf 5.13 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po1. týdnu ošetření 2500 Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 1. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0, CPM ošetřený perilla zelená vodný kmín vodný neošetřený perilla červená vodný název vzorku Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Z Grafu 5.13 je ale viditelné, že nejvyšší účinnost z hlediska CPM měl ze vzorků ošetřených rostlinnými extrakty vzorek perila zelená vodný. Tabulka 5.17 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 4. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření Chyba

47 Graf 5.14 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 4. týdnu ošetření CPM ošetřený Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 4. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0,95 perilla zelená vodný kmín vodný neošetřený perilla červená vodný název vzorku Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Graf 5.14 ale ukazuje, že nejvyšší vliv na CPM ze vzorků ošetřených rostlinnými extrakty měl vzorek perila červená vodný, nejnižší vliv poté vzorek perila zelená vodný. Tabulka 5.18 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 8. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření *** Chyba Tabulka 5.19 Průměrné hodnoty CPM v tis. KTJ.g -1 v 8. týdnu ošetření Ošetření Faktor ošetřený neošetřený kmín vodný perila červená vodný perila zelená vodný CPM 101,8 a 2014,48 a 7000 b 16,08 a 7000 b 47

48 Graf 5.15 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 8. týdnu ošetření CPM (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 8. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0,95 perilla zelená vodný kmín vodný neošetřený perilla červená vodný název vzorku Graf 5.16 Graf průměrných hodnot vzorků po 8. týdnu ošetření v porovnání s hraniční hodnotou 10 4 Pozn. Mezní hodnota 10 5 je označena modrou přímkou. Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními byl statisticky velmi vysoce průkazný rozdíl. Vzorky perila zelená vodný a kmín vodný v 8. týdnu ošetření zplesnivěly, proto měly pro výstižnější statistické vyhodnocení přidělenu hodnotu Graf 5.15 navíc ukazuje, že nejvyšší vliv na CPM měl vzorek perila červená vodný. Všechny zkoušené vzorky značně překročily mezní hodnotu 10 4 stanovenou pro 48

49 celkový počet mikroorganismů v potravinářství (Graf potravinářské účely zcela nevyhovující. 5.16), byly by tedy pro 2. varianta Tabulka 5.20 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 1. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření ,8 Chyba Graf 5.17 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po1. týdnu ošetření 1000 Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 1. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0, CPM ošetřený neošetřený aksamitník dobromysl konopí vlaštovičník název vzorku Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Z Grafu 5.17 je patrné, že rostlinný extrakt z aksamitníku lihového měl hned po kontrolním vzorku ošetřený nejvyšší vliv na celkový počet mikroorganismů. Tabulka 5.21 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 4. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření

50 Chyba Graf 5.18 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 4. týdnu ošetření 2500 Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 4. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0, CPM (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený neošetřený aksamitník dobromysl konopí vlaštovičník název vzorku Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Nejvyšší účinnost na CPM ze vzorků ošetřených rostlinnými extrakty měl vzorek dobromysl lihový, nejnižší vzorek aksamitník lihový (Graf 5.18). Tabulka 5.22 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 8. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření ** Chyba Tabulka 5.23 Průměrné hodnoty CPM v tis. KTJ.g -1 v 8. týdnu ošetření Faktor CPM Ošetření ošetřený 101,8 a neošetřený 2014,48 a aksamitník lihový 7000 b dobromysl lihový 2062,2 a 50

51 konopí lihový vlaštovičník lihový 3008 ab 3026 ab Graf 5.19 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 8. týdnu ošetření Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 8. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0, CPM (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený neošetřený aksamitník dobromysl konopí vlaštovičník název vzorku Graf 5.20 Graf průměrných hodnot vzorků po 8. týdnu ošetření v porovnání s hraniční hodnotou 10 4 Pozn. Mezní hodnota 10 5 je označena černou přímkou. Komentář výsledků: Kontrolní vzorky ošetřený a neošetřený a vzorek dobromysl 51

