Histologický odhad dožitého věku jedince ze spálené a nespálené kompaktní kosti lidského žebra

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Antropologie a genetika člověka Mgr. Karolína Absolonová Histologický odhad dožitého věku jedince ze spálené a nespálené kompaktní kosti lidského žebra The histological estimation of the age-at-death of an individual from the burned and unburned compact bone of the human rib Disertační práce Školitel: RNDr. Petr Velemínský, PhD. Praha, 2012

2 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, dne Podpis:

3 Tato práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy v Praze (grant č ) a Ministerstva kultury ČR v rámci institucionálního financování dlouhodobého koncepčního rozvoje výzkumné organizace Národní muzeum v Praze (výzkumný záměr č. VZ PM MK ). PODĚKOVÁNÍ Děkuji školiteli RNDr. Petru Velemínskému, PhD. z Antropologického oddělení Národního muzea v Praze a konzultantům RNDr. Miluši Dobisíkové z Antropologického oddělení Národního muzea v Praze a prim. MUDr. Michalu Beranovi, PhD. z Oddělení soudního lékařství Nemocnice Na Bulovce v Praze za neocenitelnou teoretickou, materiálovou i finanční pomoc poskytnutou v průběhu výzkumu a za poskytnutí biologického kosterního materiálu. Za zapůjčení histologické pily IsoMet děkuji Antropologickému oddělení Národního muzea v Praze. Za osvětlení histologických a mikroskopických technik děkuji RNDr. Aleně Němečkové, CSc., doc. RNDr. Josefu Reischigovi, CSc. a doc. RNDr. Pavlu Fialovi, CSc. z Lékařské fakulty UK v Plzni, RNDr. Vítězslavu Kuželkovi z Národního muzea v Praze a Aleně Bastlové z Oddělení soudního lékařství Nemocnice Na Bulovce v Praze. Za propůjčení spalovací pece děkuji Prof. RNDr. Martinu Mihaljevičovi, PhD. z Ústavu geochemie, mineralogie a nerostných zdrojů Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze. RNDr. Jiřímu Kvačkovi, CSc. a jeho kolegům z Oddělení paleontologie Národního muzea v Praze děkuji za poskytnutí mikroskopu pro digitalizaci mikroskopických snímků. Za cenné rady při statistickém zpracování dat děkuji RNDr. Jarmile Zocové a doc. RNDr. Karlu Zvárovi, CSc. Paní RNDr. Janě Velemínské, PhD. z Katedry antropologie a genetiky člověka Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy děkuji za zapůjčení počítače pro zpracování mikroskopických snímků. Děkuji též paní Taťáně Dubové z Antropologického oddělení Národního muzea v Praze a paní Daniele Kučerové a Jaromíře Seidlové z Katedry antropologie a genetiky člověka Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy za administrativní výpomoc při zpracovávání tématu a získání grantu. Děkuji také panu Bc. Janu Aulickému, řediteli Kanceláře Sdružení hasičů Čech, Moravy a Slezska v Praze 2 za písemné rady ohledně teploty požáru a panu Juliu Mlčochovi, řediteli Pohřebního ústavu hl. m. Prahy za písemné rady týkající se teplot používaných v moderním krematoriu. Kojeneckému ústavu v Krči, Sulická 120, Praha 4 Krč, děkuji za sběr lahviček pro uložení biologických vzorků.

4 OBSAH 1. Abstrakt... 7 Abstract Klíčová slova / Keywords Úvod Cíle výzkumného projektu Úvod do problematiky Histologická stavba a fyziologie kostní tkáně Buňky kostní tkáně, mezibuněčná hmota Typy kostní tkáně Primární kostní tkáň Sekundární kostní tkáň Distribuce mikrostruktur v kompaktní kosti a její vliv na odhad věku Periost a endost Cévní zásobení kostí, kostní dřeň Funkce kostní tkáně, vliv výživy a hormonů Vývoj kostní tkáně v ontogenezi Histogeneze kostní tkáně Osifikace intramembranózní Osifikace endochondrální Růst a remodelace kosti během života Modelace a remodelace kosti Vliv zdravotního stavu jedince na remodelaci kosti Změny ve složení kostní tkáně během života Věkové změny mikrostruktur viditelných na příčném řezu kompaktní kostí Rozdíly v remodelaci kostí mezi individui Sexuální a etnické (rasové, populační) rozdíly v remodelaci kostí Rozdíly v remodelaci kostí mezi vzorky různého archeologického stáří Ontogenetický vývoj žebra Změny kompaktní kosti při spalování Změny kostní tkáně podle teploty spalování Smrštění spálených kostí... 75

5 Změny mechanické pevnosti Změny mikroskopické struktury kosti Teploty dosahované při požáru, při pravěkých kremacích a v moderním krematoriu Teplota požáru Prehistorické kremace Moderní krematorium Vybrané histologické metody odhadu dožitého věku z kompaktní kostní tkáně Metody využívající dlouhé kosti Studie porovnávající metodu Kerleyho a Ahlqvista a Damstena Metody redukující poškození dlouhých kostí Metody využívající jiné než dlouhé kosti Kvalitativní metody Metody využívající elektronový mikroskop Jiné možnosti odhadu dožitého věku Základní přehled výzkumů zaměřených na histologii spálených kostí Výzkumy prováděné světelným mikroskopem Výzkumy prováděné elektronovým mikroskopem Další možnosti výzkumu spálených kostí Materiál a metodika Biologický materiál, složení studovaných souborů Zpracování biologického materiálu a tvorba preparátů Experimentální spalování kosterního materiálu Digitalizace mikroskopických snímků Histologická analýza vzorků Statistické zpracování dat Deskriptivní statistiky výběrových souborů Normalita rozdělení souborů Popis věkových změn v kompaktní kosti Rozdíly mezi pohlavími Popis změn vyvolaných spalováním Regresní analýza, regresní rovnice a jejich kontrola Zjištění chyby měření Výsledky Zachovalost spálených kostí

6 7.2. Barva spálených kostí Rozlišitelnost histologických struktur ve světelném mikroskopu Deskriptivní statistiky měřených souborů Věkové změny kostní mikrostruktury Odlišnosti mezi pohlavími Změny kostní mikrostruktury vlivem žáru Různé chování mikrostruktur při spalování u obou pohlaví Odhad dožitého věku Odhad dožitého věku na nespálených kostech Odhad dožitého věku na spálených kostech Chyba měření Diskuse Závěr Souhrn Přehled použité literatury a pramenů Seznam použitých zkratek Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam příloh Přílohy

7 1. ABSTRAKT Obsahem předkládané disertační práce je studium histologické struktury spálené a nespálené kompaktní kosti lidského žebra. Cílem bylo vyhodnotit vliv různě vysokých teplot spalování na stavbu kostní tkáně a na základě toho navrhnout vhodnou metodiku pro odhad dožitého věku neznámé osoby. Jako výzkumný materiál byla použita recentní lidská žebra, pocházející od jedinců známého věku, pohlaví a příčiny smrti. Kosterní vzorky byly experimentálně spalovány za předem stanovených podmínek. Každá kost byla rozdělena na několik částí, z nichž jedna zůstala nespálena a ostatní byly spalovány při teplotách 600, 700, 800 a 1000 C. Ze spálených i nespálených vzorků kostí byly zhotoveny neodvápněné neobarvené příčné histologické výbrusy, které byly mikroskopicky hodnoceny při stonásobném zvětšení. Vlastní histologická analýza byla provedena na digitálních mikrofotografiích pomocí programu pro analýzu obrazu SigmaScan Pro 5. Na výbrusech bylo sledováno celkem 28 proměnných a získaná histomorfometrická data byla statisticky zpracována v programu Statistica 6. Výsledkem výzkumu je popis změn histologických struktur vyvolaných stárnutím a spalováním, popis rozdílů mezi pohlavími a regresní rovnice pro odhad dožitého věku jedince pro kosti nespálené a pro kosti spálené při 700 a 800 C. Histologické metody odhadu věku jsou vhodné u dospělých jedinců staršího věku, a u poškozených a fragmentárních vzorků. Metoda odhadu věku na podkladě studia histologických struktur spálených a nespálených kostí je využitelná ve forenzní praxi a v oblasti studia minulých populací. 7

8 ABSTRACT The content of the presented dissertation work is the study of the histological structure of the burned and unburned compact bone of the human rib. The aim was to evaluate the effects of the differently high cremation temperatures on the structure of the bone tissue, and, on the basis of these findings, to design an applicable methodology for the estimation of the age-at-death of an unknown individual. As the research material the recent human ribs were used, belonging to the individuals of known age-at-death, sex and cause of death. The skeletal samples were experimentally burned under the beforehand set conditions. Every bone was divided into several pieces; one of them remained unburned, and the other were burned at the temperatures of 600, 700, 800 and 1000 C. From burned and unburned bone samples the undecalcified and unstained crosssections were made, which were microscopically analysed under the magnification of 100. The histological analysis was performed in the digital microphotographs using the SigmaScan Pro 5 image analysis programme. In each cross-section in total 28 variables were studied, and obtained histomorphometric data were statistically processed using the Statistica 6 programme. The result of the research is the description of the changes of histological structures caused by the aging and burning, the description of differences between the sexes, and the regression equations for the estimation of the age-at-death of an individual for the unburned bones and bones burned at 700 and 800 C. The histological methods of the age-at-death estimation are suitable in the case of the older adult individuals, and damaged and fragmentary samples. The method of the age-atdeath estimation based on the study of the histological structures of burned and unburned bones is usable in the forensic practice and in the field of the study of past populations. 8

9 2. KLÍČOVÁ SLOVA Kompaktní kost lidského žebra, vliv teploty spalování na mikrostrukturu kosti, histologie, histomorfometrie, odhad dožitého věku. KEYWORDS The compact bone of the human rib, influence of incineration temperature on the bone microstructure, histology, histomorphometry, age-at-death estimation. 9

10 3. ÚVOD Odhad dožitého věku z kosterních pozůstatků člověka je jedním z nejobtížnějších úkolů kosterní antropologie. Problematika odhadu věku je ztížena hlavně rozdílem mezi biologickým a chronologickým věkem individua. Chronologický (kalendářní) věk jedince je vyjádřen v letech či měsících od narození, ale neříká nic o stupni jeho biologického vývoje. Ten je určen tzv. biologickým věkem, který je charakterizován vývojovými změnami probíhajícími během ontogeneze každého jedince. Různé vnější a vnitřní vlivy hrají při určení biologického věku významnou roli, takže se chronologický a biologický věk jen málokdy úplně shodují. Přestože obecné projevy vývoje, růstu a stárnutí organismu probíhají v určitém pevně daném pořadí, nastávají u každého jedince v jiném období života a probíhají různou rychlostí. Věk biologický a chronologický se tak mohou od sebe značně lišit. U dětí a dospívajících je tato odchylka poměrně malá, ale u dospělých, především v kategorii senilis, může být velmi výrazná. Je to dáno např. pohlavím, životním stylem, genetickým pozadím, stravou, nemocemi, zaměstnáním, biomechanickou zátěží apod. Odhad věku jedince provedený na podkladě kosterní antropologie či histologie odpovídá proto spíše věku biologickému než chronologickému (Cunha et al., 2009). V kostní tkáni dochází během života jedince k neustálé přestavbě a remodelaci. Makroskopický vzhled kosti i její histologická struktura se s postupujícím věkem mění a tyto změny podléhají určitým pravidlům. Kost je navíc schopna zachovat záznam o těchto dějích i po smrti jedince. Všechny tyto vlastnosti kostí lze využít pro určení dožitého věku jedince. Biologický věk lze na skeletu určit s různým stupněm přesnosti, což závisí na věku jedince a zachovalosti kosterních pozůstatků (Kerley, 1965; Fiala, 1978; Bass, 1969, 1987). U dětí a dospívajících může být věk určen s velkou přesností pomocí makroskopických metod. Tyto metody využívají k odhadu věku např. postup mineralizace a prořezávání zubů, objevování osifikačních jader, uzavírání osifikačních štěrbin a délku diafýz dlouhých kostí. U dospělých jedinců po ukončení růstu závisí makroskopický odhad věku především na degenerativních změnách kostry. Po dvacátém pátém roce věku se většina makroskopických metod odhadu věku stává méně spolehlivou, protože postup degenerativních změn je velmi individuální a variabilní a jejich hodnocení je do jisté míry subjektivní (Singh a Gunberg, 1970; Cunha et al., 2009). Mezi tato kritéria patří např. abraze zubů, uzavírání lebečních švů, dosah dřeňové dutiny do proximální hlavice humeru a femuru, morfologie sternálního konce klavikuly a žeber, změny na facies symphysialis, degenerativní změny obratlů a velkých kloubů, osifikace některých chrupavek apod. 10

11 U dospělých jedinců jsou proto pro odhad věku vhodné také histologické metody, které mohou za určitých okolností poskytnout přesnější výsledky odhadu věku a obvykle jsou objektivnější díky statistickému zpracování dat. Jsou nezastupitelné rovněž při výzkumu fragmentárních nebo nekompletních kosterních pozůstatků, kde chybí makroskopická kritéria nutná pro posouzení věku jedince. Histologické metody jsou založeny na sledování změn mikroskopických struktur v kompaktní a spongiózní kosti nebo v zubech. V kompaktní kosti s přibývajícím věkem individua ubývá obvodových lamel a non-haversových kanálků, roste počet sekundárních osteonů (Haversových systémů) a fragmentů osteonů, mění se velikost osteonů a jejich kanálků a roste počet lamel v osteonu. Na těchto a některých dalších změnách jsou založeny histologické metody odhadu dožitého věku z kompaktní kosti. Odhad věku jedince ze spálených kostí je mnohem obtížnější než odhad věku na nativních kostech a většina badatelů považuje identifikaci jedince na podkladě spálených kostí za nejtěžší formu identifikace skeletních pozůstatků vůbec (Herrmann, 1976). Např. Bass a Driscoll byli schopni identifikovat jen 46% spálených pozůstatků s jistotou a 13% s vysokou pravděpodobností (Bass a Driscoll, 1983). Obtížnost analýzy spálených kostí je způsobena poškozením kostí vlivem žáru a změnami probíhajícími na makroskopické i mikroskopické úrovni kosti. Tím je výpovědní hodnota spálených kostí silně omezena. Kosti vlivem žáru mění svůj tvar a velikost, praskají, smršťují se a stávají se velmi křehkými, což znesnadňuje manipulaci s nimi. Díky smrštění (tj. zmenšení makroskopických i mikroskopických rozměrů, změna tvaru a proporcí, změna prostorových vztahů v rámci kosti) je velmi zavádějící používat při hodnocení spálených kostí metody, které byly vypracovány na nespálených kostech. Bohužel se tak stále ještě v některých případech děje (Thompson, 2004; Cunha et al., 2009). Pro spálené kosti je však bezpodmínečně nutné mít vypracované speciální metody. Na spálených kostech lze pozorovat makroskopická i mikroskopická kritéria pro odhad věku, spolehlivost analýzy ovšem závisí na stupni zachování kosti a počtu vyšetřených ukazatelů. U vysoce fragmentárního spáleného kosterního materiálu je nejvýhodnější používat pro odhad věku histologické metody za použití výbrusů kompaktní kostní tkáně (Schutkowski, 1991). 11

12 4. CÍLE VÝZKUMNÉHO PROJEKTU Cílem výzkumu bylo vypracování metodiky odhadu dožitého věku jedince na základě histologické stavby spálené a nespálené kompaktní kostní tkáně lidského žebra. První fází výzkumu byl popis věkových změn kostní mikrostruktury a definování změn či struktur, které lze využít k odhadu dožitého věku. Následoval popis změn v kompaktní kosti podmíněných spalováním při různých teplotách. Konečně, hlavním cílem práce bylo tedy ověřit existenci takových kostních mikrostruktur, jejichž stavba je rezistentní vůči působení teploty spalování, a tudíž by byly vhodné pro odhad dožitého věku jedince. Na základě histologické struktury spálené a nespálené kompaktní kosti lidského žebra byla navržena sada regresních rovnic pro odhad dožitého věku jedince. Práce ověřovala následující hypotézy: 1. V kompaktní kostní tkáni lidského žebra existují mikrostruktury, které se mění s rostoucím věkem jedince (jejichž změny korelují s věkem). Některé z nich lze využít pro odhad dožitého věku jedince. 2. V některých mikrostrukturách existují i rozdíly mezi pohlavími. 3. Vliv teploty spalování v kompaktní kosti podmiňuje změny mikrostruktur, které do jisté míry odhad dožitého věku jedince ovlivňují. 12

13 5. ÚVOD DO PROBLEMATIKY 5.1. HISTOLOGICKÁ STAVBA A FYZIOLOGIE KOSTNÍ TKÁNĚ BUŇKY KOSTNÍ TKÁNĚ, MEZIBUNĚČNÁ HMOTA Kostní tkáň patří spolu s vazivem a chrupavkou mezi pojivové tkáně, jejichž funkcí je formovat a udržovat tvar těla a chránit důležité orgány (lebka, páteřní kanál, hrudní koš, pánev, kostní dřeň). Pojivové tkáně obsahují základní mezibuněčnou hmotu (extracelulární matrix), vlákna a buňky. V kosti najdeme zvápenatělou mezibuněčnou hmotu (kostní matrix) a tři typy buněk: osteoblasty, osteocyty a osteoklasty (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Osteoblasty syntetizují organickou složku kostní matrix (kolagen typu I., proteoglykany a glykoproteiny), a proto se vyskytují v místech vzniku kosti. Zahajují také následnou mineralizaci kostní hmoty a svou přítomností ji dále udržují (Ortner, 1975). Osteoblasty jsou vzájemně propojeny mezibuněčnými můstky, z nichž při mineralizaci okolní kostní hmoty vznikají rozvětvené a anastomózující výběžky osteocytů (Weinmann a Sicher, 1947; Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Osteocyty vznikají z osteoblastů, které se úplně zalily do mezibuněčné hmoty. Jsou uloženy jednotlivě v lakunách mezi lamelami kostní matrix. V kosti primární přetrvávají jen krátce, zatímco v kosti sekundární žijí po dlouhou dobu. Na povrchu mají tenké cytoplazmatické výběžky, které jsou v kostní tkáni uložené v jemných kanálcích (canaliculi ossium). Jelikož metabolické látky a živiny nemohou zvápenatělou kostní matrix difundovat, probíhá výměna látek mezi osteocyty a krevním řečištěm přes tyto cytoplazmatické výběžky (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Osteocyty novou mezibuněčnou hmotu nevytvářejí, ale podílejí se na jejím udržování a mineralizaci, takže jejich zánik je následován resorpcí matrix (Ortner, 1975; Junqueira et al., 1997). V případě potřeby se osteocyty mohou přeměnit zpět na osteoblasty (Stloukal et al., 1999). Osteoklasty jsou obrovské, mnohojaderné, rozvětvené a pohyblivé buňky, které odbourávají kostní tkáň (Junqueira et al., 1997). Jsou v kosti přítomné při růstových, regenerativních nebo rekonstrukčních procesech, při kterých dochází k destrukci kostní 13

14 hmoty. V místech, kde probíhá resorpce kosti, vytvářejí prolákliny zvané Howshipovy lakuny. Působením osteoklastů je nejprve rozkládána organická složka mezibuněčné hmoty. Přitom dochází k uvolňování minerálních složek kosti, které jsou odplaveny tkáňovým mokem nebo odneseny makrofágy. Osteoklasty vznikají splynutím krevních monocytů a jsou součástí mononukleárního fagocytárního systému (Weinmann a Sicher, 1947; Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Kostní matrix je syntetizována osteoblasty a obsahuje organické a anorganické látky. Chemické složení a minerální obsah kostí závisí na věku, pohlaví, fyziologickém stavu organismu, struktuře kostní tkáně, místě ve skeletu a dalších faktorech (Herrmann, 1976; Stloukal et al., 1999). Kost obyčejně obsahuje 70% anorganických látek, 20% kolagenu, 8% vody a 2% ostatních organických látek (tuky, mukopolysacharidy apod.). Organické látky dávají kosti pružnost, anorganické látky pevnost a tvrdost (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Kostní matrix mineralizuje z počátku velmi rychle, až dosáhne 65% konečné mineralizace. Pak následuje perioda zrání, během níž je zbytek minerálu postupně ukládán v období několika měsíců (Grynpas, 2003). Organická složka kosti je tvořena vlákny kolagenu typu I a základní hmotou, která obsahuje glykosaminoglykany, glykoproteiny, tuky a mukopolysacharidy. Kolagen je nerozpustný ve vodě, je pevně vázán na anorganickou složku kosti a zajišťuje mechanickou pevnost kostí. Glykoproteiny sialoprotein a osteokalcin váží vápník a jsou tedy důležitým faktorem kalcifikace kostní matrix (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Anorganická složka kosti se z 55 až 60% skládá z fosforečnanu vápenatého, který se v kosti vyskytuje buď v amorfní formě, nebo tvoří krystalky hydroxyapatitu. Amorfní fosforečnan vápenatý se vyskytuje ve větším množství u dětí, zatímco u dospělých převažuje hydroxyapatit (Stloukal et al., 1999). Krystalky hydroxyapatitu jsou v kostech uloženy podél kolagenních fibril a je kolem nich vytvořena hydratační vrstva vody, která usnadňuje výměnu iontů mezi krystalem a tělními tekutinami. Spojení hydroxyapatitu a kolagenních fibril zajišťuje tvrdost a pružnost kosti. Z ostatních minerálů se v kosti vyskytují uhličitan vápenatý, fosforečnan hořečnatý, fluoroapatit, fluorid vápenatý, chlorid vápenatý a zásadité soli, a také stopové prvky, např. hořčík, draslík, sodík, stroncium, baryum, zinek, hliník, železo, fluór, kadmium, olovo a mangan (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). S věkem v kosti ubývá množství organických látek. U novorozence má kost asi 52% organických látek, kdežto v dospělosti jen 40% a méně (Borovanský et al., 1976). Proto jsou v mládí kosti pružnější a ve stáří spíše křehké (Chatterji a Jeffery, 1968). Rovněž obsah vody 14

15 se mění se stavem růstu kosti. U nově se formující kosti může být obsah vody až 70%, zatímco u staré kompaktní kosti je to jen 10% (Heuck, 1993) TYPY KOSTNÍ TKÁNĚ Primární kostní tkáň Primární kost (nezralá, plsťovitá, fibrilární, vláknitá) se objevuje jako první typ kostní tkáně v embryogenezi, při růstu kosti, při hojení zlomenin a v rámci reparačních procesů, její existence je jen dočasná a je velmi rychle nahrazována kostí lamelární (sekundární). Trvale se vyskytuje pouze v okolí lebečních švů, kolem středoušního labyrintu, v zubních alveolech a v úponech svalů, vazů a šlach (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Primární kost se vyznačuje nepravidelným a náhodným uspořádáním kolagenních vláken, postrádá Haversovský systém lamel a je vždy uspořádána v trabekulách (Weinmann a Sicher, 1947). Relativně velké prostory kostní dřeně v plsťovité kosti se nazývají primární osteony (Weinmann a Sicher, 1947; Šmahel, 2001). Uvnitř jsou vystlány osteoblasty, které postupně ukládají koncentrické lamely kostní tkáně směrem ke středu tohoto prostoru. Tak vzniká sekundární osteon s koncentrickými lamelami a centrálním Haversovým kanálkem. Původní primární kost je při přestavbě v kost lamelární resorbována osteoklasty. Proces přestavby plsťovité kosti v kost lamelární začíná již před narozením (Weinmann a Sicher, 1947). Primární kost má nižší obsah minerálů a vyšší zastoupení osteocytů nežli kost sekundární, osteocyty jsou nepravidelného tvaru a uspořádání a mají jen málo výběžků (Weinmann a Sicher, 1947) Sekundární kostní tkáň Sekundární kost (zralá, lamelární) u člověka vytváří převážnou většinu kostní hmoty (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Kostní matrix je uspořádána v lamelách, silných 3 až 12 μm (Weinmann a Sicher, 1947; Junqueira et al., 1997). Lakuny s osteocyty se vyskytují převážně mezi lamelami, jen výjimečně uvnitř jednotlivých lamel (Obr. 1, 2). V každé lamele jsou kolagenní vlákna uspořádána rovnoběžně, ale jejich průběh se kříží s vlákny sousedních lamel přibližně v úhlu 90 (Maat et al., 2006). Takové uspořádání fibril zvyšuje mechanickou odolnost kosti. V kompaktní kosti mají lamely charakteristickou 15

16 organizaci tvořenou vnějšími a vnitřními obvodovými lamelami, Haversovými systémy (osteony) a vmezeřenými (intersticiálními) lamelami (Obr. 1, 3). Vnější a vnitřní obvodové lamely jsou paralelní vrstvy lamel umístěné bezprostředně pod periostem a endostem a jsou výsledkem jejich apoziční činnosti. Při zvětšování průměru kosti apozicí se obvodové lamely ukládají kolem již existujících krevních cév a tím vznikají non-haversovy kanálky, které obvykle nemají koncentrický systém lamel (Obr ). Pokud jsou kanálky velké, mohou mít jednu nebo dvě koncentrické lamely, nikdy však nemají cementovou linii sekundárního osteonu. Obvodové lamely nejsou přerušeny a plynule kanálek obkružují. Obvodové lamely a non-haversovy kanálky představují primární (neremodelovanou) lamelární kost, protože se vytvářejí bezprostředně při vzniku kosti. Neremodelovaná kost se vyskytuje především v dětství, u dospělých je zachována v podobě zbytků obvodových lamel. Obvodové lamely jsou postupně odbourávány remodelací (Obr. 4). Při tom vznikají osteony a fragmenty osteonů, které proto představují sekundární (remodelovanou) lamelární kost (Obr. 5-11). Obr. 1. Uspořádání sekundární kostní tkáně do lamel. Mezi lamelami se nacházejí lakuny osteocytů (šipka). Zvětšení 400. Muž, 61 let. 16

17 Obr. 2. Lakuny osteocytů jsou v obvodových lamelách (šipka) oproti zbytku kosti větší a protáhlé. Zvětšení 400. Muž, 61 let. Obr. 3. Stavba kompaktní kosti: vnější obvodové lamely (A), osteony (B) a fragmenty osteonů (C), vnitřní obvodové lamely (D). Zvětšení 100. Muž, 75 let. 17

18 Obr. 4. Kompaktní kost s již odbouranými vnějšími obvodovými lamelami (šipky označují vnější okraj kompaktní kosti). Zvětšení 100. Muž, 57 let. Obr. 5. Vnější obvodové lamely (prázdná šipka) se sekundárním osteonem (plná šipka). Zvětšení 400. Muž, 23 let. 18

19 Obr. 6. Vnitřní obvodové lamely částečně překrývající sekundární osteony. Zvětšení 400. Žena, 51 let. Obr. 7. Nově uložené vnitřní obvodové lamely (A), na opačné straně kosti jsou viditelné stopy resorpce (B) Zvětšení 400. Muž, 58 let. 19

