MENDELOVA UNIVERZITA V BRN

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Mikroflóra jogurtů Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Bc. Lenka Režná Brno 2010

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma,,mikroflóra jogurtů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF Mendelovy univerzity v Brně. V Brně dne Lenka Režná

3 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D., vedoucímu mé diplomové práce, za cenné rady a čas, který mi při zpracování práce věnoval.

4 Abstrakt Režná, L. Mikroflóra jogurtů. Diplomová práce. Brno, Diplomová práce se zabývá mikroflórou jogurtů. V literární rešerši je zmíněna historie a rozvoj výroby jogurtů. Literární rešerše dále vysvětluje a popisuje mléčné kvašení, které probíhá při výrobě jogurtů a zmiňuje význam kyseliny mléčné, která se tvoří při tomto procesu. Další kapitoly literární rešerše jsou věnovány popisu a charakteristice jednotlivých rodů a druhů bakterií mléčného kvašení tvořících jogurtovou kulturu a jiné kultury využívané k výrobě jogurtů. Dále se teoretická část zabývá technologiemi výroby jogurtů. V literární rešerši nejsou opomenuty ani patogenní mikroorganismy, které se mohou vyskytovat v jogurtech, včetně jejich možných negativních dopadů na konzumenta. Praktická část je věnována mikrobiologickým analýzám bílých jogurtů; Klasik firmy Olma, a. s., Activia firmy Danone, a. s. a Choceňský smetanový jogurt MAX od firmy Choceňská mlékárna, s. r. o. se zaměřením na stanovení významných skupin mikroorganismů. Zmiňované jogurty splňovaly limity dané normy. Klíčová slova: mléčné kvašení, bakterie mléčného kvašení, jogurtová kultura, výroba Abstract Režná, L. Microflora of yoghurts. Diploma thesis. Brno, Diploma thesis deals with microflora of yoghurts. The history and development of manufacturing the youghurts are mentioned in the literature search. The literature search farther explains and describes milk fermentation which proceeds within production of yoghurts and mentions the role of lactic acid which is formed during this process. Farther chapters of the literature search discourse on description and characterization of each genera and species of lactic acid bacterias generating yoghurt culture and other cultures used for yoghurt production. The theoretic part farther deals with technologies of yoghurt manufacturing. In the literature search there aren t missed out pathogenic micro-organisms which can occur in yoghurts and can possibly have negative influence on consumer. The practical part discourses on microbiological analyses of classic yoghurts without flavour; Klasik made by Olma, a. s., Activia made by Danone, a. s. and Choceňský smetanový jogurt MAX made by Choceňská mlékárna, s. r. o. and is aimed at assesment of important groups of micro-organisms. Mentioned yoghurts met limits of given norm. Key words: milk fermentation, lactic acid bacteria, yoghurt culture, manufacturing

5 OBSAH PRÁCE 1 ÚVOD... 2 CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Historie jogurtu Mléčné kvašení Význam kyseliny mléčné a bakterií mléčného kvašení ve výživě člověka Bakterie mléčného kvašení Rod Streptococcus Rod Lactobacillus Rod Bifidobacterium Čisté mlékařské kultury Jogurtová kultura Výroba jogurtu Patogenní mikroorganismy v jogurtech Salmonella sp Campylobacter spp Escherichia coli Staphylococcus aureus Clostridium botulinum Bacillus cereus Vady jogurtů MATERIÁL A METODIKA Odběr a příprava vzorku Očkování vzorků Živná média MRS Agar (Biokar Diagnostic, France) PCA se sušeným odtučněným mlékem Plate Count Agar with skimmed milk (Biokar Diagnostic, France) VRBL (Biokar Diagnostic, France) Agar s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem Chloramphenicol Yeast Glucose Agar (Hi Media, India) Kultivace

6 4.4.1 Bakterie mléčného kvašení Celkový počet mikroorganismů Koliformní bakterie Plísně a kvasinky Vyjádření výsledků VÝSLEDKY A DISKUSE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

7 1 ÚVOD Již v dávných dobách objevil člověk v kysaném mléce poměrně trvanlivý a také stravitelný pokrm, začal jej tedy doma vyrábět. Proto už po celá tisíciletí tvoří tento pokrm základní součást lidské výživy (Hylmar, 196). Bakterie mléčného kysání se používají při přípravě fermentovaných potravin již nejméně 4000 let. Na celém světě jsou využívány při výrobě fermentovaných mléčných výrobků včetně jogurtu, sýra, másla, kefíru a kumysu. Bakterie mléčného kysání představují skupinu mikroorganismů nejen s velkým ekonomickým významem, ale rovněž se uplatňují při udržování a zlepšování lidského zdraví. ( Jogurty mají blahodárný vliv na lidské zdraví. Zlepšují trávení, jejich konzumací se do organismu dostávají látky, které pozitivně ovlivňují složení střevní flóry. Nenahraditelné jsou ve chvíli, kdy je rovnováha bakterií trávicího ústrojí narušena, nejčastěji po léčbě antibiotiky. Dlouhodobě zlepšují vstřebávání látek střevními stěnami a působí preventivně proti alergiím a autoimunitním onemocněním. Jogurty mají velký význam pro výživu lidí, kteří nemohou pít mléko, protože nesnášejí laktózu. Obsahují totiž enzymy, které pomáhají zpracovávat laktózu v trávicím ústrojí. Jogurty dále pomáhají chránit dětský organismus před průjmovými onemocněními a omezují s nimi spojený úbytek hmotnosti. S jogurty tělo snadno přijímá minerální látky jako je vápník a fosfor, a také řadu důležitých vitaminů. (

8 2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je shrnout poznatky o mikroflóře jogurtu, charakterizovat rody a druhy mikroorganismů uplatňujících se při výrobě jogurtů, a také mikroorganismů nežádoucích, kontaminujících jogurty. Dále je cílem popsat výrobu jogurtů. Cílem praktické části je stanovit významné skupiny mikroorganismů ve vybraných jogurtech. 9

