Acta fytotechnica et zootechnica Mimoriadne číslo Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitriae, 2009, s

Transkript

1 Acta fytotechnica et zootechnica Mimoriadne číslo Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitriae, 2009, s MOŽNOST STANOVENÍ CHOLESTEROLU, STIGMASTEROLU A SITOSTEROLU V ROSTLINNÝCH A ŽIVOČIŠNÝCH TUCÍCH METODOU HPLC POSSIBILITY OF CHOLESTEROL, STIGMASTEROL, AND SITOSTEROL DETERMINATION IN VEGETABLE AND ANIMAL FATS BY HPLC METHOD Ivana BORKOVCOVÁ, Michaela DRAČKOVÁ, Bohumíra JANŠTOVÁ, Lenka VORLOVÁ Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Česká republika Abstract: The aim of this study was to develop a rapid and reliable method for the determination of selected sterols in fats of animal and vegetable origin, which will be an alternative to the capillary gas chromatography, i.e. the Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP HPLC) method. Concentration levels of cholesterol, stigmasterol, and sitosterol were estimated in fresh butter, butter with added vegetable fat, and in margarines. Prior to the final RP HPLC analysis the saponification step with methanolic potassium hydroxide solution was used, followed by the extraction of the unsaponificable residue into n-hexane. Final HPLC determination on the C8 reverse phase was performed in the isocratic mode with mobile phase methanol-water (95:5) and UV detection at 205 nm. For the identification and quantitation of analytes the external standard method was used. The detection limits (LOD) determined on the basis of blank samples analysis were 5 and 15 mg.kg -1. The recovery ranged between %, and the repeatibility expressed as RSD of 12 paralel samples measurements was %. The parameters of the RP HPLC method were compared with the parameters of the GC determination. Key words: sterols, animal fat, vegetable fat, HPLC Cholesterol, sitosterol a stigmasterol jsou sloučeniny s obdobnou chemickou strukturou, jde o polycyklické isoprenoidní sloučeniny s hydroxylovou funkční skupinou. Cholesterol je typicky živočišný sterol, mléčný tuk ho např. obsahuje minimálně 95 98%, stigmasterol a sitosterol jsou řazeny mezi fytosteroly, vyskytující se převážně v tucích rostlinného původu. Jak cholesterol, tak fytosteroly se v matrici vyskytují buď volné nebo ve formě jejich esterů. (CARERI, 2001) Vliv cholesterolu na lidské zdraví je považován za negativní, jeho přívod z potravy je dáván do přímého vztahu s výskytem artherosklerotických a kardiovaskulárních onemocnění Naopak je známo, že fytosteroly vykazují celou řadu kladných vlastností, působí proti kardiovaskulárním onemocněním, jsou to antioxidanty a snižují negativní účinek cholesterolu (tzv. cholesterol-lowering effect ). Z těchto důvodů jsou fytosteroly přidávány např. k mléčným výrobkům, na našem i zahraničním trhu je dostupný zvyšující se počet výrobků s přidanými rostlinnými steroly nebo jejich estery. Vedle cholesterolu tak u těchto výrobků nacházíme zvyšující se procento dalších sterolů, zejména sitosterolu a stigmasterolu. Dalším důvodem zvýšeného obsahu fytosterolů v mléčných výrobcích může být falšování mléčného tuku přídavkem tuků rostlinných (CARERI, 2001). Stanovením sterolů v mléčných výrobcích získáme tedy jednak informace důležité z nutričního hlediska, tj. údaje o koncentraci celkového cholesterolu a také detekujeme přítomnost rostlinných tuků přidaných buď ze zdravotních důvodů nebo při falšování mléčného tuku. (CONTARINI, 2002) Zájem í o fyziologické vlastnosti sterolů stále vzrůstá, je tedy důležité získat