52 lihový byly vysoce statisticky rozdílné od vzorku aksamitník lihový, který v průběhu skladování zplesnivěl. Ve statistice měl tudíž tento vzorek pro lepší výstižnost uměle určenou hodnotu Graf 5.20 ukazuje, že všechny vzorky opět přesáhly mezní hodnotu varianta Tabulka 5.24 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 1. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření , ,9 Chyba ,7 1070,99 Graf 5.21 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 1. týdnu ošetření 120 Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 1. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0, CPM ošetřený aksamitník lihový konopí lihový neošetřený kmín lihový perilla červená vodný název vzorku Komentář výsledků: Mezi jednotlivými ošetřeními nebyl statisticky významný rozdíl. Z Grafu 5.21 je patrné, že nejvyšší účinnost na CPM měl vzorek perila červená vodný, nejnižší kontrolní vzorek ošetřený. 52

53 Tabulka 5.25 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 4. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření Chyba Graf 5.22 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 4. týdnu ošetření Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 4. týdnu po ošetření intervaly spolehlivosti 0,95 CPM (tis. KTJ.g -1 ) ošetřený aksamitník lihový konopí lihový neošetřený kmín lihový perilla červená vodný název vzorku Komentář výsledků: Mezi ošetřeními nebyl statisticky průkazný rozdíl. účinnost na CPM vykazoval kontrolní vzorek ošetřený a vzorek kmín lihový. Nejvyšší Tabulka 5.26 Jednofaktorová analýza variance (faktorem je ošetření) po 8. týdnu ošetření Zdroj variability Stupně volnosti Suma čtverců Průměry čtverců Ošetření , ,996*** Chyba ,78 265,199 53

54 Tabulka 5.27 Průměrné hodnoty CPM v tis. KTJ.g -1 v 8. týdnu ošetření Ošetření Faktor ošetřený neošetřený aksamitník lihový kmín lihový konopí lihový perila červená vodný CPM 0,54 a 9,86 a 2,84 a 2,16 a 11,9 a 67,42 b Graf 5.23 Průměrný počet CPM v tis. KTJ.g -1 ve vzorcích po 8. týdnu ošetření CPM ošetřený Počet CPM (tis. KTJ.g -1 ) ve vzorcích po 8. týdnu po ošetření interval spolehlivosti 0,95 aksamitník lihový konopí lihový neošetřený kmín lihový perilla červená vodný název vzorku Graf 5.24 Graf průměrných hodnot vzorků po 8. týdnu ošetření v porovnání s hraniční hodnotou

55 Pozn. Mezní hodnota 10 5 je označena modrou přímkou. Komentář výsledků: Mezi ošetřeními existoval vysoce průkazný rozdíl, a to mezi vzorkem perila červená vodný a ostatními vzorky. Nejnižší hodnota CPM (Graf 5.23) ze vzorků ošetřených rostlinnými extrakty byla u vzorku kmín lihový. Graf 5.24 ukazuje, že vzorky perila červená vodný a konopí lihový překročily mezní hodnotu 10 4 povoleného obsahu CPM v potravinách, tudíž by byly pro potravinářství nevyhovující. 5.3 Stanovení obsahu silice v plodech fenyklu Množství silice v plodech fenyklu bylo analyzováno po 8 týdnech skladování u vzorků ošetřených rostlinnými extrakty a kontrolních vzorků, tzn. ošetřených od dodavatele a neošetřených od dodavatele, o hmotnosti 10 g pomocí metody destilace s vodní parou. Dodavatelem bylo garantováno, že je v 1 kg plodu fenyklu neošetřeného obsaženo 15 ml silice a v 1 kg plodu fenyklu ošetřeného parní sterilací 19 ml silice. Tabulka 5.28 Množství silice v plodech fenyklu Název vzorku Množství silice v ml.kg -1 Fenykl + zkoušený 1. opakování extrakt 1. varianta neošetřený fenykl 11 ošetřený fenykl 16 kmín vodný * - perila červená vodný 8 perila zelená vodný * - 2. varianta aksamitník lihový* - dobromysl lihový 10 konopí lihový 9 vlaštovičník lihový 9 3. varianta neošetřený fenykl 10 55

