Relaxace a chemická výměna

Transkript

1 Relaace a chemická výměna ecitace relaace Relaační doby Metody měření relaačních dob Relaační mechanismy Dipól-dipólová relaace Nukleární verhauserův efekt Příklad dynamika trisacharidu hemická výměna + příklady Pár definic Abychom mohli pochopit relaace, je nutné zavést statistický soubor spinů. To je v prai celý vzorek pro NMR měření, čili cca 0 23 spinových systémů. Takový soubor se popisuje pomocí statistické fyziky ( např. Boltzmannovo rozdělení obsazení energetických hladin). Hodnoty fyzikálních veličin v takovém souboru mohou fluktuovat. Magnetizace vzorku, kterou měříme je hustota magnetického dipólového momenu = vektorový součet příspěvků jednotlivých jader / objem vzorku. Proto precese kolem statického magnetického pole neprobíhá pro každý ekvivalentní spin přesně stejnou úhlovou rychlostí, a tedy nemáme nekonečně úzké čáry ve spektru.

2 Detailnější pohled na relaaci jaderné magnetizace Podélná relaace snižování energie souboru jaderných spinů a jeji přenos na mřížku. Příčná relaace ztráta koherence precese mezi jednotlivými spiny Průběh relaace v čase: z M z M y T = 2 s T 2 = 2 s Ω/2π = Hz y M y brázek upraven podle knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, hichester M z M y t t Relaační jevy Relaace je proces navracení spinového systému do rovnováhy (nebo do stacionárního stavu). Fenomenologicky jsou zavedeny dva základní druhy relaace, které se popisují jako eponenciální v čase. To je ve skutečnosti zjednodušení, které platí jen za speciálních podmínek!!!!! Podélná (= longitudinální, spin-mřížková) relaace (T ): Týká se komponenty M z spinové magnetizace, která je rovnoběžná s magnetickým polem v ose z. - Spinový systém ztrácí energii energie se přenáší na okolí (mřížku) ve formě tepla. - Dipolární interakce s ostatnimi spiny, interakce s paramagnetickými částicemi, apod... y M z z Příčná (= transversální, spin-spinová) relaace (T 2 ): z Týká se komponent magnetizace M y, které leží v rovině <y>. - Spin-spinové interakce rozfázují M y -přispívá též nehomogenita magnetického pole. - nemůže být větší než T. y M y

3 Detailnější pohled na příčnou relaaci Rozfázování = ztráta koherence. Důvody: Fluktuace silových polí působících na jednotlivé spiny (síly mohou mít původ ve vzorku samotném nebo v okolí). Statické nehomogenity magnetického pole. y Platí T 2 T (pro běžné vzorky) rozfázování obecně T 2 2T M,y M 0 t Pokles,y-magnetizace M,y při volné precesi: M,y = M 0 ep(-t/t 2 ) NMR spektrum vzniká jako Fourierova transformace FIDu, a tedy rychlost poklesu FIDu ovlivňuje tvar spektra. Detailnější pohled na příčnou relaaci (pokrač.) Po Fourierově transformaci F (M (t)) dostaneme Lorentzovu křivku se šířkou ν (Hz) v polovině výšky: Velikost chemického posunu určuje pozici čáry. Relaace určuje její tvar!!!! ν 0/2π ν=/πt 2 Příspěvek nehomogenity magnetického pole /T 2n se nazývá nehomogenní rozšíření a většinou není zajímavý a snažíme se ho odstranit shimování magnetického pole, vhodný tvar vzorku, kvalitní kyvety apod. Změna značení: /T 2 * = /T 2 + /T 2n Rychlost poklesu FIDu je nyní dána /T 2 *. Potenciálně zajímavá informace je skryta jen ve složce /T 2 (homogenní rozšíření). Vždy, když budete chtít ze spektra odečítat pološířky čar, si vzpomeňte, že obsahují nehomogenní rozšíření, které je těžké oddělit pološířka je levná, ale mnohdy nepřesná informace!!!!

4 Spinové echo y t echo /2 t echo /2 Vektorová analýza po 90 pulzu (v rotující soustavě souřadné): z M,y y t echo/2 y y 80 y t echo /2 y rozfázování refokusace Dojde ke kompenzaci statických nehomogenit mag. pole (nehomogenní rozšíření). Úbytek M,y je v důsledku fluktuací lokálních polí vmístě každého spinu. M 0 M,y M,y = M 0 ep(-t/t 2 ) t Metody měření relaačních dob Nejlepší metoda pro měření T 2 je sekvence PMG (arr, Purcell, Meiboom, Gill) mnohonásobné spinové echo s konstantním echočasem a proměnným počtem cyklů n y t echo /2 t echo /2 Typické nastavení pro 3 : t echo = ms délka pulzu << t echo << /2J H n (Heteronukleární případ decoupling) Komplikace Spinové echo je ovlivněno J-interakcí zejména homonukleární Velké množství pulzů nutnost velmi přesné kalibrace pulzů, jinak vznikají artefakty. Shrnutí Přesné měření T 2 patří ve skutečnosti mezi obtížné eperimenty. Spinové echo se velmi často používá jako segment pulzních sekvencí s jiným určením.