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie jogurtu Jogurt prošel tisíciletým vývojem a dodnes patří k základním potravinám. Uplatní se ve studené i teplé kuchyni. Pokud se jí v rozumném množství, přináší lidskému zdraví mnohonásobný užitek. Výrobky získané kysáním mléka provázejí lidstvo více než tři tisíciletí. Kdo poprvé vyrobil jogurt, se již nedozvíme. Uvádí se, že u jeho objevu stáli hunsko-bulharští kočovníci, kteří si převáželi mléko ve vacích vyrobených z kozí kůže. Bakterie, které v kůžích setrvávaly, se spolu s teplem postaraly o přeměnu čerstvého mléka na kysané. ( Aby vznikl skutečný jogurt, bylo zapotřebí přidat další bakterie. K tomuto poznání se v Evropě patrně poprvé dostali příslušníci kmenů žijících na Balkáně. Je rovněž možné, že první pravý jogurt vznikl v Turecku. Jisté je, že odtud pochází jeho jméno. Turecké slovo yo gurt je odvozeno od slova zahustit a pravděpodobně odkazuje na způsob, jakým se jogurty vyráběly. Z turečtiny pak slovo jogurt převzaly téměř všechny jazyky světa. Západní státy se s jogurtem seznamovaly pomalu. V šestnáctém století byl pomocí jogurtu uzdraven francouzský renesanční král František I. Zásluhu na tom měl jeho spojenec sultán Sulejman I. Nádherný, jehož lékaři králi podávali jogurt k překonání těžkých zažívacích potíží. Jogurty se celý novověk běžně jedly ve východní, jižní i západní Asii a také v jihovýchodní Evropě, jinde však ne. ( Zásluhu na popularizaci jogurtu v západoevropských státech měl ruský mikrobiolog a nositel Nobelovy ceny z roku 190 Ilja Iljič Mečnikov ( Byl první, kdo identifikoval dvě probiotické bakterie obsažené v kysaném mléce a zároveň jim přisoudil pozitivní vliv na dlouhověkost Turků, Bulharů a Arménců. Jsou to bakterie: Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. ( Mečnikovovy výzkumy inspirovaly židovského lékaře Isaaca Carcassa ze Soluně (dnešní Thessaloniki). Carcasso se v roce 1912 přestěhoval do Španělska a založil tam společnost, kterou pojmenoval Danone, což byla katalánská podoba jména syna Daniela. Jogurtové kultury získal z Bulharska a z Mečnikovovy laboratoře pařížského Pasteurova institutu a zahájil průmyslovou výrobu jogurtů. 10

10 Až do počátku třicátých let se vyráběly pouze bílé neochucené jogurty. V roce 1933 napadlo pracovníky Radlické mlékárny v Praze přidat na povrch jogurtů zrajících ve skle zavařeninu, aby tím zabránili tvorbě plísní. Jogurt díky tomu dostal jemnou chuť a rychle získal velkou oblibu. Nápad si nechala Radlická mlékárna patentovat a prodávala licence po celé Evropě. Tradiční jogurty se v Praze vyráběly až do šedesátých let, kdy je nahradily jogurty míchané v kádích a přelévané do plastových kelímků. Tradici původních ovocných jogurtů se pak mlékárně do zániku nepodařilo obnovit. ( Mlékárenství v České republice má dlouholetou tradici a šíře sortimentu mléčných výrobků a jejich kvalita mají vysoký evropský standard. Po vstupu České republiky do Evropské unie a otevření domácího trhu se konkurence samozřejmě přiostřila. Chtějí-li naši výrobci držet krok, musejí nabídku výrobků nejen rozšiřovat, ale také obměňovat a inovovat v duchu současných spotřebitelských požadavků a moderních trendů zdravé výživy. A to je koneckonců i důvod k tomu, proč mezi sebou čeští mlékaři již od roku 2002 soutěží o prestižní ocenění Mlékárenský výrobek roku. (Kopáček, 2009) Výsledky soutěže byly vyhlášeny v rámci oslav Světového dne mléka. Cílem Světového dne mléka, , který si čeští mlékaři připomínají od roku 1994, je propagace mléka jako základní složky lidské výživy. Ve světě mlékaři svátek slaví již od roku 1957, dle odhadů se tak v současnosti děje zhruba v 70 zemích světa. Rozhodnutí, na jaký den svátek připadne, je na každé zemi. ( Sedmého ročníku soutěže o Mlékárenský výrobek roku se zúčastnilo 16 tuzemských výrobců, kteří do hodnocení přihlásili celkem 43 výrobků. Zařazeny byly výrobky uvedené na trh od 1. dubna 200 do 30. března Hodnotilo se v šesti kategoriích: tekuté mléčné výrobky, jogurty a zakysané mléčné výrobky, másla a mléčné pomazánky, tvarohy a tvarohové výrobky, sýry přírodní a tavené a kategorie specialit. Odborné hodnocení připravil kolektiv Ústavu technologie mléka a tuků VŠCHT Praha a uskutečnilo se 24. dubna (Kopáček, 2009) V kategorii jogurty a zakysané výrobky zvítězilo Acidofilní malinové mléko z mlékárny Kunín, a. s., fermentovaný mléčný výrobek získaný kysáním mléka s pomocí probiotických bakterií mléčného kvašení (Lbc. acidophilus a Bifidobacterium) a ochucený malinovou složkou. Výrobek je balen do bílé polyethylenové láhve o obsahu 950 g uzavřené zeleným šroubovým uzávěrem a opatřený barevnou etiketou. 11

11 Použitelnost je 21 dnů při dodržení podmínek skladování a přepravy. Výrobek byl uvedený na trh v dubnu 200. Druhé místo získal Biojogurt - jahoda z Mlékárny Valašské Meziříčí, s. r. o., a třetí místo smetanový jogurt Krajanka,5 %, 150 g s borůvkovou příchutí. (Kopáček, 2009) Spotřeba mléčných výrobků v ČR v roce 200 poprvé od roku 1997 poklesla na 242,6 kilogramu na osobu, vyplývá z předběžných údajů ČMSM. Pokles nastal u většiny položek s výjimkou másla a konzumního mléka. Tuzemské mlékárny v roce 200 nakoupily a zpracovaly 2,36 miliardy litrů mléka, což bylo o půl procenta méně než v roce V roce 200 klesl dovoz, vývoz i celkové saldo zahraničního obchodu s mlékem a mléčnými výrobky, které skončilo přebytkem 4,7 miliardy korun. ( 3.2 Mléčné kvašení Při výrobě mléčných fermentovaných výrobků se využívá některých vlastností mikroorganismů. Při použití čistých mlékařských kultur musí být vytvořeny takové podmínky, aby se čistá kultura mohla plně rozvíjet a zabezpečit organoleptické, fyzikálně chemické změny, typické pro požadovaný druh výrobku. Do skupiny kysaných mléčných výrobků zařazujeme výrobky, u kterých vzniká kyselina mléčná enzymatickým anaerobním procesem přeměny laktózy vlivem bakterií mléčného kvašení. (Cempírková et al., 1997) Za pravé bakterie mléčného kvašení se považuje velká přirozená skupina nepohyblivých, nesporulujících grampozitivních koků a tyčinek, které fermentují sacharidy za fakultativně anaerobních podmínek a tvoří jako hlavní produkt kyselinu mléčnou. (Görner, Valík, 2004) Typické bakterie mléčného kysání se řadí do rodů Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc a Pediococcus. K bakteriím mléčného kvašení se přiřazuje i rod Bifidobacterium. (Grieger et al., 1990) Mléčné kvašení je pochod, při němž zmíněné bakterie tvoří z jednoduchých sacharidů (hlavně monosacharidů a disacharidů) kyselinu mléčnou. Tato fermentace je 12