20 Obr. 8. Driftující osteon (směr driftu ukazuje šipka) vrůstající do vnitřních obvodových lamel. Zvětšení 400. Muž, 75 let. Obr. 9. Vnitřní obvodové lamely (A), tenká vrstva kompaktní kosti s osteonem a fragmenty osteonů, periostální okraj kosti (B). Zvětšení 400. Muž, 67 let. 20

21 Obr. 10. Osteony nacházející se ve vnitřních obvodových lamelách. Zvětšení 400. Muž, 26 let. Obr. 11. Nově uložené obvodové lamely (šipka). Zvětšení 400. Muž, 26 let. 21

22 Obr. 12. Vnější obvodové lamely (A) s non-haversovými kanálky. Zvětšení 100. Muž, 19 let. Obr. 13. Non-Haversův kanálek, označený na předchozím obrázku šipkou, zobrazený ve zvětšení 400. Muž, 19 let. 22

23 Obr. 14. Non-Haversův kanálek (A). Kost spálená při 1000 C. Zvětšení 400. Muž, 19 let. Obr. 15. Non-Haversovy kanálky (šipky). Kost spálená při 1000 C. Zvětšení 400. Muž, 19 let. 23

24 Základní jednotkou kompaktní kosti je Haversův systém (sekundární osteon). Osteon vzniká v prostoru, který byl v kosti vyhlodán resorptivní činností osteoklastů, a proto přerušuje průběh okolních lamel (Obr. 16). Osteon je 1 až 30 mm dlouhý válec tvořený čtyřmi až dvaceti koncentrickými lamelami uspořádanými kolem cévního (Haversova) kanálku. Mezi lamelami jsou v lakunách uloženy osteocyty (Obr. 17, 18). V rámci jedné lamely jsou kolagenní vlákna uspořádána rovnoběžně a tvoří spirálu probíhající celou délkou osteonu. Směr kolagenních vláken v sousedních lamelách se kříží, což zvyšuje mechanickou odolnost kosti (Novotný, 2000). Stěna osteonu může být maximálně 100 µm silná, protože to je maximální možná tloušťka tkáně pro průchod živin (Arnold et al., 1966). Průměr Haversových kanálků je značně variabilní, průměrně má cca 50 až 60 µm (Harsányi, 1993; Bertelsen et al., 1995). Průměr Haversových kanálků bývá v subperiostální oblasti kosti většinou menší a zvětšuje se směrem k dřeňové dutině (Arnold et al., 1966; Heussner, 1987). Každý osteon vzniká postupným ukládáním lamel směrem ke středu kanálku, takže kanálky mladších osteonů jsou větší. Haversův kanálek obsahuje krevní a lymfatické cévy, nervy, endost a řídké vazivo (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Haversovy kanálky se v průběhu osteonu mohou rozvětvovat (Obr. 19). Od svého okolí je osteon oddělen vrstvičkou vysoce mineralizované matrix s malým množstvím kolagenních vláken. Tato cementová linie se v mikroskopu jeví jako tzv. obrácená linie (a reversal line). Někteří autoři (Weinmann a Sicher, 1947) rozeznávají dva typy cementové linie. Tzv. klidová linie vzniká na původně volném povrchu kosti a je rovná a hladká, zatímco obrácená linie vzniká na místě zastavené kostní resorpce a je vroubkovaná díky Howshipovým lakunám. Oba typy linií oddělují nově vytvořenou kost od staré kosti. Haversovy kanálky mezi sebou komunikují prostřednictvím příčných či šikmých Volkmannových kanálků (Obr. 20, 21). Volkmannovy kanálky nejsou obklopeny koncentrickými lamelami, ale naopak skrz lamely pronikají. Některé Volkmannovy kanálky propojují systém osteonů s cévami periostu a kostní dřeně (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). 24

25 Obr. 16. Sekundární osteony a fragmenty osteonů. Zvětšení 400. Žena, 40 let. Obr. 17. Lamely tvořící stěnu osteonu. Zvětšení 400. Žena, 51 let. 25

26 Obr. 18. Lamely tvořící stěnu osteonu a obvodové lamely (oblouky lamel v pravém a levém dolním rohu obrázku). Zvětšení 400. Muž, 75 let. Obr. 19. Sekundární osteon proříznutý v místě rozvětvení Haversova kanálku. Zvětšení 400. Muž, 75 let. 26

27 Obr. 20. Osteony propojené pomocí Volkmannova kanálku. Zvětšení 400. Muž, 90 let. Obr. 21. Volkmannovy kanálky v kostní tkáni (šipky). Zvětšení 100. Muž, 61 let. 27

28 Mezi osteony nacházíme prostory, které jsou vyplněny nepravidelně uspořádanými intersticiálními (vmezeřenými) lamelami. Jsou to zbytky obvodových lamel a fragmenty osteonů, které byly při přestavbě kosti destruovány vrůstáním cév, kolem nichž se vytvořily nové osteony vyšších generací. Na makroskopické úrovni se kost skládá z oblastí celistvé kostní tkáně kost kompaktní (substantia compacta) a z úseků obsahujících trámce a navzájem propojené dutinky kost spongiózní (substantia spongiosa). Kompakta tvoří povrchovou vrstvu kostí, spongióza se nachází uvnitř. Kompaktní kost se vyznačuje charakteristickým uspořádáním lamel. Spongiózní kost je tvořena trojrozměrnou sítí trámců, mezi nimiž jsou navzájem komunikující dutiny vyplněné kostní dření. Je buď nepravidelně houbovitá, nebo jsou její trámce uspořádány v určitých směrech. Toto uspořádání se nazývá architektonika spongiózní kosti. Trámce odpovídají křivkám, v nichž se uplatňuje tah nebo tlak na kost, a proto zajišťují maximální odolnost kosti při minimu kostního materiálu. Architektonika kosti se neustále přestavuje podle potřeby, protože trámce vystavené napětí mohutnějí, zatímco trámce nezatížené se ztenčují a odbourávají (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Novotný, 2000) Distribuce mikrostruktur v kompaktní kosti a její vliv na odhad věku Mikrostruktury nejsou na příčném řezu kompaktní kostí rozmístěny uniformně, ale jejich distribuce závisí na poloze pozorovaného pole v řezu (Frost, 1969, 1987a; Stout a Gehlert, 1980, 1982; Lazenby, ; Stout, 1989b; Chan et al., 2007). Např. u dlouhých kostí je v sousedství endostu vyšší hustota sekundárních osteonů než v subperiostální oblasti (Drusini, 1996). Mikrostruktury vhodné pro odhad dožitého věku se v dlouhých kostech nacházejí především v periostální třetině kompakty (Kerley, 1965). Počet struktur na mm² se v dlouhých kostech liší po obvodu příčného řezu, mezi subperiostálním a endostálním okrajem kompakty i podél dlouhé osy kosti (Frost, 1969; Chan et al., 2007). Příčinou jsou odlišnosti v průběhu remodelace a kortikálního driftu v jednotlivých částech kosti a také v odlišné mechanické zátěži jednotlivých úseků skeletu (Frost, 1987a; Chan et al., 2007). Tento problém lze částečně vyřešit hodnocením variability v menších kostech, např. žebrech, které nejsou vystaveny takové mechanické zátěži jako dlouhé kosti. Pfeifferová a kolektiv (Pfeiffer et al., 1995) testovali vliv lokalizace pozorovaného pole na procento remodelované kosti (osteonů a fragmentů) na femuru. K měření vybrali pole 28

29 u periostálního a endostálního okraje kompakty po obvodu příčného řezu. Množství remodelované kosti se lišilo jak podél obvodu řezu, tak mezi periostálním a endostálním okrajem. Metody odhadu věku často využívají anteriorní kortex femuru (např. Kerley, 1965; Ahlqvist a Damsten, 1969; Thompson, 1979; Ericksen, 1991). U anteriorních polí femuru však autoři (Pfeiffer et al., 1995) pozorovali zvláště vysokou variabilitu v remodelaci, takže metody využívající femur by se podle nich měly zaměřit na jiné oblasti řezu. Studie také ukázala, že pokud je povrch kosti poškozen a pozorovaná pole se tím posunou směrem k endostálnímu kortexu, výsledky metod vyvinutých na subperiostálním kortexu jsou nepřesné. Je to dáno tím, že endostálněji situovaný kortex vykazuje vyšší procento remodelované kosti. Eroze periostálního povrchu u archeologického a forenzního materiálu obvykle vede k hodnocení právě těchto polí, takže výsledkem je zvýšený odhad věku. I přes neuniformní distribuci struktur v řezu kostí je však možné omezit analýzu jen na určitá subperiostální pole. Jowseyová (Jowsey, 1960) zkoumala data z jednotlivých částí příčného řezu femurem a nenalezla mezi zkoumanými oblastmi žádné velké rozdíly. Rovněž Thomas (Thomas et al., 2000) doporučuje u femuru hodnotit pouze vybrané regiony kortexu, nikoli celý příčný řez. Iwaniecová (Iwaniec et al., 1998) se zabývala schopností části řezu předpovědět hodnoty proměnných pro celý řez. Zjistila, že měření z 50% plochy řezu předpovědělo 98 až 99% hustoty osteonů celého řezu, z 15% plochy to bylo 88 až 95% celkové hustoty osteonů a dokonce < 1% plochy dokázalo předpovědět kolem 50% hustoty osteonů celého řezu. Histologické metody odhadu věku obvykle analyzují 3 až 20% plochy řezu, ze které lze předpovědět 80 až 94% hustoty osteonů celého řezu. Minimalizace vyšetřené plochy kosti bez ztráty přesnosti dovoluje zkrátit čas věnovaný sběru dat a využít i poškozené vzorky. Na druhou stranu Chanová (Chan et al., 2007) aplikovala Thompsonovu metodu odhadu věku na různé oblasti příčného řezu femurem (anterior, posterior, medial, lateral) a různé úseky podél diafýzy a porovnávala získané odhady věku s odhadem provedeným podle originální metody (Thompson, 1979). V některých anatomických lokalizacích byly mezi odhady věku zjištěny významné rozdíly, zatímco v jiných nikoli. Jako příčinu autoři uvádějí různou mechanickou zátěž působící na jednotlivé části femuru. Někteří autoři (Stout a Gehlert, 1980; Stout a Stanley, 1991; Stout a Paine, 1992) doporučují analyzovat zejména u menších kostí (žebro, klavikula) celé příčné řezy, aby se vyhnuli možným histomorfometrickým odchylkám mezi jednotlivými poli. Na žebru bylo zjištěno, že většina rutinně používaných mikrostruktur nevykazuje na obou stranách příčného řezu žebrem statisticky významné rozdíly (Cannet et al., 2011). Naopak analýza celého 29

30 příčného řezu femurem nevede k uspokojivým odhadům dožitého věku (Thomas et al., 2000). Hodnocení průměru osteonů a Haversových kanálků nelze v kompaktě dlouhých kostí provádět na celé ploše řezu, ale je nutné měřit struktury pod periostem a endostem zvlášť. Velikost osteonů a kanálků se totiž pod endostem s věkem zvětšuje, zatímco pod periostem se zmenšuje (Fiala, 1988) PERIOST A ENDOST Vnitřní i vnější povrch kostí je pokryt endostem resp. periostem (okosticí), které obsahují osteogenní buňky a vazivo. Jejich hlavní funkcí je výživa kostní tkáně, nepřetržitá dodávka nových osteoblastů a hojení zlomenin. Ze strany periostu i endostu se kost může odbourávat nebo naopak narůstat apozicí (Obr. 22, 23). Apozice probíhá tak, že osteoblasty vytvoří nejprve tenkou vrstvu nezvápenatělé matrix, která je v kontaktu se starší kostí. Následně se do této matrix ukládají soli vápníku, čímž je proces tvorby kosti dovršen (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Periost pokrývá povrch kosti, je bohatě prokrven a inervován a ke kosti je pevně přirostlý jen v místě úponů vazů a šlach a na okraji plochých kostí lebečních. Nevyskytuje se na povrchu kloubních ploch, které jsou pokryty kloubní chrupavkou. Periost se skládá ze dvou vrstev. Zevní vrstva fibrózní obsahuje kolagenní vlákna a fibroblasty. Svazky kolagenních vláken pronikající z periostu do kosti se nazývají Sharpeyova vlákna a upevňují jej ke kosti. Vnitřní vrstva kambiová obsahuje osteoprogenitorové buňky, které se mitoticky dělí a diferencují v osteoblasty a hrají významnou úlohu při růstu a reparaci kosti (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Endost vystýlá vnitřní povrchy kostních dutin a kanálků a obsahuje jen jednu vrstvu osteoprogenitorových buněk. Je proto ve srovnání s periostem podstatně tenčí (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). 30

31 Obr. 22. Osteony odbourávané činností periostu (A), na opačné straně se nacházejí endostální lamely (B). Zvětšení 400. Muž, 58 let. Obr. 23. V horní části obrázku se nacházejí vnitřní obvodové lamely s velkými protáhlými lakunami vzniklé činností endostu, jako podklad jim slouží zbytky kompaktní kosti s fragmenty osteonů. Zvětšení 400. Muž, 58 let. 31

32 CÉVNÍ ZÁSOBENÍ KOSTÍ, KOSTNÍ DŘEŇ Hlavním zdrojem cévního zásobení kosti je periost, jehož cévy mezi sebou anastomozují a vnikají do kosti Volkmannovými kanálky (Obr. 24). Ty pronikají šikmo do kosti a spojují se s cévami v Haversových kanálcích, které jsou dále spojeny s kapilárami v kostní dřeni (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Novotný, 2000). Samostatnými kanálky vnikají do kosti tepny arteriae nutriciae. Spojují se s cévami v Haversových kanálcích, s cévami periostu a s cévami metafýz a pronikají až do kostní dřeně (Obr. 25). Kanálky nutričních arterií (canales nutricii) mají na každé kosti typickou polohu a směr, obvykle vyznačují místo primárního osifikačního centra a na dlouhých kostech směřují k méně aktivní růstové chrupavce. Stejnou cestou jakou probíhá arteria nutricia opouštějí kost žíly venae comitantes. Samostatné cévy arteriae metaphysariae vnikají do kosti a do dřeně též pod úponem vazivových kloubních pouzder a větví se hluboko do spongiózní kosti v oblastech metafýz, které vyživují. Protože přes chrupavčitou růstovou chrupavku nepronikají žádné cévy, jsou epifýzy v období růstu vyživovány pomocí samostatných arteriae epiphysariae. Tyto cévy také vyživují zárodečnou vrstvu růstové chrupavky. Nutritivní arterie přivádějí do kosti 60% krve, cévy metafyzární 30%, periostální cévy zásobují jednu čtvrtinu kompakty (Šmahel, 2001). Dutinky spongiózní kosti a dřeňová dutina dlouhých kostí (cavum medullare) obsahují kostní dřeň (medulla ossium). Ta se vyskytuje ve třech druzích: červená kostní dřeň je orgánem krvetvorby, žlutá kostní dřeň je tvořena tukovými buňkami a šedá kostní dřeň je tvořena vazivem (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Matonoha, 1998). Červená kostní dřeň se vyskytuje u novorozence ve všech kostech, ale již v dětském věku se mění v dlouhých kostech v dřeň žlutou. V dospělosti najdeme červenou kostní dřeň jen v proximálním konci femuru a humeru, obratlích, kosti hrudní, žebrech, kostech lebečních, kostech pánevních a drobných kostech ruky (Borovanský et al., 1976). Žlutá dřeň se ve stáří přeměňuje vlivem ztráty tuku v dřeň šedou (Matonoha, 1998). 32

33 Obr. 24. Spojení osteonu s cévami periostu pomocí kanálku probíhajícího kolmo k povrchu kosti (A). Zvětšení 400. Muž, 61 let. Obr. 25. Kanálek vedoucí do kostní dřeně (šipka). Zvětšení 400. Muž, 84 let. 33

34 FUNKCE KOSTNÍ TKÁNĚ, VLIV VÝŽIVY A HORMONŮ Kosti díky své tvrdosti velmi dobře odolávají mechanickým stresům. Spolu s vazivem a chrupavkou tvoří kostru, která představuje 15 až 20% hmotnosti člověka (Pacovský, 1988). Kostra má několik různých funkcí (Novotný, 2000): Opora těla, ochrana orgánů, aktivní pohyb za pomoci svalů, expanzivní růst těla, zásobárna anorganických látek, skládka odpadních látek a krvetvorba. Důležitou roli hrají kosti v metabolismu lidského těla (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Novotný, 2000; Šmahel, 2001; Zemková, 2005). Ionty vápníku a jiných minerálů jsou z kostní tkáně uvolňovány a ukládány zpět tak, aby se neměnilo iontové složení tělních tekutin. Kostra obsahuje 99% vápníku v těle a plní funkci jeho zásobárny. Mezi vápníkem v krvi a v kostech dochází k nepřetržité výměně. Při zvýšení hladiny Ca v krvi (např. přijatého s potravou) se vápník ukládá v kostech nebo je vyloučen močí a stolicí. Z kostí se Ca uvolňuje tehdy, když klesne jeho koncentrace v krvi. Vápník je z kostí uvolňován dvěma způsoby (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Šmahel, 2001). Prvním způsobem je přenos iontů z hydroxyapatitových krystalů do tkáňové tekutiny a odtud do krve. Tento mechanismus je čistě fyzikální a odehrává se v mladých, mírně zvápenatělých lamelách. Druhý mechanismus mobilizace vápníku je řízen hormony. Parathormon (hormon příštítných tělísek) aktivuje osteoklasty a zvyšuje jejich počet, tím zvyšuje odbourávání kosti a uvolňování vápníku. Sekrece parathormonu je ovlivňována hladinou vápníku v extracelulární tekutině. Při poklesu hladiny vápníku se sekrece parathormonu zvyšuje (následuje uvolnění Ca z kostí), při vzestupu hladiny Ca sekrece parathormonu klesá (přestává uvolňování Ca z kostí). Nadměrná tvorba parathormonu (tzv. hyperparathyroidismus) způsobuje odvápnění kostí. Kalcitonin (hormon štítné žlázy) inhibuje vznik a aktivitu osteoklastů a tím tlumí resorpci kosti. Zároveň podporuje tvorbu kostní hmoty a je nutný i pro její správnou mineralizaci. Stimulátorem jeho sekrece jsou ženské pohlavní hormony estrogeny. Protože koncentrace vápníku v krvi a tkáních musí být stálá, vede jeho nedostatečný přívod potravou k odvápnění kostí. Kost je citlivá na faktory výživy hlavně v období svého vývoje. Nedostatečný přívod bílkovin v potravě může způsobit snížení syntézy kolagenu. Nedostatek vápníku způsobuje nedostatečné zvápenatění organické kostní hmoty; příčinou může být snížený přívod vápníku potravou či nedostatek vitamínu D. 34

35 Vitamín D ovlivňuje vstřebávání vápníku v tenkém střevě, je nezbytný pro správnou mineralizaci skeletu, tlumí odbourávání kostí a ovlivňuje aktivitu osteoblastů. Při nedostatku vitamínu D se může nadměrně tvořit organická hmota kostí, která nemineralizuje. Velké množství vitamínu D naopak způsobuje odvápnění kostí a zároveň kalcifikaci řady měkkých tkání. Nedostatek vápníku nebo vitamínu D je u dětí příčinou rachitis (křivice) a u dospělých osteomalácie (měknutí kostí). Osteoporóza je charakterizována nadměrným úbytkem kostní hmoty, který je vyvolán sníženou tvorbou kosti, její zvýšenou resorpcí nebo obojím. Poměr minerálů k organické matrix zůstává nezměněn. Postmenopauzální osteoporóza vzniká u žen po menopauze vlivem úbytku estrogenů, senilní osteoporóza se vyskytuje u obou pohlaví po sedmdesátém roce věku (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997). Na vývoj kostí má vliv také vitamín C, který je nezbytný pro syntézu kolagenu. Nedostatek vitamínu C vyvolává kurděje, omezuje růst kosti a zabraňuje hojení zlomenin tím, že narušuje ukládání kolagenu. Kromě parathormonu, kalcitoninu a vitamínu D účinkují na kost také další hormony. Je to zejména růstový hormon, který ve spolupráci s růstovým faktorem IGF podporuje celkový růst. Nedostatek růstového hormonu v dětství způsobuje hypofyzární nanismus (trpaslictví), jeho nadbytek způsobuje nadměrný růst dlouhých kostí (gigantismus). V dospělosti vyvolává nadbytek růstového hormonu akromegalii, kdy dochází k patologickému zesílení kostí, zejména dlouhých (Šmahel, 2001; Zemková, 2005). Pohlavní hormony mužské (androgeny) i ženské (estrogeny) mají na kosti komplexní účinek, ovlivňují vznik a vývoj osifikačních center a způsobují pubertální růstové zrychlení. Nadbytek pohlavních hormonů na konci puberty způsobuje postupné uzavření růstových chrupavek a ukončení růstu. Rovněž předčasné sexuální dozrávání vyvolané např. nádory zpomaluje tělesný růst dřívějším uzavřením růstových chrupavek. Při nedostatku pohlavních hormonů se období činnosti růstových chrupavek prodlužuje a vede k vysokému tělesnému vzrůstu (Šmahel, 2001; Zemková, 2005). Růst je stimulován také tyroxinem a trijodtyroninem ze štítné žlázy. V kůře nadledvin se produkují glukokortikoidy růst tlumící a androgeny růst stimulující. Adrenální androgeny zvyšují hladinu růstového hormonu a kolem šestého roku života způsobují růstové zrychlení zvané adrenarchae (Šmahel, 2001; Zemková, 2005). 35

36 5.2. VÝVOJ KOSTNÍ TKÁNĚ V ONTOGENEZI Základem pro pojivové tkáně (vazivo, chrupavka, kost) je mezenchym, který vzniká ze středního zárodečného listu, mezodermu. Mezenchym se skládá z buněk s dlouhými výběžky a z mezibuněčné hmoty, která se později mění v mezibuněčnou hmotu vaziva, chrupavky nebo kosti (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Šmahel, 2001) HISTOGENEZE KOSTNÍ TKÁNĚ Kost se vytváří přímou mineralizací matrix ve vazivu (intramembranózní, endezmální, dezmogenní osifikace) nebo ukládáním kostní matrix na předem vytvořený chrupavkový model (endochondrální, enchondrální, chondrogenní osifikace). V obou případech se nejprve vytváří kost primární (nezralá), která je brzy nahrazena kostí sekundární (lamelární). Konečná struktura kostí je u obou typů osifikace stejná (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Šmahel, 2001). Pro každou kost a její jednotlivé části je určitý druh osifikace typický. Kosti trupu, končetin a báze lební osifikují chondrogenně, kdežto kosti klenby lební, splanchnokrania a větší část klavikuly osifikují desmogenně (Borovanský et al., 1976). Místa, v nichž osifikace začíná, jsou konstantní a objevují se v určitém časovém sledu. Rovněž uzavírání růstových zón probíhá podle předem daného časového harmonogramu. Časový rozvrh osifikace je využíván pro makroskopické metody odhadu dožitého věku Osifikace intramembranózní Tímto typem osifikace vznikají kosti membranosní (krycí, primární, achondrální), kam patří většina plochých kostí klenby lební, některé kosti splanchnokrania a část klavikuly. Intramembranózní osifikace též přispívá k růstu krátkých kostí a k růstu dlouhých kostí do šířky z periostu. Při intramembranózní osifikaci se tvoří kostní trámečky přímo ve vazivu, v tzv. kondenzovaném mezenchymu (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Šmahel, 2001). V kondenzovaném mezenchymu se nachází počáteční bod osifikace, primární osifikační centrum, kde z mezenchymových buněk vznikají osteoblasty. Ty produkují mezibuněčnou hmotu s kolagenními vlákny, která později kalcifikuje. Vzniklé ostrůvky plsťovité kostní tkáně se nazývají spikula (trámce). Mezi trámci jsou dutiny obsahující 36

37 kapiláry, nervová vlákna, buňky kostní dřeně a nediferencované elementy. Splynutím jednotlivých spikul v primárním osifikačním centru vzniká kost s houbovitou strukturou. Vazivem mezi kostními trámci prorůstají krevní cévy, které jsou zdrojem buněk kostní dřeně. V mezenchymu vznikají další osteoblasty, čímž osifikační centrum dále roste. Osifikační centra kosti se zvětšují a nakonec splynou, čímž nahradí původní vazivovou tkáň. Část vazivové tkáně zůstává zachována jako periost a endost. Periost pak přispívá k vytváření dalších vrstev kosti tzv. periostální osifikací (Šmahel, 2001) Osifikace endochondrální Při endochondrální osifikaci vzniká kost náhradou hyalinní chrupavky tzv. chrupavčitého modelu kosti (Borovanský et al., 1976; Junqueira et al., 1997; Šmahel, 2001). Takto vzniklé kosti se nazývají kartilaginózní (náhradní, primordiální, chondrogenní) a jsou to kosti trupu a končetin a některé kosti lebky (báze lební). Endochondrální osifikace se uplatňuje také při růstu dlouhých kostí do délky z růstových plotének, tvořených hyalinní chrupavkou. Endochondrální osifikace začíná již v osmém embryonálním týdnu. Nejprve dochází k hypertrofii a zániku chondrocytů chrupavčitého modelu, takže vzniknou rozšířené lakuny oddělené septy kalcifikované chrupavkové matrix. Sem pak pronikají krevní kapiláry s osteoprogenitorovými buňkami, které se mění v osteoblasty a začnou na zbytcích zvápenatělé chrupavky vytvářet kostní hmotu. Zbytky chrupavky jsou nakonec odbourány chondroklasty a chrupavka je nahrazena primární plsťovitou kostí, která je později nahrazena lamelární kostí s Haversovými systémy. Podle toho, zda tvorba kosti začíná na povrchu chrupavky nebo uvnitř, rozeznává se osifikace perichondrální a enchondrální (Šmahel, 2001) RŮST A REMODELACE KOSTI BĚHEM ŽIVOTA Modelace a remodelace kosti Kost díky své tvrdosti nemůže růst dělením, zvětšováním buněk nebo přibýváním mezibuněčné hmoty jako jiné tkáně. Osteocyty zalité v mezibuněčné hmotě se již nedělí, nezvětšují ani neprodukují novou mezibuněčnou hmotu. Kost proto roste pouze apozicí a to jen tam, kde kostní tkáň sousedí s chrupavkou nebo vazivem. V těchto místech vzniká činností osteoblastů nová mezibuněčná hmota, která je přikládána na kostní povrch a pak 37