přesná kvantitativní data o výskytu těchto nutričně významných lipidů v potravinách pomocí rychlých a přesných analytických metod. Pro stanovení sterolů se používá celá řada analytických metod, nejčastěji kapilární plynová chromatografie s plamenově ionizační (FID) a hmotnostní (MS) detekcí. Kapalinová chromatografie, která je méně častá, využívá stanovení jak na normální, tak na reverzní fázi s UV/PDA detekcí nebo detekcí pomocí detektoru rozptýleného světla ELSD (FENTON, 1992; ABIDI, 2001) Pro stanovení celkového obsahu sterolů je třeba je uvolnit z esterifikované formy, proto finálnímu stanovení obvykle předchází saponifikace vzorku. 64

2 Cílem naší práce bylo vyvinout rychlou a spolehlivou metodu pro stanovení sterolů v živočišných a rostlinných tucích metodou alternativní k plynové chromatografii, tj. metodu kapalinové chromatografie na reverzní fázi. Byla vyvinuta metoda pro extrakci a stanovení celkového cholesterolu, stigmasterolu a sitosterolu v matricích živočišného původu bohatého na cholesterol s eventuální příměsí nejčastěji se vyskytujících fytosterolů stigmasterolu a sitosterolu. Izolace sledovaných analytů ze vzorku spočívala v saponifikaci tukového podílu methanolickým roztokem KOH, následovaná extrakcí nesaponifikovatelného zbytku do nepolárního rozpouštědla, n-hexanu. Finální stanovení bylo prováděno kapalinovou chromatografií na reverzní fázi C8 s izokratickou elucí a detekcí v UV oblasti. Materiál a metody Vzorky Obsah cholesterolu, stigmasterolu a sitosterolu byl sledován u čerstvého másla, stolního másla, másla s přídavkem rostlinného tuku, margarinu a soleného másla. Vzorky byly získány z obchodní sítě v České republice. Použitelnost metody byla testována na těchto vzorcích: máslo čerstvé, mlékárna Olešnice, 82 % mléčného tuku, máslo čerstvé, Laktos, 82 % mléčného tuku, máslo čerstvé, MILKPOLm, Polsko, 82 % mléčného tuku, máslo s přídavkem rostlinného tuku Masielko, MILSY, Bánovce n/b., 20 % mléčný tuk, 80% rostlinný tuk, máslo s přídavkem rostlinného tuku Zlatá Haná, OLMA, 15 % mléčný tuk, 76% rostlinný tuk, máslo s přídavkem rostlinného tuku Créme Bonjour, Unilever, 48,6 % rostlinného tuku, Slané irské máslo KERRYGOLD, 80% mléčného tuku, máslo solené s krystalky mořské soli, 80 % mléčného tuku, Máslo solené English Butter, 80% mléčného tuku, margarin Perla, jogurtová příchuť, Unilever, 39 % tuku, margarin Diana light, Kaka CZ, Jeneč, 40% tuku, margarin Rama Classic, Unilever, 60% tuku, máslo stolní OLMA, 83% mléčného tuku. Chemikálie a standardy: Cholesterol (grade I, approx. 99%, Sigma Aldrich, USA) stigmasterol (approx. 95%, Sigma- Aldrich, USA), β-sitosterol (80%, Extrasynthese, Francie), methanol, n-hexan, isopropylalkohol (Merck, Německo), fenolftalein, hydroxid draselný, síran sodný (Penta, ČR). Všechny použité chemikálie byly p.a. nebo HPLC kvality. Standardní referenční materiál 1845 (Cholesterol in Whole Egg Powder, NIST, USA). Příprava standardních roztoků. Zásobní roztok cholesterolu, stigmasterolu a β-sitosterolu o koncentraci 1000 mg.l -1 byl připraven rozpuštěním těchto standardů ve směsi methanol/n-hexan (10:1). Pro stanovení plynovou chromatografií byl připraven zásobní roztok standardů v hexanu.. Tyto zásobní roztoky jsou při skladování v temnu při teplotě 4 0 C stálé něklik měsíců. Pracovní roztoky o koncentraci mg.l -1 pro kapalinovou chromatografii byly získány naředěním zásobního roztoku do methanolu, pro plynovou chromatografii ředěním do n-hexanu. Byla testována stabilita těchto pracovních standardů během jednoho analytického cyklu (intra-day) i v několika po sobě následujících dnech (inter-day) a nebyly shledány významné změny po dobu minimálně 3 dnú. Příprava vzorku 1 g vzorku tuku byl rozpuštěn v 10 ml isopropylalkoholu. 