56 ošetřený fenykl 15 aksamitník lihový 10 kmín lihový 9 konopí lihový 9 perila červená vodný 8 * zplesnivělý vzorek, obsah silice nebyl stanovován Komentář výsledků: Z tabulky informující o množství silice v plodech fenyklu u pokusné varianty 1, 2 a 3 je při porovnání se vstupními daty o obsahu silice v plodech fenyklu od dodavatele zřejmé, že kvantita silice v průběhu skladování u všech vzorků klesla. Nejvyšší pokles silice u vzorků ošetřených rostlinnými extrakty byl zaznamenán u vzorku perila červená vodný (8 ml.kg -1 ), nejnižší u vzorků dobromysl lihový a aksamitník lihový (10 ml.kg -1 ). Poměrně nízké hodnoty silice v plodech fenyklu by mohly být zapříčiněny nejen těkavostí silice, ale i vysokou chybou v opakovatelnosti při vlastní destilaci. 5.4 Ekonomické zhodnocení metody aplikace rostlinných extraktů Cena za ošetření plodového koření parní sterilací se pohybuje v závislosti na množství odebraného materiálu v rozmezí od 1,00 do 1,50 za 1 kg, což činí při současném kurzu české měny 26,50-30,50 Kč za 1 kg. Mikrobiální dekontaminace u celých plodů fenyklu pomocí ozařování ionizujícím zářením standardní dávkou 3-7 kgy stojí, podle údajů společnosti ARTIM spol. s r.o., 8,90 Kč za 1 kg ( 2008). Společnost PRVNÍ JÍLOVSKÁ, a.s. - divize EXAR, zabývající se výrobou rostlinných extraktů, uvádí, že se výše ceny rostlinných extraktů stanovuje na základě koncentrace použitého rozpouštědla a obsahu sušiny. Aktuální ceník extraktů platný od nabízí rostlinné extrakty, jež byly použity pro pokusné účely v této diplomové práci, v cenové relaci: Aksamitník rozkladitý nať - lihový extrakt Kč za 1 kg; Dobromysl obecná nať - lihový extrakt - 115,00 Kč za 1 kg; Kmín kořenný plod - lihový extrakt Kč za 1 kg; Kmín kořenný plod - vodný extrakt Kč za 1 kg; Konopí technické seté nať - lihový extrakt - 200,00 Kč za 1 kg; Vlaštovičník větší nať - lihový extrakt - 135,00 Kč za 1 kg. Při úvaze 257 ml jako průměrné spotřeby extraktu na 1 kg plodu fenyklu byla cena ošetření - viz Tabulka

57 Tabulka 5.29 Ekonomické porovnání jednotlivých metod ošetření koření Způsob úpravy koření Cena v Kč na 1 kg plodů fenyklu sterilace vodní parou 26,50-30,50 ozařování ionizujícím zářením 8,90 aplikace extraktů rostlin aksamitník rozkladitý nať - lihový extrakt 54,0 dobromysl obecná nať - lihový extrakt 28,80 kmín kořenný plod - lihový extrakt 37,30 kmín kořenný plod - vodný extrakt 27,0 konopí technické seté nať- lihový extrakt 51,40 vlaštovičník větší nať - lihový extrakt 34,70 Pozn. Údaje o ceně rostlinného extraktu perily křovité formy červenolistá a zelenolistá nejsou k dispozici, protože rostliny byly získány od soukromého pěstitele zdarma a samotný extrakt byl připraven na Ústavu pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství. Komentář výsledků: Aplikace rostlinných extraktů na plodové koření vycházela v porovnání se sterilací vodní parou a s ozařováním ionizujícím zářením jako metoda nejdražší (průměrná cena za ošetření 1 kg plodového koření je 38,90 Kč). V nákladech na ošetření byla zahrnuta pouze cena za rostlinný extrakt, nikoli další významné nákladové položky, např. spotřebovaná energie, cena za přístroje a zařízení, lidský faktor atd. 57