38 osifikuje. Tyto oblasti se nazývají růstová centra neboli růstové zóny (Šmahel, 2001). Mezi hlavní růstové zóny patří růstové ploténky dlouhých kostí, synchondrosy lebeční báze a pánve, sutury lebky a některé kloubní chrupavky. Kosti rostou také periostální či endostální apozicí a všude tam, kde jsou ve styku s chrupavkou (např. žebra). Dlouhé kosti rostou do délky pomocí růstových chrupavek a do šířky apozicí z periostu. Kost se nachází v neustálém stavu obratu, který probíhá na makroskopické i mikroskopické úrovni pomocí modelace a remodelace (Weinmann a Sicher, 1947; Frost, 1969, 1987a, 2003; Stout, 1989b, 1992; Parfitt, 2003). Modelace je spojena především s růstem kosti, zatímco remodelace zajišťuje neustálou obnovu kostní hmoty během života. Oba procesy probíhají na základě stejných typů buněk a stejných mechanismů resorpce a formace kosti. Kosti jsou díky modelaci a remodelaci neobyčejně plastické, jsou schopny přestavovat svou vnitřní strukturu, měnit svůj tvar a velikost, přizpůsobovat se nárokům a biomechanickým požadavkům, které jsou na ně kladeny (Sobotková, 1989; obr. 26). Např. při silné mechanické zátěži se v dlouhých kostech končetin zvyšuje rychlost periostální i endostální modelace, takže mají větší plochu příčného řezu. Tím lépe odolávají ohýbání a torzi. Zároveň se zvyšuje i remodelace, aby odstraňovala mikroskopická poškození, která se hromadí v důsledku velké mechanické zátěže (Robling a Stout, 2003; Chan et al., 2007). Schopnost modelace a remodelace je vlastní všem druhům kostí (Sobotková, 1989). Hlavním úkolem modelace (a bone modeling) je růst kostí, změna objemu kostní hmoty, změny velikosti a tvaru kostí a reakce na biomechanickou zátěž (Frost, 1969, 2003; Šmahel, 2001; Parfitt, 2003). Modelace probíhá hlavně během růstu a v dospělosti je zabrzděna. Při modelaci dochází k aposici nebo resorpci na periostálním či endostálním povrchu kosti, takže se celý útvar může posunovat v prostoru ve směru aposice (kortikální drift). Kortikální drift vede ke zvětšení průměru kosti a dřeňové dutiny nebo k přemístění kompaktní kosti v prostoru určitým směrem (Frost, 1987a; Streeter et al., 2010). Tím si kost během růstu zachovává svůj typický tvar a udržuje se ideální vzdálenost úponů svalů od kloubů (Šmahel, 2001). Kortikální drift se na příčném řezu kostí projevuje převahou obvodové lamelární kosti, velkým množstvím non-haversových kanálků a nedostatkem osteonů a fragmentů (Ericksen a Stix, 1991; obr ). Modelace reaguje na longitudinální růst kosti, celkový růst těla a mechanickou zátěž a zřejmě není přímo ovlivněna faktory jako je výživa, endokrinní a chronické nemoci nebo léky (Frost, 1987a). Poruchy modelace kosti způsobují např. osteopetrosu, hyperfosfatázu a osteogenesis imperfecta (Frost, 1969). 38

39 Obr. 26. Účinky růstu (A), kortikálního driftu (B) a růstu spojeného s kortikálním driftem (C) na histomorfologii kompaktní kosti (Podle Stout, 1992). Obr. 27. Projevy kortikálního driftu ve stěně žebra stěna je tvořena výhradně obvodovými lamelami. Zvětšení 100. Muž, 84 let. 39

40 Obr. 28. Projevy kortikálního driftu ve stěně žebra. Zvětšení 100. Muž, 84 let. Obr. 29. Projevy kortikálního driftu u muže starého 20 let. Zvětšení

41 Remodelace kosti (a bone remodeling) probíhá po celý život jedince a je hlavním procesem, pomocí něhož dospělá kost odpovídá na fyziologické, environmentální a genetické vlivy (Cho a Stout, 2003). Při remodelaci je kost resorbována a nahrazena novou, ale tvorba a resorpce kosti nemusí být vždy vyrovnané, takže může docházet i ke ztrátě nebo přibývání kostní hmoty (Frost, 2003). Při remodelaci kosti vznikají sekundární osteony, dochází k obratu kostní hmoty, odbourávání obvodových lamel, vzniku a opětnému odbourávání osteonů a fragmentů (Frost, 1969). Remodelace je proto zodpovědná za pozorované změny v počtu a velikosti mikrostruktur kompaktní kosti s věkem. Mezi úkoly remodelace patří oprava mikroskopických a únavových poškození, odpověď na mechanickou zátěž, odstranění nepoužívaných úseků kosti, hojení zlomenin, odpověď na vliv výživy a hormonů (např. hospodaření vápníkem), reakce na ztrátu mechanických vlastností kosti během stárnutí, prevence stárnutí kostní tkáně, náhrada nadměrně mineralizované kosti (zhoršená výměna iontů Ca), zachování životaschopnosti osteocytů, uvolnění růstových faktorů, zachování různých fyziologických a mechanických funkcí a normální věkový úbytek kosti (Cho a Stout, 2003; Parfitt, 2003; Robling a Stout, 2003). Remodelace je zvýšena v silně mechanicky namáhaných kostech, protože v nich vzniká více únavových poškození, která je potřeba opravit (Robling a Stout, 2003; Chan et al., 2007; Keough et al., 2009). Remodelace kosti může být vyvolána nebo zpomalena různými faktory, jako jsou nemoci, immobilita nebo trauma (Keough et al., 2009). Poruchy remodelace způsobují např. osteomalácii nebo osteoporózu (Frost, 1969). Veškerá remodelace je obstarávána dočasnými anatomickými strukturami zvanými Basic Multicellular Unit (BMU). U dospělého člověka se vytvoří kolem 3 milionů BMU ročně a najednou se jich může v kostře vyskytovat asi 1 milion (Frost, 2003). Funkční cyklus (tzv. remodelační perioda) jednotky BMU se skládá z aktivace, resorpce a formace a u člověka trvá asi čtyři měsíce (Frost, 1969). Na přední straně BMU se nacházejí osteoklasty, které resorbují starší kost. Za nimi je kapilára, která přináší cirkulující monocyty měnící se v další osteoklasty, a za ní následují osteoblasty. Celá struktura je asi 1 až 2 mm dlouhá a 0,2 až 0,4 mm široká. BMU se pohybuje skrz kostní tkáň rychlostí cca 25 µm denně a za dobu své existence dokáže obnovit asi 0,05 mm3 kosti (Frost, 1969, 2003; Parfitt, 2003). Během své činnosti BMU v kosti vyhloubí tunel a znovu jej vyplní lamelami, takže vytvoří nový osteon. Vznik osteonu trvá u zdravého člověka jeden až čtyři měsíce (Fiala, 1988; Pacovský, 1988). Lamely osteonu se tvoří rychlostí 1 až 2 µm za den a kanálek osteonu vznikne resorpcí v kompaktní kosti během 1 až 3 měsíců (Fiala, 1988). Na tvorbu osteonů působí lokální a 41

42 systémové nemoci, traumata, genetická informace, výživa, fyzická aktivita, zaměstnání, biomechanické vlivy, chronologický věk, pohlaví a živočišný druh (Frost, 1987a; Bednarek, 2008). Při vzniku BMU nejprve vznikají osteoklasty, osteoblasty a podpůrné buňky a také vyživující kapilára (Frost, 2003). Remodelační proces začíná aktivací osteoklastů tam, kde vznikne nutnost náhrady staré kostní tkáně. Osteoklasty a osteoblasty jsou přitahovány k poškozeným úsekům kosti, kde nahradí poškozenou kost mladší a strukturně vhodnější kostí (Robling a Stout, 2003). Počátek remodelace musí být blízko krevní cévě, která sem přináší prekursorové buňky (Obr. 30). Centrální kapilára budoucího osteonu proto doprovází čelo BMU a v případě potřeby zde vznikají i nové cévy (Parfitt, 2003). Osteoklasty na přední straně BMU resorbují kost a vytvoří resorpční prostor, jenž má obvykle tvar válce. Resorpce probíhá tak dlouho, dokud se nevytvoří dutina požadované velikosti. Tím se určuje lokalizace, tvar a velikost budoucího osteonu (Stout, 1992; Parfitt, 2003). Resorpční fázi remodelační aktivity poznáme podle resorpčních dutin, které mají díky Howshipovým lakunám vroubkované hranice. Frekvence resorpčních míst zůstává během života konstantní, což naznačuje, že funkčnost osteoklastů se s věkem nemění (Ortner, 1975). Asi po měsíci činnosti osteoklasty mizí (Frost, 1969). Resorpce je následována klidovou fází (a reversal phase) variabilního trvání, během níž je vyhlazen vroubkovaný povrch resorpční dutiny. Osteoblasty sem pak uloží na kolagen chudou tzv. cementovou linii (Obr. 31). Cementová linie formovaná během klidové fáze (a reversal line) odlišuje sekundární osteony od jiných podobných struktur, např. primárních osteonů. Cementová linie označuje oblast, kde se zastavila osteoklastická resorpce a byla následována tvorbou nové kosti (Kerley, 1965). Někdy může dojít ke krátkodobé resorpci podél určitého úseku Haversova kanálku zralého osteonu a reversální linie se pak nalézá uvnitř osteonu. Nový resorpční prostor je relativně malý a je nakonec opatřen cementovou linií a vyplněn novými lamelami. Vzniká tak struktura osteonu uvnitř osteonu, jehož dvě soustředné cementové linie se vzájemně nedotýkají. Protože reversální linie vznikla na základě předchozí resorpce, přerušuje lamely i osteocytární lakuny starší části osteonu (Ortner, 1975; Richman et al., 1979; Ericksen, 1991). Vznikne tak osteon typu II (Stout, 1992; obr. 32). Po klidovém (reversálním) období přichází fáze formace nové kosti. Aktivují se osteoblasty, které počnou na stěnách resorpčního prostoru ukládat směrem dovnitř vrstvy kostní matrix (Parfitt, 2003). Dosud nemineralizovaná matrix vytváří na stěně resorpčního prostoru tzv. osteoidní lem. Dostředivá tvorba kosti pokračuje tak dlouho, dokud se uprostřed 42

43 budoucího osteonu nevytvoří Haversův kanálek. V závěru aktivity BMU se velký počet jejích osteoblastů změní v osteocyty nového osteonu. První fází nového osteonu je formující se osteon, který je málo mineralizován a má velký Haversův kanálek. Kompletní osteon má již kanálek normální velikosti, ale není ještě zcela mineralizován. Zralý (mature) osteon se vyznačuje maximálním stupněm mineralizace. V poslední fázi své existence může mít osteon kolem cévního kanálku vysoce mineralizované lamely, které slouží pro výměnu minerálů s krevní cévou (Ortner, 1975). Kompletní osteon zůstane v kosti přítomen tak dlouho, dokud nebude resorbován a nahrazen osteony vyšších generací. Obvykle je to dva až dvacet let podle rychlosti remodelace (Frost, 1969). Rychlost vyplnění resorpčního prostoru novými lamelami a rychlost mineralizace se s věkem zpomalují (Ortner, 1975). Formační proces je někdy dočasně zastaven (Obr ), takže po jeho opětném nastartování vzniká zabrzděná cementová linie (an arrest line). Jde o reakci organismu na stres, podobně jako u Harrisových linií (Stout, 1989a). Zabrzděné linie lze odlišit od reversálních linií díky jejich rovnému okraji a návaznosti na koncentrické lamely a osteocyty Obr. 30. Resorpční prostor s přívodním Volkmannovým kanálkem pro krevní cévu (šipka). Zvětšení 400. Muž, 26 let. 43

44 Obr. 31. Osteon tvořící se v resorpčním prostoru. Zvětšení 400. Muž, 20 let. Obr. 32. Osteony typu II (šipky). Zvětšení 400. Žena, 77 let. 44

45 Obr. 33. Osteon s dočasně pozastaveným a opět obnoveným procesem uzavírání Haversova kanálku (šipka). Zvětšení 400. Muž, 65 let. v okolí (Stout, 1992). Když se zabrzděná linie vyskytne uvnitř osteonu, vznikne pásmový osteon (a zonal osteon, a double-zoned osteon). Ten se odlišuje od osteonu typu II tím, že linie plynule navazuje na lamely a osteocytární lakuny osteonu, v němž se objevuje. U osteonu typu II je přerušuje. Dalším typem osteonu může být osteon s přidruženým fragmentem (an osteon with associated fragment), u něhož se vnitřní a vnější cementové linie vzájemně dotýkají (Ericksen, 1991). Každý osteon reprezentuje vytvoření jedné kostní remodelační jednotky BMU v minulosti. Počet osteonů na mm² plochy příčného řezu kostí tedy představuje viditelný důkaz minulé remodelační aktivity v této oblasti kosti u konkrétního jedince. Zahrnuje osteony a fragmenty osteonů, které byly částečně narušeny následnou remodelační aktivitou, a nazýváme ji hustota populace osteonů (the osteon population density, OPD). Ve vyšším věku jsou některé osteony či fragmenty následnou remodelací úplně vymazány. Nepřetržitá remodelace způsobuje dosažení asymptoty v hodnotě OPD kolem šedesáti let věku. K tomu dojde, když osteony zabírají celou plochu kompakty, takže každý nový osteon odstraňuje stopy po starším osteonu (Cho a Stout, 2003). 45

46 Obr. 34. Sekundární osteon s dvěma soustřednými cementovými liniemi (šipka). Zvětšení 400. Žena, 58 let. Obr. 35. Struktura osteonu uvnitř osteonu (šipka). Zvětšení 400. Žena, 77 let. 46

47 Dynamika a rychlost remodelace se během života mění. U malých dětí může být remodelace až dvěstěkrát rychlejší než u dospělých (Junqueira et al., 1997). Během prvního a druhého roku života je obměněno téměř 50% kostní hmoty (Šmahel, 2001). Rychlost remodelace poté klesá až do třetí dekády, mezi třicátým a čtyřicátým rokem dosahuje minima a pak opět mírně stoupá (Fiala, 1978, 1988; Stout a Paine, 1994; Stloukal et al., 1999). Do dvaceti let převažuje tvorba kosti nad resorpcí, pak jsou oba procesy na čas v rovnováze. Maxima kostní hmoty je dosaženo kolem dvaceti let věku (Pacovský, 1988). Po dvacátém roce klesá rychlost periostální apozice, pokračuje však s menší intenzitou po celý život a vyskytuje se ještě i u sedmdesátiletých jedinců (Fiala, 1988). V dospělosti se ročně obnovuje 3 až 10% kostní hmoty a ztráta způsobená resorpcí činí asi 0,7% kostní hmoty ročně (Frost, 1969; Fiala, 1988; Šmahel, 2001). Od dvaceti pěti až třiceti let věku převažuje resorpce kosti nad její tvorbou a dochází k úbytku kostní hmoty (Obr. 36). Kosti ztrácejí nejprve spongiózu a potom i kompaktu. Kompaktní kost se ztenčuje a zejména v jejích vnitřních vrstvách se objevují resorpční dutiny (Arnold et al., 1966; Fiala, 1978; Šmahel, 2001; Cho a Stout, 2003). Z dlouhodobého hlediska představuje ztráta kostní hmoty asi 0,7 až 1,5% za rok (Frost, 1969; Parfitt, 2003). Ženy ztrácejí kostní hmotu rychleji než muži a ztráta kosti u nich začíná brzy po dosažení skeletní zralosti (Ericksen, 1976, 1982; Fiala, 1988). Ztenčování kompaktní kosti a řídnutí kostí nabývají na intenzitě u žen po šedesátém roce věku a u mužů po sedmdesátém roce (senilní a postmenopauzální osteoporóza). Ztráta kostní hmoty je způsobena nerovnováhou mezi tvorbou a resorpcí kosti během remodelace a může být vyvolána např. fyzickou nečinností a oslabením svalstva, úbytkem pohlavních hormonů, nadbytkem glukokortikoidů, nemocemi a stárnutím (Frost, 2003; Cho a Stout, 2003; Parfitt, 2003). Ztráta kosti je normálním průvodním jevem stárnutí u všech lidských populací minulých i současných, nicméně její manifestace je nejvyšší u moderních populací evropského původu (Cho a Stout, 2003). Průběh a rychlost remodelace se liší mezi různými kostmi skeletu i mezi částmi stejné kosti (Stout, 1989a). Je to způsobeno tím, že se různé části skeletu liší v rychlosti kostního obratu a změny způsobené např. věkem nebo metabolickými poruchami se nejvíce projevují právě v místech s nejrychlejším kostním obratem. Mezi takové oblasti patří např. žebra. V rámci dlouhých kostí existuje variabilita v remodelaci podél diafýzy, kolem obvodu příčného řezu i mezi subperiostální a endostální částí řezu (Drusini, 1996). Remodelace je v dlouhých kostech nejintenzivnější do třetího roku života a odehrává se hlavně na straně 47

48 Obr. 36. Částečně odbourané osteony na periostálním povrchu kosti. Zvětšení 400. Muž, 58 let. endostu. Ve věku od čtyř do jedenácti let zahrnuje celou šíři kompakty. Mezi deseti a sedmnácti lety věku se odehrává intenzivní resorpce pod periostem. Po třicátém roce u žen a po čtyřicátém roce u mužů následuje resorpce medulární stěny kosti (Kósa et al., 1992; Stloukal et al., 1999). Ztráta kostní hmoty je rovněž prostorově variabilní a nastává hlavně v endostálním kortexu a ve spongióze. Rychlost ztráty kosti je ve spongióze větší a objevuje se dřív než v kompaktě. Mezi příčiny těchto odlišností patří např. fyzická aktivita, různá mechanická zátěž jednotlivých kostí skeletu a jednotlivých regionů v rámci kosti, různé vzory kortikálního driftu a velikost těla (Ericksen, 1976; Ruff a Hayes, 1982; Frost, 2003; Cho a Stout, 2003; Parfitt, 2003; Chan et al., 2007). Na femuru existují rozdíly ve ztenčování kompakty mezi jednotlivými kvadranty příčného řezu a mezi různými úrovněmi podél diafýzy (Ericksen, 1982). Také průběh remodelace se v různých oblastech femuru liší, nejodlišnější je oblast na zadní straně diafýzy, kam se upínají velké svaly (Chan et al., 2007). Remodelace kompaktní kosti žebra je asi dvakrát rychlejší než u dlouhých kostí (Fiala, 1988; Stout, 1989a; Stloukal et al., 1999). V žebrech je resorpce a formace kosti během života relativně konstantní (Barer a Jowsey, 1967). Během růstu hrudního koše podléhají žebra především modelaci, která určuje jejich tvar (Streeter a Stout, 2003). Probíhá zde periostální 48

49 apozice a kortikální drift, kdy se celé žebro pohybuje směrem k povrchu těla a zároveň se zvětšuje jeho průměr. Při tom dochází k rychlému obratu kompaktní kosti, takže počet osteonů na mm² zůstává nízký. Vzrůst počtu osteonů je v žebrech patrný až po čtrnáctém roce věku. Celková plocha řezu i plocha dřeňové dutiny se až do dospělosti zvětšují. Formace kosti je poměrně velká v dětství a potom klesá, vrcholu kostní hmoty žebra je dosaženo ve druhé dekádě života. Resorpce kosti se pomalu zvyšuje od dvaceti let věku. Tloušťka kompakty až do dospělosti roste, pak začíná s postupujícím věkem klesat, i když ne tak výrazně jako u femuru. Odlišnosti v remodelaci najdeme v rámci skeletu také mezi vzorky odebranými v různých dnech, měsících a sezónách (Stout, 1989a). Tato variabilita vyplývá např. z hormonálních změn, z odlišností ve výživě, ze sezónních rozdílů v expozici slunečnímu záření nebo z cirkadiánních rytmů ve fyziologii tvrdých tkání. Struktury používané pro odhad věku však nejsou sezónními rozdíly ovlivněny, protože postihují mnohem delší časové intervaly. Remodelace je ovlivňována mnoha faktory, které na kosti působí globálně (Robling a Stout, 2003). Patří sem např. hormony, sérové hladiny minerálních iontů, biochemické podněty, potrava a jiné faktory ovlivňující kortikální kostní obrat. Tyto globální faktory určují počet remodelačních událostí v celém skeletu, ale lokálně jsou modifikovány mechanickou zátěží dané kosti. Pozorovaná mikrostruktura kosti je tedy výsledkem lokálních biomechanických vlivů na kostní remodelaci, které jsou nadřazeny vlivům globálním. Z hlediska odhadu dožitého věku jsou důležité účinky kortikálního driftu, který se vyskytuje během růstu a při některých onemocněních skeletu (např. osteogenesis imperfecta), na histomorfologii kosti (Wu et al., 1970; Stout, 1992; Stout et al., 1994). Kortikální drift během růstu mění velikost a proporce kosti, posunuje kompaktní kost v prostoru určitým směrem a tím odstraňuje stopy po starší kosti (Obr ). Např. žebro během růstu prodělává drift směrem k tělní stěně a zároveň se zvětšuje jeho průřez. Kortikální drift zde neustále odstraňuje starší kompaktní kost ze strany tělní dutiny a přidává novou kost na stranu k tělní stěně. Taková kompaktní kost je pak určena jako příliš mladá. Ačkoli je kortikální drift po ukončení růstu poměrně neaktivní, může být zodpovědný za více než 30% objemu kompaktní kosti u lidí nad padesát let věku. Tento zdroj chyby může být zvláště významný u individuí se senilní kyfózou, která je obvyklou páteřní deformitou u jedinců po páté dekádě. 49

50 Takový drift by měl být v kosti identifikován na základě abnormálního množství a lokalizace primární kosti, tenké kompakty a podnormální velikosti osteonů. Histomorfometrie kosti může být také ovlivněna tzv. regionálním akceleračním fenoménem (Stout, 1989a, 1992; Tab. 1). Jde o urychlení procesů probíhajících v normální kostní tkáni, jehož příčinou může být jakýkoli lokální stimul, např. zlomenina, léze, metastázy či zánět žil. Protože oblasti ovlivněné akceleračním fenoménem mají vyšší kostní obrat než jejich okolí, je odhad věku z takových regionů příliš vysoký. Tab. 1. Faktory, které mohou způsobit regionální akcelerační fenomén (Podle Stout, 1992) Faktory způsobující regionální akcelerační fenomén Tříštivá poranění Zlomeniny Operace kostí: Osteotomie, vrtání, vnitřní fixace, odlupování periostu, implantace fixačních zařízení a dráždivých materiálů Arthrotomie Arteriotomie Popáleniny Akutní denervace Akutní paralýza Infarkty Infekce kosti a měkkých tkání Neinfekční zánětlivé procesy: Arthritida, revmatická horečka, Reiterova nemoc Vliv zdravotního stavu jedince na remodelaci kosti Remodelace kosti je ovlivněna také zdravotním stavem jedince (Kerley, 1965; Stout a Teitelbaum, 1976a; Frost, 1987a; Ericksen, 1991; Harsányi, 1993; Paine a Brenton, 2006; Keough et al., 2009). Mikrostrukturu kosti ovlivňují např. nedostatečná výživa, hypovitaminózy, traumata, záněty a infekce, nádory, kardiovaskulární choroby, chronické nemoci ledvin, různé vývojové a metabolické poruchy, absence biomechanické zátěže, immobilita, tuberkulóza, senilní osteopenie a osteoporóza, osteopetrosa, hyperfosfatáza, osteogenesis osteomalácie, imperfecta, sklerotická hyperplazie dřeně, osteitis, anémie, osteomyelitida, diabetes periostitida, mellitus, křivice, sekundární hyperparathyroidismus, alkoholismus, cirhóza jater apod. Při metabolických chorobách 50

51 dochází k abnormálnímu zvýšení či snížení remodelace kosti. Některé metabolické kostní choroby způsobují zvýšení rychlosti remodelace, takže histologický odhad věku z takového regionu je pak příliš vysoký (Stout, 1989a). Proto je vhodné při konstruování histologických metod odhadu věku vyloučit ze souboru všechny jedince se zjevnou skeletní patologií. U sekundárního hyperparathyroidismu je zvýšena formace i resorpce kosti, takže v kostech najdeme zvýšený počet osteonů a Howshipových lakun (Stout a Teitelbaum, 1976a; Stout a Gehlert, 1982; Stout, 1989a; Paine a Brenton, 2006). Senilní osteopenie způsobuje snížený počet osteonů a nadbytek resorpčních dutin (Stout, 1989a). Diabetes mellitus a léčba adrenálními kortikosteroidy snižují rychlost remodelace, vyznačují se redukovaným počtem osteonů a pomalejším uzavíráním Haversových kanálků (Singh a Gunberg, 1970; Stout a Gehlert, 1982; Stout, 1989a; Stloukal et al., 1999). Pagetova nemoc má urychlenou remodelaci, takže zde najdeme nadměrné množství fragmentů osteonů, reversálních linií, Howshipových lakun a osteoidu (Kerley, 1965; Stout a Teitelbaum, 1976a). Osteomalácie se vyznačuje silnými osteoidními lemy (Stout a Teitelbaum, 1976a). Přítomnost plsťovité kosti u staršího jedince (Stout a Teitelbaum, 1976a) může ukazovat na rychlý obrat kosti (např. renální osteodystrofie, hyperparathyroidismus, hojící se zlomenina) nebo na zpožďování maturace kosti a abnormální strukturu (osteogenesis imperfecta). U osteoporózy je dřeňová dutina kosti větší, rychlost resorpce může být nepatrně zvýšena, rychlost formace je normální nebo zmenšená, osteony jsou malé (Singh a Gunberg, 1970; Wu et al., 1970). Osteoporóza také doprovází leukémii, zvláště u dětí (Arnold et al., 1966). Vysoký nutriční deficit, infekční nemoci a stres způsobují převahu resorpce kosti nad její tvorbou (Martin et al., 1987; Stloukal et al., 1999). Nízké procento plochy kompakty v příčném řezu a malá tloušťka kompakty v porovnání s normálně živenou populací indikují nutriční stres (Martin et al., 1987). Špatná výživa a choroby mohou také způsobovat vysokou porozitu kostí, která se normálně vyskytuje u starších věkových skupin (Martin et al., 1987). Zvýšený či snížený počet osteocytárních lakun, zónovitě uspořádané a zvětšené lakuny, příliš malá velikost osteonů a jejich příliš velký počet na jednotku plochy, malý počet osteonů v subperiostální oblasti a silně strukturované hranice jednotlivých osteonů signalizují např. nádory, rakovinu, diabetes mellitus, tuberkulózu nebo nedostatečnou výživu (Heussner, 1990a). Pacienti s kvadruplegií mají nízkou hustotu populace osteonů. U sklerózy se počet osteonů neliší od normy, protože kosti jsou zatěžovány křečemi (Stout, 1989b). Osteogenesis imperfecta se vyznačuje častým kortikálním driftem a malým počtem osteonů a fragmentů, což vede ke sníženému odhadu dožitého věku (Wu et al., 1970; Paine a Brenton, 2006). 51