1ml tohoto roztoku byl umístěn do 50 ml baňky, k němu byl dále přidán roztok 10 mol.l -1 hydroxidu draselného v methanolu (1 : 9) a směs zahřívána pod refluxem po dobu 30 minut. Po ochlazení na laboratorní teplotu bylo přidáno 5 ml deionizované vody a 10 ml n-hexanu a intenzivně třepáno po dobu 20 minut. Po oddělní vrstev byla hexanová fáze odebrána pomocí separačního nástavce, promyta vodou do neutrální reakce (kontrola fenolftaleinem) a vysušena bezvodým síranem sodným. Z alikvotního podílu této směsi (5 7 ml) byl odpařen hexan, odparek byl rekonstituován v 1 ml methanolu, přefiltrován přes nylonový 65

3 membránový filtr 45 μm a podroben HPLC analýze. Paralelně byl hexanový extrakt analyzován přímým nástřikem metodou plynové chromatografie. Podmínky HPLC stanovení Obsah cholesterolu, stigmasterolu a sitosterolu byl stanoven metodou HPLC na reverzní fázi. Pro dělení bylo použito chromatografické kolony Zorbax Eclipse XDB C8, 150x4,6 mm, 5μm (Agilent, USA). Analýzy byly prováděny na kapalinovém chromatografu Alliance 2695 (Waters, USA) s detektorem PDA Detekce byla prováděna v UV oblasti při 205 nm. Bylo použito isokratické eluce, mobilní fází byla směs methanolu a vody (95:5), průtok 0,7 ml.min -1. Teplota kolony byla 35 0 C, velikost nástřiku 10 μl. Doba analýzy byla 14 minut. Sběr a vyhodnocení dat byly prováděny softwarem Empower (Waters, USA). Příklad chromatografického záznamu je uveden na obr. č.1. 0,090 0,080 0,070 0,060 STG - 9,688 AU 0,050 0,040 0,030 chol - 8,627 SIT - 11,021 0,020 0,010 5,034 0,000 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 Minutes Obr.č.1: RP HPLC chromatogram vzorku másla s přídavkem rostlinného tuku. Podmínky HRGC stanovení Paralelní analýzy byly prováděny na plynovém chromatografu 6820 GC System (Agilent, USA) s plamenově ionizační detekcí na kapilární koloně DB 1, 15 m x 0,53 mm, tloušťka filmu 0,5 μm (J&W Scientific, USA). Teplota iinjektoru byla C, teplota detektoru C, byl použit lineární teplotní gradient C s prodlevou 15 min. při C. Průtok nosného plynu N 2 byl 3 ml.min -1. Typ nástřiku splitless. Pro sběr a vyhodnocení dat byl použit software Clarity (DataApex,ČR). Validační parametry Každý vzorek byl analyzován nejméně ve dvou paralelních stanoveních, s každou sérií vzorků byl analyzován slepý vzorek. Vyhodnocení bylo prováděno metodou vnějšího standardu. Detekční limity, tj. meze detekce byly zjištěny z odezev analýz slepých vzorků a jejich standardní odchylky a byly 5,2 mg.kg -1 (cholesterol), 4,8 mg.kg -1 (stigmasterol) a 14,7 mg-kg -1 (β-sitosterol) mg.kg -1 pro HPLC stanovení, pro GC stanovení pak 12,6 mg.kg -1 (cholesterol), 11,8 mg.kg -1 (stigmasterol) a 8,0 mg.kg -1 (β-sitosterol). Linearita byla prokázána na základě hodnot korelačních koeficientů R, jejichž hodnoty jsou uvedeny v tabulce 1. 66

4 Analyt R pro HPLC R pro GC Cholesterol 0,9996 0,9993 Stigmasterol 0,9997 0,9998 β-sitosterol 0,9997 0,9998 Tab. č. 1: Hodnoty korelačních koeficientů stanovovaných sterolů pro HPLC a GC stanovení. Výtěžnost metody byla zjištěna analýzami vzorků s přídavkem standardů o známé koncentraci k matrici másla s přídavkem rostlinného tuku na dvou koncentračních úrovních 10 a 100 mg.kg -1 a pohybovala se v rozmezí 80 92%. Opakovatelnost metody byla stanovena ze 12 paralelních měření vzorku másla s přídavkem rostlinného tuku, odchylka