5 Inversion recovery Podélná relaační doba T návrat po inverzi (inversion recovery) mi Analýza pomocí vektorového modelu: z z z z y 80 y mi y 90 y FT Během směšovací periody mi necháme z-složku magnetizace relaovat. Postupně v následných eperimentech měníme délku mi. Inversion recovery (pokračování) Když vyneseme závislost intenzity signálu na směšovacím čase mi, dostaneme eponenciální závislost. intensity mi I(mi) = I * ( - 2 * e -mi/ T ) Velmi robustní metoda získaná hodnota T závisí velmi málo na přesné kalibraci pulzů (jen její statistická přesnost). Případně je vhodné nahradit faktor 2 ve vzorci proměnným parametrem. Měřit raději T než T 2!!!!

6 K čemu je vůbec detailní znalost relaací dobrá? a) ptimalizace NMR eperimentů: optimální nastavení relaační periody, která determinuje celkovou délku eperimentu s více skeny. b) Nové informace o vzorku. tázky: Proč je někdy relaační doba krátká, jindy dlouhá? Jak souvisí relaační doby s velikostí molekuly, vzdáleností jednotlivých spinů, s druhem rozpouštědla? Relaační mechanismy B o = 0 B o > 0 Zeemanova interakce + isotropní ch. posun B o > 0 ostatní interakce, pro které H 0 β α E=hν E = hj/2 E = hj/2 Každá interakce (působení) je charakterizována svým energetickým příspěvkem k celkové energii systému (veličině popisující příspěvek k energii systému se ve fyzice říká hamiltonián, H). Základní interakcí, která je zodpovědná za jev NMR je Zeemanova interakce. Jejím důsledkem je eistence 2 hladin (pro spin ½) a možnost přechodů mezi nimi za současné absorpce a emise radiofrekvenčního el.-mag. záření na kruhové frekvenci ω =-γ B 0 ( ω = 2πν) Interakce, které jsou v čase konstantní H(t) = konst 0, způsobují dodatečný posun nebo štěpení resonancí. Jsou to např. isotropní složka magnetického stínění (způsobuje chemický posun) a nepřímá spin-spinová (J-coupling).

7 Relaační mechanismy (pokračování) Pro relaaci mají význam ty interakce (nebo jejich složky), které rychle fluktuují v čase H(t) konst. Pokud mají střední hodnotu H(t) = 0, nepřispívají k frekvenci, ani nezpůsobují štěpení čáry. Některé z těchto interakcí mohou být i velmi silné. Jejich význam pro relaaci tak závisí na jednak na jejich síle (amplitudě) a jednak na charakteristických frekvencích jejich fluktuací. Interakce Přímá dipól-dipólová (DD) Paramagnetická (paramg.) Anisotropie chemického stínění (SA) Kvadrupolární (Q) (Spin-rotační) (Skalární (J)) Anisotropie chemického stínění (SA) B 0 B i (t) brázek z knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, hichester Velikost a směr indukovaného pole B i (t) závisí na orientaci molekuly vzhledem k B 0. Střední hodnota indukovaného pole určuje (isotropní) chemický posun: δ = B i (t) / B 0 Fluktuující (anisotropní) složka (B i (t) - B i ) způsobuje relaaci. Velikost ~ 0 khz. Příspěvek k relaaci závisí na B 02, má větší význam ve velkých magnetických polích.