58 6 DISKUZE A ZÁVĚR Aplikace rostlinných extraktů - přírodní a netoxický způsob likvidace stávající mikrobiální kontaminace a bránící vzniku nové - je možnou alternativou metodám sterilace vodní parou a ozařování ionizujícím zářením běžně užívaným pro potravinářské účely. Rostlinné extrakty a silice z rostlin byly hodnoceny v řadě studií a výzkumů, kde byl sledován vliv především na plísně a bakterie u potravin typu maso, mléko a sýry (TASSOU et al., 2004) nebo na čisté kultury mikroorganismů (TUCHILA et al., 2008; DAMJANOVIAE-VRATNICA et al., 2008; ROTA et al. 2004). V těchto hodnoceních však nebylo doposud zahrnuto žádné koření. Koření je přitom každodenně používanou ingrediencí do jídel a dalších potravinářských výrobků. Udržet mikrobiální čistotu, a tedy i tolik důležitou kvalitu, by mělo být prioritou každého výrobce a zpracovatele koření. Tato diplomová práce se snažila dát odpověď na otázku, zda je reálné využití rostlinných extraktů, u kterých byla potvrzena mikrobiální aktivita, na ochranu plodového koření, konkrétně Foeniculum vulgare var. vulgare, proti mikrobiálnímu znečištění v průběhu skladování. Jako kontrolní vzorky byly zvoleny plody fenyklu ošetřené od dodavatele parní sterilací a neošetřené. Výzkum byl zaměřen na zjišťování množství KTJ na 1 g plodového koření u vzorků a kontrolních vzorků po jednotlivých týdnech ošetření, nikoli však již na přesnou determinaci druhů mikroorganismů, jak tomu bylo u řady jiných zahraničních studií zkoumajících antimikrobiální vliv rostlinných extraktů a silic v potravinářském odvětví. Ze statistického vyhodnocení a grafických znázornění lze stanovit závěr, že jak rostlinné extrakty, tak i kontrolní ošetření vodní parou významně působily na plísně a kvasinky, a to tím způsobem, že po 8 týdnech od ošetření byla průměrná hodnota kolonií plísní a kvasinek pod mezní hodnotou 10 5 povolenou v potravinářství, pokud ovšem vzorky v průběhu skladování nezplesnivěly chybou např. nedokonalého vysušení vzorků po aplikaci rostlinného extraktu. Jediný vzorek, který hranici 10 5 přesáhl, byl vzorek perila červená vodný u 3. varianty. U celkového počtu mikroorganismů (CPM), vyjma plísní a kvasinek, byla po 8 týdnech skladování u vzorků, ale i u kontrolního vzorku ošetřený několikanásobně překročena 58

59 hraniční hodnota 10 4 stanovená pro potraviny, tudíž se staly pro potravinářství nevyhovující. Výjimka byla pouze u 3. varianty v 8. týdnu po ošetření, kdy vzorky kmín lihový, aksamitník lihový a kontrolní vzorky ošetřený a neošetřený tento limit splnily. Hraniční hodnoty 10 5 pro plísně a kvasinky a 10 4 pro celkový počet mikroorganismů byly převzaty od autorů GÖRNER, VALÍK, 2004, kteří je uvádí jako mikrobiologické limity pro koření ve státech EU. V České republice dříve limity pro koření upřesňovala vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení. Po zrušení této vyhlášky bylo začleněno do českých právních norem Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny, které se již koření konkrétně nevěnuje. Efektivita rostlinných extraktů na mikroorganismy v průběhu 8 týdenního vyhodnocování u jednotlivých variant kolísala, dokonce některé vzorky vykazující výborné výsledky na plísně a kvasinky v závěru vyhodnocování zplesnivěly, např. kmín vodný u 1. varianty či aksamitník lihový u 2. varianty. Za nejúčinnější rostlinné extrakty na plísně a kvasinky, eventuálně za dobře a stabilně působící rostlinné extrakty, se by se mohly považovat: lihový extrakt aksamitníku rozkladitého (u 3. varianty se zaplísněním problémy nebyly), lihový extrakt kmínu kořenného, lihový extrakt konopí setého a lihový extrakt vlaštovičníku většího. Také u kontrolního vzorku ošetřený byly kolonie plísní a kvasinek na velmi nízké úrovni. Celkový počet mikroorganismů významněji regulovaly lihové extrakty z aksamitníku rozkladitého, kmínu kořenného, konopí setého a kontrolní ošetření vodní parou. Podle výsledků tedy lihové extrakty dosahovaly velmi vysoké efektivnosti. V úvahu se u nich ovšem musí brát nejen působnost rostlinného extraktu, ale také konzervační účinnost samotného lihu. Všechny rostlinné extrakty byly připraveny z 35% lihu, nicméně podle zvyklostí má líh sterilační působnost až od 70 % (RŮŽIČKOVÁ, 2009). Co se týče ekonomické stránky metody aplikace rostlinných extraktů, jedná se o metodu finančně náročnější. Do nákladů byly započítány pouze ceny extraktů, avšak nikoli další důležité položky, které by cenu za aplikaci ještě významně navýšily. Průměrná cena za ošetření byla 38,90 Kč za 1 kg plodového koření. Nejvýhodněji by se jevilo ošetření koření ozářením ionizujícím zářením (8,90 Kč.kg -1 u společnosti ARTIM spol. s r.o.). Tento způsob ošetření ale vyvolává u spotřebitelů jisté pochybnosti o kvalitě a nezávadnosti takto upravených potravin. 59