12 náročná na podmínky prostředí. Mikroorganismy často vyžadují vitamíny a dusíkaté organické látky. Jedná se o anaerobní proces. ( Základním anaerobním katabolickým procesem sacharolytických mikroorganismů je tzv. glykolýza neboli Embden - Meyerhofova metabolická cesta. Spočívá v přeměně hexóz na pyruvát. Pyruvát je pak dále metabolizovám za anaerobních podmínek u různých mikroorganismů odlišným způsobem. Cílem jeho přeměny je vždy současná přeměna redukovaného kofaktoru (NADH) ve formu schopnou dehydrogenovat další molekulu substrátu při glykolýze v NAD +. U homofermentativních mléčných bakterií (např. Streptococcus, Lactococcus, u některých laktobacilů) je pyruvát vzniklý glykolýzou redukován za součinnosti redukovaného kofaktoru v laktát, tj. anion mléčné kyseliny (CH 3 -CHOH-COO ). Heterofermentativní mléčné bakterie však neobsahují aldolázu, tj. glykolitický enzym štěpící hexóza-1,6-bisfosfát ve dva triózafosfáty. Proto převádějí hexózy oxidačním mechanismem hexózafosfátového zkratu v pentóza-5-fosfát a oxid uhličitý. Za součinnosti anorganického fosfátu se pak enzymově štěpí pentóza-5-fosfát v acetylfosfát (CH 3 -COO-PO 3 H 2 ) a glyceraldehyd-3-fosfát. Z acetylfosfátu vzniká za součinnosti redukovaného kofaktoru ehtanol, glyceraldehyd-3-fosfát je glykolýzou přeměněn v pyruvát a pak v laktát. Tím vzniká z hexózy ekvimolekulární množství oxidu uhličitého, ethanolu a laktátu. U některých mléčných bakterií se šest molekul pentóza-5-fosfátu přeměňuje v deset molekul glyceraldehyd-3-fosfátu, jež jsou pak glykolýzou metabolizovány přes pyruvát v laktát. (Šilhánková, 200) Kyselina mléčná je dvojího druhu. První je alfa oxypropionová - ethylidenomléčná, která má asymetrický uhlík. Tudíž může být pravotočivá i levotočivá. Směs obou je opticky inaktivní pokud jsou oba isomery přítomny ve stejném množství. Druhá kyselina je beta oxypropionová - ethylenomléčná, která má symetrický uhlík. Zda se tvoří při kysání mléčná kyselina pravotočivá nebo levotočivá závisí na druhu bakterií a také na výchozím materiálu. (Olšanský, 195) enz. laktáza Lactobacteriaceae: (Olšanský, 195) C12 H 22O11 + H 2O enz. laktacidáza 2C6H12O6 4C3H 6O3 13

13 Při mléčném kysání vznikají kromě hlavních produktů i produkty vedlejší, podle kterých lze mikroorganismy třídit. Skupina homofermentativních mikroorganismů přeměňuje sacharid téměř výlučně na kyselinu mléčnou a heterofermentativní mikroorganismy přeměňují sacharid na kyselinu mléčnou (>50%), kyselinu octovou, oxid uhličitý a za určitých okolností i ethanol. U některých rodů bakterií mléčného kvašení je možné jako identifikační znak použít i konfiguraci a optickou otáčivost kysáním vzniklé kyseliny mléčné. (Görner, Valík, 2004) 3.3 Význam kyseliny mléčné a bakterií mléčného kvašení ve výživě člověka Pro člověka, tak jako pro jiné organismy, je velice důležité zabezpečení výměny látek s okolní přírodou. S tím, jak má člověk v dnešní době stále méně pohybu, se snižuje energetická spotřeba, ustupuje význam energetické hodnoty potravin a roste význam biologické hodnoty potravin a kvality výživy. Stále více musíme dávat pozor na kvalitu potravin, aby organismus nepřijímal přebytek energie. (Nehyba, 2009) Užitečné mikroorganismy obsažené v kysaných mléčných výrobcích zvyšují stravitelnost mléka. Dochází totiž k částečnému natrávení hlavních složek mléka. Bylo prokázáno, že mléko se po jedné hodině v trávicím traktu stráví pouze z 32 %, zatímco jogurt se za stejnou dobu stráví z 91 %. Obecně lze říct, že nutriční hodnota kysaných mléčných výrobků pro všechny skupiny obyvatelstva je vždy vyšší, než u původního sladkého mléka. (Nehyba, 2009) U lidí s laktózovou intolerancí, tj. neschopností strávit mléčný cukr, nedochází při konzumaci kysaných mléčných výrobků k zažívacím potížím, protože ve výrobcích je laktóza natolik rozložena, že nemůže způsobit problémy se zažíváním. (Nehyba, 2009) Čerstvé sladké mléko obsahuje zanedbatelné množství mléčné kyseliny. Vyprodukovaná mléčná kyselina v kysaných mléčných výrobcích jim dodává jemně kyselou osvěžující chuť, chrání je a zvyšuje jejich trvanlivost. Sráží mléčné bílkoviny do jemných vloček, zlepšuje využití vápníku, fosforu a železa. Vyvolává sekreci žaludečních šťáv a působí příznivě na aktivitu pepsinu. (Hylmar, 196) Dle Nehyby (2009) kyselina mléčná stimuluje peristaltiku střev, a tak dochází k zabránění 14

14 dlouhodobého pobytu škodlivých mikroorganismů ve střevech člověka a chrání ho před jejich neblahým působením. Dále kyselina mléčná podporuje resorpci vitamínů přijímaných potravinami a resorpci aminokyselin uvolněných při fermentativním odbourávání bílkovin. (Grieger et al., 1990) Kyselina mléčná odštěpuje vápník vázaný na kasein a vytváří se volný kasein a mléčnan vápenatý. Kasein z mléka lze vysrážet též použitím jiných organických a anorganických kyselin. V druhé fázi tohoto procesu se kasein převádí do isoelektrického stavu (ph 4,7), v němž má nejnižší rozpustnost a vylučuje se. (Kněz et al., 1960) Kyselina mléčná, která vzniká v intestinálním ústrojí mikrobiální činností, zvyšuje resorpci vápníku. Lepší využití vápníku nastává při konzumaci kysaných mléčných výrobků. Kyselina mléčná tvoří s vápníkem rozpustný resorbovatelný komplex láktátu vápníku a rozpouští určité látky, které by blokovaly transport vápníku v mukóze. (Grieger et al., 1990) Mléčné výrobky mohou mít na lidské zdraví i negativní vliv. Klinická studie provedená u mužů ve Francii v roce 2006 naznačuje, že může existovat souvislost mezi přílišnou konzumací výrobků z mléka, zejména jogurtů, a nádorovým onemocněním prostaty. Ohroženi jsou podle studie muži, kteří jedí více než tři jogurty denně, zřejmě kvůli nadměrnému přísunu vápníku. Podobný závěr přinesly studie z roku Jiné práce tyto výsledky vyvracejí. ( Kyselina mléčná zabraňuje rozmnožování mikroorganismů rozkládajících mléčné bílkoviny za vzniku látek pro lidské zdraví škodlivých a chuťově nepříjemných. Průkopníkem názoru o příznivých účincích kysaných mlék, zejména jogurtu, byl známý ruský badatel Mečnikov. V pravidelném požívání zakysaných mlék viděl způsob, jak zabránit rozvoji hnilobné mikroflóry v lidském střevním traktu, a tím tvorbě toxinů rozkladem bílkovin za vzniku indolu, skatolu a krezolu. V těchto produktech totiž hledal Mečnikov příčinu rychlého stárnutí lidského organismu. I když jen některé z jeho názorů byly pozdějšími výzkumy potvrzeny, patří mu nesporně zásluha, že upoutal pozornost vědců a lékařů na příznivé, výživné a dietetické účinky kysaných mléčných výrobků. (Teplý et al., 196) Mléčná kyselina se vyskytuje v kysaných mléčných výrobcích ve dvou optických izomerech: jako pravotočivá L (+) mléčná kyselina a jako levotočivá D (-) mléčná kyselina. Oba izomery jsou absorbovány v trávicím traktu, ale jejich přeměna je rozdílná. Pravotočivá mléčná kyselina se kompletně přeměňuje v respiračním procesu 15