8 Kvadrupolární interakce Multipólový rozvoj rozložení elektrického náboje v jádře: Bodový náboj Dipól = 0 Kvadrupól Interakce s gradientem elektrického pole v místě jádra. brázky z knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, hichester Velikost a směr gradientu elelektrického pole fluktuuje v důsledku molekulárního pohybu. Velikost ~ -00 MHz Dipól-dipólová relaace Přímá interakce mezi dvěma magnetickými dipóly Volně přes prostor (dosah cca 0.5 nm) není ovlivněna chemickými vazbami, na rozdíl od nepřímé dipól-dipólové interakce. µ 3 Velikost: 0 γ Iγ Sh Kdip = ( ) r 2 IS 8π Praktická poznámka: Relaační doby a velikost krospíků závisí na K dip2 ~ r IS -6 r IS < 0.5 nm H H dipól - dipólová interakce mezi magnetickými dipóly

9 Dipól-dipólová relaace (pokračování) Příklad: jádra a 2 v rigidní molekule, magnetický spin 2 se nachází v magnetickém poli spinu (a opačně). Rotační pohyb molekuly způsobuje změnu pole B dip (t) v místě spinu B 0 B dip (t) Zdroj fluktuací: pohyb spojnice dvou dipólů vzhledem k B 0, tedy náhodný rotační pohyb molekul a jejich částí (tzv. rotační difúze). Nulová střední hodnota dipól dipólové interakce je v kapalných vzorcích způsobena právě rychlým rotačním pohybem. U pevných vzorků nebo u velkých molekul je velmi efektivní ve zkracování T 2 (rozšíření čar), v případě nedokonalého středování i vliv na chemický posun. Velikost ~ 20 khz Srovnej s nepřímou dipólovou interakcí J ~ 00 Hz brázek z knihy: M. H. Levitt: Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley, hichester Dipól-dipólová relaace (pokračování) Z DD-relaace můžeme zjistit: I) Střední vzdálenost dvou dipólů. II) harakteristiky molekulárních rotačních pohybů (např. rotační korelační časy) potřebujeme odhadnout typ pohybu (izotropní rotace rigidní kulové molekuly (adamantan) atd.). Závislost T, T 2 na rotačním korelačním času τ. brázek z publikace: P. J. Hore: Nuclear Magnetic Resonance, ford University Press, ford 995. Speciálním případem je i paramagnetická relaace (paramg.). Dipólová interakce magnetického momentu jádra s elektronovým magnetickým momentem v radikálech, paramagnetických iontech kovů apod. Magnetický moment elektronu je zhruba 000 větší než jaderný. Velikost ~ -00 MHz Srovnání relaačních mechanismů Q (jen I > ½) ~ (paramg.) >> DD > SA

10 Nukleární verhauserův Efekt (NE) NE je typický případ, kde selhává představa mono-eponenciální podélné relaace jedná se o tzv. křížovou relaaci, kdy změna stavu jednoho spinu (způsobená uměle nebo i jeho vlastní podélnou relaací) ovlivňuje stav spinu druhého a naopak. NE je nedílnou součástí podélné relaace. Jedná se o skutečný přenos z-magnetizace = energie. V důsledku toho potom ve spektru vidíme změněné intenzity. Nukleární verhauserův Efekt (NE) pokrač. Příklad: relaace izolovaného spinového páru H - 3 po převrácení spinu H do směru -z. (B 0 = 9,4 T, r H = 0,09 nm, τ = 0 ps). relativní intenzita signálu H čas (s) H H bez cross-relaace 3 3 bez cross-relaace Pokud budeme měřit podélnou relaaci za přítomnosti NE, nebude mono-eponenciální.

11 Energetický diagram dvouspinového systému IS: Saturace spinu I ββ ββ W I W 2IS W0IS W S βα W I W 2IS W0IS W S βα αβ W I W I W S αα W S αα W je pravděpodobost přechodu mezi hladinami. Pro systém v rovnováze máme W I a W S přechody, které jsou jednokvantové. W 0IS a W 2IS jsou nul- and dvou kvantové přechody. Intenzita pozorovaného signálu spinů I,S je dána rozdílem populací jejich stavů α, β. Nukleární verhauserův Efekt (NE) pokrač. NE homonukleární např. mezi jádry H Přechodné: RF pulzem vybudíme selektivně jeden spin interagujícího páru a pozorujeme přenos magnetizace na druhý spin. Množství přenesené magnetizace = energie závisí na délce směšovacího času = NE je relaační proces, takže k přenosu dochází v průběhu určitého času, ne okamžitě. NE heteronukleární např. mezi 3 a H Stacionární: po dlouhou dobu selektivně ozařujeme jednoho partnera ( H) a následně změříme signál druhého spinu ( 3 ). Tak se normálně měří 3 spektra: 90 y 3 H ozařování dekapling Navýšení 3 intenzity v ideálním případě: NE = + 0,5 γ H /γ 3 Využití: Navýšení signálu málo citlivých jader (γ > 0!). Protože je to projev DD interakce, závisí na r 6 - určení vzdálenosti spinů, a tedy určení konformace molekuly v prostoru. Získání dynamické informace o rotačních pohybech molekuly.