60 V diplomové práci byla potvrzena skutečnost, že vybrané rostlinné extrakty mají antimikrobiální účinky, a to především na plísně a kvasinky. Při vhodných poměrech sušina/rozpouštědlo, koncentracích použitých extraktů, přijatelné ceně za extrakty, technické vybavenosti a po provedení dalších výzkumů by bylo možné tuto metodu plnohodnotně využít v potravinářství na ochranu plodového koření proti mikrobiální kontaminaci. Pro rekapitulaci: 1. rostlinné extrakty s účinnou aktivitou proti plísním a kvasinkám - lihový extrakt aksamitníku rozkladitého - lihový extrakt kmínu kořenného - lihový extrakt konopí setého - lihový extrakt vlaštovičníku většího 2. rostlinné extrakty s účinkem na celkový počet mikroorganismů (CPM) - lihový extrakt aksamitníku rozkladitého - lihový extrakt kmínu kořenného - lihový extrakt konopí setého 60

61 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY 1. ARAUJO, C. (ed.). Activity of essential oils from Mediterranean Lamiaceae species against food spoilage yeasts. JOURNAL OF FOOD PROTECTION, 2003, Vol. 66, s BRANŽOVSKÝ, I. (ed.). Situační a výhledová zpráva: Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny. Praha: Ministerstvo zemědělství ČR, s. ISBN BRANŽOVSKÝ, I. (ed.). Situační a výhledová zpráva: Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny. Praha: Ministerstvo zemědělství ČR, s. ISBN BUČKOVÁ, A. Praktické cvičenia z farmakognózie: Chemická časť. 3. vyd. Bratislava: Univerzita Komenského, ISBN CARMO, E., S. (ed.). The potential of Origanum vulgare L. (Lamiaceae) essential oil in inhibiting the growth of some food-related Aspergillus species. BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY, 2008, Vol. 39, s ČESKÝ LÉKOPIS Praha: Grada Publishing a.s., ISBN DAMASIUS, J. (ed.). Antioxidant and antimicrobial properties of caraway (Carum carvi L.) and cumin (Cuminum cyminum L.) extracts. VETERINARIJA IR ZOOTECHNIKA, 2007, Vol. 40, s DAMJANOVIAE-VRATNICA, B. (ed.). Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil of wild-growing Salvia officinalis L. from Montenegro. JOURNAL OF ESSENTIAL OIL BEARING PLANTS, 2008, Vol. 11, s DRAŠNAROVÁ, Z., BUCHTOVÁ, I. Situační a výhledová zpráva: Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny. Praha: Ministerstvo zemědělství ČR, s. ISBN FAKOOR, M., H., RASOOLI, I. Pathogen control by antioxidative characteristics of Cuminum cyminum and Rosmarinus officinalis essential oils. PROCEEDINGS OF THE INTERNATIONAL WORKSHOP ON MEDICINAL AND AROMATIC PLANTS, Book Series: ACTA HORTICULTURAE, 2008, Vol. 786, s GARCIA, V., P. (ed.). Biosynthesis of antitumoral and bactericidal sanguinarine. JOURNAL OF BIOMEDICINE AND BIOTECHNOLOGY, 2006, Art. No

