Praktické příklady měření a interpretace chemické é výměny a relaxací. rychlostních konstant k. Měření

Transkript

1 Praktické příklady měření a interpretace chemické é výměny a relaxací A. Chemická výměna 1. Dynamická NMR - teplotně závislá 1D spektra. Výměnná spektroskopie - EXY (EXchange pectroscopy) Měření rychlostních konstant k Rychlost reakce závisí na G reakce, které je teplotně závislé. Rychlost reakce se zvýší při zvyšování teploty T. NMR spektra budou vypadat takto: B. Měření pohyblivosti pomocí 13 C relaxací T T C Při koalescenční teplotě se rychlost o výměny k mezi jednotlivými stavy stává srovnatelná s rozdílem chemických posunů (v Hz), při při T c : c : k = π(δν)/ Chemická výměna ovlivňuje jak posun, tak tvar signálu a tedy má vliv na příčnou relaxaci

2 diast ereotopic H diast ereotopníh ch chiral(hel irální(heli tudium rotační bariéry kolem vazby aromát- karben η -chelatovaný (N,N-diallylamino)(aryl)karben wolframu A B C b c rozpouštědlo: CDCl 3, 500 MHz zabržděná rotace o-ph 308 K diastereotopní H chirální (helikální) 98 K 88 K Motivace: tanovení původu bariéry rotace ze dvou předpokládaných možností: 73 K 1) sterická interakce mezi aromatickým kruhem a karbenovou částí, ) překryv aromatického π-systému s elektronově chudým karbenovým uhlíkem, který způsobuje zvýšení řádu vazby. 3,5 4,6 63 K 43 K B A C b c a Hana Dvořáková, Tomáš Tobrman, Dalimil Dvořák, MC Taipei 001

3 Praktické aspekty měření Měří se základní 1D homonukleární spektra při různých teplotách. Metodicky velmi jednoduché. Je nutné zajistit: přesnou kalibraci teploty (standardní vzorek MeH K, ethylenglykol K), stejně kvalitní naladění magnetu v celém rozsahu teplot. nutný vysoký poměr signál/šum. Zpracování spekter a výpočty (pokrač.) Rychlostní konstanty chemické výměny se získají fitováním pološířek a poloh příslušných rezonancí (např. program g-nmr). U pomalé výměny: ν = k/π, v přechodné oblasti je závislost složitá. právné nafitování signálů je překvapivě moc citlivé na kvalitu zpracování spekter!!! Zpracování spekter a výpočty co je jednodušší měření, o to jsou těžší výpočty. Nezbytné je velmi pečlivé zpracování spekter: Fourierova transformace - bez LB a jiných apodizací, fázování, kvalitní odečtení pozadí (baseline correction) Získají Získajíse se rychlostní konstanty při při každé každé měřicí měřicí teplotě. teplotě. k -1 [s ] T [K]

4 Důležité poznámky: 308 K 98 K 88 K 73 K Relativné přesně se rychlostní konstanty získají jen při teplotách, kdy je rozšíření čáry >> než přirozená šířka čáry (bez chemické výměny), tj. v relativně malém rozmezí kolem teploty koalescence. Přirozená šířka čáry není a priori známa -může se mezi jednotlivými signály lišit. A navíc se mění s teplotou, což běžný výpočet zanedbává. k -1 [s ] k = k T B h e H RT - + T [K] R 63 K 43 K G aktivační volná energie ( G = H -T ) H aktivační enthalpie aktivační entropie k B h R T Boltzmannova konstanta x 10-4 J/K Planckova konstanta x Js univerzální plynová konstanta J/K/mol teplota v K

5 Výsledek bdobná měření byla provedena pro různě substituované (R) deriváty. Konformační výměna v kalix[4] [4]arenech A Pr Pr Pr Pr 1-3 Tetrapropoxythiakalix[4]aren - konický konformer, 1 H spektrum v C D Cl 4, teplota 373 K electron acceptors electron donors R Η kj/mol J/mol/K G 98 kj/mol CF ± ± C CH ± ± H 59.8 ± ± Cl 55.8 ± ± CH ± ± CH ± ± Bráněná rotace je enthalpicky řízená reakce. Měření různých derivátů prokázalo, že bariéra rotace je vyšší pro substituenty, které jsou akceptory elektronů. Původ bariéry rotace je tedy sterická interakce mezi aromatickým kruhem a karbenovou částí. B Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr dpovídá spektrum statické struktuře A nebo dynamické rovnováze B?