12 Nukleární verhauserův Efekt (NE) pokrač. Podrobnější úvahy o rychlosti rotace molekuly a jejího vlivu na velikost NE Vždy se týká rychlosti rotace spojnice příslušného spinového páru (pro různé páry v molekule mohou mít spojnice různou rychlost). Jak rychlé pohyby ovlivní DD interakci? I) na rezonanční frekvenci každého ze spinů V kombinaci Larmorovou precesí vedou k lineární kombinaci pravděpodobností přechodu na I) na rezonanční frekvenci každého ze spinů II) na součtu obou frekvencí III) na rozdílu obou frekvencí IV) T 2 - také na nulové frekvenci tj. velmi pomalé pohyby. Nukleární verhauserův Efekt (NE) pokrač. Výsledný vliv příspěvků má vliv na polaritu homonukleárního NE ( H H): ) Malé molekuly - ωτ c << (v prai: ω Η = 0 9 s -,τ c = 0 - s) molekula rotuje rychle, NE je kladné, tzv. limita etrémního zúžení. 2) Velké molekuly - ωτ c >> (v prai: ω Η = 0 9 s -, τ c = 0-8 s) molekula rotuje pomalu, NE je záporné. 3) Středně velké molekuly NE je nulové nebo velmi malé. NE navýšení Závislost homonukleárního NE na ωτ c (pro stacionární případ) ω o τ c - NE

13 Metoda měření přechodného NE RF pulsem vybudíme selektivně jeden spin interagujícího páru a pozorujeme přenos magnetizace na druhý spin. Množství přenesené magnetizace závisí na délce směšovacího času t m. eperiment I 80 t m selektivní inverze 90 t m směšovací čas - čas, ve kterém se buduje NE Hb Ha Hc eperiment II 90 Ha Hb Hc t m eperiment I eperiment II diferenční spektrum: : odečten tení 2 fidů (spekter) Intenzita červeného signálu odpovídá navýšen ení v důsledku NE. Měření pohyblivosti pomocí 3 relaací Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy 6H 2 H H 2 H 5 4 H g2 2 f H 5 H H 2 H H 6 H H g3 H 2 H g 2 g 3 3f 5f 3g 2 5g 3 3g 3 5g 2 2g 2 f4 2g 3 4g 2 4g 3 f 6g 3 6g 2 6f 2f ppm NMR spektrum, D 2 /DMS 7/3, 303 K,.8 T

14 Příklad lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Lipari-Szabóův přístup Pro analýzu je nutný model pohybu molekuly jako celku a jejích částí. Jeden z nejúspěšnějších je Lipari-Szabóův bezmodelový přístup ( modelfree approach) Předpoklady Lipari-Szabóova modelu: relaace je modulována dvěma pohyby: globálním a lokálním oba pohyby jsou statisticky nezávislé globální reorientace je izotropní molekulární pohyb je charakterizován parametry: τ M korelační čas globálního pohybu S 2 parametr uspořádanosti (hodnota 0 - ) τ e korelační čas lokálního pohybu Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy T Závislost jaderné relaace na molekulárním pohybu T 2 nh = D 4 nh = D γ H η = γ J [ J( ω ω ) + 3J ( ω ) + 6J( ω + ω )] H [ 4J(0) + J( ω ω ) + 3J ( ω ) + 6J( ω ) + 6J( ω + ω )] H 6J( ωh + ω ) J( ωh ω ) ( ω ω ) + 3J ( ω ) + 6J( ω + ω ) H H H H H Dipól-dipolární interakční konstanta: D 3 ( µ / π ) γ γ r = 0 4 H H Lipari-Szabóovy spektrální hustoty: J 2 2 S τ ω τ M 2 S τ 2 + ω τ ( ) ( ) ω + M = 2 τ = τ M + τe Rotační molekulární pohyb ovlivňuje jadernou relaaci prostřednictvím spektrálních hustot J(ω) - udávají (zhruba) množství molekulárního pohybu na frekvenci ω. Pro jadernou relaaci jsou nejvýznamnější ω H, ω, (ω H + ω ), (ω H - ω ) a 0 s -. Při různém magnetickém poli B 0 se mění i kruhové frekvence ω, a tedy zkoumáme pohyby při různých frekvencích.