52 Existují různé faktory, které vyvolávají vyšší ztrátu kostní hmoty, takže odhad věku je pak příliš vysoký (Frost, 2003). Patří sem ztráta pohlavních hormonů, léčba adrenokortikoidními steroidy, chronické oslabení svalstva, malnutrice, hladovění, chronické nemoci, cystická fibróza, polyarthritis, zranění způsobená úderem, alkoholismus, AIDS, Turnerův syndrom, osteogenesis imperfecta, idiopatická juvenilní osteoporóza, pokročilá mnohočetná skleróza, paraplegie a jiné chronické paralýzy nebo parézy a pobyt kosmonautů ve stavu beztíže. Objevuje se také asociace mezi výskytem osteonů typu II a některými nemocemi, jako je rakovina, diabetes mellitus, nepohyblivost, senilní osteoporóza a různé srdeční choroby. Naopak nebylo nalezeno žádné spojení mezi chorobami a výskytem pásmových osteonů (Stout, 1989a). Paine a Brenton (Paine a Brenton, 2006) zkoumali vliv malnutrice a pelagry na odhad věku provedený metodou Stouta a Painea (1992). Ukázalo se, že odhady věku založené na počtu intaktních a fragmentárních osteonů jsou u takto postižených jedinců podhodnoceny průměrně o 29,2 let. Velikost osteonů a Haversových kanálků byla větší než obvykle, zatímco plocha kompakty byla menší. U jedinců s pelagrou se vyskytovalo velmi málo osteonů i jejich fragmentů. Vliv výživy a zdravotního stavu na odhad dožitého věku může mít fatální následky při určování kostrových nálezů ve forenzní praxi. Na remodelaci kostí má vedle zdravotního stavu vliv také socioekonomický statut jedince, který úzce souvisí s životním stylem, výživou, pohybovou aktivitou, lékařskou péčí a nemocností (Keough et al., 2009; Tab. 2; Obr. 37). 52

53 Tab. 2. Faktory, které ovlivňují remodelaci kostí a tvorbu osteonů (Podle Frost, 1987a; Stout, 1989b, 1992) Faktory ovlivňující remodelaci kosti a tvorbu osteonů Biologický druh Regionální trauma Pohlaví Paralýza Chronologický věk Mechanická zátěž Životní styl Akutní nedostatek mechanické zátěže Skeletální zrání Výživa a podvýživa Hormony Metabolická alkalóza Poruchy elektrolytů Metabolická acidóza Metabolismus a jeho poruchy Vitamíny Genetické choroby Genetické strukturální choroby Toxické činitele Mikroskopická poškození Radiační poškození Drogy a léčiva Růst kosti Průměrný věk kostní tkáně Vzory kostní remodelace Mechanické napětí Regionální akcelerační fenomén Anémie Nádory Pagetova nemoc Obr. 37. Stopy absorpce neznámé látky, snad léčiv, v kostní tkáni (žluté linie v kosti). Zvětšení 100. Muž, 37 let. 53

54 Změny ve složení kostní tkáně během života S věkem se mění také stupeň mineralizace a chemické složení kostní tkáně (Arnold et al., 1966; Ortner, 1975; Fiala, 1978, 1988; Sobotková, 1989; Grynpas, 2003). Mineralizace je nejnižší během rychlého růstu v dětství, protože mladí jedinci mají velké množství nových málo mineralizovaných osteonů. Mineralizace dosahuje maxima mezi třiceti pěti a padesáti lety a v tomto období je stupeň mineralizace kosti stejnoměrný. Potom začíná mineralizace klesat. Po šedesátém roce nacházíme velký rozdíl v mineralizaci osteonů a vmezeřených lamel, mineralizace je značně nehomogenní, nacházíme zde hyper- i hypo-mineralizované osteony. Ve stáří roste koncentrace Ca a Mg, snižuje se koncentrace Na+ a K+ a mění se poměr Ca / P. Také ubývá vody v kostech z 60% v mládí na 10% ve stáří. Obsah kolagenu zůstává po celý život téměř konstantní, ale zvyšuje se stupeň jeho zesíťování. S obsahem kostního minerálu souvisejí i změny hustoty (tzv. denzita, měrná hmotnost) kompaktní kosti během života (Arnold et al., 1966; Fiala, 1988). Hustota kostí roste až do třetí dekády života a potom trvale klesá. Hustota jednotlivých kostí skeletu i různých částí téže kosti se liší, což je dáno stupněm mineralizace. Nově vytvořená kost je méně mineralizována než starší tkáň, takže má i menší hustotu. Proto u rychle se remodelující kosti očekáváme velký podíl neúplně mineralizované tkáně a nízkou hustotu. Ženy nad čtyřicet let věku mají nižší hustotu než muži, protože mají nižší obsah vápníku v kostech. Odlišnosti jsou i rasové, např. muži afrického původu po čtyřicátém roce věku mají vyšší hustotu kostí než stejně staří Evropané Věkové změny mikrostruktur viditelných na příčném řezu kompaktní kostí Kost plsťovitá, která se objevuje jako první při vzniku kosti, je velmi brzy nahrazena sekundární kostní tkání, která se vyznačuje lamelárním uspořádáním kostní matrix. Je to tzv. primární lamelární kost neboli neremodelovaná, obvodová lamelární kost. Vzniká apozicí z periostu a endostu a je tvořena obvodovými lamelami, které jsou rovnoběžné s povrchem kosti a při svém vzniku obklopují již existující krevní cévy. Tím se vytvářejí non-haversovy kanálky, které většinou nemají koncentrické lamely a jsou obvodovými lamelami plynule obtékány. Non-Haversovy kanálky nikdy nemají cementovou linii, která by je oddělovala od okolí. 54

55 Mezi mladistvé charakteristiky kostní tkáně patří alespoň 90% neremodelované lamelární kosti s četnými non-haversovými kanálky, velmi málo osteonů a minimum fragmentů (Ericksen a Stix, 1991). S rostoucím věkem se mikrostruktura kosti mění (Tab. 3). Obvodové lamely a non-haversovy kanálky se postupně odbourávají, takže se plocha neremodelované kosti na příčném řezu zmenšuje (Maat et al., 2006). Tento proces není lineární, nýbrž odbourávání obvodových lamel postupuje pozvolna a asymptoticky až do chvíle, kdy jsou poslední zbytky neremodelované lamelární kosti odstraněny (Maat et al., 2006). Obvodové lamely začínají mizet obvykle okolo dvaceti pěti let věku (Fiala, 1978), u lidského žebra podíl vnějších obvodových lamel klesá k nulové hodnotě v šedesáti letech (Loubová, 1999). Mezi primární obvodové lamely postupně prorůstají sekundární osteony s koncentrickým systémem lamel, které jsou od svého okolí odděleny cementovou linií. Nakonec jsou obvodové lamely a non-haversovy kanálky úplně nahrazeny sekundárními osteony. Non-Haversovy kanálky jsou hojné v dětství, s věkem jejich počet klesá a okolo padesátého pátého roku věku mizí úplně (Kerley, 1965). Vznikem sekundárních osteonů ovšem vývoj kosti nekončí. Kost během celého života prodělává neustálou přestavbu, kdy jsou sekundární osteony postupně nahrazovány dalšími osteony vyšších generací. Zbytky odbouraných osteonů se nazývají fragmenty osteonů. Přestavba osteonu probíhá po jeho délce rovnoběžné s povrchem kosti, a proto v jednotlivých úrovních téhož osteonu nalezneme různá stádia jeho vývoje (Šmahel, 2001). Nově vzniklé generace osteonů se posunují k okraji kompakty ve směru aposice kosti, aby se zajistila adekvátní vzdálenost osteocytů od cévního zásobení (Šmahel, 2001; Obr ). S přibývajícím věkem roste počet sekundárních osteonů a fragmentů osteonů, které vznikají neustálým odbouráváním předchozích generací osteonů (Obr. 41). Fragmenty osteonů vytvářejí tzv. intersticiální (vmezeřené) lamely, které v kosti přetrvávají po celý život. Výsledkem těchto procesů je komplikovaná kostní struktura, ve které vedle sebe existují osteony různé velikosti a stáří, formující se osteony, kompletní osteony, osteony ve stádiu odbourávání i jejich fragmenty. V jakémkoli věku můžeme v kosti nalézt mladé i staré osteony zároveň (Singh a Gunberg, 1970). Mladý osteon se vyznačuje velkým Haversovým kanálkem a nízkým počtem lamel (Obr. 42). S věkem se v kosti obecně zvyšuje procento remodelované kosti (osteony a fragmenty). Rychlost tvorby a mineralizace osteonů s věkem klesá, takže u starých jedinců nacházíme mnoho osteonů v počátečních stádiích vývoje, s velkými kanálky a neúplně mineralizované. To ukazuje, že syntéza matrix osteoblasty i mineralizace se s věkem zpomalují (Ortner, 1975). 55

56 Obr. 38. Sekundární osteon driftující skrz obvodové lamely (směr driftu ukazuje šipka). Zvětšení 400. Žena, 42 let. Obr. 39. Sekundární osteon driftující a zároveň zvětšující svou velikost (směr driftu a zvětšování ukazují šipky). Zvětšení 400. Žena, 65 let. 56

57 Obr. 40. Sekundární osteon driftující a neměnící svou velikost (směr driftu ukazuje šipka). Zvětšení 400. Žena, 65 let. Obr. 41. Vznik osteonu v obvodových lamelách. Uprostřed kosti se vyskytuje resorpční dutina (A), do které přicházejí krevní cévy skrz Volkmannovy kanálky (B). Dutina bude posléze vyplněna lamelami a vznikne sekundární osteon podobný tomu, který se nachází v levé části obrázku (C). Zvětšení 100. Muž, 60 let. 57

58 Na femuru, tibii a fibule (Kerley, 1965) byla nalezena korelace mezi věkem a počtem osteonů, fragmentů a non-haversových kanálků i procentem obvodových lamel. Počet osteonů a fragmentů koreloval s věkem lépe než procento obvodových lamel nebo počet nonhaversových kanálků. Ericksenová (Ericksen, 1991) na femuru nalezla vysokou korelaci s věkem u počtu non-haversových kanálků, sekundárních osteonů, osteonů typu II a fragmentů osteonů na mm². Vysokou korelaci s dožitým věkem vykazovalo i procentuální zastoupení obvodových lamel, osteonů a fragmentů na ploše řezu. V žebrech byla nalezena vysoká korelace s věkem u počtu osteonů na mm², počtu osteonů a fragmentů na mm² a plochy osteonu (Loubová, 1999; Kim et al., 2007). Počet osteonů s věkem roste, zatímco plocha osteonu klesá. Procento vnějších obvodových lamel a plocha Haversova kanálku mají na odhad věku jen malý vliv. V žebrech u dětí probíhá intenzivní růst, modelace a remodelace (Streeter a Stout, 2003). Tím dochází k tomu, že Obr. 42. Mladý osteon s velkým Haversovým kanálkem. Cirkulární lamely obkružují Haversův kanálek po celém jeho obvodu. Zvětšení 400. Žena, 58 let. 58

59 zvyšování počtu osteonů a fragmentů na mm² je u nich patrné až po čtrnáctém roce věku. Patrná stáze nebo dokonce pokles počtu osteonů je u dětí způsoben zvětšováním velikosti osteonů a rychlým kostním obratem během růstu. Křivka závislosti počtu osteonů a fragmentů na mm² na věku dosahuje u žeber v cca šedesáti letech asymptoty (Wu et al., 1970; Robling a Stout, 2003). Je to způsobeno zvyšujícím se počtem osteonů s věkem, takže na této úrovni hustoty osteonů každý nový osteon vzniká na místě starších osteonů a způsobí tak částečnou nebo úplnou destrukci staršího osteonu. U kostí, které remodelují rychleji než žebra, nastane asymptota dříve a u kostí, které remodelují pomaleji (např. tibie), nastane později. Během života se mění také velikost osteonů a jejich kanálků. Ve vnějších vrstvách kompakty dlouhých kostí se s věkem zmenšuje průměr osteonů, ale průměr Haversových kanálků se výrazně nemění. Ve vnitřních vrstvách kompakty dlouhých kostí se s věkem zvětšuje průměr osteonů i Haversových kanálků tzv. medulizace kompakty (Currey, 1964; Arnold et al., 1966; Fiala, 1978, 1988; Grynpas, 2003). Thompson naopak na femuru nezaznamenal žádnou věkovou změnu v průměru osteonů (Thompson a Gunness-Hey, 1981; Stloukal et al., 1999). Na žebru dochází k poklesu průměru osteonů s věkem, ale změna není statisticky významná (Barer a Jowsey, 1967). Plocha osteonu na žebru s věkem klesá (Kim et al., 2007), podle jiných studií se nemění (Streeter a Stout, 2003). Průměr Haversových kanálků se do padesáti let věku zvětšuje, u starších jedinců je variabilní, u žen mírně klesá (Loubová, 1999; Kim et al., 2007). Obvod a plocha Haversova kanálku zůstává s rostoucím věkem konstantní (Barer a Jowsey, 1967; Kim et al., 2007). S věkem roste počet lamel v osteonu, ale korelace je nízká (Singh a Gunberg, 1970). Mění se i velikost a počet osteocytárních lakun v osteonu (Fiala, 1988). Počet osteocytárních lakun s přibývajícím věkem obecně klesá. V kompaktě mandibuly se v mládí vyskytují větší osteocytární lakuny s širšími kanálky. S rostoucím věkem se zvyšuje plocha resorpčních dutin v kompaktě, takže roste porozita kosti (Atkinson, 1969; Fiala, 1988; Grynpas, 2003). Resorpční dutiny jsou v kompaktě vyhlodány činností osteoklastů, reprezentují první krok při vzniku nového osteonu a vyznačují se vroubkovanými okraji (Howshipovy lakuny). Destruují starší kost a vytvářejí prostor pro tvorbu nové kosti. Najdeme je v neremodelované i remodelované kosti v různé velikosti, od drobných průniků cév až po velké resorpční dutiny u starších jedinců 59

60 (Ericksen, 1991). Porozita kosti je kromě resorpčních dutin ovlivněna také zvýšením počtu a průměru Haversových kanálků. Vnitřní část kompakty je přitom více ovlivněna než vnější (Grynpas, 2003). Na femuru (Fiala, 1978) byla zjištěna závislost mezi věkem a plochou resorpčních dutin ve vnějších vrstvách kompakty, která po padesátém roce života stoupá. Na druhou stranu nebyla nalezena významná korelace mezi věkem a počtem resorpčních dutin na mm² (Ericksen, 1991). Jejich počet měl tendenci zůstávat na stále stejné výši. V kompaktě žeber (Sedlin et al., 1963a; Fiala, 1978) je počet resorpčních dutin na mm² nejvyšší v dětství, do čtvrté dekády klesá a potom opět roste. Po šedesátém roce života počet resorpčních míst dále stoupá, ale klesá velikost a počet osteoidních lemů. To znamená, že s věkem dochází ke zvýšení resorpce kosti oproti její tvorbě. Osteoidní lem je vrstva dosud nemineralizované matrix na stěně Haversova kanálku tvořícího se osteonu Rozdíly v remodelaci kostí mezi individui Mezi jedinci existují rozdíly v průběhu remodelace a v důsledku toho i v mikrostruktuře kompaktní kosti. Tyto rozdíly jsou způsobeny pohlavím, rasovou, etnickou a populační příslušností jedince, věkem, genetickými faktory, zdravotním stavem, endokrinními funkcemi, mechanickou zátěží, immobilizací, složením a stavbou těla, výživou, fyzickou aktivitou, pracovními podmínkami, způsobem života (lov a sběr, primitivní zemědělství, moderní životní styl, vyšší vs. nižší socioekonomický status), geografickou polohou bydliště, životním prostředím, těhotenstvím a kojením u žen, absencí zemské přitažlivosti u astronautů, archeologickým stářím vzorku apod. (Eidlin, 1974; Ericksen, 1976; Thompson a GunnessHey, 1981; İşcan a Loth, 1989; Cho a Stout, 2003; Streeter a Stout, 2003; Keough et al., 2009) Sexuální a etnické (rasové, populační) rozdíly v remodelaci kostí Někteří badatelé (Kerley, 1965; Singh a Gunberg, 1970; Stout, 1992; Stout et al., 1994; Maat et al., 2006; Han et al., 2009) uvádějí, že nezjistili žádné statisticky významné sexuální rozdíly v remodelaci kompaktní kosti, které by ovlivnily odhady dožitého věku. Přesto určité sexuální rozdíly v remodelaci kostí existují. Příčinou těchto rozdílů mohou být např. životní styl odlišný mezi pohlavími zejména u lovců-sběračů a primitivních zemědělců, 60

61 dále fyziologické odlišnosti, hormony (např. nedostatek estrogenů po menopause), výživa, fyzická aktivita, těhotenství a kojení u žen, choroby a genetické pozadí. V období zvýšených nároků na přívod vápníku při těhotenství a kojení nacházíme v kostech žen dočasně zvýšenou kortikální porozitu, která je způsobena vyšší úrovní remodelace. Remodelace zde slouží k uvolňování vápníku z kostí (Parfitt, 2003). Jisté sexuální rozdíly v remodelaci byly zjištěny v rámci jednotlivých kostí. Na femuru se muži a ženy s postupujícím věkem liší ve vztahu mezi osteony a fragmenty (Ericksen, 1991). Počet osteonů roste u mužů po celý život, zatímco u žen jen do šesté dekády. Počet fragmentů překročí počet osteonů u žen v páté dekádě a u mužů až v sedmé dekádě. Plocha fragmentů je u žen od osmé dekády větší než plocha osteonů, avšak u mužů plocha fragmentů nikdy nepřekročí plochu osteonů. Na femuru a tibii byly nalezeny pohlavní rozdíly také ve ztenčování kompaktní kosti s věkem. Tloušťka kompakty se u žen s věkem zmenšuje dva až desetkrát rychleji než u mužů (Arnold et al., 1966; Ruff a Hayes, 1982; Fiala, 1988). Ztráta kompaktní kosti je u žen spojena s větší endosteální resorpcí a s vyšším počtem resorpčních dutin a formujících se osteonů. Byly také nalezeny odlišné mechanismy ztráty kosti mezi mladými jedinci a ženami po menopauze. Zatímco ztráta kosti je u mladých individuí způsobena zrychleným obratem kostní hmoty, u starších žen je obrat kosti redukovaný (Stout, 1989b). Existují také pohlavní rozdíly v remodelaci žeber (Doktorov et al., 2002; Streeter a Stout, 2003; Kim et al., 2007). Plocha příčného řezu žebrem se zvětšuje u žen jen do druhé dekády života, u mužů do třetí dekády. U žen dochází k dřívějšímu ukončení periostální apozice kosti. Ve vyšším věku je u žen ztenčování kosti mnohem rychlejší než u mužů a je způsobeno především přeměnou kompaktních vrstev na spongiózní kost. Ve věku 40 až 49 let se odlišnosti mezi pohlavími týkají také plochy kompakty, počtu osteonů, počtu fragmentů, plochy osteonu a plochy Haversova kanálku. U kategorie 60 až 69 let se mezi pohlavími liší hlavně plocha osteonu a plocha kompakty. Odlišnosti ve vyšším věku mohou být způsobeny nastupující menopausou u žen. Kerley (Kerley, 1965) uvádí, že nezjistil žádné významné rasové rozdíly v remodelaci dlouhých kostí. Je však známo, že populační původ jedince má vliv na spolehlivost histologických metod odhadu věku, když jsou regresní rovnice použity na jiné populace, než na kterých byly vypracovány. Populační původ je tedy jednou z mnoha proměnných, které ovlivňují histologii kostní tkáně a remodelaci (Stout, 1989a; Kim et al., 2007; Bednarek, 2008; Han et al., 2009; Pavón et al., 2010). 61

62 Tab. 3. Přehled struktur kostní tkáně, které se mění v průběhu lidského života (Podle Bruchhaus, 1990) Struktury kostní tkáně člověka, které se mění s věkem Plocha kompaktní kosti Tloušťka kompaktní kosti Plocha spongiózní kosti a dřeňové dutiny Topografické uspořádání lamel: Procento obvodových lamel Procento osteonů a fragmentů Velikost osteonů Počet non-haversových kanálků Volkmannovy kanálky Osteony: Počet osteonů na mm² Počet lamel v osteonu Počet osteoidních lemů Počet fragmentů osteonů Průměr osteonu Průměr Haversova kanálku Průměr kanálků v kosti Počet dutin na jednotku plochy Spongiózní kost: Tloušťka spongiózních trámečků Hustota Počet resorpčních míst Průměr kolagenních fibril Velikost krystalů kostního minerálu Obsah kostního minerálu Poměr mezi organickou a anorganickou složkou matrix Rasové i sexuální rozdíly byly zjištěny ve ztenčování kompaktní kosti femuru s věkem (Ericksen, 1976, 1982). Ztráta kostní hmoty je velká u žen po šedesátém roce věku. V některých oblastech femuru je ztráta kosti stejná u žen a afroamerických mužů, zatímco bílí muži se od obou skupin liší. V jiných oblastech kosti existují rozdíly mezi afroamerickými a bílými ženami a jinde zase najdeme rozdíly mezi pohlavími bez ohledu na rasu. Ztenčování kompaktní kosti s věkem je největší u afroamerických žen, následují bílé ženy a afroameričtí muži a nejmenší je u bílých mužů. Zajímavé je, že environmentální faktory, fyzická aktivita nebo výživa nemají na ztrátu kostní hmoty s věkem velký vliv. 62

63 Rozdíly v remodelaci kostí mezi vzorky různého archeologického stáří Histologické struktury je možné studovat i na archeologických kosterních nálezech, kde lze identifikovat mnoho struktur včetně osteonů, Haversových kanálků a cementových linií (Kerley, 1965; Stout a Teitelbaum, 1976a; Hanson a Cain, 2007). Zachování histologické struktury kosti záleží na podmínkách uložení kosti v zemi, zejména na působení vody a mikroorganismů. Stav zachování je obvykle velmi dobrý a je zřejmě nezávislý na čase (Stout a Teitelbaum, 1976a). Odlišnosti v remodelaci kostí byly nalezeny mezi archeologickými a současnými populacemi a také mezi archeologickými populacemi navzájem. Minulé populace dosahovaly skeletální zralosti v pozdějším věku než populace současné a měly jinou rychlost remodelace (Ericksen, 1976, 1982; Stout a Lueck, 1995). Rovněž u nich byly nalezeny odlišnosti ve ztrátě kostní hmoty s věkem, např. ztenčování kompakty femuru bylo u nich oproti moderním skupinám urychleno. Mezi příčiny těchto odlišností patří různý životní styl, životní prostředí, stres, výživa, nutriční stres, stavba těla, fyzická aktivita, způsob obživy (lov a sběr, zemědělství, moderní způsob života), choroby a genetické pozadí (Ericksen, 1976; Thompson a Gunness-Hey, 1981; Stout a Lueck, 1995; Cho a Stout, 2003; Robling a Stout, 2003). Ericksenová (Ericksen, 1973; Stout, 1989b) porovnávala věkové změny v kompaktě u tří amerických domorodých archeologických populací. Autorka zjistila, že remodelace byla u archeologických populací srovnatelná s moderními soubory. Mezi jednotlivými populacemi se lišil počet osteonů u žen, muži se nelišili. Zřejmě to bylo způsobeno dietními odlišnostmi a rozdíly ve fyzické aktivitě mezi populacemi (lovci a sběrači vs. usedlí zemědělci). Richman však zpracoval stejný kosterní soubor a nenalezl žádné rozdíly ve frekvenci osteonů mezi populacemi ani mezi pohlavími (Richman et al., 1979; Stout, 1989b). Na femuru byly zjištěny rozdíly mezi archeologickými populacemi Eskymáků a současnými bílými Američany (Thompson a Gunness-Hey, 1981; Cho a Stout, 2003). Eskymáci měli oproti bělochům větší ztrátu kostního minerálu s věkem, tenčí kompaktní kost, vyšší kortikální porozitu a větší počet osteonů. Eskymáci a běloši i eskymácké populace navzájem se liší v tloušťce kompakty a v obsahu minerálů. Všechny eskymácké populace mají stejnou rychlost remodelace. Eskymáci měli vyšší rychlost remodelace než běloši, což může být způsobeno genetickými faktory, výživou a fyzickou aktivitou. Mezi Eskymáky a bělochy nebyly zaznamenány žádné rozdíly ve velikosti osteonů a v hustotě kompaktní kosti. 63

64 Histomorfometrické proměnné u mumie eskymácké ženy zemřelé v šesté dekádě života byly shodné s hodnotami zdravých moderních žen stejného věku (Stout a Teitelbaum, 1976b; Cho a Stout, 2003). Na druhou stranu analýza femuru a crista iliaca ze dvou aljašských mumií ukázala nižší tloušťku kompakty femuru a méně kostních trabekul než u současných bílých Američanů. Obě aljašské mumie vykazovaly známky osteoporózy (Cho a Stout, 2003). Při porovnávání zemědělských indiánských populací s Eskymáky bylo zjištěno, že remodelace byla nejvyšší u eskymáckých žen, které měly vyšší frekvenci osteonů, fragmentů a resorpčních dutin (Cho a Stout, 2003). Tento jev je u eskymáckých žen připisován vyšším požadavkům na vápník během těhotenství a kojení. Dle jiných autorů byla vysoká rychlost remodelace u Eskymáků způsobena jejich vysoce proteinovou potravou (Richman et al., 1979). Stout a Luecková (Stout a Lueck, 1995; Cho a Stout, 2003) určovali rychlost remodelace kompakty žeber u dvou lovecko-sběračských a jedné zemědělské severoamerické archeologické populace a současného souboru. Obě sběračské populace se vzájemně podobaly ve všech parametrech remodelace a měly nejnižší úroveň remodelační aktivity. Recentnější zemědělská populace se nachází ve sledovaných parametrech uprostřed mezi sběrači a současnou populací, která má nejvyšší úroveň remodelace kompaktní kosti. Sběrači měli menší počet osteonů a fragmentů než zemědělci a současný soubor. Mezi populacemi se vyskytly rovněž odlišnosti ve velikosti osteonů (současná populace největší osteony vs. zemědělci nejmenší osteony). Zjištěné rozdíly mezi populacemi mohou být způsobeny tím, že dřívější populace, zvláště sběračské, dosahovaly skeletní zralosti ve starším věku než populace současné. Je možné, že rozdíly mezi sběrači a zemědělci odrážejí také vliv různých stresových faktorů. Sběrači trpěli především nutričním stresem, zatímco zemědělci malnutricí a treponemálními infekcemi. Ve větším rozsahu mohou rozdíly v remodelaci ukazovat na genetické a behaviorálně-kulturní faktory působící na rostoucí skelet mladých jedinců (Cho a Stout, 2003). Rychlost remodelace v kompaktě žebra byla porovnávána u tří archeologických severoamerických indiánských populací, u jedné archeologické jihoamerické populace a u moderního souboru (Stout, 1983; Cho a Stout, 2003). Severoamerická zemědělská populace měla nejrychlejší kostní obrat v porovnání s lovci-sběrači a moderní populací. Lidé z této populace se živili hlavně kukuřicí, která je chudá na vápník a bohatá na fosfor. To u nich 64