15 nebo je syntetizována na glukózu nebo glykogen. Levotočivá mléčná kyselina se transformuje jen omezeně a pozvolna. Tím, že ji organismus jen slabě asimiluje, přechází v určitém množství až do tlustého střeva, kde okyseluje prostředí a brzdí tak rozvoj především hnilobné mikroflóry. (Hylmar, 196) U kojenců však může levotočivá mléčná kyselina vyvolat acidózu. Doporučuje se proto, aby kysané mléčné výrobky pro kojence obsahovaly převážně pravotočivou mléčnou kyselinu. Dospělí sice snášejí levotočivou mléčnou kyselinu dobře, ale přesto však světová zdravotnická organizace (WHO) doporučuje, aby se nepřekročilo množství 100 mg levotočivé mléčné kyseliny na 1 kg tělesné hmotnosti a den. (Hylmar, 196) Poměr mezi izomerickými formami mléčné kyseliny je v kysaných mléčných výrobcích dán použitými čistými kulturami, způsobem kultivace, skladováním, případně ochucováním. Mezofilní laktokoky mléčného kvašení, stejně jako leukonostoky a Streptococcus thermophilus produkují pravotočivou mléčnou kyselinu. Jejich produkce levotočivého izomeru je nevýznamná. Podobně je tomu i u kmenů Bifidobacterium bifidum. Lactobacillus acidophilus produkuje z celkového množství mléčné kyseliny asi 10 % levotočivého izomeru, zatímco jogurtová kultura 30 až 50 %. (Hylmar, 196) Jogurtová mikroflóra působí příznivě proti zácpě. Pomáhá odstranit páchnoucí dech, který je průvodním jevem při silně zapáchající stolici. Mléčné kultury dále mají antikarcinogenní, antileukemické a antisklerotické účinky, což znamená, že snižují hladinu cholesterolu v krevním séru, a dále ovlivňují detoxikační kapacitu jater. (Nehyba, 2009) 3.4 Bakterie mléčného kvašení Jsou to bakterie, které z laktózy tvoří kyselinu mléčnou. Morfologicky jsou to koky nebo tyčinky, vesměs grampozitivní. Systematicky se dělí na homofermentativní mléčné bakterie, které zkvašují cukry na pravotočivou kyselinu mléčnou, přičemž tvoří jen malé množství těkavých produktů, a na heterofermentativní mléčné bakterie, které produkují levotočivou kyselinu mléčnou a vedle toho značné množství jiných kyselin a látek (kyselina octová, oxid uhličitý, ethanol). (Grieger et al., 1990) 16

16 Skupina bakterií mléčného kvašení se dnes skládá z 13 rodů grampozitivních bakterií: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella. Příbuzné rody s bakteriemi mléčného kvašení jsou rody Aerococcus, Microbacterium a Propionibacterium, které ale nejsou považovány za bakterie mléčného kvašení. (Jay et al., 2005) Rod Streptococcus V taxonomii streptokoků se často užívají dva klasifikační systémy vedle sebe. V starším pojetí se klasifikace rodu Streptococcus dělí na šest skupin: pyogenní streptokoky, orální streptokoky, jiné streptokoky, anaerobní streptokoky, enterokoky a mléčné streptokoky. V novém, částečně odlišném klasifikačním systému rodu Streptococcus, jak ho navrhli Schilfer a Kilper-Bälz (194, 195, a 197), je rozdělení do výše uvedených skupin streptokoků ponechané s výjimkou vynechání anaerobních streptokoků. Pro potravinářské mikrobiology je ale z taxonomického hlediska ještě důležitější, že uvedení autoři navrhli skupinu enterokoků a skupinu mléčných streptokoků povýšit na samostatné rody: Enterococcus a Lactococcus. Uvnitř klasických skupin streptokoků a nově navrhnutých rodů odůvodnili a navrhli i nové taxony a některé přesunuli mezi skupinami a rody. (Görner, Valík, 2004) Buňky streptokoků jsou okrouhlé nebo vejčité s průměrem 2 µm, když rostou v tekutém médiu, jsou uspořádané v párech, krátkých nebo delších řetízcích, obyčejně nepohyblivé. Netvoří spóry. Jsou grampozitivní. Většinou fakultativně anaerobní, katalázo-negativní. Rod Streptococcus tvoří kyselinu mléčnou jako téměř jediný produkt metabolismu cukrů. Proto se zařazuje mezi homofermentativní mléčné bakterie. (Šilhánková, 200). Některé druhy fermentují i organické kyseliny (malonová, citronová) a aminokyseliny (serin, arginin). Neredukují dusičnan na dusitan. (Görner, Valík, 2004) Streptokoky rostou v rozmezí 25 až 45 C s optimem 37 C, nerostou při 10 C (Sedláček, 2007). Rod Streptococcus obsahuje druhy parazitické, saprofytické až choroboplodné pro lidi a zvířata (Görner, Valík, 2004). Dle Sedláčka (2007) osidlují převážně ústní dutinu a horní část respiračního traktu. Saprofytické se vyskytují v přírodě a potravinách 17