6 343 K D EXY (EXchange pectroscopy) t 1 t m F E E F E,F E F 33 K 3,5 4 pektra při nižších teplotách dokazují, že se jedná o dynamickou rovnováhu B. Počet signálů ve spektru souvisí se symetrií molekuly - čím vyšší symetrie, tím větší počet degenerovaných signálů. inverze Během směšovacího času času t m dochází k přenosu magnetizace vlivem chemické výměny. V D spektru jsou v obou dimenzích chemické posuny, mezi vyměňujícími se spiny jsou krospíky. Velikost krospíků závisí na rychlosti chemické výměny. ekvence je totožná s NEY - ve spektru budou též krospíky v důsledku NE. Ha Hb Hb δ (f 1 ) 5 F E 4 3 E F Hc Hc Ha Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pr chemická výměna mezi polohami E F δ (f ) Poznámka: 1D EXY je totožná s 1D NEY (diferenční NE). Výběr 1D nebo D sekvence je dán jen počtem počtem krospíků, které chceme analyzovat - v 1D excitujeme jediný signál jako zdroj chemické výměny, ve D sekvenci takto slouží všechny signály.

7 EXY - výměnná spektroskopie EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. Měření rychlosti chemické výměny analýzou pološířek v 1D spektrech je komplikováno náhodným překryvem aromatických signálů kruhů E. Proto je výhodnější EXY (v tomto případě D). 5 F E 4 3 E1 F1 F1 -E1 E1 F1 F1 -E1 Pr Pr Pr Pr F3,5-E F4-E E F3,5-F4 F4 F3,5-E F4-E E F3,5 F3,5-F4 F3,5 Toto spektrum: 37.5 K, t m = 00 ms Krospíky: chemická výměna: F3,5-E, F4-E, F1 -E1 NE: F3,5-F4 F4 Integrace krospíků i diagonálních píků ve D spektru: Diagonální píky vždy slouží jako reference. Pro stanovení rychlosti chemické výměny A B potřebujeme relativní velikost krospíku I(A-B) vzhledem k velikosti I(A) (zdroje ch. výměny). Krospíky, symetrické vzhledem k diagonále, jsou vždy stejné (pokud ne, je to artefakt) I(A-B) = I(B-A). Můžeme použít jen dobře separované signály (signál E je nepoužitelný!)

8 EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. Změříme spektra pro několik hodnot směšovacího času t m. becně (tj. v případě nesymetrické výměny, ([A] [B]) (I(A) I(B)) jsou rychlostní konstanta dány: I(A-B) / I(A) = k(a B) * t m I(A-B) / I(B) = k(b A) * t m Tento vzorec platí jen pro počáteční nárůst, který je lineární. dchylka od linearity je způsobena členy s vyššími mocninami t m (t m, t m3, t m4, ), které jsou pro dostatečně malé t m zanedbatelné (tzv. spinová difúze). EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. V našem případě je chemická výměna symetrická ([E]=[F]) a tedy jako reference postačí diagonální signály F a nepotřebujeme překývající se aromatické signály E. k(e F) =.51 s -1 Podobně se změří rychlostní konstanta při jiných teplotách a spočítají se aktivační parametry. 8 I(A-B) / I(A) Inte nz ita F3,5 - E E-F3,5 F4-E E-F4 rychlostní konstanta (s -1 ) teplota (K) směšovací čas I(A-B) = F3,5-E; F4-E I(A) = F3,5; F4 směšovací časy: 10, 0, 50, 100, 00 ms G H = 56.0 kj/mol aktivační volná energie při 337 K = 43.7 kj/mol aktivační enthalpie = -51 J/mol/K aktivační entropie