15 Základní princip Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Reorientační molekulová dynamika moduluje jadernou relaaci. Jádra 3 v molekule cukru, která nesou přímo vázaný proton, relaují téměř výlučně vlivem přímé dipól-dipólové interakce s tímto protonem. Eperimentální metodika Měření 3 relaačních dob T, T 2 a heteronukleárního NE při různých intenzitách magnetického pole B 0. Podmínkou je režim mimo etrémní zúžení (etreme narrowing) - musí být ωτ M, aby relaační doby byly závislé na B 0. Základní pulzní sekvence: inversion recovery (T ) spinové echo - PMG (T 2 ) měření stacionárního heteronukleárního NE Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Závislost relaačních rychlostí a NE pro 3 jádra cukerných kruhů (R = /T, R 2 = /T 2 ) na magnetickém poli B 0 při teplotách 303 K (a) a 323 K (b). R R 2 +η R R 2 +η 6H 2 H H 2 H 5 4 H g2 2 f H 5 H H H H g3 H 2 H H 2 H 6 Závislost relaačních rychlostí a NE pro 3 jádra eocyklických H 2 H skupin na magnetickém poli B 0 při teplotě 303 K. 6g 2 6g 3 f R R 2 +η R R 2 +η R R 2 +η

16 Dynamické charakteristiky trisacharidu melezitosy Atom T(K) τ Μ (ns) S 2 τ e (ns) -cykl ± ± 0.0-6g ± ± 0.0-6g ± ± 0.0 -f ± ± cykl ± ± 0.0-6g ± ± 0.0-6g ± ± 0.0 -f ± ± f ± ± 0.0 6H 2 H H 2 H 5 4 H g2 2 f H 5 H H H H g3 H 2 H H 2 H 6 Závěr: Jednotlivé kruhy jsou dynamicky ekvivalentní. Hydroymethylová skupina -f je podstatně méně pohyblivá než ostatní hydroymethylové skupiny. becné: Pomocí měření relaací se studuje pohyblivost jak malých tak velkých molekul a jejich funkčních skupin v časové škále s. hemická výměna zahrnuje všechny procesy, kdy sledované jádro přechází do jiného chemického okolí tj. chemické reakce, konformační změny, mezomerní přechody, tvorbu kompleu apod. K e Konformační rovnováha K B hemická rovnováha Neřadí se přímo mezi relaační mechanismy, ale velmi se jim podobá místo samotné magnetizace nám po systému putuje celé jádro, včetně svého spinu. Důsledky i popis chemické výměny jsou velmi podobné spinové relaaci. Vliv na z-složku magnetizace je matematicky téměř totožný s NE. Na rozdíl od NE má chemická výměna vliv i na příčnou složku magnetizace.

17 Měření rychlostních konstant Příklad: inverze NN-dimethylformamidu: N H N H Máme výměnu mezi červeným a modrým methylem kvůli dvojnému charakteru amidické vazby. ba methyly jsou chemicky a magneticky různé, takže NMR spektrum DMF obsahuje dva různé methylové signály: k << << ν ν To znamená, že rychlost výměny mezi dvěma místy je malá ve srovnání s relativní vzdáleností (v Hz) mezi rezonancemi obou míst (červeného a modrého): Měření rychlostních konstantk (pokračování) Rychlost reakce závisí na G inverze, které je teplotně závislé. Rychlost inverze se zvýší při zvyšování teploty T. NMR spektra budou vypadat takto: T T Při koalescenční teplotě T c se rychlost o výměny k mezi jednotlivými stavy stává srovnatelná s rozdílem chemických posunů ν (v Hz), při T c : k = π( ν)/ 2 Definice koalescence: 2.derivace signálu v bodě ½(ν A + ν B )je rovna0. hemická výměna ovlivňuje jak posun, tak tvar signálu a tedy má vliv na příčnou relaaci.

18 Měření rychlostních konstantk (pokračování) Realističtější obrázek: symetrická chemická výměna mezi dvěma stavy - závislost NMR spekter na teplotě: brázek z publikace: P. J. Hore: Nuclear Magnetic Resonance, ford University Press, ford 995. Pro chemickou výměnu rozlišujeme dva režimy vzhledem k rozdílu chemických posunů (v Hz) dvou vyměňujících stavů k << ν k >> ν pomalá výměna rychlá výměna Protože je rozdíl chemických posunů v Hz a nikoli v ppm, je tento rozdíl závislý na magnetickém poli (při 200 MHz: ppm = 200 Hz, při 500 MHz: ppm = 500 Hz), může být chemická výměna k = 350 Hz v prvním případě rychlá a v druhém pomalá. Proto při klasifikaci chemické výměny je třeba stanovit rezonanční frekvenci. Časové škály v NMR k << ν k >> ν pomalá výměna rychlá výměna Navíc, eistuje celá řada důležitých časových režimů: s molekulární rotace 0-8 s Larmorova precese > 0-7 s chemická výměna > 0-3 s spinová relaace blíbená věta: hemická výměna je rychlá v NMR škále. je bez specifikace rezonanční frekvence nesmysl! I tak ale udává jen dolní limit pro rychlostní konstantu chemickou výměnou indukovaný posun zpravidla nepřesahuje cca 5 ppm, při 500 MHz potom k > 2500 Hz. Pojem časové škály se pro různé jevy v NMR liší, proto je třeba vždy specifikovat přesně, o které škále se mluví. V případě chemické výměny např.: Rychlá výměna v časové škále dané H chemickým posunem při rezonanční frekvenci 500 MHz.