17 a mají v potravinářském průmyslu významné využití. Jsou nově zahrnuty v rodech Lactococcus a Enterococcus a řadí se k nim i druh Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. (Görner, Valík, 2004) Streptococcus salivarius ssp. thermophilus je termofilní streptokok mléčného kvašení, jehož optimální teplota je 37 až 45 C, zvlášť virulentní kmeny přežijí i čtvrthodinový záhřev na 0 C. Při optimální teplotě sráží mléko za 1 až 20 hodin. Tvoří pravotočivou kyselinu mléčnou a štěpí také kasein. (Teplý et al., 196) Buňky Streptococcus salivarius ssp. thermophilus jsou kulovité až oválné o velikosti 0, - 1,0 µ m v průměru, tvořící řetízky o různých délkách. Rychle rostou na vhodném médiu za nepřítomnosti kyslíku. Většina kmenů nejsou hemolytické na krevním agaru, ale lze nalézt i kmeny α - hemolytické a β - hemolytické. Na agaru s obsahem sacharózy odštěpují rozpustný fruktan, jehož výsledkem jsou velké mukoidní kolonie. Některé kmeny produkují nerozpustné glukany. Kolonie se na sacharidovém agaru mění z jemných na drsné v závislosti na poměru syntetizovaných polysacharidů. Kyselina je produkována z amygdalinu, arbutinu, celobiózy, fruktózy, glukózy, sacharózy, maltózy, manózy, N-acetylglukosaminu a salicinu. Není produkována z arabinózy, arabitolu, adonitolu, cyklodextrinu, dulcitolu, glykogenu, glycerolu, manitolu, melibiózy, rhamózy, ribózy, sorbitolu, L-sorbózy, škrobu, tagatózy nebo xylózy. Produkce kyseliny z galaktózy, laktózy, metyl D-glukosidu, inulinu, rafinózy a trehalózy má různé charakteristiky. Konečné ph v glukózovém bujónu je 4,0 až 4,4. Kmeny bakterií jsou izolovány z ústní dutiny lidí a zvířat, obzvlášť z jazyka, slin a dále z výkalů. Příležitostně se izoluje z krve pacientů s endokarditidou. (Vos et al., 2009) 1

18 Obr. č. 1 Streptococcus salivarius ssp. thermophilus v MRS médiu ( Rod Lactobacillus Rod Lactobacillus zahrnuje fakultativně anaerobní nebo mikroaerofilní nepohyblivé tyčinkovité bakterie mléčného kvašení (zpravidla rovné, občas kokobacily). Jejich hlavním metabolitem fermentace sacharidů je kyselina mléčná, ale i octová, etanol a oxid uhličitý. Nachází se ve fermentovatelných rostlinných a živočišných materiálech a také v trávicím a zažívacím traktu lidí a zvířat. Jsou to saprofyti, jen zřídka patogeny. Laktobacily rostou, rozmnožují se a metabolizují za anaerobních podmínek, ale i při sníženém obsahu kyslíku ve všech prostředích, které jim poskytují dostatek fermentovatelných sacharidů, štěpných produktů bílkovin, nukleových kyselin a vitamínů skupiny B. (Görner, Valík, 2004) Laktobacily jsou velmi náročné na vitamíny, z nichž některé vyžadují pro svůj růst až šest různých vitamínů. Spolu se streptokoky mají poměrně termorezistentní vegetativní buňky. Většina druhů je schopna růst při 45 C. (Šilhánková, 200) Upřednostňují tedy mezofilní a mírně termofilní teploty. Jsou acidotolerantní až acidofilní. Při fermentaci tvorbou kyselin snižují kyselost prostředí až pod ph 4,0. Kyseliny mléčná a octová jsou v kyselém prostředí málo disociované a v tomto stavu působí spolu se sníženým ph inhibičně až mikrobicidně na ostatní mikroorganismy 19

19 v prostředí, s výjimkou jiných bakterií mléčného kvašení a kvasinek. (Görner, Valík, 2004) Tyto vlastnosti laktobacilů jsou užitečné a uplatňují se v potravinářské technologii a v intestinálním traktu lidí a zvířat mají také pozitivní vliv (Görner, Valík, 2004). Na základě konečných produktů fermentace cukrů je možno dělit laktobacily do tří skupin. Obligátně homofermentativní laktobacily fermentují hexózy výhradně na kyselinu mléčnou, pentózy ani glukonát nefermentují. Do skupiny spadá L. delbrueckii, L. acidophilus a L. helveticus. Fakultativně heterofermentativní laktobacily fermentují hexózy na kyselinu mléčnou, nebo na směs kyseliny mléčné, octové, mravenčí a ethanolu. Pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou. Zástupci této skupiny jsou L. casei a L. plantarum. Obligátně heterofermentativní laktobacily fermentují hexózy na kyselinu mléčnou, octovou (ethanol) a oxid uhličitý. Pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou. Do skupiny spadá L. fermentum a L. kefir. (Sedláček, 2007) Mléko po opuštění vemene při aseptickém dojení neobsahuje laktobacily. Později může dojít ke kontaminaci z vnějšího prostředí prachem, stykem s mlékárenským nářadím a zařízením, jak uvádějí Görner, Valík (2004) a Vos et al. (2009). Mléčné streptokoky (Lactococcus spp.) rostou v mléce rychleji než laktobacily. Proto v čerstvém kysaném mléku je laktobacilů v poměru k laktokokům málo. Ale když kysané mléko stojí ve vhodných teplotních podmínkách delší čas, přerůstají laktobacily, neboť jsou vůči kyselému prostředí tolerantnější než laktokoky. (Görner, Valík, 2004) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus je termofilní tyčinka ze skupiny bakterií mléčného kvašení (Teplý et al., 196). Jeho buňky jsou nepohyblivé tyčinky se zaoblenými konci o velikosti 0,5 až 0, x 2 až 9 µ m, vyskytující se samostatně a v krátkých řetízcích (Vos et al., 2009). Jak uvádí Teplý et al. (196) vyskytují se však i formy delší a širší. V nepříznivém prostředí má zvýšený sklon k tvorbě řetízků až dlouhých vláken tyčinek, zejména pak tvoří zprohýbané involuční tvary. Má stálý a velký sklon ke granulaci. Jeho růst se značně zvýší v prostředí s nízkým obsahem kyslíku nebo anaerobním prostředí. Růstové optimum má při teplotě 45 C a dobře roste i při 4 až 20

20 52 C. K růstu vyžaduje pantotenovou kyselinu a niacin. Thiamin, pyridoxin, biotin, a také p-aminobenzoovou kyselinu nevyžaduje. (Vos et al., 2009) Při teplotě kolem 40 C sráží mléko někdy již i za 2,5 až 4,5 hodiny. V mléce tvoří zpravidla kyselinu mléčnou inaktivní, podle některých autorů však i levotočivou, popř. i pravotočivou. Dále tvoří i nepatrné množství kyseliny octové, mravenčí a jantarové. Ze sacharidů fermentuje laktózu, glukózu a galaktózu. (Teplý et al., 196) Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus je tedy homofermentativní, dále grampozitivní. Buněčná stěna obsahuje peptidoglykan (murein) a buněčná membrána kyselinu teichovou. Mikroorganismus produkuje v malém množství heteropolysacharidy. Produkce těchto polysacharidů je užitečná právě při výrobě mléčných výrobků, hlavně jogurtu, protože má pozitivní vliv na reologické vlastnosti, ovlivňuje konzistenci, zvyšuje viskozitu a stabilizuje sraženinu. (Vos et al., 2009) Kolonie rostoucí na agaru jsou obvykle malé (2 až 5 mm) s hladkým okrajem, vypouklé, hladké, lesklé a bez barviva. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se adaptuje na komplexní organické substráty. Nevyžaduje pouze sacharidy jako zdroj energie a uhlíku, ale vyžaduje také nukleotidy, aminokyseliny a vitamíny. (Vos et al., 2009) Obr. č. 2 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ( 21