65 mohlo spustit chronický sekundární hyperparathyroidismus, který zvyšuje rychlost remodelace. Robling a Stout (Robling a Stout, 2003) zkoumali vzorky žeber a femurů z jedné archeologické lokality v Peru. Obyvatelé byli původně lovci-sběrači a potom přešli na mořský rybolov, čímž se změnila i jejich fyzická aktivita. Muži vykazovali pokles fyzické aktivity, ženy naopak. S tím také klesala (u mužů) nebo stoupala (u žen) remodelace v kompaktě femuru. Autoři dále uvádějí, že ztráta kostní hmoty a osteoporotické fraktury, obvyklé u moderních usedlých populací, jsou u minulých populací vzácné. To může být spojeno s odlišnou úrovní fyzické aktivity, která má významný vliv na tvorbu a udržování kostní hmoty. Přechod k usedlému životnímu stylu a omezená fyzická aktivita u moderních populací jsou spojeny s poklesem kvality a kvantity kostní tkáně i s poklesem odolnosti vůči zlomeninám. Choová a Stout (Cho a Stout, 2003) studovali remodelaci žebra v jedné městské archeologické populaci v Itálii. Mezi pohlavími se v počtu osteonů vyskytly rozdíly jen ve věkové třídě 50+, v níž měly ženy vyšší hustotu osteonů než muži. Rychlost remodelace u obou pohlaví s věkem klesala a rozdíly mezi pohlavími byly podobné jako u současných populací. Soubor byl také porovnáván se současnými americkými bělochy a Afroameričany. Populace z Itálie měla větší plochu kompakty a menší dřeňovou dutinu než obě současné populace. Ztenčování kompakty je podobné mezi italskou populací a současnými bělochy, od Afroameričanů se liší. Běloši mají největší plochu osteonu, italská populace je uprostřed a Afroameričané mají osteony nejmenší. Rychlost tvorby osteonů byla u bělochů i u populace z Itálie vyšší než u Afroameričanů. Počet osteonů se u všech tří populací neliší. Výskyt osteoporózy je u minulých populací poměrně nízký (Cho a Stout, 2003). Největší riziko osteoporózy mají současné populace evropského původu. Současné populace afrického původu a archeologické populace oproti nim vykazují větší kvantitu a kvalitu kostní hmoty. Lidé ze starověké Itálie měli oproti moderním Evropanům více kostní hmoty a nižší rychlost remodelace kompakty. Měli také silnější stěnu žebra. Oproti tomu současní Afroameričané se neliší od bělochů v relativní ploše kompakty, ale spíše mají hustší kosti díky omezené remodelaci a menší velikosti osteonů. U dvou archeologických populací evropského původu (Londýn a Kanada) byla měřena velikost osteonů v žebru a femuru (Cho a Stout, 2003). Osteony ve femuru byly u obou 65

66 skupin větší než v žebru. Londýnský soubor měl největší femorální osteony a nejmenší žeberní osteony ve srovnání se souborem z Kanady i se současnými lidmi. Tato variabilita může být způsobena mechanickými, genetickými a lokálními faktory. Nejzkoumanější archeologickou populací Afriky jsou súdánští Núbijci (Cho a Stout, 2003). Mladé núbijské ženy začínaly ztrácet kostní hmotu femuru dříve než muži, měly rychlejší remodelaci, zvýšenou resorpci a pomalejší formaci. Měly také méně osteonů a více fragmentů než muži, jejich osteony měly větší plochu. Tyto rozdíly jsou přisuzovány vlivům nutričního stresu, reprodukce (několikanásobná těhotenství a prodloužené kojení) a dělbě práce, která se projevila v odlišné mechanické zátěži femuru. Ztráta kostní hmoty femuru nastupovala u núbijských žen v mladším věku než u současné populace. Na Středním Východě byly studovány také vzorky femuru pozdně pleistocénních fosilních hominidů (Cho a Stout, 2003). Ti měli oproti současné populaci nižší hustotu osteonů a pomalejší rychlost remodelace, podobnou jiným archeologickým populacím lovcůsběračů. Tyto výsledky ukazují na vysokou úroveň fyzické aktivity. Abbott a kolegové (Abbott et al., 1996) zaznamenali u pleistocénních hominidů menší osteony a pomalejší kostní obrat ve srovnání se vzorky Indiánů z 15. a 16. století. Jejich práce byla později přezkoumána a byly v ní nalezeny jisté matematické chyby (Streeter et al., 2010). Autoři došli k závěru, že rychlost remodelace byla u pleistocénních hominidů pravděpodobně podobná jako u mladších archeologických vzorků ONTOGENETICKÝ VÝVOJ ŽEBRA Žebra vznikají z prvosegmentů paraxiálního mezodermu uložených podél chorda dorsalis (Vacek, 1992; Šmahel, 2001). Počátkem čtvrtého týdne vývoje se každý prvosegment rozdělí na tři části: dermatom (dermis a podkožní vazivo), myotom (kosterní svalstvo) a sklerotom (axiální skelet). Mezenchym sklerotomů vytvoří obal kolem chorda dorsalis a nervové trubice a vznikají z něj obratle a meziobratlové ploténky. Z těl obratlů vyrůstají processus costales, které u hrudních obratlů rychle rostou ventrálním směrem a tvoří základy žeber. Od dorzálního konce postupně chondrifikují. Chondrifikace žeber a jejich růst do délky rychle pokračují ventrálně a později i mediálně. Žebra tím nabývají obloukovitého tvaru a obemykají hrudník. Ventrální konce budoucích žeber srůstají v párovou sternální lištu. 66

67 Sternální lišty srůstají se základem manubria a vzájemně se spojují kraniokaudálním směrem. Spojením ventrálních konců žeber, srůstem sternálních lišt a jejich chondrifikací vzniká uzavřený chrupavčitý hrudník. Processus costales krčních obratlů zůstávají krátké a vytvářejí přední ohraničení foramen processus transversi. Processus costales lumbálních obratlů srůstají s processus transversi a vytvářejí základ pro processus costarii. Na os sacrum vytvářejí processus costales a processus transversi dohromady na každé straně jednotnou ala sacralis (Vacek, 1992). Žebra osifikují od šestého až osmého týdne fetálního života z jednoho primárního osifikačního centra uloženého v oblasti angulus costae. Odtud osifikační proces rychle postupuje oběma směry. Osifikace končí v určité vzdálenosti od sterna, takže zůstává zachována chrupavka, cartilago costalis. K žeberní chrupavce dosáhne osifikace do konce čtvrtého měsíce vývoje (Bass, 1987). Sekundární osifikační centra pro caput costae a tuberculum costae se objevují od sedmého až osmého roku života. Asi od šestnácti let začínají tato přídatná osifikační centra splývat se zbytkem kosti a srůst je ukončen do dvaceti pěti let. Osifikace začíná na horních a dolních žebrech a postupuje ke středu hrudníku (Bass, 1987; Stloukal et al., 1999). Žebra rostou až do dvaceti let věku, potom se jejich velikost mění jen málo. Růst žeber do tloušťky periostální apozicí končí u žen v polovině druhé dekády života a u mužů ve třetí dekádě (Streeter a Stout, 2003). Dřeňová dutina žebra se během života zvětšuje endostální resorpcí (Frost, 1969). U jedinců do jednadvaceti let věku prodělává kompaktní kost žebra jisté pravidelné změny (Streeter, 2010). Od narození až do pěti let věku se kompakta skládá z plsťovité kosti, která je postupně transformována v primární lamelární kost (obvodové lamely a nonhaversovy kanálky). Vytváří se dřeňová dutina a začínají být patrné trámce spongiózy. Modelační drift se projevuje ukládáním obvodové lamelární kosti, která postupně nahrazuje plsťovitou kost. K tomuto nahrazení dochází nejprve v pleurální kompaktě (tj. na straně k plicím). Nově uložená primární lamelární kost se hromadí nejdřív na endostální pleurální straně žebra, později na periostální kutánní straně (tj. na straně k povrchu těla). Osteoklastická resorpce je viditelná na protilehlých stranách kompakty. To ukazuje na kortikální drift žebra směrem k tělní stěně, jak se hrudník postupně zvětšuje. Kutánní kompakta je složena hlavně z plsťovité kosti, pleurální kompakta obsahuje primární lamelární kost s množstvím Volkmannových kanálků. Ve věku pěti až devíti let se v kompaktě objevují driftující osteony, a to nejdříve v primární lamelární kosti blízko periostu na pleurální straně kompakty. Pohybují se od periostu směrem k endostu. Význačné jsou rozdíly v tloušťce pleurální a 67

68 kutánní kompakty. Pleurální kompakta je často dva až třikrát silnější než kutánní a obsahuje velké množství Volkmannových kanálků. Mnoho těchto kanálků spojuje osteony s periostálním a endostálním povrchem kosti. Kutánní kompakta má porózní vzhled díky velkým resorpčním dutinám. Kortikální drift se projevuje resorpcí na periostální pleurální a endostální kutánní straně kompakty a ukládáním kosti na opačných površích, směřujících k tělní stěně. Díky tomuto driftu se trámce spongiózy inkorporují do pleurální kompakty (Obr. 43, 44). Rozptýlené úseky plsťovité kosti můžeme stále vidět především v kutánní kompaktě. Mezi deseti a sedmnácti lety je na obou stranách žebra primární lamelární kost remodelována driftujícími osteony. Typická je tenká vrstva primární lamelární nebo plsťovité kosti podél kutánního periostálního povrchu kosti. Mezi osmnácti a jednadvaceti lety má žebro již více adultní morfologii s normálními osteony. Vznikají také fragmenty osteonů. Vliv růstu a modelačního driftu u dětí a nedospělých zastiňuje remodelační aktivitu. Z toho důvodu nekorelují např. počty osteonů s věkem až do druhé dekády života tak dobře jako u dospělých. Obr. 43. Trámce spongiózy (šipky) zakomponované do kompaktní kosti v průběhu modelace kosti. Zvětšení 100. Muž, 84 let. 68

69 Obr. 44. Tentýž jev u muže starého 20 let. Zvětšení ZMĚNY KOMPAKTNÍ KOSTI PŘI SPALOVÁNÍ Při spalování dochází v kostech k mnoha makroskopickým i mikroskopickým změnám. Mění se velikost, tvar, lomivost, barva, pevnost, histologická struktura i chemické složení kosti (Tab. 4). Spalování způsobuje smrštění délkových i příčných rozměrů, vznik hlubokých prasklin, odlupování vnějších vrstev kompakty, lámání a zkroucení kosti. Rozsah poškození kosti žárem je dán stupněm spálení, anatomickou stavbou kosti (robusticita, rozložení kompakty a spongiózy, rozsah dřeňové dutiny, vnitřní architektonika kosti, trajektoria atd.) a patologickými změnami kosti (Dokládal, 1999a). Kosti s větším podílem spongiózy se více rozpadají než kosti se silnou kompaktou. Stupeň spálení kosti závisí na výši teploty i délce trvání žáru. Bylo zjištěno, že vysoká teplota krátkého trvání způsobuje v kosti podobné změny jako nižší teplota po dlouhou dobu působení (Hanson a Cain, 2007). Tepelná destrukce suché kosti je odlišná od destrukce tučné kosti a kosti spálené s měkkými tkáněmi, které ji částečně chrání před přímým působením ohně (Quatrehomme et al., 1998; Hanson a Cain, 2007). U archeologických kremací hrají při zachování kostí roli i další faktory, např. uložení v urně nebo volně v zemi, drcení kostí na kousky, jejich polévání vodou, zhroucení pohřební hranice při kremaci, poškození kostí orbou apod. 69

70 ZMĚNY KOSTNÍ TKÁNĚ PODLE TEPLOTY SPALOVÁNÍ Chemické, fyzikální a strukturní změny v kosti vlivem žáru (Tab. 4) byly podrobněji popsány v mnoha pracích, ze kterých vycházíme v následující kapitole (Herrmann, 1976, 1977a, 1977b; Schutkowski, 1991; Harsányi, 1993; Holden et al., 1995a, 1995b; Quatrehomme et al., 1998; Dokládal, 1999a; Thompson, 2004; Hanson a Cain, 2007; Ubelaker, 2009). Mezi 150 C a 300 C dochází k prvnímu smrštění kosti, které je vyvoláno zkracováním kolagenních fibril, a mizí krystalická voda vázaná na minerální složku kosti. Kost má barvu nažloutlou (150 C), oranžovou (200 C), hnědou až tmavě šedou či černou (300 C). Haversovy kanálky jsou dosud nepoškozeny, při 200 C se však začíná rozpadat jejich vnitřní výstelka. Při teplotě 300 až 500 C se kostní hmota přechodně opět natahuje, takže kosti dosahují svého původního tvaru a velikosti. Voda je z kosti odstraněna za 30 až 60 minut. Dochází k hoření organické kostní substance, při čemž vzniká množství uhlíku. Při 400 C mizí většina organické složky kosti, kost má velmi malou mechanickou pevnost až k dosažení tzv. křídovitého strukturálního spojení, barva je černavě šedá. Kost vykazuje mnoho prasklin. Při spalování o délce dvanácti hodin je odstraněna většina endostu, po dvaceti čtyřech hodinách zmizí veškerý endost. Při 500 C je kost černá. Kanálky zůstávají zatím nepoškozeny. Od 500 do 600 C se pochody zkracování a protažení kosti přibližně vyrovnávají. Současně se díky oxidaci uhlíku a spalování organické hmoty mění barva kosti od nažloutlé přes hnědou, šedou a šedomodrou. Nedokonalé spálení kostí se projevuje karbonizací a zuhelnatěním organické kostní hmoty. Lamelární struktura kosti (osteony, lamely, lakuny osteocytů) zůstává nezměněna. Při teplotě spalování 600 C se vyžíhají všechny organické látky, kost se stává křehkou, ale tvarově se zřetelněji nemění. Při spalování organických komponent kostí dochází ke ztrátě uhlíku ve formě CO2. Barva kosti je šedá až černá a endost Haversových kanálků je úplně destruován (Obr. 45). To ukazuje na úplné odstranění kolagenních fibril, proteinů a 70

71 tuku z kostní tkáně. Začíná rekrystalizace kostního minerálu a kost se začíná výrazněji smršťovat. Při teplotě 600 až 700 C dochází k další ztrátě CO2. Díky neúplnému spálení organické hmoty vykazují kosti rozsáhlé zabarvení uhlíkem a v závislosti na jeho množství jsou hnědé, černé, šedé až modré (Obr. 46, 47). Spalováním hydroxyapatitu vzniká pyrofosfát. Na kostech jsou zřetelné praskliny. Teploty do 700 C způsobují neúplné spálení kosti a smrštění o 1 až 3%. Histologická stavba neúplně spálených kostí je téměř identická s nativní kostí, takže jejich histologické vyšetření má stejnou hodnotu jako vyšetření čerstvé kosti (Herrmann, 1977a). K největším změnám ve struktuře kosti dochází při teplotě spalování 700 až 800 C, což je tzv. kritická teplota (Herrmann, 1977a). Apatitové krystaly ztrácejí vodu, ale po opětném zchlazení rekrystalizují a znovu získávají apatitový tvar. Výstup uhlíku ve formě CO2 je při teplotě kolem 800 C ukončen, kost získává křídovitou podobu (Obr. 48, 49). Nad 800 C je kremace úplná, organická hmota je zcela spálena, krystaly kostních minerálů se taví a rekrystalizují (Herrmann, 1977a). Tavením minerálních krystalů dochází ke smršťování kosti. Dokonale spálené kosti mají bílou barvu, protože uhlík z organických vazeb je již úplně odstraněn. V kostním minerálu nastávají chemické reakce pevných částic, vznikají difosfáty a odpařuje se voda. Difosfát se slučuje s hydroxyapatitem na β-trikalciumfosfát. Ten představuje vysokoteplotní modifikaci apatitu a je charakteristickou součástí spálené kosti. Je méně rozpustný ve vodě, takže jsou spálené kosti odolnější vůči diagenezi než čerstvé kosti. Díky rekrystalizaci a reakci pevných částic kalciumfosfátů se opětně zvyšuje mechanická pevnost kosti. Reakce pevných částic probíhající v kostech jsou zcela srovnatelné s procesem vypalování keramiky. Od 800 do 1400 C se objevují nové krystaly a při 1000 C začíná fúze krystalů. Změny ve složení minerální fáze mají za následek změny kostní struktury. Lamelární struktura se mění na homogenní texturu a ztrácí se díky rychlému růstu krystalů (Obr. 50, 51). Haversovy kanálky a lakuny osteocytů si udržují svou integritu až do 1400 C. Při 1600 C je kostní minerál roztaven a při chladnutí opět rekrystalizuje, takže všechny strukturální tvary jsou úplně zničeny. V kostním popelu se nachází asi 85% kalciumfosfátu (zejména hydroxyapatitu) a 10% kalciumkarbonátu, zbytek tvoří jiné soli magnesiumfosfát, kalciumfluorid, stopy solí Na a K (Borovanský et al., 1976). 71

72 Bod tavení kosti je 1630 až 1645 C. Mírně pod touto teplotou leží vlastní sintrovací teplota kosti. Přítomnost tavidel, např. dřevěného popela, může snižovat teplotu tání a sintrování až o několik set stupňů Celsia (Schutkowski, 1991; Dokládal, 1999a). Obr. 45. Kost spálená při 600 C. Zvětšení 400. Muž, 62 let. Obr. 46. Osteony v kosti spálené při 700 C. Zvětšení 400. Muž, 67 let. 72

73 Obr. 47. Osteon a vnitřní obvodové lamely v kosti spálené při 700 C. Zvětšení 400. Muž, 67 let. Obr. 48. Osteony a fragmenty osteonů v kompaktní kosti spálené při 800 C. Zvětšení 400. Muž, 42 let. 73

74 Obr. 49. Osteony, fragmenty osteonů, vnitřní obvodové lamely a část resorpční dutiny (bílá skvrna vpravo dole) v kompaktní kosti spálené při 800 C. Zvětšení 400. Muž, 75 let. Obr. 50. Kompaktní kost spálená při 1000 C, identifikovatelné jsou především intaktní osteony. Zvětšení 400. Muž, 67 let. 74

75 Obr. 51. Vnitřní obvodové lamely a osteony v kosti spálené při 1000 C. Zvětšení 400. Muž, 65 let SMRŠTĚNÍ SPÁLENÝCH KOSTÍ Kostní tkáň se při spalování smršťuje, příčinou je především tavení kostního minerálu a splynutí krystalů (Herrmann, 1976). Smrštěním se zabývalo mnoho prací, protože tento jev významně komplikuje analýzu spálených kostí (van Vark, 1970; Herrmann, 1976, 1977a, 1977b; Swegle, 1979; Bradtmiller a Buikstra, 1984; Shipman et al., 1984; Hummel a Schutkowski, 1986; Schutkowski, 1991; Nelson, 1992; Cattaneo et al., 1999; Thompson, 2005; Ubelaker, 2009). Vyšší obsah minerálních látek v kosti způsobuje výraznější smrštění a kvůli nestejnoměrnému rozložení minerálu dochází k disproporcionálnímu smrštění, vzniku puklin, zkroucení a fragmentaci spálených kostí (Herrmann, 1976, 1977a, 1976b; Schutkowski, 1991; Dokládal, 1999a). Smrštění kosti je při teplotách pod kritickou teplotou ovlivněno také mineralizací kolagenních fibril, protože minerál kolagenní fibrily stabilizuje proti smrštění a tepelné denaturaci. Jednotlivé mineralizované kolagenní fibrily jsou v kosti patrné až do 600 C (Holden et al., 1995b). Biologický věk kostní tkáně rovněž ovlivňuje stupeň smrštění. Je to způsobeno větším příčným propojením kolagenních řetězců s věkem, které poskytuje kosti odolnost vůči pohybu. Míra smrštění kostí závisí i na dalších faktorech. Jsou to teplota a 75

76 délka spalování, druh topiva a podmínky hoření, přítomnost a tloušťka měkkých tkání, věk a pohlaví zemřelého (u starších žen je smrštění větší), distribuce kompakty a spongiózy v kosti, robusticita kosti (čím silnější je kompaktní kost, tím méně se smršťuje), část kosti (největší smrštění vykazují epifýzy, menší metafýzy a nejmenší středy diafýz), velikost kostního fragmentu apod. (Herrmann, 1976, 1977a; Golubovich, 1990; Ubelaker, 2009). Při teplotách ležících pod kritickou teplotou dosahuje smrštění 1 až 3%, zatímco při teplotě spalování nad 600 C kolísá mezi 2 a 12% (Herrmann, 1976, 1977a; Dokládal, 1999a). Většina rozměrů dlouhých kostí se zmenšuje o 6 až 13%, avšak kompaktní kost se může smrštit až o 25% (Herrmann, 1976; Bradtmiller a Buikstra, 1984; Dokládal, 1999a). Kosti novorozenců a dětí do sedmi let se smršťují průměrně o 10%, u dospělých je smrštění průměrně 10 až 13% (Herrmann, 1976; Bradtmiller a Buikstra, 1984; Harsányi, 1993). Změny tvaru a velikosti jsou průkazné u délkových, šířkových i obvodových rozměrů kostí. Míra smrštění kosti v délkovém směru je závislá na délce kostního fragmentu (Tab. 5). Čím je fragment kosti kratší, tím více se smršťuje. Délkové smrštění femuru je při 1000 C u dlouhých kusů 5% a u malých zlomků 15 až 20%. Příčné smrštění je ovlivněno teplotou spalování a tloušťkou kompakty (Tab. 5). Kosti s tenčí kompaktou se smršťují o 29%, zatímco ty se silnější stěnou jen o 24%. Čím je vyšší teplota spalování, tím je příčné smrštění větší. Intenzita změn je u jednotlivých kostí různá, může však přesáhnout i 20% až 30% (Hummel a Schutkowski, 1986; Golubovich, 1990; Schutkowski, 1991; Harsányi, 1993). Smrštění se týká i velikosti jednotlivých mikrostruktur, např. osteonu (Herrmann, 1977a). Smrštění rozměrů jednotlivých částí příčného řezu kompaktou a jejich vzájemných vzdáleností je prakticky konstantní (Hummel a Schutkowski, 1986; Dalitz a Hunger, 1990; Schutkowski, 1991). Smrštění těsně pod periostem se neliší od smrštění v sousedství dřeňové dutiny. Typ strukturních elementů neovlivňuje míru smrštění, tj. smrštění na příčném řezu kostí je lineární a jeho velikost je stejná u řezu jako celku i u jeho jednotlivých částí (Hummel a Schutkowski, 1993). Relativní uspořádání strukturních elementů, jejich relativní velikostní poměry a relativní podíly na příčném řezu zůstávají i po spálení zachovány (Hummel a Schutkowski, 1986; Schutkowski, 1991) ZMĚNY MECHANICKÉ PEVNOSTI Se vzrůstající teplotou spalování ubývá mechanické pevnosti kosti, která nabývá minima při 400 C až 500 C (Herrmann, 1976; Dokládal, 1999a). Příčinou jsou změny ve složení kostního minerálu. Takové kosti jsou zkřídovatělé, lehké, mají bílou barvu někdy 76

77 s nádechem do modra a jsou jen velmi málo odolné proti mechanickému poškození. Od 500 C pevnost spálené kosti opět roste a při teplotě 800 C dosahuje více než dvojnásobku výchozí hodnoty (Herrmann, 1976; Dokládal, 1999a). Toto zpevnění souvisí s procesem sintrování kostního minerálu, které nastává při teplotách nad 700 až 800 C a při němž dochází k tavení minerálních krystalů. Stav zachování kostí bezprostředně po spálení je poměrně špatný. Pokud jsou kosti ještě horké, mají vysoký stupeň lomivosti a rozpadají se při manipulaci na drobnější části. Po vychladnutí se pevnost kosti vlivem vzdušné vlhkosti opět zvyšuje. Při delším pobytu v zemi vzrůstá pevnost spálených kostí vlivem různých chemických sloučenin obsažených v půdě (Dokládal, 1999a) ZMĚNY MIKROSKOPICKÉ STRUKTURY KOSTI Během spalování se mikrostruktura kosti výrazně mění, především při úplném spálení nad 700 až 800 C. Neúplně spálené kosti mají histologickou strukturu obdobnou nespáleným kostem, jsou jen o 1 až 3% smrštěny (Herrmann, 1977a). U spálených kostí se rozlišení jednotlivých struktur kompakty stává oproti nativní kosti obtížnějším. Různí autoři uvádějí, že jednotlivé struktury jsou viditelné do teploty spalování 700 až 900 C (Golubovich, 1975; Golubovich a Talanov, 1990; Heussner, 1987, 1990a; Harsányi, 1993; Stloukal et al., 1999). Podle jiných autorů bývá i při teplotách nad 700 C mikrostrukturní vzhled kosti zachován a v histologických řezech lze rozeznat různé typy strukturních elementů, při teplotě 1000 C je však rozlišení struktur již obtížné (Hummel a Schutkowski, 1993). Podle novějších prací lze provést histologickou analýzu dokonce i u kostí spálených při 800 až 1200 C (Ubelaker, 2009). Vliv na rozpoznatelnost mikrostruktur ve spálené kosti má zřejmě také typ kosti (silná vs. slabá kompakta, robusticita atd.) a použitá technika zpracování (výroba preparátu, použitý mikroskop apod.). Lamely jsou ve spálených kostech často nerozpoznatelné, včetně jednotlivých lamel osteonu. Při teplotě nad 700 až 800 C je lamelární struktura kosti nahrazena homogenní skladbou, vzniklou tavením kostního minerálu (Herrmann, 1976, 1977a). Přechodná fáze mezi lamelární strukturou a homogenní skladbou se vyznačuje velmi malou mechanickou pevností (tzv. křídovitá struktura). Obvodové lamely se spalováním výrazně destruují a jejich hodnocení je proto značně nepřesné (Loubová, 1999). Při spalování se mění průměr osteonu i Haversova kanálku (Tab. 6). Průměr osteonu se při teplotě 700 až 800 C zmenšuje o 15 až 17%, při 1200 C se smrští ještě o dalších 0,9% 77

78 (Golubovich a Talanov, 1990; Nelson, 1992; Loubová, 1999, Squires et al., 2011). Jedna práce uvádí zvětšení všech rozměrů osteonů při 600 C (Bradtmiller a Buikstra, 1984). Rozměry Haversových kanálků vykazují při působení vysoké teploty velkou variabilitu. Jejich průměr se může zmenšit až o 26% (Golubovich a Talanov, 1990), podle jiné studie se zvětšuje o 10,5% (Nelson, 1992). Kolísání velikosti Haversových kanálků je zřejmě způsobeno současným vypalováním samotného kanálku a smršťováním celého osteonu (Loubová, 1999). Smrštění kompakty způsobuje, že se do pozorovaného mikroskopického pole dostává větší počet struktur než u čerstvé kosti (Holden et al., 1995b). Počty struktur se při teplotě 700 C zvyšují o 5%, při vyšších teplotách o 16 až 20% (Loubová, 1999; Tab. 6). Zvýšené počty struktur v pozorovaném poli mají při použití rovnic vyvinutých pro nespálené kosti za následek nadhodnocení odhadu věku (Bruchhaus, 1990). Dalším problémem při odhadu věku u spálených kostí je fakt, že změny způsobené žárem se často překrývají s věkovými změnami v kosti (Tab. 7). 78