RSD byla 4,2-6,8 % pro HPLC stanovení a 4,6 10,1%. Správnost celého postupu byla ověřena analýzou standardního referenčního materiálu SRM 1845, Cholesterol in Whole Egg Powder určeného pro validaci analytických metod pro stanovení cholesterolu v potravinách živočišného původu a biologického materiálu s obsahem cholesterolu 18,64 g.kg -1. Průměrná nalezená hodnota opakovaných měření (n = 6) byla u obou postupů 17,9 g.kg -1 tedy 95,7 % Výsledky a diskuse Prezentovaná metoda stanovení obsahu celkového cholesterolu a případných dalších sterolů - stigmasterolu a sitosterolu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reversní fázi C8 je rychlou a spolehlivou metodou pro stanovení těchto analytů v mléčných výrobcích s eventuálním přídavkem rrostlinného tuku. Pokud nejde o komplikovanou matrici, nevyžaduje speciálních čistících postupů ani derivatizačních kroků před finálním stanovením. Stanovení na reversní fázi má oproti klasickému stanovení kapalinovou chromatografií na normální fázi tu výhodu, že používá polárnějších a tedy méně těkavých rozpouštědel, methanolu s asi 5% vody a vykazuje lepší reprodukovatelnost retenčních charakteristik a dalších chromatografických parametrů. Parametry RP HPLC metody jsou v souladu s parametry paralelně prováděné kapilární GC, kde se ale pracovalo metodou přímého nástřiku. Zakoncentrováním n-hexanového extraktu pro GC stanovení jsme docílili snížení detekčních limitů, ale v daném uspořádání (kapacita kolony) jsme dosáhli horší opakovatelnosti. Citlivost metody, umožňující stanovení analytů v jednotkách mg.kg -1 je pro jejich stanovení v lipidovém podílu mléčných výrobků dostačující. Súhrn: Cílem práce bylo vyvinout rychlou a robustní metodu pro stanovení vybraných sterolů v tucích živočišného a rostlinného původu alternativní ke kapilární plynové chromatografii. tj. kapalinovou chromatografií na reversní fázi (RP HPLC). Koncentrace cholesterolu, stigmasterolu a sitosterolu byly zjišťovány v máslech čerstvých, stolních, solených, s přídavkem rostlinného tuku a v margarinech. Pro izolaci sledovaných analytů z matrice bylo použito saponifikace methanolickým roztokem hydroxidu draselného a následné extrakce nesaponifikovatelného podílu do n-hexanu. Finální stanovení HPLC na reversní fázi C8 bylo prováděno v isokratickém uspořádání s mobilní fází methanol-voda (95:5) a detekcí v UV oblasti při 205 nm. Vyhodnocení bylo provedeno metodou vnějšího standardu. Detekční limity stanovené z analýz slepých vzorrků byly 5 a 15 mg.kg -1, výtěžnost %, opakovatelnost vyjádřená jako RSD z 12 paralelních měření byla 4,2-6,8 %.Parametry metody byly porovnány s GC stanovením. Klíčová slova: steroly, živočišné tuky, rostlinné tuky, HPLC Práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. 67

5 Literatura ABIDI, S.L Chromatographic analysis of plant sterols in food and vegetable oils. Journal of Chromatography A, 935, CARERI, M., ELVIN, L., MANGIA, A Liquid chromatography UV determination and liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric characterizationof sitosterol and stigmasterol in soybean oil. Journal of Chromatography A, 935, CONTARINI, G., POVOLO, M., BONFITTO, E., BERARDI, S Quantitative analysis of sterols in dairy products: experiences and remarks. International Dairy Journal 12/ FENTON, M Chromatographic separation of cholesterol in foods (review). Journal of Chromatograph, vol. 624 (1-2), Kontaktní adresa: RNDr. Ivana Borkovcová, Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, Brno, Česká republika, borkovcovai@vfu.cz. 68