19 dia stere otopotopn ich íh chirá lní(h iral(h elici elikál Studium rotační bariéry kolem vazby aromát-karben η 2 -chelatovaný (N,N-diallylamino)(aryl)karben wolframu zabržděná rotace diastereotopní H chirální (helikální) Motivace: Stanovení původu bariéry rotace ze dvou předpokládaných možností: ) sterická interakce mezi aromatickým kruhem a karbenovou částí, 2) překryv aromatického π-systému s elektronově chudým karbenovým uhlíkem, který způsobuje zvýšení řádu vazby. 3 2 b c A b c rozpouštědlo: Dl 3, 500 MHz B o-ph 308 K 298 K 288 K 273 K 263 K 3, 5 4 2,6 243 K B A b c a Hana Dvořáková, Tomáš Tobrman, Dalimil Dvořák, MS Taipei 200

20 Praktické aspekty měření Měří se základní D homonukleární spektra při různých teplotách. Metodicky velmi jednoduché. Je nutné zajistit: přesnou kalibraci teploty (standardní vzorek MeH K, ethylenglykol K), stejně kvalitní homogenity magneticého pole (shimování) v celém rozsahu teplot. nutný vysoký poměr signál/šum. Zpracování spekter a výpočty co je jednodušší měření, o to jsou těžší výpočty. Nezbytné je velmi pečlivé zpracování spekter: Fourierova transformace - bez LB a jiných apodizací, fázování, kvalitní odečtení pozadí (baseline correction) Zpracování spekter a výpočty (pokrač.) Rychlostní konstanty chemické výměny se získají fitováním pološířek a poloh příslušných rezonancí (např. program g-nmr). U pomalé výměny: ν = k/π, v přechodné oblasti je závislost složitá. Správné nafitování signálů je překvapivě moc citlivé na kvalitu zpracování spekter!!! Získají se rychlostní konstanty při každé měřicí teplotě. k [s ] k = 200 K vysvětlení teplotní závislosti je možné použít Arrheniovu či Eyringovu rovnici k T B h - H S + e RT R T [K] G aktivační volná energie ( G = H -T S ) H aktivační enthalpie S aktivační entropie k B Boltzmannova konstanta J/K h Planckova konstanta Js R univerzální plynová konstanta J/K/mol T termodynamická teplota v K

21 Důležité poznámky: 308 K 298 K 288 K Relativné přesně se rychlostní konstanty získají jen při teplotách, kdy je rozšíření čáry >> než přirozená šířka čáry (bez chemické výměny), tj. v relativně malém rozmezí kolem teploty koalescence. Přirozená šířka čáry není a priori známa -může se mezi jednotlivými signály lišit. A navíc se mění s teplotou, což běžný výpočet zanedbává. 273 K 263 K 243 K Výsledek bdobná měření byla provedena pro různě substituované (R) deriváty. electron acceptors electron donors R Η kj/mol S J/mol/K G 298 kj/mol F ± ± H ± ± H 59.8 ± ± l 55.8 ± ± H ± ± H ± ± A B b c Bráněná rotace je enthalpicky řízená reakce. Měření různých derivátů prokázalo, že bariéra rotace je vyšší pro substituenty, které jsou akceptory elektronů. Původ bariéry rotace je tedy sterická interakce mezi aromatickým kruhem a karbenovou částí.