21 Lactobacillus acidophilus, základní kultura čisté acidofilní kultury, je fakultativně anaerobní mikroorganismus, jehož optimální kultivační teplota je 37 C. Špatně roste již při teplotách nižších než 20 C a vyšších než 4 C. Teplotu 63 C běžné kmeny tohoto mikroorganismu vůbec nesnášejí. V mladé kultuře je grampozitivní a značně odolný vůči fenolu. Pro zdravotnické účely se pěstují speciální kmeny Lactobacillus acidophilus, odolné vůči hlavním druhům antibiotik používaných ve zdravotnictvích. Mléko sráží při ph 5,, optimální reakci vykazuje při ph 6,5. V čerstvé kultuře se vyskytuje nejčastěji jako tyčinka dlouhá 2 až 10 µm a široká 0,5 až 1,0 µm, méně často v párech, shlucích nebo kratších řetízcích. Ve staré kultuře nebo v nepříznivém životním prostředí vytváří involuční tvary, a to buď protáhlé, nebo silně zprohýbané tyčinky, které se mohou barvit podle Gramma i negativně. (Teplý et al., 196) Obr. č. 3 Lactobacillus acidophilus v MRS médiu ( 22

22 3.4.3 Rod Bifidobacterium Bifidobakterie jsou tyčinky, které mají velmi rozmanitý tvar. Jsou obvykle zakřivené a kyjovité, často s náznaky větvení. Uspořádané jsou jednotlivě, nebo ve dvou ve,, V seskupení, občas v řetízcích, palisádách nebo růžicích. Příležitostně vykazují kokovité tvary. Jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující a anaerobní. Optimální růstová teplota je v rozmezí 37 až 41 C. Charakteristickým klíčovým enzymem rodu je fruktózo-6-fosfát-fosfoketoláza. (Sedláček, 2007) Bifidobakterie mají významnou úlohu v intestinálním traktu kojenců. Z fermentovatelných sacharidů produkují kyselinu octovou a kyselinu mléčnou, které inhibují nežádoucí bakterie a stimulují intestinální peristaltiku. Kyselina octová, kterou bifidobakterie produkují ve větším množství než kyselinu mléčnou (v poměru 3:2), má silnější antagonistický účinek na nevítané gramnegativní bakterie než kyselina mléčná. (Görner, Valík, 2004) Současně produkují malé množství sukcinátu a mravenčanu (Šilhánková, 200). Používají se pro přípravu mléčných nápojů s blahodárnými dietetickými účinky (Šilhánková, 200). V současnosti se v mlékařském průmyslu vyrábí řada tzv. probiotických kysaných mlék jogurtového typu s uvedenými účinky na složení střevní mikroflóry. K tomuto účelu se používá bifidobakterií původem z lidského střeva, např. Bifidobacterium longum BB536, vedle vlastních jogurtových bakterií v kysaném mléčném přípravku jogurtového typu. Tzv. probiotické bakterie musí mít proto schopnost překonat v žaludku pro ně nepříznivé prostředí (žaludeční šťávy), musí snášet žlučové kyseliny a nízké povrchové napětí a musí odolávat pohyblivosti střev (peristaltika). (Görner, Valík, 2004) 23

23 Obr. č. 4 Bifidobacterium sp. ( 3.5 Čisté mlékařské kultury V současné době bývají čisté mlékařské kultury nejčastěji definovány jako vybrané a vyšlechtěné mikroorganismy, záměrně přidávané do mléka nebo smetany s cílem vyvolat určité specifické změny ve vzhledu, konzistenci, obsahu, chuti i dalších vlastnostech daného mléčného výrobku. U nás se definují čisté mlékařské kultury jako klíčové výrobní prostředky, kterými se do suroviny (mléko, smetana, syrovátka) zbavené všech patogenních i pokud možno nežádoucích a technologicky škodlivých mikroorganismů zavádějí vybrané účelově zaměřené druhy specifických mikroorganismů, aby vyvolaly a zajistily správný průběh výrobního procesu a dosažení žádoucí jakosti hotových výrobků. (Hylmar, 195) Pro mlékárenskou výrobu kysaných mléčných výrobků je zvlášť důležitý výběr vhodných čistých mlékařských kultur. Proto se stále hledají nové a speciální kmeny, které by umožňovaly zavádět další druhy kysaných mléčných výrobků do výroby a na trh. U čistých mlékařských kultur používaných při výrobě kysaných mléčných výrobků se požadují základní charakteristické vlastnosti, a to zajištění správného průběhu biochemických pochodů, především mléčného kvašení, správný vývoj 24

24 senzorických vlastností a příznivé dieteticko - léčebné účinky. Výběr se zaměřuje hlavně na čisté mlékařské kultury se zvýšenými antagonistickými účinky, s odolností vůči jiným antibiotikům a jiným inhibičním látkám, na možnost jejich adaptace v trávicím traktu a odolnost kultur vůči fágům. U směsných kultur se požaduje, aby použité druhy a kmeny mezi sebou nevykazovaly antibiózu, ale naopak reverzní symbiózu, které zajišťuje vzájemné stimulující působení na růst a biologickou aktivitu. (Hylmar, 196) V mlékárenském průmyslu se používá široká škála čistých mlékařských kultur, z nichž převážnou část tvoří bakterie mléčného kvašení. Ty se také staly základními kulturami v mlékárenské výrobě a všechny ostatní, pokud se používají, kulturami doplňkovými. (Hylmar, 195) Přestože se ve světě vyrábí mnoho druhů kysaných mléčných výrobků, liší se svými enzymovými procesy jen velmi málo a okruh využívaných mikroorganismů není velký. Při výrobě kysaných mléčných výrobků se uplatňují tři skupiny čistých mlékařských kultur, a to mezofilní laktokoky mléčného kvašení, termofilní bakterie mléčného kvašení a kombinace bakterií mléčného kvašení s kvasinkami zkvašujícími laktosu. (Hylmar, 196) Z termofilních bakterií mléčného kvašení se při výrobě kysaných mléčných výrobků (jogurtů) využívají laktobacily a streptokoky. Z laktobacilů se uplatňují především Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Lactobacillus helveticus var. jogurti a ze streptokoků Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, dále Bifidobacterium bifidum, Pediococcus acidilactici a další. (Hylmar, 196) 25