62 12. GÖRNER, F., VALÍK L. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava: Malé centrum, s. ISBN GREENWAY, R., I., SVOBODA, K., P. Secretory structures of medicinal and aromatic plants. Medicinal Plants and Their Uses. Conference of Association od Applied Biologists, Imperial College, London, HECTOR, J., R. (ed.). Malagasy aromatic plants: Essential oils, antioxidant and antimicrobial activities. FUTURE FOR MEDICINAL AND AROMATIC PLANTS, Book Series: ACTA HORTICULTURAE, 2004, s IBRAHIM, H., R. (ed.). Enhanced antimicrobial action of lysozome against gramnegative and gram-positive bakteria due to modification with perillaldehyde. JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, 1994, Vol. 42, s KALÁČKOVÁ, P. Mikrobiologická čistota kmínu kořenného (Carum carvi L.) během skladování. Diplomová práce, AF MZLU Brno, KANG, R. (ed.). Antimicrobial activity of the volatile constituents of Perilla - frutescens and its synergistic effects with polygodial. JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, 1992, Vol. 40, s KOKOŠKA, L. (ed.). Screening of some Siberian medicinal plants for antimicrobial aktivity. JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY, 2002, Vol. 82, s KOPEC, K., BALÍK, J. Kvalitologie zahradnických produktů : nauka o hodnocení a řízení jakosti produktů a produkčních procesů. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, s. ISBN KRAJČOVÁ, E. (ed.). Study of antimicrobial activity of selected plant extracts against bacterial food contaminants. JOURNAL OF FOOD AND NUTRITION RESEARCH, 2008, Vol. 47, s LACOBELLIS, N., S. (ed.). Antibacterial activity of Cuminum cyminum L. and Carum carvi L. essential oils. JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, 2005, Vol. 53, s LAWRENCET, B., M. Essential oil: from agriculture to chemistry. THE INTERNATIONAL JOURNAL OF AROMATHERAPY, 2001, Vol. 10, s MARES, D. (ed.). Antifungat activity of Tagetes patula extracts on some phytopathogenic fungi: ultrastructural evidence on Pythium ultimum. 62

63 MICROBIOLOGICAL RESEARCH, 2004, Vol. 159, s MICHALOVÁ, I. Ošetřování potravin ionizací. Potravinářská revue, 2004, č. 2, s NEDĚLNÍK, J., MORAVCOVÁ, H. Současný pohled na problematiku mykotoxinů. Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2005, Sborník příspěvků, 2005, s NOVÁK, J. (ed.). Essential oils of different cultivars of Cannabis sativa L. and their antimicrobial aktivity. FLAVOUR AND FRAGRANCE JOURNAL, 2001, Vol. 16, s OSTRÝ, V. Plísně a potraviny - Mykotoxiny v potravinách 2. část. Potravinářská revue, 2006, č. 2, s PETER, K. V., TASSOU, C., C. (ed.) Handbook of herbs and spices. Boca Raton: CRC Press, Woodhead Publishing in food science and technology. ISBN PRUGAR, J., DUŠEK, K., POLIŠENSKÁ, J. Kvalita rostlinných produktů na prahu 3. tisíciletí Praha: Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., s. ISBN RASOOLI, I. (ed.). Antimycotoxigenic characteristics of Rosmarinus officinalis and Trachyspermum copticum L. essential oils. INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, 2008, Vol. 122, s ROTA, C. (ed.). In vitro antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants against selected foodborne pathogens. JOURNAL OF FOOD PROTECTION, 2004, Vol. 67, s SIMIC, A. (ed.). Essential oil composition of Cymbopogon winterianus and Carum carvi and their antimicrobial activities. PHARMACEUTICAL BIOLOGY, 2008, Vol. 46, s SOUZA, E., L. de (ed.). Interference of heating on the antimicrobial activity and chemical composition of Origanum vulgare L. (Lamiaceae) essential oil. CIENCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, 2008, Vol. 28, s STARÝ, F. Zahradnický slovník naučný 3. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací s. ISBN STÁVKOVÁ, J. Biometrika. Brno: Vysoká zemědělská škola v Brně, s. 63

64 ISBN SVOBODA, K., P. (ed.). Secretory Structures of Aromatic and Medicinal Plants. Knighton: Microscopix Publications, ISBN TUCHILA, C. (ed.). Evaluation of the antimicrobial activity of some plant extracts used as food additives. JOURNAL OF FOOD AGRICULTURE & ENVIRONMENT, 2008, Vol. 6, s VALÍČEK, P. Koření a jeho léčivé účinky. Benešov: START, s. ISBN VALÍČEK, P. Pochutiny a koření. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, s. ISBN VELÍŠEK, J. Chemie potravin 3. Tábor: OSSIS, s. ISBN VELÍŠEK, J. Chemie potravin 3. Tábor: OSSIS, s. ISBN Internetové zdroje 1. ARTIM spol. s r.o. /Dekontaminace a desinsekce potravin a potravinářských surovin/ [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < 2. ČASOPIS MASO. /Koření v masných výrobcích V. - Majoránka zahradní/. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < 3. ČESKÝ STATISTICKÝ ÚŘAD. /Ediční plán/. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < < < < 4. EHGA. /EHGA Inventory - Production of Herbs in existing and incoming memberstates of European Union/. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < 5. ETIA. /Equipment catalog /. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < 64