79 Tab. 4. Změny kostní tkáně v závislosti na teplotě spalování (Podle Harsányi, 1993; Dokládal, 1999a; Thompson, 2004; Hanson a Cain, 2007; Ubelaker, 2009) Teplota Barva kosti 100 C Žlutá, 200 C hnědošedá Pevnost kosti Beze změn Chemické složení kosti Zkracování kolagenních fibril, výstup krystalické vody z minerální složky kosti, organická hmota přetrvává Oxidace uhlíku, ztráta obsahu vody Vzhled kosti Smrštění kosti Vzhled téměř jako nespálená Cca o 1% kost, první smrštění a fraktury, uhlík se akumuluje v lakunách, většina mikrostruktur nezměněna 300 C Hnědá Ubývá Zuhelnatění organické kostní substance, kost je 400 C Tmavě Přechodné nedokonale spálena, změny natažení hnědá, v porozitě kosti, lamely černá pevné zbarveny hnědočerně, substance z Haversových kanálků se šíří praskliny 500 C Šedá, Začíná vzrůst velikosti Vnitřní plocha kompakty 0% mléčně krystalů, většina uhlíku v některých případech ještě světlošedá, je oxidována černá, na řezu je světlá šedomodrá s mnoha prasklinami 600 C Mléčně Pokračuje oxidace Křídovitý povrch, kost málo 0% bílá, matně uhlíku a výstup CO2, mechanicky odolná, na řezu křídovitá začíná rekrystalizace je mnoho prasklin, minerálu mikrostruktury dosud viditelné 700 C Od tmavě Křídovitá Krystaly apatitu Hladký povrch, kost je tvrdá Od 750 C šedé až po struktura ztrácejí vodu, zvětšují a křehká, vznik smršťování sytě bílou se parabolických puklin pokračuje 800 C Přibývá Je ukončen výstup Maximální smrštění, vlivem 10-30% CO2, organická hmota změn krystalů se je spálena, vznik mikrostruktury postupně nových krystalů ztrácejí 900 C Sytě bílá, Chemické reakce pevných částic, vzniká 1000 C bílá i na lomu trikalciumfosfát, fúze krystalů, rekrystalizace minerálu, sintrování 1600 C Tavení kostního minerálu, po vychladnutí rekrystalizace Stupeň spálení I Nedokonalý II Zčásti nedokonalý III Dokonalý IV Dokonalý až křídovitý V Křídovitý Tab. 5. Smrštění kompaktní kosti ze středu diafýzy femuru v závislosti na teplotě spalování a délce fragmentu (Podle Bruchhaus, 1990) Teplota Délka Počet (N) fragmentu Délkové Příčné Ztráta smrštění smrštění hmotnosti 100 C 10 mm 12 1,3% 4,2% 4,3% 1000 C 10 mm 12 18,4% 28,3% 40,7% 1000 C 100 mm 12 10,6% 27,5% 40,9% 79

80 Tab. 6. Změny velikosti a počtu mikrostruktur kompakty lidského žebra vlivem žáru (Podle Loubová, 1999) Změny velikosti a počtu mikrostruktur kompaktní kosti lidského žebra vlivem žáru (- = zmenšení, + = zvětšení) Velikost osteonu Počet osteonů na mm² Počet fragmentů osteonů na mm² 700 C -4,37% 800 C -16,19% 1200 C -17,05% 700 C +4,17% 800 C +14,94% 1200 C +15,90% 700 C +5,14% 800 C +18,99% 1200 C +19,86% Celkový počet osteonů a fragmentů na mm² 700 C Velikost Haversových kanálků +4,50% 800 C +16,34% 1200 C +17,21% 700 C -1,17% 800 C -3,23% 1200 C -3,18% Tab. 7. Změny mikrostruktur kompaktní kosti lidského žebra způsobené rostoucím věkem a spalováním (Podle Loubová, 1999) Parametr kompaktní kosti Změna s věkem Změna při spalování Průměr osteonu Klesá Klesá Průměr Haversova kanálku Variabilní Variabilní Počet osteonů / mm² Roste Roste Počet fragmentů osteonů / mm² Roste Roste Celkový počet osteonů a fragmentů / mm² Roste Roste Počet non-haversových kanálků / mm² Klesá Destrukce Procento obvodových lamel Klesá Destrukce 80

81 5.4. TEPLOTY DOSAHOVANÉ PŘI POŽÁRU, PŘI PRAVĚKÝCH KREMACÍCH A V MODERNÍM KREMATORIU Mrtvá těla jsou úplně zpopelněna při poměrně nízkých teplotách (Harsányi, 1993). Těla novorozenců a dětí do sedmi let jsou úplně spálena při 500 C a množství popela je velmi nízké. I při spalování neživotaschopných fétů je možné za určitých podmínek (cca 700 C, doba kremace 40 až 60 minut) získat jisté množství kosterních pozůstatků (Dunlop, 2004). Kremace orgánů a částí těla bez kosterní struktury obyčejně neposkytuje hmatatelné kremační pozůstatky. Teplota nutná pro dokonalé spálení kostí, tj. nad 700 až 800 C, může nastat již při domovním požáru (Holden et al., 1995b). Účinek ohně na měkké tkáně lidského těla vypadá podobně jako mechanická zranění (Holden et al., 1995b). Hloubka spálení měkkých tkání a stupeň destrukce a fragmentace kostí jsou závislé na teplotě spalování, době trvání žáru a na zasažené oblasti těla (Quatrehomme et al., 1998). U dospělého člověka nastává při 680 C skeletonizace tváře a paží po patnácti minutách, žeber a lebky po dvaceti minutách, stehenní a holenní kosti po třiceti pěti minutách (Holden et al., 1995b). Množství tuku obsaženého v těle má vliv na hořlavost a rychlost destrukce svaloviny a měkkých tkání (Holden et al., 1995b). Kosti různých osob a jednotlivé kosti téhož individua obvykle vykazují rozdílný stupeň spálení, závislý na mnoha faktorech. Je to výška teploty a délka trvání žáru, průběh kremace, oblečení (je / není přítomno a jaké oblečení), umístění těla na žárovišti (v centru / na periferii), dosažená teplota uvnitř kosti, různé vystavení kosti žáru (umístění kosti při povrchu / uvnitř těla), robusticita a anatomická stavba kostí a patologické změny na kostech (Dokládal, 1999a). Zachovalost tělesných pozůstatků po spálení ukazuje také na průběh hoření (Quatrehomme et al., 1998). Nekompletnost kosterních částí, jejich fragmentární povaha a variabilita stupně spálení jsou typické pro malý oheň relativně krátkého trvání. Takový oheň může být použit pachatelem pro zahlazení stop zločinu. Naopak velké domovní požáry redukují tělo na malé kalcinované fragmenty. Příčinou fragmentace kostí může být také náraz, např. od padajících trosek nebo exploze, v případě prehistorických kremací je to např. úmyslné rozdrcení spálených kostí před uložením do urny (Holden et al., 1995b) TEPLOTA POŽÁRU Teplota požáru je závislá na mnoha ukazatelích, neustále se mění v prostoru i čase a její stanovení je proto značně složité. Jako teplota požáru se označuje střední hodnota teploty 81

82 plamene, případně střední hodnota teploty zplodin hoření ve směsi se vzduchem. Mezi faktory ovlivňující teplotu požáru patří teplota plamene hořících materiálů, teplota směsi zplodin hoření se vzduchem, množství a vlastnosti hořlavých látek v prostoru, výměna plynů (přívod vzduchu a odvod zplodin), výška místnosti a velikost zasažené plochy. Teplota požáru je v místě vzniku požáru vysoká a zvyšuje se od podlahy směrem vzhůru (Ptáček, 1999; Aulický, 2006). Celý proces hoření závisí hlavně na druhu hořlavého materiálu a jeho vlastnostech. S určitou přesností lze teplotu požáru určit jen při hoření čistých látek za určitých podmínek. Například podle barvy horkých ocelových konstrukcí lze s přesností na stovky stupňů Celsia odhadnout teplotu prostředí, ve kterém se tato konstrukce nachází. Podle známé teploty plamene jednotlivých hořících materiálů je možné orientačně odhadnout také teplotu samotného požáru (Ptáček, 1999; Aulický, 2006; Tab. 8). Některé nehořlavé látky se vlivem vysoké teploty taví. Teploty tavení bývají známé fyzikální konstanty, takže podle nich lze určit teploty dosažené při požáru. Nejpřesněji lze stanovit teplotu požáru měřením teplot konstrukcí a pevných materiálů, které se nacházejí v prostoru hoření. K měření lze použít termovize, speciální dálkové teploměry nebo radiační teploměry (Ptáček, 1999; Aulický, 2006). U současných domovních požárů tak byly zaznamenány teploty i nad 1000 C (Holden et al., 1995b). Tab. 8. Teplota plamene hořících materiálů (Podle Ptáček, 1999; Aulický, 2006) Hořící materiál Teplota plamene Rašelina, mazut 1000 C Dřevo, hnědé uhlí, ropa, petrolej, motorová nafta C Černé uhlí, kaučuk a jeho výrobky, benzín C Antracit, síra C Hořlavé plyny C Hořčík, elektron 2000 C Holden (Holden et al., 1995a) analyzoval zpopelněné pozůstatky oběti požáru osobního automobilu, kde byly kostní fragmenty vystaveny žáru neznámé teploty a průběhu. Fragmenty vykazovaly značné rozpětí barev doprovázené změnami struktury kostní tkáně. Malé fragmenty byly světle šedé až bílé, zatímco větší kusy byly černé, šedé a bílé. Barva vnějších oblastí kompakty byla bílá a směrem k dřeňové dutině se měnila v šedou a posléze černou. V dřeňové dutině se nenacházela žádná měkká tkáň. Vnější povrch kompaktní kosti vykazoval fraktury a malý stupeň zkroucení. Fraktury dosahovaly z povrchu kompakty až do 82

83 její střední části. Barva kostí a morfologie krystalů v jednotlivých barevných oblastech kosti svědčily o postupném poklesu teploty dosažené v kosti jako funkci radiální vzdálenosti od vnějšího povrchu kompakty. Maximální teplota v rozmezí 1000 až 1200 C byla dosažena ve vnějších bílých oblastech kompakty. Oblasti šedé barvy dosáhly teploty 600 C. Minimální teplota 300 C se vyskytovala ve vnitřních oblastech kompakty, které byly černé. Časová perioda, za kterou oheň dosáhl maximální teploty, byla příliš krátká na to, aby kostní tkáň dosáhla rovnováhy s okolním prostředím, protože požár byl způsoben náhlým vznícením. Nicméně minimální zaznamenaná teplota se udržela po delší dobu, protože organický obsah Haversových kanálků a dřeňové dutiny byl úplně spálen. Je důležité si uvědomit, že podmínky spalování v laboratoři a při požáru se od sebe velmi liší (Holden et al., 1995a). Např. atmosféra v laboratorní peci neobsahuje žádné znečištění, rychlost nárůstu teploty a zchlazení je kontrolována, a jakmile je předem stanovená maximální teplota dosažena, je udržována po určitou časovou periodu. Naopak při požáru vystupují neznámé proměnné, které mohou ovlivnit účinky tepla na kostní tkáň. Jsou to chemické podmínky včetně plynů z paliva a okolních hořících hmot přítomných v atmosféře a fyzikální podmínky jako je účinek oblečení a měkkých tkání, tlak vzduchu v omezeném prostoru, účinek náhlého vznícení a hoření, kolísání teploty plamene a změny rychlosti dosažení konečné teploty a rychlosti chladnutí. Rozdíly fyzikálních a chemických podmínek spalování v laboratoři a při požáru by tedy měly limitovat množství informací dostupných pro analýzu spálených kosterních pozůstatků. Při experimentálním spalování kostí však nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v tepelně podmíněných změnách struktury mezi vzorky spálenými v laboratoři a při požáru (Holden et al., 1995a; Hanson a Cain, 2007) PREHISTORICKÉ KREMACE Histologické zachování kostí z prehistorických kremací značně kolísá (Hummel a Schutkowski, 1993). Stav jejich zachování závisí na stupni spálení, na průběhu kremace a na fyzikálních podmínkách uložení kostí v zemi. Mezi jevy související s pohřebním ritem patří např. hašení spáleniště, ztráta kostí při jejich vybírání ze žároviště, drcení spálených pozůstatků, polévání studenou vodou apod. (Trňáčková, 1980; Heussner, 1987; Schutkowski, 1991; Měřínský, 2002). Fyzikální faktory při uložení v zemi spolu s tlakem zeminy či mrazem přispívají k další fragmentaci spálených kostí, většinou však dochází při uložení v zemi též k jejich zpevnění (Schutkowski, 1991). 83

84 Barva kostí z prehistorických žárových hrobů je různá. Vyskytují se dokonale i nedokonale spálené kosti barvy bílé až žlutobílé, žlutohnědé, šedobílé až začernalé či šedé s nádechem do hněda (Stloukal, 1959, 1967; Lorencová, 1961; Pavelčík, 1966, 1972). To značí, že prehistorické kremace měly velkou šíři použitých teplot. Pokud je rozlišení mikrostruktur snadné, byly tyto kosti obvykle neúplně spáleny a vykazují tmavé stopy zbytkového uhlíku. Až na několik výjimek jsou však neúplně spálené kosti v prehistorických kremacích ze střední Evropy vzácné, a proto musí být histologická vyšetření provedena na úplně spálených fragmentech (Herrmann, 1977a). Bohatou škálu barev mají také kosti spalované s měkkými tkáněmi, což je situace odpovídající pravěkým kremacím. Barva může být ovlivněna také chemickými látkami obsaženými v půdě (Walker et al., 2008) a různými spalovanými materiály; např. měď způsobuje růžové, železo zelené a zinek žluté zabarvení spálených kostí (Ubelaker, 2009). Prehistorické kremace mohly mít teplotu až 1000 C, obvykle však dosahovaly pouze 500 až 900 C (Heussner, 1987, 1990a; Harsányi, 1993; Holden et al., 1995b; Dokládal, 1999a). Na lokalitě Kostelec na Hané Lapačky byla pro kosti z mohylového hrobu lužické kultury určena teplota spalování do 500 C (Fojtík a Hložek, 2002). Na slovanské lokalitě Mikulčice Žabník se předpokládá teplota spalování 500 až 700 C (Dokládal, 1999b). Na anglickém nalezišti z časného Anglo-saského období v Elshamu v Lincolnshire, UK byla zjištěna teplota pohřební hranice v rozmezí 600 až 900 C (Squires et al., 2011). Při výzkumu archeologického naleziště Chan Chan v Peru byl nalezen fragment spálené lebky, u kterého byla určena teplota spalování okolo 520 C (Ubelaker, 2009). Při zpracování spálených kostí z prehistorických kremací jsou někdy nalezeny zbytky roztavených kostí (Schutkowski, 1991). Jde o sférické konkrece o velikosti hrášku až lískového ořechu, které mohou vznikat při spalování z reakce kostního minerálu. Podle experimentálního spalování tyto konkrece vznikají při 1000 až 1100 C. Nálezy přepálených kovových předmětů v žárových hrobech mohou také pomoci při odhadu teploty podle bodu tání těchto kovů. Např. neúplně roztavené bronzové přídavky hovoří o maximální teplotě 900 C (Heussner, 1990b). Holck při výzkumu prehistorických kremací zjistil, že ženské pozůstatky mají v porovnání s mužskými vyšší stupeň spálení a považuje to za následek většího rozptýlení tuku v ženském těle (Holck, 1986; Holden et al., 1995b). O teplotě a průběhu prehistorických kremací je možno získat určité informace také experimentálním spalováním. Bylo např. zjištěno, že pro úplné spálení těla dospělého člověka je při topení dřevem potřeba 4 až 16 hodin, při spalování na dřevě v peci je to 4 hodiny a 20 minut. Takto spálené kosti jsou fragmentovány na drobné kousky šedobílé barvy (Golubovich 84

85 a Talanov, 1990). Byl také proveden experiment, při kterém bylo na hranici postavené ze suchého borového a dubového dřeva při silném větru dosaženo maximálně 980 C, teplota plamene v horní části hranice dosahovala 800 až 850 C a vzhled kostí spálených při tomto pokusu odpovídal silně spáleným prehistorickým kremacím (Heussner, 1990b). Obyčejný táborový oheň dosahuje teplot mezi 400 a 900 C (Hanson a Cain, 2007). Oheň velikosti táboráku z eukalyptového dřeva dosáhne teploty 840 C za 1 hodinu a 5 minut a kosti v něm spálené mají bílou barvu s šedým a černým nádechem. Kosti vyjmuté z tohoto ohně po 25 minutách vykazovaly barvu černou, hnědou, šedou a modrobílou (Ubelaker, 2009). Oheň o průměru 60 cm z tvrdého dřeva dosáhne po 10 minutách teploty 367 C a maximální teploty 705 C je dosaženo po 20 minutách (Hanson a Cain, 2007). Při experimentálním spalování kostí na dřevěném chrastí nebylo dosaženo úplného spálení, kosti měly hnědou a černou barvu (Ubelaker, 2009). Výzkumy spalování kostí na venkovním ohni a v peci ukázaly, že oba typy spalování poskytují podobné změny kostní mikrostruktury (Hanson a Cain, 2007) MODERNÍ KREMATORIUM Většina moderních kremačních pecí jsou pece plynové, dříve se používaly i pece koksové, naftové či elektrické. Teplota v moderním kremačním zařízení se pohybuje od 800 do 1000 C, závisí na velikosti těla zemřelého a také na pořadí kremace během dne. Ráno se teplota pohybuje spíše kolem 800 C, odpoledne je již vyzdívka pece rozpálená a teplota rychleji stoupne k 900 až 1000 C. Na zařízeních staršího typu, na kterých nebyl proces hoření řízen počítačem, mohla teplota stoupnout až na 1300 C. Proces kremace záleží na velikosti těla, množství tuku nerozhoduje. Tuk sice dobře hoří, ale při kremaci je důležité především množství vody v těle, která se nejprve musí odpařit, aby tělo náležitě shořelo. Při teplotě 800 C je mrtvé tělo zpopelněno i s rakví asi za hodinu (Mlčoch, 2006). V roce 1997 bylo vybudováno moderní kremační zařízení v Hustopečích na Břeclavsku. Spalování v tomto krematoriu trvá asi 60 minut a teplota dosahuje kolem 1000 C (Mlčoch, 2006). Ve Velké Británii (Dunlop, 2004) je rakev při kremaci umístěna do předehřáté pece o teplotě cca 750 C. Této teploty může být i v plynových pecích dosaženo pomocí elektrického proudu. Vzduch je zaváděn do pece pod tlakem, aby pomohl hoření, které začíná spontánně, jakmile je rakev umístěna do pece. Většina rakve shoří obvykle během 10 až 15 minut, potom hoří tělesné tkáně a teplota v peci vystoupí na 1000 C nebo více. Celá kremace trvá 85

86 v průměru 90 minut. Na konci kremačního procesu zůstanou obvykle dva až čtyři kilogramy kalcinovaných pozůstatků. V německém krematoriu Schwerin se v 80. letech 20. století používala teplota 700 až 900 C, která dle sdělení tamního personálu plně stačila k úplnému zpopelnění mrtvého (Heussner, 1990). V USA se teplota v krematoriích pohybuje mezi 500 a 1000 C, s výkyvy až k 1278 C (Ubelaker, 2009). Nemocniční spalovny používají teploty nad 850 C (Mlčoch, 2006) VYBRANÉ HISTOLOGICKÉ METODY ODHADU DOŽITÉHO VĚKU Z KOMPAKTNÍ KOSTNÍ TKÁNĚ Histologické metody odhadu dožitého věku jsou založeny na věkových změnách mikroskopické struktury kosti. Histomorfometrie neboli kvantitativní histologie sestává obvykle z počítání nebo měření tkáňových komponent buněk, osteonů, lamel, kanálků apod. Kvantitativní histologii je možné využít k odhadu dožitého věku jedince díky tomu, že kostní tkáň je během života neustále remodelována. Určitý problém zde představuje vysoká variabilita jednotlivých struktur v lidské kosti (Fiala, 1978). Současné metody histologického odhadu věku mají svůj původ v několika zprávách popisujících věkové změny v histomorfologii kompaktní kosti. Jako první si všimli věkových změn v kompaktní kosti již v roce 1911 Balthazard a Lebrun (Eidlin, 1974; Fiala, 1978; Stloukal et al., 1999), kteří zaznamenali zvětšování velikosti Haversových kanálků s věkem. Heuler (Heuler, 1928) popsal korelaci mezi dožitým věkem a histologickou strukturou kosti. Bader a Canuto (Eidlin, 1974) v roce 1930 upozornili na vysokou variabilitu ve velikosti Haversových kanálků v tibii a píší, že tuto metodu nelze doporučit pro využití v soudní medicíně. Amprino a Bairati (Amprino a Bairati, 1936) popsali věkové změny v mikrostruktuře kompaktní kosti femuru a všimli si, že přestavba kosti probíhá během života s různou intenzitou a s individuálními odchylkami. Nálezy Balthazarda a Lebruna kritizovali Deslypere a Baert, kteří nenašli závislost velikosti Haversových kanálků na věku (Fiala, 1978). Jowseyová (Jowsey, 1960) publikovala analýzu změn normální kompakty femuru s věkem. Přitom zjistila, že neexistují výrazné odlišnosti mezi zkoumanými mikroskopickými poli a zbytkem příčného řezu. Currey (Currey, 1964) zaznamenal na femuru vzestup počtu intaktních a fragmentárních osteonů na mm² a zjistil, že s rostoucím věkem se průměr osteonů snižuje a průměr Haversova kanálku kolísá. Autor však z hodnocení vyloučil veškeré tvarově nepravidelné osteony. Jeho způsob měření byl kritizován Jowseyovou (Fiala, 1978), která 86

87 měřila velikost osteonů na femuru a žebrech jako průměr dvou na sebe kolmých rozměrů. Autorka zjistila, že velikost osteonů se v kompaktě femuru s věkem příliš nemění, ale u žeber se osteony mírně zmenšují. Dominok (Dominok, 1968) vysvětlil věkové změny osteonálních struktur, stanovil je však bez matematických souvislostí. Od té doby bylo vypracováno množství histologických metod odhadu věku, které se vzájemně liší použitím různých kostí, umístěním, tvarem a počtem mikroskopických polí a sledováním různých histologických struktur v kompaktní kosti. Výstupem převážné většiny metod jsou regresní rovnice pro odhad dožitého věku jedince. Pokus o sjednocení postupů a metodik odhadu dožitého věku pro forenzní účely předložil Cunha a kolektiv (Cunha et al., 2009) METODY VYUŽÍVAJÍCÍ DLOUHÉ KOSTI První histologickou metodu odhadu věku z kompaktní kosti vypracoval Kerley (Kerley, 1965). Jako studijní materiál (N = 126; 88 mužů, 29 žen, 9 neznámých; věk 0-95 let) použil příčné řezy ze středu diafýzy femuru (N = 67), tibie (N = 33) a fibuly (N = 25). Pro odhad věku byl použit počet osteonů, fragmentů a non-haversových kanálků a procento obvodové lamelární kosti. Obvodová lamelární kost je neremodelovaná primární lamelární kost, která byla formována během růstu kosti a je hlavní strukturou v dětství. Osteony a fragmenty patří k remodelované kosti a jejich počet s věkem roste. Kompletní osteon má více než 80% své plochy rozpoznatelné a má intaktní kanálek. Fragmenty jsou osteony odbourané následnými generacemi osteonů a vypadají jako oblouky koncentrických lamel mezi novějšími osteony. Proměnné byly kvantifikovány při stonásobném zvětšení ve čtyřech kruhových mikroskopických polích, která se nacházejí v anteriorní, posteriorní (na femuru v oblasti linea aspera), mediální a laterální části řezu ve vnější třetině kompakty (dotýkají se periostu). Použití čtyř mikroskopických polí má minimalizovat pravděpodobnost, že bude věk odhadován z atypického pole. Počty osteonů, fragmentů a non-haversových kanálků jsou vyjádřeny v součtu ze čtyř polí a procento obvodových lamel se uvádí v průměru na jedno pole. Počty struktur se dosazují do regresních rovnic nebo do profilového diagramu pro odhad dožitého věku. Při testování metody na padesáti šesti vzorcích (věk 0-82 let) se podařilo určit věk u 87,3% případů s přesností ± 5 let a u všech vzorků s přesností ± 10 let. Při využití dvou a více kostí jednoho individua byl odhad věku vždy v rozmezí ± 5 let. Přesnost odhadu věku byla větší u jedinců do třiceti let. Nejlepší korelace s věkem byla nalezena u počtu fragmentů osteonů na fibule. Pohlavní ani rasové rozdíly v remodelaci nebyly zjištěny. 87

88 Způsob definice intaktního osteonu a dalších ukazatelů v Kerleyho metodě byl několikrát kritizován (Lazenby, ; Cunha et al., 2009). Při aplikaci metod odhadu věku musí proměnné souhlasit s těmi, které byly použity při vývoji metody. U Kerleyho má mít intaktní osteon osmdesát a více procent své plochy kompletní. Takové hodnocení je však naprosto subjektivní a způsobuje chybu, která se bude lišit od badatele k badateli a také se stupněm zkušenosti. Metoda Kerleyho se po nějaké době dočkala revize, kterou provedli Kerley a Ubelaker (Kerley a Ubelaker, 1978) zejména kvůli velikosti použitého mikroskopického pole. Kerley ve své původní práci (Kerley, 1965) uvádí, že použil pole o průměru 1,25 mm, avšak skutečná velikost pole byla cca 1,62 mm. Dále se ukázalo, že některé regresní rovnice vedou k nepřiměřeným odhadům věku. Kerleyho původní data byla proto reanalyzována na původních řezech a byly vytvořeny nové regresní rovnice. Kvůli variabilitě ve velikosti pole mezi různými mikroskopy je popsán výpočet korekčního faktoru, kterým lze provést úpravu dat z mikroskopického pole, lišícího se od velikosti pole použité Kerleym. Všechny počty osteonů, fragmentů nebo non-haversových kanálků by měly být tímto faktorem vynásobeny. Odhad procenta lamelární kosti není velikostí pole ovlivněn. Použití jednoho korekčního faktoru pro všechny proměnné bylo později kritizováno (Lazenby, ). Tento způsob totiž předpokládá, že osteony, fragmenty a nonhaversovy kanálky jsou napříč kompaktou distribuovány uniformně, a že poměry mezi nimi jsou stejné ve všech částech příčného řezu. Tak tomu však není, jak bylo různými badateli zjištěno (Frost, 1969; Stout a Gehlert, 1980, 1982). Protože struktury nejsou v kompaktě distribuovány uniformně, pole různé velikosti nejspíše nebudou produkovat sobě odpovídající data. Poměr osteonů k jiným strukturám není konstantní a jednotlivé regiony kosti nejsou strukturálně ani funkčně homogenní. Později bylo také zjištěno (Stout a Gehlert, 1982; Stout, 1989a), že velikost mikroskopického pole ovlivňuje výsledky Kerleyho metody odhadu věku i po aplikaci korekčního faktoru a použití mikroskopického pole odlišné velikosti od předepsané způsobuje chybu v odhadu. Příčinou je neuniformní distribuce struktur v kompaktní kosti, která způsobuje, že pouhá úprava počtu struktur korekčním faktorem je nedostatečná. Prostorová variabilita struktur je důvodem, proč velikost pole nejbližší té Kerleyho dává při použití Kerleyho rovnic preciznější odhad věku. Takové pole totiž pokrývá stejné prostorové uspořádání struktur jako u Kerleyho. Kdyby byly struktury v řezu rozloženy pravidelně, neměla by velikost pole žádný význam a stačila by úprava dat korekčním faktorem. Jelikož tomu tak není, je nutné používat velikost pole co nejbližší té, která byla 88