22 Konformační výměna v kali[4]arenech A S S Pr Pr Pr - 3 S S Pr Tetrapropoythiakali[4]aren - konický konformer, H spektrum v 2 D 2 l 4, teplota 373 K B S S S S S S S S Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr dpovídá spektrum statické struktuře A nebo dynamické rovnováze B? 343 K F E E F E,F E F 233 K 3,5 4 Spektra při nižších teplotách dokazují, že se jedná o dynamickou rovnováhu B. Počet signálů ve spektru souvisí se symetrií molekuly - čím vyšší symetrie, tím větší počet degenerovaných signálů. F E 5 4 E 3 F S S S S S S S S Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr chemická výměna mezi polohami E F

23 2D EXSY (EXchange SpectroscopY) t t m inverze Během směšovacího času času t m dochází k přenosu magnetizace vlivem chemické výměny. V 2D spektru jsou v obou dimenzích chemické posuny, mezi vyměňujícími se spiny jsou krospíky. Velikost krospíků závisí na rychlosti chemické výměny. Sekvence je totožná s NESY - ve spektru budou též krospíky v důsledku NE. δ (f ) Ha Hb Hb Hc Hc Ha δ (f 2 ) Poznámka: D EXSY je totožná s D NESY (diferenční NE). Výběr D nebo 2D sekvence je dán jen počtem počtem krospíků, které chceme analyzovat - v D ecitujeme jediný signál jako zdroj chemické výměny, ve 2D sekvenci takto slouží všechny signály. EXSY - výměnná spektroskopie Měření rychlosti chemické výměny analýzou pološířek v D spektrech je komplikováno náhodným překryvem aromatických signálů kruhů E. Proto je výhodnější EXSY (v tomto případě 2D). Toto spektrum: K, t m = 200 ms E F F -E Krospíky: chemická výměna: F3,5-E, F4-E, F -E NE: F3,5-F4 F3,5-E F4-E E F3,5-F4 F4 F3,5

24 EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. 5 F 4 E 3 S S S S Pr Pr Pr Pr Integrace krospíků i diagonálních píků ve 2D spektru: Diagonální píky vždy slouží jako reference. Pro stanovení rychlosti chemické výměny A B potřebujeme relativní velikost krospíku I(A-B) vzhledem k velikosti I(A) (zdroje ch. výměny). Krospíky, symetrické vzhledem k diagonále, jsou vždy stejné (pokud ne, je to artefakt) I(A-B) = I(B- A). Můžeme použít jen dobře separované signály (signál E je nepoužitelný!) EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Změříme spektra pro několik hodnot směšovacího času t m. becně (tj. v případě nesymetrické výměny, ([A] [B]) (I(A) I(B)) jsou rychlostní konstanta dány: I(A-B) / I(A) = k(a B) * t m I(A-B) / I(B) = k(b A) * t m Tento vzorec platí jen pro počáteční nárůst, který je lineární. dchylka od linearity je způsobena členy s vyššími mocninami t m (t m2, t m3, t m4, ), které jsou pro dostatečně malé t m zanedbatelné (tzv. spinová difúze). 0.6 I(A-B) / I(A) Intenzita F3,5 - E E-F3,5 F4-E E-F4 I(A-B) = F3,5-E; F4-E I(A) = F3,5; F4 směšovací časy: 0, 20, 50, 00, 200 ms směšovací čas

25 EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. V našem případě je chemická výměna symetrická ([E]=[F]) a tedy jako reference postačí diagonální signály F a nepotřebujeme překývající se aromatické signály E. k(e F) = 2.5 s - Podobně se změří rychlostní konstanta při jiných teplotách a spočítají se aktivační parametry. rychlostní konstanta (s - ) teplota (K) G = 56.0 kj/mol aktivační volná energie při 337 K H = 43.7 kj/mol aktivační enthalpie S = -5 J/mol/K aktivační entropie Srovnání EXSY a měření pološířek signálu + EXSY je přesnější než měření pološířek signálu, + EXSY nevadí složitá reakční schémata, EXSY je mnohem pracnější - pro jeden bod teplotní závislosti je třeba změřit řadu spekter (třeba 5), X Z hlediska časových režimů chemické výměny jsou tyto metody komplementární - pokrývají rozdílný rozsah rychlostí chemických výměn: EXSY - pomalá výměna, která příliš nerozšiřuje čáry (nesmí docházet k překryvu), měření pološířek je nejpřesnější, když chemická výměna rozšiřuje čáru maimálně, tj. v oblasti koalescence (oblast přechodu mezi pomalou a rychlou výměnou). Měření rychlé výměny, která znatelně nerozšiřuje signál je obtížné. Pomoci může měření relaační doby T 2.