9 rovnání EXY a měření pološířek signálu +EXYje přesnější než měření pološířek signálu, + EXY nevadí složitá reakční schémata, - EXY je mnohem pracnější - pro jeden bod teplotní závislosti je třeba změřit řadu spekter (třeba 5), x obě metody pokrývají rozdílný rozsah rychlostí chemických výměn: EXY - pomalá výměna, která příliš nerozšiřuje čáry (nesmí docházet k překryvu), měření pološířek je nejpřesnější, když chemická výměna rozšiřuje čáru maximálně, tj. v oblasti koalescence (oblast přechodu mezi pomalou a rychlou výměnou). = Z hlediska časových režimů chemické výměny jsou tyto metody komplementární. = Měření rychlé výměny, která znatelně nerozšiřuje signál je obtížné. Pomoci může měření relaxační doby T.

10 Případ, kdy je použití EXY nezbytné: komplikovanější reakční schéma. EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. Chemická výměna konformérů tetraethyletheru thiakalix[4]arenu. 1,3-alt (A) k AP k PA paco (P) k PC k CP k CP k PC k CC k CC pinched cone (C) Různé konformery mají různou koncentraci a symetrii - výměna proto vesměs není symetrická. Jednotlivé rychlostní konstanty jsou odlišné (celkem 5 různých konstant). EXY - výměnná spektroskopie B 4 5 A 3 C paco 1,3-alt-3 1' ' CHCH3 cone cone-1, paco-a3 X paco-a1 paco-c4, paco-b3 1,3-alt-4 paco-b4 paco-c1 paco-c3 paco-a4 paco-a5 cone-3 cone-4 // 1,3-alt 1,-alt 1,3-alt-1 paco-a1 paco-b1 paco-c // paco-a cone- 1,3-alt- paco-b 1 H spektrum tetraethoxythiakalix[4]arenu v CDCl 3 při 303 K. Koncentrace jednotlivých konformérů jsou různé, vzájemně se vyměňující se signály mají rozdílnou míru degenerace. Je to nesymetrická chemická výměna.

11 EXY - výměnná spektroskopie 1,3-alt-3 paco-a5 paco-a3 paco-b3 paco-c3 paco-c4, paco-b4 paco-a4 1,3-alt-4 EXY - výměnná spektroskopie Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase. 0,06 intenzita 0,05 0,04 0,03 0,0 0,01 paco C 3,5-1,3-alt 3,5 paco A 3,5-1,3-alt 3,5 paco B 3-1,3-alt 3,5 paco B 5-1,3-alt 3,5 paco B 4-1,3-alt 4 fit 0 0 0,5 1 1,5 směšovací čas (s) k PA = 0,038 s -1 při 98 K 1 H NEY (EXY) spektrum aromatické oblasti tetraethoxythiakalix[4]arenu v C D Cl 4 při 98 K, t m = 1.5 s. Kladné píky (červené) = diagonála a chemická výměna, záporné píky (modré) = NE. Koncentrace jednotlivých konformérů jsou různé, vzájemně se vyměňující se signály mají rozdílnou míru degenerace. Je to nesymetrická chemická výměna. Ve spektru jsou vidět jen signály 1,3-alt a paco konformérů. cone je rozšířený v blízkosti koalescenční teploty chemické výměny pinched cone - pinched cone.