89 použita při vývoji příslušných regresních rovnic. Tím se zajistí, že je hodnocen stejný vzor a zastoupení struktur. Bylo zjištěno, že jak rozdíl mezi velikostí pozorovaného a doporučeného pole roste, stoupá i rozdíl mezi známým a odhadnutým věkem. Ahlqvist a Damsten vypracovali modifikaci Kerleyho metody (Ahlqvist a Damsten, 1968). Použili broušené řezy ze středu diafýzy femuru, pohlaví jedinců bylo ignorováno (N = 20; věk 4-89 let; průměrný věk 55,45 let). Autoři byli přesvědčeni, že odběr vzorků v místě úponů velkých svalů neodráží obvyklé poměry ve struktuře kosti. Aby se vyhnuli oblasti linea aspera na femuru, umístili mikroskopická pole doprostřed mezi pole Kerleyho. Použili čtyři pole čtvercového tvaru a struktury sledovali pomocí mřížky o jednom stu čtverců, velké 1 mm², čímž odstranili problém rozdílné velikosti mikroskopického pole. Místo počítání struktur zjišťovali procento remodelované kosti (osteony a fragmenty osteonů) na zkoumané ploše řezu a tím eliminovali problém s rozlišením a definicí kompletních a fragmentárních osteonů. Věk se určuje dosazením průměrného procenta remodelované kosti ze čtyř polí do dvou regresních rovnic. Sběr dat v metodě Ahlqvista a Damstena byl později kritizován (Lazenby ( ). V této metodě se měří procento remodelované kosti v mřížce velké 1 mm², avšak jinou velikost mřížky nelze použít. Při jakémkoli zvětšení by totiž osteon přispíval větší plochou k remodelované kosti v mřížce menší než 1 mm² a menší plochou, pokud by mřížka byla větší než 1 mm². Jiná velikost mřížky bude také pokrývat větší či menší výsek kosti. Výsledek bude stejný jako při použití jiné velikosti pole u Kerleyho metody. Rother, Krüger, Machlitt a Hunger (Rother et al., 1978) použili k odhadu věku regresní a faktorovou analýzu různých ukazatelů na humeru (N = 70; věk let). Na výbrusech sledovali počet Haversových a Volkmannových kanálků, hustotu osteocytů, nejmenší průměr deseti Haversových kanálků a deseti osteonů a objemové poměry vmezeřených lamel a osteonů v kompaktě. Tyto znaky podrobili faktorové analýze a následně provedli lineární regresní analýzu tří znaků: Nejmenšího průměru Haversova kanálku, nejmenšího průměru osteonu a velikosti dřeňové dutiny na příčném řezu kostí. S ohledem na fragmentární a erodované kosti vypracovali Samson a Branigan (Samson a Branigan, 1987) metodu určenou pro archeologické případy, kde diageneze zničila detaily mikroskopické struktury. Bylo zjištěno, že ačkoli zachování histologické struktury archeologických kostí značně kolísá, Haversovy kanálky jsou obvykle dobře zachovány. 89

90 Metoda používá femur, který se v archeologických nálezech často vyskytuje (N = 58; 31 mužů, 27 žen; věk let). Pro odhad věku použili tloušťku kompakty, minimální průměr Haversova kanálku a počet Haversových kanálků na mm² měřené ve dvou polích. Významná korelace s věkem byla zjištěna pouze u počtu Haversových kanálků na mm² u mužů, metoda selhala při odhadu věku u žen. Autoři také zjistili, že neexistují žádné rozdíly v rozměrech a počtu Haversových kanálků mezi řezy různé tloušťky. Bertelsen, Clement a Thomas (Bertelsen et al., 1995) provedli morfometrickou studii kompakty femuru (N = 195; věk 1-97 let) u jedinců známého věku, pohlaví, výšky postavy, hmotnosti a příčiny smrti. Na celé ploše řezu zjišťovali plochu řezu, dřeně a kompakty, tloušťku kompakty, periostální obvod, počet a plochu otvorů v kompaktě, průměrnou plochu otvoru, porozitu kompakty a hustotu osteonů. Výsledky ukázaly, že ačkoli se počet Haversových kanálků na celé ploše řezu mění s věkem, hodnoty jsou příliš variabilní a mají omezenou použitelnost pro odhad věku. Z toho autoři odvozují, že všechny metody, které využívají počet Haversových kanálků, jsou pravděpodobně nepřesné a nespolehlivé. Jejich postup je však diskutabilní z toho důvodu, že všechny otvory určité velikosti byly považovány za osteony, ačkoli je docela dobře možné, že mohlo jít i o resorpční prostory nebo nonhaversovy kanálky. Watanabe a kolektiv (Watanabe et al., 1998) vypracovali metodu odhadu dožitého věku pro japonskou populaci. Použili příčné řezy femurem (N = 98; 72 mužů, věk 0-92 let; 26 žen, věk 2-88 let). V řezech měřili plochu, maximální průměr, minimální průměr a obvod intaktního osteonu a Haversova kanálku, počet osteonů typu II, počet fragmentů osteonů atd. Parametry osteonů ukázaly vysoký korelační koeficient s věkem (r > 0,77), zatímco ukazatele Haversových kanálků měly korelaci nízkou (r < 0,11). Pro odhad dožitého věku použili mnohonásobnou regresní analýzu. Autoři poukazují na fakt, že bylo obtížné pokrýt precizním odhadem věku celé věkové rozmezí od narození do devadesáti let. Thomas a spolupracovníci (Thomas et al., 2000) zkoumali možnosti odhadu dožitého věku na femuru (N = 96; 50 mužů, 46 žen; věk let). Pomocí automatického sběru dat sledovali celkovou subperiostální plochu, periostální a endostální obvod, plochu kompaktní kosti a dřeňové dutiny, celkový počet otvorů, plochu jednotlivých otvorů a celkovou plochu otvorů. Ze získaných údajů byly vypočteny např. počet otvorů na mm², diverzita otvorů a kortikální porozita. Pro odhad věku byly vytvořeny různé regresní rovnice. 90

91 Bylo zjištěno, že u starších jedinců se vyskytuje větší porozita kosti a větší variabilita ve velikosti otvorů. Jako nejlepší pro odhad věku se ukázala celková subperiostální plocha, periostální a endostální obvod, velikost a diverzita otvorů. Počet otvorů na mm² ukázal značné individuální odchylky a nebyl pro odhad věku významný. Pravděpodobně to bylo způsobeno tím, že jako otvory se jeví primární i sekundární osteony, non-haversovy kanálky, Volkmannovy kanálky i resorpční dutiny. Kromě toho systém nedokázal zachytit ty nejmenší otvory, takže byl jejich skutečný počet zkreslen. Autoři došli k závěru, že nejsou schopni pomocí svého systému určit věk na klinicky (forenzně) přijatelné úrovni. Podle nich to zřejmě odráží necitlivost metody k regionálním věkovým změnám histologie kompaktní kosti (endostální vs. subperiostální oblast), protože zaznamenávali data z celé plochy kompaktní kosti. Zejména u dlouhých kostí jsou věkové změny kostní histologie lépe patrné v subperiostální oblasti. Další metodu pro odhad věku na femuru vytvořili Martrille a kolegové (Martrille et al., 2009). Soubor obsahoval dvacet devět jedinců z Francie (20 mužů a 9 žen; věk 9-96 let; průměrný věk 42 ± 15 let). Pomocí počítačové analýzy digitálních mikrofotografií byla měřena hustota intaktních a fragmentárních osteonů a procento lamelární kosti ve dvaceti subperiostálních polích. Jako intaktní osteon byl hodnocen takový, který měl neporušený Haversův kanálek a viditelných 80% své plochy. Nejlépe korelovaná s věkem byla hustota fragmentárních osteonů následovaná hustotou intaktních osteonů, procento lamelární kosti mělo korelaci nejmenší. Autoři doporučují použít při analýze femuru dvacet polí a naznačují, že nejlepšího odhadu věku je dosaženo při kombinaci více proměnných a při vyloučení jedinců nad sedmdesát let věku. Han a kolektiv (Han et al., 2009) vypracovali rovnice odhadu dožitého věku pro korejskou populaci (N = 72; 44 mužů a 28 žen; průměrný věk 68,0 ± 14,2 let; muži let, průměrný věk 66,6 ± 12,7 let; ženy let, průměrný věk 70,3 ± 16,1 let). Proměnné byly měřeny v pěti subperiostálních polích na anteriorní straně příčného řezu femurem. Během studie nebyly kromě tloušťky kompaktní kosti zjištěny žádné významné rozdíly mezi pohlavími. Schodovitá regrese ukázala, že největší korelaci s věkem má plocha osteonu a hustota populace osteonů, méně tloušťka kompaktní kosti. Plocha Haversova kanálku nebyla k věku významně vztažena. Výsledkem studie jsou dvě regresní rovnice odhadu věku využívající plochu osteonu, hustotu populace osteonů a tloušťku kompakty. Neexistence 91

92 sexuálních rozdílů mohla být způsobena nedostatkem žen mladších padesáti let ve výběrovém souboru Studie porovnávající metodu Kerleyho a Ahlqvista a Damstena Bouvierová a Ubelaker (Bouvier a Ubelaker, 1977) porovnávali přesnost Kerleyho a Ahlqvistovy-Damstenovy metody odhadu věku. Obě metody aplikovali na femury z původního Kerleyho souboru (N = 40). Na řezech bylo hodnoceno procento remodelované kosti (Ahlqvist a Damsten) a počet kompletních osteonů (Kerley). Jako problematická se ukázala oblast linea aspera v Kerleyho metodě, kde bylo obtížné získat spolehlivé počty struktur. K odhadu věku použili původní Kerleyho regresní rovnice (1965), tzn. ještě před revizí, a navíc použili pole odlišné velikosti od původního Kerleyho pole. Výsledky obou metod byly porovnány se skutečným věkem. U Kerleyho se odhad věku lišil od skutečného věku průměrně o 8,20 let a u Ahlqvista-Damstena o 9,50 let. Metoda Ahlqvista a Damstena byla přesnější u starších věkových skupin, Kerleyho metoda však poskytla přesnější odhady věku a kvalita výsledků se v průběhu života jedince neměnila. Stout a Gehlertová (Stout a Gehlert, 1980; Stout, 1992) testovali přesnost a spolehlivost metody Kerleyho, revize Kerleyho-Ubelakera a metody Ahlqvista-Damstena. Použili nezávislý soubor jedinců, který obsahoval femur, tibii a fibulu (N = 13; průměrný věk 55 let; rozpětí let). Autoři zjistili, že revize Kerleyho metody poskytuje největší přesnost a spolehlivost u většiny použitých kostí i proměnných, i když metoda Ahlqvista a Damstena také dávala relativně dobré výsledky pro jedince ve věku šedesáti let a více (Tab. 9). Pfeifferová (Pfeiffer, 1980) oznámila objev relativně dobré shody mezi odhady věku vytvořenými podle histologické metody Ahlqvista a Damstena a tradičními osteologickými indikátory věku, když je aplikovala na malý (N = 6) archeologický soubor. Ubelaker (Ubelaker, 1981) aplikoval Kerleyho a Ahlqvistovu-Damstenovu metodu na velké soubory jedinců. Když použil Kerleyho metodu na souboru sto padesáti osmi koster, získal průměrný rozdíl mezi skutečným a odhadnutým věkem 4,2 let. Jindy testoval Kerleyho metodu na sto čtrnácti individuích, kde nalezl široké rozpětí v přesnosti jednotlivých odhadů věku, ale celková věková distribuce se blížila skutečnému složení souboru. Ve svých pracích 92

93 Ubelaker diskutoval problém použití metod odhadu věku na soubory jiného etnického nebo rasového složení. Tab. 9. Pořadí Kerleyho a Ahlqvistovy-Damstenovy histologické metody odhadu dožitého věku podle jejich přesnosti a spolehlivosti zhodnocené na nezávislém souboru Pořadí metod Hodnocená metoda, proměnná nebo rovnice 1. Průměrná hodnota věku odvozeného ze všech regresních rovnic publikovaných v revizi Kerleyho a Ubelakera (Kerley a Ubelaker, 1978) 2. Regresní rovnice pro fragmenty osteonů na femuru (Kerley a Ubelaker, 1978) 3. Regresní rovnice pro intaktní osteony na femuru (Kerley a Ubelaker, 1978) 4. Regresní rovnice pro fragmenty osteonů na fibule (Kerley a Ubelaker, 1978) 5. Kerleyho profilový diagram (Kerley, 1965) 6. Regresní rovnice pro intaktní osteony na tibii (Kerley a Ubelaker, 1978) 7. Metoda Ahlqvista a Damstena (Ahlqvist a Damsten, 1969) 8. Regresní rovnice pro intaktní osteony na fibule (Kerley a Ubelaker, 1978) 9. Regresní rovnice pro fragmenty osteonů na tibii (Kerley a Ubelaker, 1978) Stout a Stanleyová (Stout a Stanley, 1991) porovnávali odhady věku pomocí procenta remodelované kosti (Ahlqvistova-Damstenova metoda) a celkové hustoty osteonů (Kerleyho metoda). Použili příčné řezy ze středu diafýzy radia, fibuly a tibie (N = 36; 21 mužů, 15 žen; věk let; průměrný věk 59,6 let). Také vzájemně porovnali odhady věku pomocí procenta remodelované kosti ze čtyř mikroskopických polí a z celého příčného řezu. Bylo zjištěno, že je výhodnější zjišťovat procento remodelované kosti v celém příčném řezu. Počet osteonů a fragmentů byl významně korelován s věkem u všech použitých kostí, procento remodelované kosti mělo významnou korelaci s věkem pouze pro radius, a to jen při hodnocení celého příčného řezu. Dále bylo zjištěno, že procento remodelované kosti a celková hustota osteonů se liší mezi tibií, fibulou a radiem jednoho individua. Závěrem autoři doporučují používat při vývoji metod odhadu věku celkovou hustotu osteonů (tj. počet intaktních a fragmentárních osteonů na mm²) spíše než procento remodelované kosti. Výhody využití procenta remodelované kosti však nepopírají, zejména při zpracování špatně zachovalých kostních vzorků. Uytterschautová (Uytterschaut, 1993) aplikovala metodu Kerleyho a metodu Ahlqvista a Damstena na femur a tibii. Soubor svou strukturou odpovídal souboru použitému 93

94 v metodě Ahlqvista a Damstena (N = 20; věk let; průměrný věk 54 let). Protože předchozí badatelé (Kerley, 1965; Singh a Gunberg, 1970) nezaznamenali žádné významné pohlavní rozdíly v remodelaci, autorka nevěnovala žádnou pozornost pohlaví jedinců. Procento osteonů a fragmentů bylo počítáno podle principu Ahlqvistovy-Damstenovy metody a výsledky byly dosazeny do jejich regresní rovnice pro odhad věku. Korelace mezi skutečným věkem a procentem osteonů a fragmentů byla vysoce signifikantní. Práce obsahuje také vlastní regresní rovnice autorky pro odhad věku na femuru a tibii. Ačkoli Kerleyho metoda bývá považována za přesnější a spolehlivější, Uytterschautová upřednostňuje metodu Ahlqvista a Damstena. Ahlqvist a Damsten použili dvě kategorie struktur: Intaktní osteony a fragmenty osteonů a Obvodové lamely a nonhaversovy kanálky. Kerley hodnotil každou z těchto struktur samostatně, ale jednoznačná identifikace struktur není bohužel vždy možná. Rovněž je problém s přesnými definicemi některých proměnných, např. v různých metodách odhadu věku existují různé definice intaktního osteonu. Sjednocením intaktních a fragmentárních osteonů do jedné kategorie problém definice intaktního osteonu odpadá. Uytterschautová vidí také některé praktické výhody použití metody Ahlqvista a Damstena. Zatímco Kerley počítá struktury v kruhovém mikroskopickém poli, Ahlqvist a Damsten použili čtvercovou síťku se sto čtverci a počítali počet čtverců více než z poloviny zaplněných osteony a fragmenty. Je snazší počítat čtverce mřížky než skutečné struktury v řezu a použitím mřížky se odstraní problémy s rozdílnou velikostí pozorovaného pole. Stejně jako Ahlqvist a Damsten považuje i Uytterschautová lokalizaci mikroskopického pole do oblasti linea aspera na femuru za chybu, neboť zde jsou histologické struktury hůře korelovány s věkem díky svalovým úponům. Sýkorová (Sýkorová, 1996) popsala histologické metody odhadu věku na dlouhých kostech. Vycházela z prací Kerleyho a Ahlqvista a Damstena, které rovněž vzájemně porovnala na nezávislém souboru. Místa odběru vzorků, lokalizaci pozorovaného pole a jeho tvar převzala z metody Ahlqvista a Damstena. Podobně jako oni předpokládá, že místa úponů velkých svalů mohou mikrostrukturu kostí ovlivnit a že ve čtvercovém poli lze pro hodnocení lépe využít síťku. V kostech hodnotila počet osteonů, fragmentů a non-haversových kanálků a procento obvodové lamelární kosti. Její regresní rovnice platí pro všechny dlouhé kosti bez ohledu na pohlaví. Jako přesnější autorka uvádí metodu Ahlqvista a Damstena. 94

95 METODY REDUKUJÍCÍ POŠKOZENÍ DLOUHÝCH KOSTÍ Některé histologické metody odhadu věku se snaží omezit poškození dlouhých kostí a využívají menší část kosti než celé příčné řezy. Důvodem této snahy je fakt, že většina dlouhých kostí je využívána také pro osteologická měření, a proto panuje mezi badateli neochota ničit je odběrem celého příčného řezu. Rovněž u archeologických koster není vhodné je takto poškozovat. Singh a Gunberg (Singh a Gunberg, 1970) vypracovali metodu (N = 59; 52 mužů, 7 žen; věk let), která využívá kostní klínek z diafýzy femuru a tibie (N = 33) a ze zadní hranice ramus mandibulae (N = 52). Model pro odhad dožitého věku byl odvozen pouze ze souboru mužů. Soubor žen byl použit k testování modelu a k analýze pohlavních rozdílů, které však zjištěny nebyly. Autoři ve dvou náhodně vybraných polích měřili celkový počet kompletních osteonů (kompletní osteon má kompletní Haversův kanálek), počet lamel v osteonu a nejmenší průměr Haversova kanálku. Počet osteonů a počet lamel v osteonu s věkem rostl a průměr Haversova kanálku klesal. Počet osteonů a průměr Haversova kanálku byly lépe korelovány s věkem než počet lamel v osteonu. Histologická data z mandibuly poskytla přesnější odhady věku a měla vyšší korelaci s věkem než údaje z dlouhých kostí. Zjištěná data se dosazují do sedmi regresních rovnic, vypracovaných zvlášť pro každou kost. Je nutné poznamenat (Uytterschaut, 1993), že tato metoda je založena na početně malém souboru s většinou jedinců nad padesát let věku. Autoři to vysvětlují potřebou vypracovat metodu odhadu věku pro jedince po ukončení růstu, tj. nad dvacet pět let věku (Singh a Gunberg, 1970). Neuvědomují si však, že v případě hodnocení neznámého nálezu bude odhad věku u mladších jedinců méně přesný, což je např. ve forenzních vědách značná nevýhoda. Navíc bylo zjištěno, že chyba odhadu věku touto metodou kolísá mezi dvanácti a čtyřiceti devíti lety (Stout a Gehlert, 1980; Uytterschaut, 1993; Thomas et al., 2000). Může to být způsobeno tím, že náhodný výběr pouze dvou mikroskopických polí může z důvodu značné topografické variability v histomorfologii kompaktní kosti vést k hodnocení neadekvátního pole. Dalším problémem může být, že při tvorbě metody byly použity broušené i odvápněné řezy lišící se svou tloušťkou. Je známo, že tloušťka řezu může ovlivnit histomorfometrické charakteristiky v kosti (Stout, 1992). Z toho vyplývá, že data získaná z obou typů řezů nemusí být zcela srovnatelná, týká se to hlavně průměrného počtu lamel v osteonu. 95

96 Další metodu, která minimalizuje poškození dlouhých kostí, vyvinul Thompson (Thompson, 1979). Studijní soubor obsahoval sto šestnáct jedinců (věk let u mužů a 4394 let u žen) a metoda vyžaduje odběr vrtného jádra kostní tkáně z diafýzy femuru (N = 91 mužů a 113 žen), tibie (N = 112 mužů a 113 žen), humeru (N = 29 mužů a 31 žen) a ulny (N = 31 mužů a 31 žen). Autor sledoval ve čtyřech mikroskopických polích celkem devatenáct proměnných (např. váhu vzorku, plochu osteonů, plochu lamel v osteonu, tloušťku kompakty, počet osteonů a Haversových kanálků, obvod osteonu a Haversova kanálku, hustotu kompaktní kosti, obsah minerálů apod.), z nichž bylo vypracováno sto osmnáct regresních rovnic. Rovnice byly vypočítány pro muže, ženy a kombinaci pohlaví. Nejlepším samostatným kritériem pro odhad věku byla plocha osteonální kosti. Celkově nejlepší předpovědi věku bylo dosaženo na horní končetině u humeru a na dolní končetině u tibie. Ericksenová (Ericksen, 1991) vyvinula metodu odhadu věku, kde je odebírán klínek z přední strany diafýzy femuru. Výzkumný soubor byl etnicky smíšený (N = 328; 154 žen, 174 mužů; věk let; průměrný věk 62,76 let). Autorka do výzkumu zařadila i třicet jedinců trpících chorobami, které mají vliv na strukturu kostí (diabetes mellitus, alkoholismus, cirhóza jater, chronická renální choroba). Důvodem byl fakt, že záznamy o těchto nemocech nejsou u všech jedinců vždy dostupné a navíc jsou metody odhadu věku aplikovány na jedince neznámého původu a zdravotního stavu. Proto by tyto metody neměly být odvozeny ze selektované populace. Autorka v pěti pravoúhlých mikroskopických polích sledovala počet sekundárních osteonů (mají intaktní Haversův kanálek), osteonů typu II, fragmentů osteonů, resorpčních dutin a non-haversových kanálků a procento neremodelované obvodové kosti, osteonální kosti (osteony, osteony typu II a Volkmannovy kanálky) a fragmentární kosti (fragmenty osteonů). Mikroskopická pole byla umístěna co nejtěsněji k periostu. Počet jednotlivých struktur autorka dělila plochou mikroskopického pole, aby získala počet struktur na 1 mm². To eliminuje problémy s rozdílnou velikostí pole, které byly spojeny s metodou Kerleyho. Procentuální zastoupení jednotlivých typů kosti určila pomocí mřížky se sto čtverci. Regresní analýza poskytla tři sady rovnic odhadu věku pro muže, ženy a kombinaci pohlaví. Všechny proměnné kromě počtu resorpčních dutin měly významnou korelaci s věkem. Lepší výsledky poskytly rovnice pro jednotlivá pohlaví, protože muži a ženy se s postupujícím věkem lišili ve vztahu mezi osteony a fragmenty. Metoda byla později aplikována (Ericksen a Stix, 1991) na soubor exhumovaných koster Afroameričanů (N = 44; 25 žen, 19 mužů). Výsledky histologického odhadu věku byly 96

97 porovnány s makroskopickým odhadem věku a ve většině případů spolu oba odhady souhlasily. Případy, kdy se odhady lišily, byly většinou způsobeny špatným zachováním kosti nebo kortikálním driftem. Oba postupy byly spolu korelovány a poskytly stejný demografický obraz zkoumané populace. Maat a spolupracovníci (Maat et al., 2006) vypracovali odhad dožitého věku na femuru na souboru jedinců z Holandska (N = 162; 86 mužů, 76 žen; věk let). Autoři hodnotili ubývání plochy neremodelované kosti (obvodové lamely a non-haversovy kanálky) s věkem. Tento postup vybrali z důvodu zjednodušení metody, kdy se vyhýbají nutnosti interpretace různých fází remodelace osteonu. Pro analýzu byl použit klínek z diafýzy femuru, v subperiostální oblasti kompakty autoři sledovali procento neremodelované kosti na ploše 1 mm² pomocí mřížky se sto čtverci při stonásobném zvětšení. Pro zhodnocení možného vlivu zvýšené zátěže na rychlost remodelace byla popsána také tělesná stavba mrtvých (štíhlý, střední, robustní) a změřena jejich tělesná délka. Závislost odhadu věku na množství neremodelované kosti se ukázala jako statisticky významná. S rostoucím věkem procento neremodelovaných obvodových lamel klesalo, avšak nelineárně. Odbourávání obvodových lamel postupovalo asymptoticky až do bodu, kdy jsou jejich poslední zbytky odstraněny. Výsledkem práce je sada regresních rovnic odhadu věku. Pohlaví nemělo na odhad věku významný vliv. Projevila se ale závislost odhadu věku na délce těla, což je ovlivněno současným sekulárním trendem výšky postavy v Holandsku. Zvýšení průměrné tělesné výšky má vliv na velikost zátěže, která působí na femur během života a tím i na nepatrné zvýšení remodelace kosti. Zařazení délky těla do rovnice zlepšilo přesnost odhadu věku, naopak stavba těla k predikci věku nepřispěla. Za účelem kvalitativních odhadů věku autoři předložili katalog se sériemi obrázků charakteristických řezů přední stěnou femuru pro jednotlivé věkové dekády. Keough a kolegové (Keough et al., 2009) zjišťovali možnosti odhadu věku na souboru nemajetných domorodých obyvatel z Jižní Afriky (N = 146; 105 mužů a 41 žen). Jejich cílem bylo zhodnotit přesnost a opakovatelnost deseti histomorfometrických proměnných, které jsou rutinně používány pro odhad věku severoamerické populace (proměnné použité u Kerley, 1965; Singh a Gunberg, 1970 a Ericksen, 1991). Pro hodnocení použili klínek z přední části diafýzy femuru. Malou korelaci s věkem vykazoval celkový počet osteonů, procento neremodelované kosti, počet non-haversových kanálků a procento osteonální kosti. Ostatní proměnné se neosvědčily. Malá nebo žádná korelace vybraných 97