26 EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Případ, kdy je použití EXSY nezbytné: komplikovanější reakční schéma. hemická výměna konformérů tetraethyletheru thiakali[4]arenu. S S S S k AP k PA S S S S k P k P k P k P S S S S k k,3-alt (A) paco (P) S S S S pinched cone () Různé konformery mají různou koncentraci a symetrii - výměna proto vesměs není symetrická. Jednotlivé rychlostní konstanty jsou odlišné (celkem 5 různých konstant). EXSY - výměnná spektroskopie paco-a3 paco-b3 paco-3 A ' 2' H 2 H 3 B S S S S S S S S S S S S S S S S paco cone,3-alt,2-alt,3-alt-3,3-alt- cone-, paco-a2 X paco-4,,3-alt-4 paco-a paco-a paco-b4 paco-b paco- paco-2 cone-2 paco-a5 paco-a4 cone-4 cone-3,3-alt-2 paco-b2 // // H spektrum tetraethoythiakali[4]arenu v Dl 3 při 303 K. Koncentrace jednotlivých konformérů jsou různé, vzájemně se vyměňující se signály mají rozdílnou míru degenerace. Je to nesymetrická chemická výměna.

27 EXSY - výměnná spektroskopie,3-alt-3 paco-a5 paco-a3 paco-4, paco-b3 paco-b4,3-alt-4 paco-3 paco-a4 H NESY (EXSY) spektrum aromatické oblasti tetraethoythiakali[4]arenu v 2 D 2 l 4 při 298 K, t m =.5 s. Kladné píky (červené) = diagonála a chemická výměna, záporné píky (modré) = NE. Koncentrace jednotlivých konformérů jsou různé, vzájemně se vyměňující se signály mají rozdílnou míru degenerace. Je to nesymetrická chemická výměna. Ve spektru jsou vidět jen signály,3-alt a paco konformérů. cone je rozšířený v blízkosti koalescenční teploty chemické výměny pinched cone - pinched cone. EXSY - výměnná spektroskopie Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase. 0,06 intenzita 0,05 0,04 0,03 0,02 0,0 paco 3,5 -,3-alt 3,5 paco A 3,5 -,3-alt 3,5 paco B 3 -,3-alt 3,5 paco B 5 -,3-alt 3,5 paco B 4 -,3-alt 4 fit 0 0 0,5,5 směšovací čas (s) k PA = 0,0238 s - při 298 K

28 EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Při vyšší teplotě jsou v H spektru pozorovatelné i signály cone konformeru.,3-alt-4 paco-a3 paco-4, cone-4 paco-b3 paco-b4,3-alt-3 paco-a5 paco-3 cone-3,5 paco-a4 0,25 Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase 0,2 intenzita 0,5 0, 0,05,3-alt 4 - paco B 4,3-alt 4 - paco 4,3-alt 4 - paco 4,3-alt 3,5 - paco B 3; A 3,5,3-alt 4 - paco B 3; A 3,5,3-alt 3,5 - paco B 5,3-alt 3,5 - paco B ,02 0,04 0,06 směšovací čas (s) k PA = 4,97 s - při 363 K t m = 0.05 s, 363 K Poměrně rychlou chemickou výměnu paco,3-alt je potřeba měřit při velmi krátkých směšovacích časech. Za těchto podmínek nejsou měřitelné krospíky v důsledku výměny paco cone. EXSY - výměnná spektroskopie - pokrač. Pro měření výměny paco cone je nutné použít mnohem delších směšovacích časů.,3-alt-4 paco-a3 paco-4, cone-4 paco-b3 paco-b4,3-alt-3 paco-a5 paco-3 cone-3,5 paco-a4 Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase intenzita 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, 0 0 0,5 směšovací čas (s) k P = 0,67 s - při 363 K paco B3 - cone 3,5 paco 3,5 - cone 3,5 paco B4 - cone 4 paco B4 - cone 4 skutečný počáteční build-up t m = 0.2 s, 363 K Vlivem mnohem (cca 0) rychlejších procesů dochází k rozsáhlé spinové difúzi a počáteční lineární část výstavbové křivky prakticky neeistuje. Je vhodné/nutné použít přesný výpočet pomocí relaační a výměnné matice -na řádcích a sloupcích jsou jednotlivé spiny, maticové prvky obsahují příslušné rychlosti chemických výměn, kros-relaační rychlosti a na diagonále též podélné relaační rychlosti.

29 EXSY - výměnná spektroskopie - závěr S S S S k AP k PA S S S S k P k P k P k P S S S S k k,3-alt (A) paco (P) 298 K 363 K * k PA 0,0238 4,97 k P 0,67 S S S S pinched cone () Závěr: Pomocí EXSY lze studovat i systémy, ve kterých dochází k mnoha různým přenosům magnetizace (s odlišnými rychlostmi) vlivem NE a chemické výměny. Je potřebné matematicky rigorosní vyhodnocení (neplatí aproimace počátečního lineárního nárůstu). Užitečná jsou měření při různých teplotách. Aktivační parametry jednotlivých procesů se stanoví v různých teplotních režimech. Přitom se mění relativní rychlosti různých přenosů magnetizace.