12 EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. Při vyšší teplotě jsou v 1 H spektru pozorovatelné i signály cone konformeru. Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase 0,5 1,3-alt-4 paco-a3 paco-c4, cone-4 paco-b3 paco-b4 1,3-alt-3 paco-a5 paco-c3 cone-3,5 paco-a4 t m = 0.05 s, 363 K intenzita 0, 0,15 0,1 0,05 1,3-alt 4 - paco B 4 1,3-alt 4 - paco C 4 1,3-alt 4 - paco C 4 1,3-alt 3,5 - paco B 3; A 3,5 1,3-alt 4 - paco B 3; A 3,5 1,3-alt 3,5 - paco B 5 1,3-alt 3,5 - paco B ,0 0,04 0,06 směšovací čas (s) k PA = 4,97 s -1 při 363 K Poměrně rychlou chemickou výměnu paco 1,3-alt je potřeba měřit při velmi krátkých směšovacích časech. Za těchto podmínek nejsou měřitelné krospíky v důsledku výměny paco cone.

13 EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. EXY - výměnná spektroskopie - pokrač. Pro měření výměny paco cone je nutné použít mnohem delších směšovacích časů. Závislost relativní intenzity krospíků na směšovacím čase 1,3-alt-3 1,3-alt-4 paco-a3 paco-c4, cone-4 paco-b3 paco-b4 paco-a5 paco-c3 cone-3,5 paco-a4 t m = 0. s, 363 K intenzita 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, paco B3 - cone 3,5 paco C3,5 - cone 3,5 paco B4 - cone 4 paco B4 - cone 4 skutečný počáteční build-up 0, ,5 1 směšovací čas (s) k PC = 0,617 s -1 při 363 K Vlivem mnohem (cca 10x) rychlejších procesů dochází k rozsáhlé spinové difúzi a počáteční lineární část výstavbové křivky prakticky neexistuje. Je vhodné/nutné použít přesný výpočet pomocí relaxační a výměnné matice - na řádcích a sloupcích jsou jednotlivé spiny, maticové prvky obsahují příslušné rychlosti chemických výměn, kros-relaxační rychlosti a na diagonále též podélné relaxační rychlosti.

14 EXY - výměnná spektroskopie - závěr k AP k PA k PC k CP k PC k CP k CC k CC 1,3-alt (A) paco (P) 98 K 363 K * k PA 0,038 4,97 k PC 0,617 pinched cone (C) * výměna k CC je při 363 K rychlá - pro vyhodnocení EXY ji není třeba uvažovat Závěr: Pomocí EXY lze studovat i systémy, ve kterých dochází k mnoha různým přenosům magnetizace (s odlišnými rychlostmi) vlivem NE a chemické výměny. Je potřebné matematicky rigorosní vyhodnocení (neplatí aproximace počátečního lineárního nárůstu). Užitečná jsou měření při různých teplotách. Aktivační parametry jednotlivých procesů se stanoví v různých teplotních režimech. Přitom se mění relativní rychlosti různých přenosů magnetizace.

15 Měření pohyblivosti pomocí 13 C relaxací Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy 6CH H 5 4 H g H 3 1g 1g 3 1CH H 1 f H H H H g3 CH H CH H 6 5g 3 3g 5g 3f 3g 3 1f g 6g 3 f4 g 3 5f 4g 6g 4g 3 6f Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Základní princip Reorientační molekulová dynamika moduluje jadernou relaxaci. Jádra 13 C v molekule cukru, která nesou přímo vázaný proton, relaxují téměř výlučně vlivem přímé dipól-dipólové interakce s tímto protonem. Experimentální metodika Měření 13 C relaxačních dob T 1, T a heteronukleárního NE při různých intenzitách magnetického pole B 0. Podmínkou je režim mimo extrémní zúžení (extreme narrowing) - musí být ωτ M 1, aby relaxační doby byly závislé na B 0. Základní pulzní sekvence: inversion recovery (T 1 ) spinové echo - CPMG (T ) měření stacionárního heteronukleárního NE f ppm C NMR spektrum, D /DM 7/3, 303 K, 11.8 T