25 Vyhláška č. 77/2003, kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje (novelizovaná) Příloha č. 2 k vyhlášce č. 77/2003 Sb. - Fyzikální, chemické a mikrobiologické požadavky na jednotlivé mléčné výrobky a na druhy mikroorganismů mléčného kysání Tabulka č. 1 Druhy mikroorganismů a jejich limity v kysaných mléčných výrobcích stanovené vyhláškou č. 77/2003 Druh výrobku Acidofilní mléko Jogurty*) Kysané mléko, vč. smetanového zákysu, podmáslí a kysané smetany Kefír Použité mikroorganismy Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. termofilní kultury bakterií mléčného kvašení protosymbiotická směs Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kvašení zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Kluyveromyces marxianus i nezkvašujících laktózu Sacharomyces unisporus, Sacharomyces cerevisiae, Sacharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g 10 6 Lactobacillus acidophilus bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky 10 4 Kefírové mléko Kysaný mléčný výrobek s bifido-kulturou zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Bifidobacterium sp. v kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléčného kvašení bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky bifidobakterie *) U jogurtových výrobků mohou být kromě základní jogurtové kultury přidávány kmeny produkující kyselinu mléčnou a pomáhající dotvářet specifickou chuťovou nebo texturovou charakteristiku výrobku. Musí však být zachován optimální poměr obou základních kmenů jogurtové kultury. ( Čisté mlékařské kultury se dodávají do mlékárenských závodů v různých formách a zde se buď dále rozmnožují, nebo přímo využívají v mlékárenské výrobě. 26

26 Nejčastější formy čistých mlékařských kultur jsou tekuté, sušené, zmrazené, zmrazené koncentráty a sušené koncentráty. (Hylmar, 195) Producenti mikrobiálních kultur v současnosti vyrábějí a do potravinářských podniků dodávají kultury s kratší nebo delší trvanlivostí ve formě tekutých kultur, sušených kultur (lyofilizací, koncentrovaných a sušených lyofilizací) nebo mrazených kultur při -40 C (hluboko zmrazených při -196 C). Tekuté kultury představují starší obchodní formu. Tato kultura slouží na očkování výrobního mléka (substrátu) 0,1 až 5 % podle druhu kultury, teploty a doby fermentace substrátu. Tekuté kmenové kultury po dobu několikadenní přepravy, hlavně v letním období, jsou oslabené a vzájemný poměr mikroorganismů bývá změněný a buňky přechází do fáze odumírání. Trvanlivost kmenové kultury je velmi malá. Samotná kultura se uchovává zchlazená na +5 C. Zákysové kultury jsou náchylné na kontaminaci kvasinkami a při poklesu jejich aktivity i koliformními bakteriemi. (Görner, Valík, 2004) Sušené kultury se suší vymrazováním (lyofilizací). Při tomto postupu se tekuté kultury zmrazí v tenké vrstvě při -40 C a za sníženého tlaku vzniklý led sublimuje na páru, která se odsává. (Görner, Valík, 2004) Koncentrované sušené kultury byly vyvinuty ve snaze snížit potřebný počet přeočkování při množení kultury a současně i snížit riziko kontaminace bakteriofágem a jinými mikroorganismy. Udává se spotřeba 15 až 20 g sušené kultury na očkování 500 až 1000 l substrátu při požadované koncentraci inokula 6 10 KTJ/g. Koncentrované kultury se dosahuje zlepšením kultivačních podmínek, baktofugací nebo ultrafiltrací. Hluboce zmrazené kultury mají velmi dobré vlastnosti. Jejich nevýhodou je potřeba nepřetržitého udržení teploty nepřekračující -45 C po dobu dopravy a skladování, a tím i vysoká cena. Na konci fáze růstu se buňky koncentrují odstřeďováním nebo ultrafiltrací, asepticky plní do hliníkových obalů a okamžitě zmrazí v tekutém neomezeně. (Görner, Valík, 2004) dusíku při -196 C. V tomto stavu je kultura trvanlivá skoro Milcom, a. s. je tradiční výrobce, který produkuje celou řadu mlékařských kultur, jak pro mlékárenskou velkovýrobu, tak pro faremní zpracování mléka a drobné chovatele skotu, ovcí a koz na výrobu kysaných výrobků a různých typů sýrů. Tato společnost je významným partnerem všech výrobců potravin, zejména mlékáren, na cestě k novým výrobkům, ve využití nových technologií a rychlé a spolehlivé diagnostice potravin. ( 27

27 3.6 Jogurtová kultura K výrobě jogurtů se používají různé typy jogurtových kultur. Jogurtová kultura (klasická) je směsný typ kultury, kterou tvoří termofilní tyčinky Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a termofilní streptokok druhu Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. (Teplý et al., 196) Tyto mikroorganismy mají symbiotický vztah a spolu se vyznačují rychlou tvorbou kyseliny mléčné, při optimální teplotě 40 až 43 C koagulují kasein za 2 až 3 hodiny. Koagulace začíná při hodnotě ph 5,3 a při 4,5 je ukončená. Druhou významnou vlastností jogurtového zákysu je tvorba aromatické látky jogurtů acetaldehydu v množství 20 až 30 mg/l. (Görner, Valík, 2004) Kultury nejsou schopny nezávisle na sobě vytvářet ideální rovnováhu kyseliny a aroma. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus zahajuje produkci mléčné kyseliny a snižují množství kyslíku, který stimuluje růst Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Vlivem streptokoků je ph sníženo asi na 5 a poté laktobacily sníženo na méně než 4. (Marth, Steele, 2001) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus stimuluje růst Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, který má malou schopnost hydrolyzovat bílkovinu, proto první ho podporuje uvolňováním aminokyselin z bílkovin mléka svojí větší proteolytickou aktivitou. (Görner, Valík, 2004) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus částečně odbourává kasein, čímž uvolňuje valin, histidin, methionin, kyselinu glutamovou a leucin. Z této směsi pak zejména valin působí stimulačně na rozvoj streptokoků. (Holec et al., 199) Streptococcus salivarius ssp. thermophilus naopak stimuluje tvorbou kyseliny mravenčí (při anaerobní kultivaci), růst a metabolizmus Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Při vysokém záhřevu mléka určeném pro výrobu jogurtu (0 C po dobu 20 až 30 min nebo 95 C po dobu 5 min) vzniká termickým rozkladem laktózy taktéž kyselina mravenčí, ale ne dostatečné množství. (Görner, Valík, 2004) Streptokoky tedy vytváří kyselinu mléčnou a tím vhodné prostředí pro rozvoj laktobacilů. Zvyšování kyselosti pak omezuje rozvoj streptokoků. (Holec et al., 199) Streptococcus salivarius ssp. thermophilus je tedy citlivější ke kyselině než Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, z toho důvodu během delšího skladování jogurtu jsou streptokoky kyselinou poškozeny a postupně zanikají. Proto se počáteční 2

