Dynamické procesy & Pokročilé aplikace NMR. chemická výměna, translační difuze, gradientní pulsy, potlačení rozpouštědla, NMR proteinů

Transkript

1 Dynamické procesy & Pokročilé aplikace NMR chemická výměna, translační difuze, gradientní pulsy, potlačení rozpouštědla, NMR proteinů

2 Chemická výměna jakýkoli proces při kterém dané jádro mění svůj stav / okolí a NMR charakteristiky k 1 k -1 chemický posun J vazba relaxační čas translační difuze + k 1 k -1 K eq K assoc Intramolekulární (konformační) výměna Intermolekulární výměna tautomerizace konformační rovnováha pohyb postranních řetězců proteinu sbalování proteinů struktura nukleových kyselin vazba ligandu protonace/deprotonace výměna labilních vodíků enzymaticky katalyzované reakce

3 Chemická výměna dimethylformamide pomalá k << ν ν ex = k π k π ν = 2 koalescence k >> ν rychlá ν ex ( ν ) π = 2k 2 analýza tvaru spektra k příspěvek k vlastní šířce čáry

4 Chemická výměna minoritní komponenta mizí dříve : : 0.25

5 Chemická výměna Cone inverted cone transformace kalixarenu analýza tvaru spektra inversion rate ~ 1 s -1 at 30 C G ~ 63 kj.mol -1

6 Změna chem. posunu s ph Chemická výměna - titrace rychlá výměna průměrný posun určení pk a Změna chem. posunu s koncentrací β-cd CHES určení disociační konstanty K d ( 1 p)( [H] p[g ) [ H][G] = = [HG] p 0 ] 0 K d

7 Chemická výměna a relaxační disperze Teplotní závislost 13 C spekter a relaxací kalixarenu překlápění orientace vodíkových vazeb apparent true R 2 = R 2 + R ex

8 Chemická výměna a relaxační disperze R ex závisí na echo čase v CPMG experimentu p A ν, p populations B chem. shift difference k ex exchange rate

9 Chemická výměna a přenos magnetizace 19 F rychlost výměny = rychlost počátečního nárůstu (po normalizaci)

10 Pulsy gradientu magnetického pole I gradientní echo G z rozfázování refokusace Odstranění chyb rf pulsů I G z 180 refokusace ve spinovém echu Čistší přenos koherence 1 H 13 C G z y 1 2 HSQC podmínka refokusace G G z1 z2 τ 1 γ = H τ γ 2 C

11 Translační difuze DOSY

12 Translační difuze DOSY rozdělení směsi podle velikosti molekul Studium komplexů K d =0.7 mm

13 Presaturace Potlačení signálu rozpoštědla 1 H WATERGATE během relaxační doby ozařujeme signál vody slabým rf polem G z gradientní echo se selektivním 180 pulsem 180 pro vše kromě vody

14 Typy NMR biomolekul proteiny a peptidy rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul nukleové kyseliny a oligonukleotidy omezení malou rozmanitostí chemického složení polysacharidy a oligosacharidy omezení malou rozmanitostí chemického složení kombinace Dosažitelné informace prostorová struktura molekul, případně komplexů kinetické studie (vazba ligandu, denaturace, komplexace...) molekulárně-dynamické chování Měřená jádra 1 H, 13 C, 15 N, 31 P izotopové obohacení

15 Řešení prostorové struktury Vzorek NMR spektrometr pulsní sekvence NMR spektra obecné informace o molekule (primární struktura, koval. vazby,...) extrahování experimentálních dat přiřazení signálů extrakce strukturních NMR parametrů zpracování všech informací a predikce struktury validace konečného souboru struktur vzdálenosti vodíků dihedrální úhly orientace vazeb...

16 Proteinové NMR experimenty aminokyselina i-1 aminokyselina i Experiment HNCA korelace vodík dusík uhlík α (i a i-1) 15 N-NOESY-HSQC objem krospíku vzdálenost

17 Reziduální dipolární vazba částečně orientované molekuly proteinu kapalný krystal, lipidové bicely, zmáčknutý gel, samovolná orientace projev zbytkové přímé dipól-dipólové interakce ve spektrech 400Å 40Å S~ RDC ~ 0-20 Hz Informace o vzájemné orientaci pomalých pohybech Kummerlowe et al. Angew Int. 50 (2011), 2643