65 6. KYSILKA, J. /Silice/. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < 7. OSTERHOLM, M., T., NORGAN, A., P. /The Role of Irradiation in Food Safety./ Přel. Plesník, V. [online] [cit ] Dostupné na World Wide Web: < 8. REVTECH. /Food Industry/. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < 9. SAFESTERIL. /Safesteril - steam sterilization/. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < 10. Slovenský liekopis [CD-ROM] Bratislava: HERBA spol. s.r.o., ŠTOLCOVÁ, M. /Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny/. [online] [cit ]. Dostupné na World Wide Web: < Právní předpisy 1. Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 331/1997 Sb., kterou se provádí zákon č. 110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů pro koření, jedlou sůl, dehydratované výrobky a ochucovadla a hořčici. Sbírka zákonů ČR Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 53/2002 Sb., kterou se stanoví chemické požadavky na zdravotní nezávadnost jednotlivých druhů potravin a potravinových surovin, podmínky použití látek přídatných, pomocných a potravních doplňků. Sbírka zákonů ČR Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení. Sbírka zákonů ČR Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 133/2004 Sb. o podmínkách ozařování potravin a surovin, o nejvyšší přípustné dávce záření a o způsobu označení ozáření na obalu. Sbírka zákonů ČR Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny ve znění Nařízení komise (ES) č. 1441/

66 Ústní sdělení RŮŽIČKOVÁ, G. [cit ]. 66

67 8 PŘÍLOHY Seznam obrázků Obr. 8.1 Plísně a kvasinky - kontrolní vzorek: Ošetřený - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.2 Plísně a kvasinky - kontrolní vzorek: Neošetřený - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.3 Plísně a kvasinky - vzorek: Vodný extrakt perila křovitá typu zelenolistá - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.4 Plísně a kvasinky - vzorek: Vodný extrakt perila křovitá typu červenolistá - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.5 Plísně a kvasinky - vzorek: Vodný extrakt kmín - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.6 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt aksamitník - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.7 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt dobromysl - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.8 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt konopí - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr. 8.9 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt vlaštovičník - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt kmín - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Vodný extrakt perila křovitá typu červenolistá - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt aksamitník - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt dobromysl - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt konopí - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt vlaštovičník - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) 67

68 Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt kmín - po 3 týdnech skladování (Staňková, B ) 68

69 Obr. 8.1 Plísně a kvasinky - kontrolní vzorek: Ošetřený - po 3 týdnech skladování Obr. 8.2 Plísně a kvasinky - kontrolní vzorek: Neošetřený - po 3 týdnech skladování Obr. 8.3 Plísně a kvasinky - vzorek: Vodný extrakt perila křovitá typu zelenolistá - po 3 týdnech skladování Obr. 8.4 Plísně a kvasinky - vzorek: Vodný extrakt perila křovitá typu červenolistá - po 3 týdnech skladování

70 Obr. 8.5 Plísně a kvasinky - vzorek: Vodný extrakt kmín - po 3 týdnech skladování Obr. 8.6 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt aksamitník - po 3 týdnech skladování Obr. 8.7 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt dobromysl - po 3 týdnech skladování Obr. 8.8 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt konopí - po 3 týdnech skladování

71 Obr. 8.9 Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt vlaštovičník - po 3 týdnech skladování Obr Plísně a kvasinky - vzorek: Lihový extrakt kmín - po 3 týdnech skladování Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Vodný extrakt perila křovitá typu červenolistá - po 3 týdnech skladování Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt aksamitník - po 3 týdnech skladování

72 Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt dobromysl - po 3 týdnech skladování Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt konopí - po 3 týdnech skladování Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt vlaštovičník - po 3 týdnech skladování Obr Celkový počet mikroorganismů - vzorek: Lihový extrakt kmín - po 3 týdnech skladování