16 Metody měření relaxačních dob Inversion recovery Podélná relaxační doba T 1 návrat po inverzi (inversion recovery). Měření heteronukleárního NE heteronukleární stacionární NE mezi 13 C a 1 H pektrum 1 13 C 90 y 180 y (or x) 90 y 1 H ozařování dekapling t mix pektrum 13 C 90 y CPMG Příčná relaxační doba T - sekvence CPMG (Carr, Purcell, Meiboom, Gill) mnohonásobné spinové echo s konstantním echočasem a proměnným počtem cyklů n. 1 H dekapling NE se získá jako podíl intenzit signálů {(spektrum 1) / (spektrum )}. Maximální navýšení 13 C intenzity (tj. v režimu extrémního zúžení): NE = 1 + 0,5 γ H /γ C 3 90 y 180 y (or x) t echo / t echo / n

17 Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Pro analýzu je nutný model pohybu molekuly jako celku a jejích částí. Jeden z nejúspěšnějších je Lipari-zabóův bezmodelový přístup ( model-free approach) Předpoklady Lipari-zabóova modelu: relaxace je modulována dvěma pohyby: globálním a lokálním oba pohyby jsou statisticky nezávislé globální reorientace je izotropní molekulární pohyb je charakterizován parametry: τ M korelační čas globálního pohybu parametr uspořádanosti (hodnota 0-1) korelační čas lokálního pohybu τ e Lipari-zabóův přístup Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Závislost jaderné relaxace na molekulárním pohybu T 1 1 T 1 nh = D [ J( ω H ωc ) + 3J ( ωc ) + 6J( ωh + ωc )] 4 nh = D 4J(0) + J ω H ωc + 3J ωc + 6J ωh + 6J ωh + ωc 8 γ H η = γ C J Dipól-dipolární interakční konstanta: J [ ( ) ( ) ( ) ( )] 6J( ωh + ωc ) J( ωh ωc ) ( ω ω ) + 3J ( ω ) + 6J( ω + ω ) H Lipari-zabóovy spektrální hustoty : τ 5 1+ ω τ M ( ) ( ) ω + C C 1 τ 1+ ω τ D H C 3 ( µ / π ) γ γ hr = 0 4 C H CH M = τ = τ M + τe Rotační molekulární pohyb ovlivňuje jadernou relaxaci prostřednictvím spektrálních hustot J(ω) - udávají (zhruba) množství molekulárního pohybu na frekvenci ω. Pro jadernou relaxaci jsou nejvýznamnější ω H, ω C, (ω H + ω C ), (ω H - ω C ) a 0 s -1. Při různém magnetickém poli B 0 se mění i kruhové frekvence ω, a tedy zkoumáme pohyby při různých frekvencích.

18 Lokální pohyblivost trisacharidu melezitosy Závislost relaxačních rychlostí a NE pro 13 C jádra cukerných kruhů (R 1 = 1/T 1, R = 1/T ) na magnetickém poli B 0 při teplotách 303 K (a) a 33 K (b). Dynamické charakteristiky trisacharidu melezitosy Atom T(K) τμ (ns) τe (ns) C-cykl ± ± 0.01 C-6g ± ± 0.01 C-6g ± ± 0.01 C-1f ± ± 0.0 C-cykl ± ± 0.01 C-6g ± ± 0.01 C-6g ± ± 0.01 C-1f ± ± 0.03 C-6f ± ± 0.01 R 1 R 1+η R 1 R 1+η 6CH H 5 4 H g H 3 1CH H 1 f H 5 H 3 4 H CH H 6 Závislost relaxačních rychlostí a NE pro 13 C jádra exocyklických CH H skupin na magnetickém poli B 0 při teplotě 303 K. 6g 6g 3 R 1 R R 1 R 1f R 1 R Závěr: H g3 CH H Jednotlivé kruhy jsou dynamicky ekvivalentní. Hydroxymethylová skupina C-1f je podstatně méně pohyblivá než ostatní hydroxymethylové skupiny. 1+η 1+η 1+η becné: Pomocí měření relaxací se studuje pohyblivost jak malých tak velkých molekul a jejich funkčních skupin v časové škále s.