28 poměr laktobacilů a streptokoků, tj. 1:1, během skladování jogurtu mění. (Marth, Steele, 2001) Produkce kyseliny mléčné začíná asi po 30 minutách inkubace. Aromatické látky, zejména acetaldehyd, vznikají později. (Holec et al., 199) Produkce kyseliny a aromatu je závislá na výběru kmene laktobacilů a streptokoků. Acetaldehyd je produkován oběma mikroorganismy, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Oba mikroorganismy produkují enzym, který přeměňuje threonin na acetaldehyd. (Marth, Steele, 2001) Při výrobě jogurtů z nezahuštěného mléka (jogurtové mléko a jiné) se stává, že vzniklá sraženina nemá požadovanou konzistenci, velmi snadno se poruší a uvolňuje syrovátku. Z tohoto důvodu se používá jogurtová kultura, která se vyznačuje tvorbou slizu, vedle ostatních požadovaných vlastností. Slizy zvyšují kompaktnost koagulátu. Tuto vlastnost získávají jogurtové kultury vlivem nižší kultivační teploty (30 C), při vyšší hodnotě ph, při méně častém přeočkovávání jako i izolací kmenů, u kterých je tato vlastnost významná. (Görner, Valík, 2004) Jogurtová kultura se podobně jako kultura smetanová pěstuje ve vybraném mléce. Kulturu neovlivňuje tučnost substrátu, a proto ji lze pěstovat i v odstředěném mléce. Optimální kultivační teplota je 40 až 45 C. Některé kmeny kultur jsou adaptovány až na 4 C, neodlučují syrovátku, a proto tím bezpečně zajišťují mikrobiální čistotu. Kultivační doba je asi 3 až 3,5 hodiny. Jakmile se vytvoří viditelná, byť i nepatrná vrstvička syrovátky, kultura se ihned vychladí bez třepání ve vodní lázni a uskladní v chladu. (Kněz et al., 1960) Jogurtová kultura musí dostatečně rychle produkovat kyselinu mléčnou při fermentaci a co nejméně překysávat po ukončení fermentace a ochlazení jogurtu. Dále musí v požadované míře vytvářet aromatické látky, podle potřeby produkovat slizovité látky zlepšující konzistenci míchaných jogurtů a vhodnou mírou štěpit mléčné bílkoviny. Kultury s příliš intenzivním překysáním mají tendenci k dokysání po zchlazení jogurtů. Naopak kultury s pomalou tvorbou kyseliny mléčné umožňují na začátku fermentace růst nežádoucích bakterií, hlavně koliformních a v krajním případě i choroboplodných. (Görner, Valík, 2004) Dobrá jogurtová kultura ve vychlazeném stavu (asi +10 C) má hustou konzistenci, hrubší než smetanová kultura. Film na stěnách neulpívá, ale rozděluje se 29

29 v praménky, které stékají po skle. Chuť je čistě kyselá, specificky jogurtová. Jogurt musí být na povrchu suchý, prostý syrovátky. (Kněz et al., 1960) Kyselost za 2 až 3 hodiny dosahuje v mléce při 40 až 45 C 40 až 50 SH, při kultivaci v zahuštěném mléce 45 až 60 SH. Při překysání se množství tyčinek zvětšuje. (Holec et al., 199) Kultura acidofilního jogurtu je složena tak, že doplňuje mikroflóru normální jogurtové kultury ještě o tyčinku Lactobacillus acidophilus tak, že poměr tyčinek a streptokoků zůstává v zásadě nezměněn 1:1. Účelem je doplnit výživný účinek jogurtu o léčivé účinky Lactobacillus acidophilus. Z tohoto hlediska je někdy v jogurtové kultuře Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus zcela nahrazen Lactobacillus acidophilus. (Kněz et al., 1960) 3.7 Výroba jogurtu Fermentace je jednou z nejstarších metod, které prodlužují život mléka v regále (Horiuchi et al., 2009). Jogurty patří k nejrozšířenějším kysaným mléčným výrobkům jak u nás, tak v zahraničí. Jejich rozmanitost je dána řadou výrobních a technologických variací. (Holec et al., 199) Termín jogurt zahrnuje široký okruh výrobků. Mnoho zemí má své vlastní standardy, kterými identifikují jogurt s ohledem na složení startovacích kultur. Většina zemí definuje jogurt jako produkt získaný fermentací mléka pomocí kultury, která zahrnuje Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Některé země povolují další bakterie mléčného kvašení, zatímco ostatní, jako například Austrálie, povolují jen Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a vybraný Lactobacillus. Velká Británie požaduje Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, ke kterému mohou být přidány jiné bakterie mléčného kvašení. (Marth, Steele, 2001) Definice jogurtu byla stanovena v Potravinářské a zemědělské organizaci spojených národů/světové zdravotnické organizaci (FAO/WHO, 194) následně: Jogurt je sražený mléčný produkt získaný mléčným kvašením pomocí bakterií Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. 30

30 Mikroorganismy ve finálním výrobku musí být životaschopné a v hojném množství. Takový výrobek je blahodárný pro lidské zdraví. (Horiuchi et al., 2009) Podle norem Mezinárodní mlékárenské federace se jogurt vyrábí směsnou kulturou již zmíněných mikroorganismů, která vytváří víc než 1 % kyseliny mléčné (Drdák et al., 1996). Jogurt je tedy fermentovaný mléčný výrobek, který je zpravidla vyráběný z pasterovaného mléka. Tučnost mléka se pohybuje v rozmezí od 0 do 4 % v závislosti na oblasti a legislativě. Vysoká teplota pasterace se používá u jogurtové směsi k dosažení hladké a tuhé konzistence. Může se také přidávat sušené odtučněné mléko nebo stabilizátory, které zvýší obsah sušiny, umožní navázání více vody a tím vylepší jeho konzistenci. Používá se to zejména u nízkotučných výrobků. (Marth, Steele, 2001) Podle obsahu tuku lze dělit jogurty na smetanové (více než 10 procent tuku), bílé (více než 3 procenta), jogurty se sníženým obsahem tuku (0,5 až 3 procenta) a nízkotučné (0 až 0,5 procenta tuku). ( Komerčně jsou dostupné různé typy jogurtů, zahrnují klasické bílé (bez příchutě), s příchutí, tekuté, s nízkým obsahem laktózy a sycené oxidem uhličitým (Marth, Steele, 2001). V Mississippi byly vyráběny karbonizované slazené jogurty s nízkým obsahem tuku (1 %) a nízkotučné jogurty švýcarského typu s příchutěmi z mléka, smetany, odtučněného sušeného mléka, cukru a stabilizátorů (směs modifikovaného škrobu, karagenanu a pektinu). Po přídavku kultur Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium longum byly jogurty inkubovány při 43 C po dobu než bylo dosaženo ph 5 nebo 4,2. Oxid uhličitý (0,0 až 0,09 2 kg / cm ) byl do jogurtů přidán až při chlazení. Jogurty byly zchlazeny na 4 C a byly senzoricky hodnoceny. Výsledky ukázaly, že karbonizace nijak významně neovlivní život jogurtu v regále a nemění jeho senzorické vlastnosti. (Karagül-Yüceer et al., 1999) Tzv. přírodní jogurt se vyrábí už jen v malém množství, převládají jogurtové výrobky. V některých zemích jsou to velmi oslazené a aromatizované produkty, ve střední Evropě se upřednostňuje ovocný jogurt. Kromě jogurtů podvrstvených ovocem se vyrábí i míchané ovocné jogurty. (Drdák et al., 1996) Ochucené jogurty zahrnují tzv. pohárkové typy, ve kterých je ovocné pyré na dně spotřebního obalu a je smícháno s jogurtem před spotřebou. Dalším typem ochucených jogurtů je švýcarský typ, kde je bílý jogurt lehce promíchán s ovocným 31