98 proměnných k věku mohla být ovlivněna geneticky (jiná rychlost kostního obratu), velikostí souboru, nižším socioekonomickým statutem jedinců, životním stylem (šlo převážně o těžce pracující dělníky), nemocemi, výživou a populačním původem souboru. To se projevilo také tím, že oproti metodám vyvinutým pro severoamerickou populaci měla metoda aplikovaná na tento soubor nižší korelační koeficienty proměnných s věkem a vyšší standardní chybu odhadu METODY VYUŽÍVAJÍCÍ JINÉ NEŽ DLOUHÉ KOSTI Většina histologických metod odhadu věku, které nevyužívají dlouhé kosti, se zaměřuje na žebro a klavikulu. Pro použití těchto dvou kostí hovoří hned několik důvodů (Stout, 1992; Stout a Paine, 1992; Stout et al., 1994; Crowder a Rosella, 2007; Kim et al., 2007). Většina metod odhadu věku využívá velké dlouhé kosti (např. femur, tibii a fibulu), z nichž odebírá celé příčné řezy. Protože však jsou tyto kosti využívány též pro osteologická měření, je zde kvůli invazivnosti těchto histologických metod pochopitelný odpor k jejich používání. Na druhou stranu neexistují žádné důležité osteologické metody, které by vyžadovaly celé intaktní žebro nebo klavikulu (Stout, 1992; Stout a Paine, 1992; Kim et al., 2007). Díky častému použití žebra v biomedicínském výzkumu (např. Sedlin et al., 1963a, 1963b, 1963c; Epker a Frost, 1964; Landeros a Frost, 1964; Sedlin, 1964; Pirok et al., 1966; Frost, 1987b) existuje poměrně velká datová základna o histomorfologii normálního a patologického žebra. Žebra a klavikula jsou rovněž vhodné při fragmentárním zachování skeletu, kdy jsou dlouhé kosti zničeny nebo chybí. Obě tyto kosti jsou též snadno přístupné k odběru a minimalizují množství tkáně potřebné pro analýzu (Stloukal et al., 1999; Streeter, 2010). Žebra a klavikula nejsou přímo zahrnuty do lokomoce a nenesou velkou zátěž, takže vykazují méně variability v remodelaci způsobené biomechanickými faktory, navíc nejsou ovlivněny porody (Stout, 1992; Dudar et al., 1993; Kim et al., 2007; Pavón et al., 2010; Cannet et al., 2011). Současné použití žebra a klavikuly zvyšuje počet kritérií pro odhad věku a tím i přesnost a spolehlivost dané metody. Někteří badatelé zkoumali věkové změny v poměru plochy kompakty a celkové plochy řezu. Byli to např. Sedlin a kolektiv (Sedlin et al., 1963b), Takahashi a Frost (Takahashi a Frost, 1966) a Frost (Frost, 1969). Poměr se vypočítá jako plocha kompaktní kosti / celková plocha řezu (včetně dřeňové dutiny a spongiózních trabekul). Tento poměr s věkem klesá. Uvedenou metodu by bylo možné použít k vytvoření odhadů věku 98

99 v případech, kde jsou kosterní pozůstatky extrémně fragmentární, a proto nelze použít klasické histologické metody odhadu dožitého věku. Boivin, Schoenboerner a Baud (Boivin et al., 1981) píší, že pro odhad věku lze do jisté míry využít počet intaktních a fragmentárních osteonů na mm² v kompaktní kosti crista iliaca. Stout (Stout, 1986, 1989b, 1992) vypracoval metodu odhadu věku ze střední třetiny levého šestého žebra (N = 63). U každé kosti se hodnotí dva příčné řezy, čímž se minimalizuje možnost hodnocení atypického vzorku tkáně. Pro odhad věku autor používá celkovou hustotu viditelných osteonů (počet osteonů a fragmentů na mm²) zjišťovanou na celé ploše řezu. Tím se eliminují problémy spojené s velikostí pozorovaného pole, odlišným zvětšením, korekčními faktory, lokalizací pole v řezu a s definicí intaktního a fragmentárního osteonu. Práce bohužel neuvádí žádné detaily o referenčním souboru ani o výsledné chybě odhadu. Stout a Paine (Paine, 1983; Stout, 1986, 1989b, 1992; Stout a Paine, 1992) tento postup dále rozpracovali a vytvořili metodu odhadu věku ze střední třetiny levého šestého žebra a středu diafýzy klavikuly. Soubor byl rasově smíšený (N = 40; 32 mužů, 7 žen, 1 neznámý; věk let; průměrný věk 28,6 let). Na celé ploše řezu hodnotili plochu kompakty, počet intaktních osteonů na mm² (sekundární osteon s alespoň 90% obvodu Haversova kanálku bez jakékoliv resorpce), počet fragmentů osteonů na mm² a celkovou hustotu viditelných osteonů. Celková hustota viditelných osteonů sloužila pro výpočet regresních rovnic pro žebro, klavikulu a jejich kombinaci a její použití eliminuje problémy spojené s interpretací intaktního osteonu. Autoři doporučují používat regresní rovnici pro kombinaci dat z obou kostí. Pro testování rovnic byl použit nezávislý soubor dvanácti žeber a sedmi klavikul (7 mužů, 2 ženy a 3 neznámého pohlaví). Průměrný rozdíl mezi známým a odhadnutým věkem byl 3,4 let (žebro), 1,1 roku (klavikula) a 2,6 let (kombinace obou). Statisticky se průměr skutečného a odhadnutého věku nelišil. Stout a spolupracovníci (Stout et al., 1994) publikovali další variantu metody, kde odebírají příčný řez na sternálním konci čtvrtého žebra. Soubor obsahoval bělochy (N = 60; věk let; průměrný věk 39,2 let). Vzorky pocházely ze souboru, který použil İşcan pro tvorbu makroskopické metody odhadu věku (Loth a İşcan, 1989). V řezech hodnotili počet 99

100 intaktních osteonů na mm² (mají 90% obvodu Haversova kanálku intaktní), počet fragmentárních osteonů na mm² a celkovou hustotu populace osteonů. Celková hustota populace osteonů sloužila pro tvorbu regresních rovnic. Protože nebyl v odhadu věku nalezen rozdíl mezi pohlavími, byla data pro ženy a muže zkombinována. Metoda zahrnuje i makroskopický odhad dožitého věku podle sternálního konce čtvrtého pravého žebra (Loth a İşcan, 1989). Tato kombinace je doporučena vždy, když jsou obě metody aplikovatelné, protože značně zlepšuje výsledek odhadu věku. Obě metody lze aplikovat na stejnou kost. I když novější práce (Fanton et al., 2010) zaznamenala u İşcanových proměnných špatnou opakovatelnost jinými badateli, přináší tato metodika i přesto významné zpřesnění odhadu dožitého věku. Dudar a spolupracovníci (Dudar et al., 1993) zhodnotili na nezávislém souboru (N = 55; 31 mužů, 24 žen; věk let; průměrný věk 61,8 let) morfologickou metodu odhadu věku na čtvrtém žebru (Loth a İşcan, 1989) a histologickou metodu odhadu věku na šestém žebru (Stout, 1986). Srovnání se skutečným věkem neodhalilo žádné statisticky významné rozdíly mezi odhady vzešlými z obou metod. U obou metod klesala přesnost odhadu se stoupajícím věkem jedinců. Kombinace obou metod přinesla lepší výsledky, proto je při hodnocení neznámých kosterních pozůstatků doporučena. Cool a spolupracovníci (Cool et al., 1995) se pokusili určovat věk z histologie os occipitale. Předpokládali, že týlní kost není příliš ovlivněna vlivy prostředí a bude ukazovat změny mikrostruktury použitelné pro odhad věku. Podobně se pokusil určovat věk i Clarke (Clarke, 1987) v případě os parietale. Oba týmy však zjistily, že mikrostruktura lebeční klenby není pro histologický odhad věku vhodná. Pigolkin a kolektiv (Pigolkin et al., 2002) se zabývali věkovými změnami na třetím žebru a tibii za použití počítačové histomorfologické analýzy (N = 564 mužů; věk 0-90 let). Byl stanoven komplex parametrů nejsilněji korelujících s věkem, např. rozsah zóny aktivní osteogeneze v longitudinálním řezu žebrem, tloušťka vnitřních a vnějších lamel diafýzy tibie, plocha trabekul v epifýze tibie apod. Věkové změny histologických struktur jsou charakterizovány velkou variabilitou, závisejí na typu a lokalizaci těchto struktur a probíhají nepravidelně a asynchronně, proto je jejich korelace s věkem odlišná u různých věkových skupin. 100

101 Vystrčilová (Vystrčilová, 2002) se zabývala odhadem dožitého věku z histologie zubů a žeber a podle makroskopických metod. Metody porovnávala mezi sebou a také vytvořila vlastní regresní rovnice odhadu věku. Použila výbrusy zubů a žeber z recentního i historického materiálu ( žebro; N = 44; 24 mužů, 20 žen; věk let; průměrný věk 59,32 let). Vzorky žeber byly posuzovány podle kvalitativní metody (Hummel, 2001) a podle počtu sekundárních osteonů na mm² (Lynnerup et al., 1998). Mikroskopické snímky byly hodnoceny v náhodně vybraném čtvercovém poli o velikosti 1 mm². Autorka poskytuje regresní rovnici a identifikační tabulku odhadu dožitého věku na základě počtu sekundárních osteonů na mm². Kim a kolegové (Kim et al., 2007) vypracovali metodu odhadu věku podle sternálního konce levého čtvrtého žebra pro populaci Korejců (N = 64; 36 mužů, 28 žen; muži let; průměrný věk 44,8 let; ženy let; průměrný věk 38,6 let). Na celém příčném řezu hodnotili plochu kompakty, procento plochy kompakty, počet intaktních osteonů na mm² (mají 90% obvodu Haversova kanálku intaktní), počet fragmentárních osteonů na mm², celkovou hustotu viditelných osteonů, plochu osteonu a plochu Haversova kanálku. Při zpracování dat byly zjištěny rozdíly v histomorfologických proměnných mezi pohlavími, a to ve věku let pro všechny proměnné a ve věku let pro plochu osteonu a procento plochy kompakty. Pro odhad věku se ukázaly jako nejlepší hustota populace osteonů a plocha osteonu. Plocha Haversova kanálku měla k věku jen malý vztah a procento plochy kompakty nebylo k věku významně vztaženo. Výsledkem studie je sada regresních rovnic pro odhad dožitého věku na základě hustoty populace osteonů, plochy osteonu a pohlaví. Crowder a Rosellaová (Crowder a Rosella, 2007) se zaměřili na nutnost využití přesně stanoveného žebra v metodách odhadu věku. Obvykle tyto metody používají střední třetinu šestého žebra. Přesné stanovení pořadí žeber je však při nálezech zejména fragmentovaných pozůstatků obvykle obtížné, žebra mohou být rozlámána na kousky nebo některá úplně chybět. Proto autoři zkoumali, zda lze tyto metody aplikovat i na ostatní žebra a použili řezy ze střední třetiny třetího až osmého žebra (N = 20; 11 mužů, 9 žen; věk let, průměrný věk 74,6 let) a stanovili v nich celkovou hustotu populace osteonů (OPD). Bylo zjištěno, že i ostatní žebra dávají podobné hodnoty OPD jako šesté žebro a odhady věku se mezi jednotlivými žebry statisticky významně neliší, takže lze i ostatní žebra v příslušných metodách odhadu věku použít. 101

102 Pavónová a spolupracovníci (Pavón et al., 2010) vyvinuli rovnice odhadu věku pro čtvrté levé žebro moderní Mayské populace a testovali aplikovatelnost dvou starších metod odhadu věku pro šesté žebro (Stout a Paine, 1992; Cho et al., 2002). Použili soubor známého věku a pohlaví (N = 36; 34 mužů a 2 ženy, věk let, průměrný věk 43,8 let) a měřili hustotu populace osteonů (intaktní a fragmentární osteony na mm²), plochu kompakty a plochu osteonu. Výsledkem studie bylo sedm regresních rovnic pro odhad dožitého věku, z nichž nejlepší byla rovnice využívající hustotu populace osteonů. Autoři kritizují používání metod odhadu věku na jiné populace, včetně archeologických, než na jakých byly vyvinuty. Lepších výsledků na svém souboru dosáhli pomocí metody Stouta a Painea (1992), metoda Choové a spol. (2002) selhala. Příčinou jsou jiné parametry remodelace mezi populacemi, zejména rychlost tvorby kosti a celková hustota populace osteonů. Pořadí žebra bylo v tomto případě vyloučeno jako nepodstatné. Cannetová a kolegové (Cannet et al., 2011) vyvinuli metodiku pro odhad věku podle odvápněných řezů levého čtvrtého žebra (N = 80; 62 mužů, věk let, průměrný věk 57,6 let; 18 žen, věk let, průměrný věk 42,2 let). Studie byla zaměřena na zjištění vhodnosti použití odvápněných řezů pro odhad věku, hledání spolehlivé definice mikrostruktur, zjištění rozdílů mezi vnitřní a vnější stranou žebra, nalezení struktur vhodných pro odhad dožitého věku a konečně na možnost redukovat množství prováděných měření. V řezech zjišťovali celkovou plochu kompakty, maximální a minimální průměr a plochu Haversova kanálku, plochu intaktních a remodelovaných osteonů, plochu non-haversových kanálků atd. Hustota populace osteonů poskytla při použití diskriminační analýzy rozlišení mezi třemi věkovými skupinami: (dospělost), (střední věk) a 60+ (senioři). Metodika byla ověřena na deseti nezávislých vzorcích (7 mužů, 3 ženy). Dále bylo zjištěno, že většina parametrů histologických struktur se mezi vnitřní a vnější stranou žebra neliší. Je nutno podotknout, že definice mikrostruktur se v této studii liší od obecně uznávaných pravidel. Neremodelovaný osteon je zde popsán jako struktura, která má aspoň 80% cementové linie intaktní. Jako nonhaversovy kanálky se berou všechny prostory postrádající cementovou linii, tedy včetně Volkmannových kanálků a resorpčních dutin KVALITATIVNÍ METODY Hummelová (Hummel, 2001) publikovala metodu kvalitativního hodnocení změn v kompaktní kosti, při které se používají schémata vypracovaná podle fotografií preparátů 102

103 známého věku. Hodnocené vzorky lze zařadit do šesti základních věkových kategorií: Infans I, infans II, juvenis, adultus, maturus a senilis. Streeterová (Streeter, 2010) vypracovala kvalitativní metodu odhadu dožitého věku pro nedospělé jedince na základě řezů z pátého až sedmého žebra (N = 72; věk 2-21 let). Její metoda využívá systematické změny v morfologii kompaktní kosti lidského žebra a rozděluje jedince do čtyř věkových fází: fáze I (<5 let), fáze II (5-9 let), fáze III (10-17 let), fáze IV (1821 let). Histomorfologie neznámého vzorku žebra se porovnává s popisem a ilustracemi těchto fází METODY VYUŽÍVAJÍCÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP Někteří badatelé (Chatterji a Jeffery, 1968; Kósa et al., 1992) studují věkové změny v kosti pomocí elektronového mikroskopu. S věkem dochází např. ke změnám fyzikálních vlastností apatitových krystalů, mění se jejich velikost, tvar a vzájemné prostorové uspořádání. S věkem např. roste velikost krystalů apatitu v kosti (Chatterji a Jeffery, 1968). Kósa a kolektiv (Kósa et al., 1992) zkoumali struktury v kostní tkáni femuru vzniklé působením věku (N = 25; věk let). Pro odhad věku nepokládají za důležitý jen počet jednotlivých struktur či procento obvodových lamel, ale také např. rozměry osteonů, počet lamel v osteonu, poměr mezi cirkulárními a semicirkulárními lamelami, vzdálenost mezi Haversovými kanálky atd. Byl vytvořen postup odhadu věku, který využívá kvalitativní zhodnocení morfologických charakteristik kostní tkáně bez nutnosti počítání struktur a bez použití regresních rovnic JINÉ MOŽNOSTI ODHADU DOŽITÉHO VĚKU Některé metody se zabývají méně obvyklými strukturami v kompaktní kosti, které vykazují věkové změny (Fiala, 1978, 1988). Je to např. tvorba osteoidních lemů a resorpčních míst v Haversových kanálcích, která umožňuje sledovat rychlost remodelace a je známkou vytváření nového osteonu. Dále je to sledování hustoty kompaktní kosti, která s věkem klesá, a mineralizace kompakty, která s věkem roste. Porozita kompakty se s věkem také zvyšuje. Lze rovněž měřit velikost osteonů a jejich kanálků, která ve vnější vrstvě kompaktní kosti 103

104 s věkem klesá a ve vnitřní vrstvě roste. Velikost resorpčních dutin se s věkem zvětšuje, hlavně pod periostem ZÁKLADNÍ PŘEHLED VÝZKUMŮ ZAMĚŘENÝCH NA HISTOLOGII SPÁLENÝCH KOSTÍ VÝZKUMY PROVÁDĚNÉ SVĚTELNÝM MIKROSKOPEM Młodziejewski (Heussner, 1987) porovnával mikroskopický obraz spálených a nespálených kostí a zjistil, že mikroskopická struktura kosti zůstává zachována i po jejím spálení. Gladyšev (Golubovich a Talanov, 1990) analyzoval výbrusy kostí člověka a zvířat s cílem jejich druhové diferenciace. Metodiku použil při výzkumu spálených kostí z archeologických vykopávek. U spálených kostí zdůrazňuje výhody mikrorentgenografie, protože zhotovení výbrusů o ideální tloušťce je krajně složité. Mikrorentgenografie dovoluje nejen dobře zobrazit mikrostrukturu kosti, ale také zhodnotit stupeň mineralizace osteonů. Dobrjak (Herrmann, 1977a) zkoumal strukturální změny spálených kostí do teploty 300 C. Za takové teploty je spálená kost téměř identická s nespálenou kostí. Van Vark (Van Vark, 1970) experimentálně spaloval fragmenty femuru, patelly a mandibuly v elektrické peci. Změny rozměrů kostí zaznamenával při teplotách 200 až 1500 C. Mezi 400 a 800 C byly kosti stále křehčí a mikroskopický obraz se stával nejasným. Smrštění kostí začalo při 700 C, zvyšovalo se až do 800 C a pak již nepokračovalo. Zároveň nebyly zjištěny žádné významné rozdíly ve smrštění mezi vzorky spálenými s měkkými tkáněmi nebo bez nich. Při 800 C a více se mikroskopický obraz dramaticky měnil, až byly viditelné jen lakuny osteocytů. Herrmann (Herrmann, 1976, 1977a) zjistil, že vypovídací hodnota histologické struktury spálených kostí je díky smrštění silně omezena. Teploty pod kritickou teplotou (700 až 800 C) způsobují neúplné spálení kosti a smrštění jen o 1 až 3%. Neúplné spálení se vyznačuje zabarvením kosti uhlíkem díky neúplnému spálení organické hmoty. Po histologické stránce jsou neúplně spálené kosti téměř totožné s kostmi nespálenými. Nad

105 až 800 C je kremace úplná, organická hmota je zcela spálena a krystaly kostního minerálu se taví. Tyto změny jsou příčinou smrštění kosti. Histologické vyšetření úplně spálených kostí je velmi obtížné kvůli změnám v kostní struktuře způsobeným žárem. Struktura je oproti čerstvé kosti výrazně změněna, lamelární struktura se stává homogenní. Ve spálených kostech je možné vyšetřit i struktury vhodné pro odhad věku, samozřejmě s ohledem na smrštění. Ani barva ani tvrdost kosti není podle Herrmanna užitečným kritériem pro posouzení stupně spálení. Swegle (Swegle, 1979; Bradtmiller a Buikstra, 1984) ve své studii o experimentálně spálených kostech zjistil smrštění od 0 do 5%, s maximem případů kolem 3%. Bradtmiller a Buikstraová (Bradtmiller a Buikstra, 1984) sledovali vliv spalování na mikrostrukturu kompaktní kosti a na spolehlivost histologického odhadu věku. Pro zjištění vlivu spalování na odhad věku použili metodu Kerleyho (1965). Za jeden z nejvýznamnějších aspektů pro aplikaci této metody na spálené kosti považovali stupeň smrštění kostní tkáně, protože smrštění způsobuje zvýšení počtu struktur pozorovaných v mikroskopickém poli. Autoři spalovali části femuru a pak je porovnali s nespálenou částí stejné kosti. Jeden úsek kosti byl spálen s měkkými tkáněmi, druhý bez nich. Kosti se spalovaly v elektrické peci při 600 C po několik minut, až se zdálo pravděpodobné, že kosti dosáhly stejné teploty jako pec. Pak byla pec vypnuta, kosti se nechaly dohořet a vychladnout. Přesná teplota samotných kostí při spalování nebyla známa. Zkoumány byly řezy ze spálených i nespálených částí kosti. Bylo zjištěno, že kost spálená při 600 C si uchovává všechny mikroskopické struktury nutné pro odhad věku. Všechny struktury byly u spálených kostí snadno identifikovatelné. Dále se ukázalo, že osteony ve spálené kosti se oproti osteonům v nespálené kosti zvětšily. Autoři poskytují pro zvětšení osteonů několik vysvětlení. Kost se může, předtím než se smrští, nepatrně rozpínat a tento okamžik byl zachycen popsaným pokusem. Nebo se kost může ve svých vnějších rozměrech smršťovat, ale díky určitému přeskupení mikrostrukturních elementů se osteony zvětšují. Nakonec je možné, že se kost i osteony smršťují, ale smrštění není patrné kvůli problémům při tvorbě řezů. Jedním z důvodů zvětšení osteonů může být také fakt, že nativní a spálené vzorky byly odebírány na kostech ve značné vzdálenosti od sebe (cca 10 cm). Je možné, že v takové vzdálenosti existují na diafýze femuru rozdíly ve velikosti osteonů. Za účelem zjištění vlivu smrštění kosti na přesnost Kerleyho metody odhadu věku autoři přezkoumali recentní forenzní případ. Pro zjištění dožitého věku byl použit počet 105

106 osteonů, fragmentů a non-haversových kanálků a procento lamelární kosti na femuru. Počty struktur pak autoři zvýšili o 9,75%, což podle nich odpovídá smrštění kosti o 5%. Dožitý věk vypočítaný pro spálenou kost se lišil od věku spočítaného pro nespálenou kost pouze o dva roky. Použitý postup ovšem předpokládá, že struktury jsou napříč kompaktou distribuovány uniformě. Tento předpoklad však jiní autoři označili za mylný (Stout a Gehlert, 1982; Stout, 1992; Pfeiffer et al., 1995; Drusini, 1996; Maat et al., 2006). Tato demonstrace podle autorů nicméně ukázala, že při smrštění kosti o 5% jsou rozdíly v odhadu věku oproti čerstvé kosti docela malé. Heussnerová (Heussner, 1987, 1990a, 1990b) se zabývala metodami vhodnými pro zpracování žárových hrobů. Zkoumala spálené a nespálené vzorky femuru od sto čtrnácti recentních jedinců a vzorky ze čtyř pravěkých pohřebišť. Hlavní část práce představovala aplikace Kerleyho metody odhadu věku na sto recentních vzorků femuru. Kosti spálila při 600 až 800 C a porovnala je s nespálenými kostmi. V řezech zkoumala nejméně čtyři pole ležící co nejblíže k periostálnímu okraji kosti tak, aby byly vyloučeny anomálie, příčně ležící osteony, svalové úpony, destrukce způsobené spalováním apod. V kostech byly hodnoceny osteony a Haversovy kanálky, fragmenty osteonů, obvodové lamely, non-haversovy kanálky a lakuny osteocytů. Smrštění kostí bylo dle autorky zanedbatelné. Kerleyho metoda odhadu věku byla na femur aplikována s vyloučením oblasti linea aspera, jako proměnná byl použit počet intaktních osteonů. Dožitý věk byl zjištěn pomocí příslušné Kerleyho rovnice. Výsledky odhadu věku se u řezů spálenou a nespálenou kostí shodovaly. U některých řezů byl odhad věku negativně ovlivněn poškozením kosti ohněm. Autorka upozorňuje, že u spálených kostí může dojít k obtížím při odběru vzorku z pevně definovaných anatomických míst, protože kosti jsou silně fragmentární a poškozené. Dle výsledků studie lze Kerleyho metodu odhadu věku použít i na prehistorickém materiálu. Výzkum Heussnerové byl kritizován (Herrmann, 1990; Grimm, 1990; Bruchhaus, 1990; Ullrich, 1990) ze dvou hlavních důvodů. Prvním důvodem bylo, že autorka použila teploty spalování ležící pod tzv. kritickou teplotou, při které teprve dochází k úplnému spálení kosti. Práce byla kritizována také proto, že autorka aplikovala na spálené kosti Kerleyho metodu, aniž by vzala v úvahu smrštění spálených kostí, dále použila jinou velikost pole než Kerley a zcela opominula revizi Kerleyho metody z roku Dle Herrmanna (Herrmann, 1990) se autorkou nalezené hodnoty neshodují s dosavadními znalostmi o spálených kostech. 106

107 Golubovich (Golubovich, 1975) provedl expertízu spálených kostí s ohledem na určení druhové příslušnosti. Použil dlouhé kosti lidí známého věku a pohlaví a kosti zvířat (tur, vepř, ovce, pes). Kosti spaloval v peci při 400 až 500 C, mechanicky je rozbil a z úlomků připravil histologické preparáty. Z nespálených kostí zhotovil podélné i příčné řezy. Autor zkoumal průměr primárních a sekundárních osteonů, průměr Haversových kanálků, rozměry a počet lakun osteocytů. Autor došel k závěru, že druhová identifikace je na spálených kostech možná, ovšem problémem analýzy je deformace, fragmentace a smrštění kosti vlivem žáru. Později provedl autor (Golubovich, 1990) další experimentální spalování kostí s cílem rozpracovat metodiku identifikace osoby. Použil humerus a femur osob známého pohlaví a věku (17-91 let) a humerus a femur zvířat (tur, vepř, ovce). Kosti nejprve zabalil do kusů svaloviny a kůže, poté je spaloval na dřevě a v ohništích, na kamenném uhlí, plynem, spájecí lampou a v technické peci při teplotách 400 až 1000 C po dobu jedné až pěti hodin. Za účelem stanovení věku zjišťoval počet jednotlivých typů osteonů na ploše 1 mm². Autor tvrdí, že stanovení věku, druhové příslušnosti, výšky postavy a pohlaví lze spolehlivě provést podle celých kostí a jejich velkých fragmentů nezávisle na stupni spálení, a že je také možné určit druhovou příslušnost a věk podle malých fragmentů. Nelson (Nelson, 1992) porovnával mikrostrukturu spálené a nespálené kosti s ohledem na odhad věku a své výsledky diskutoval s prací Bradtmillera a Buikstraové (Bradtmiller a Buikstra, 1984). Použil femur z osmi jedinců známého věku a pohlaví. Části kostí byly spáleny při 537 a 815 C v propanové peci po dobu třiceti minut a ponechány pomalu vychladnout. Autor srovnával průměr osteonu a Haversova kanálku a jejich podíl a plochu osteonu a kanálku a jejich rozdíl. Počet lamel v osteonu se u spálených kostí nedal hodnotit. Kompletní osteon Nelson definoval jako ten, který má jasně viditelný kanálek a nebyl zasažen následnou remodelací. Struktury byly měřeny a počítány na ploše 1 mm², aby se eliminovaly rozdíly ve velikosti mikroskopického pole. Nelson zjistil, že spalování způsobuje statisticky významné změny v rozměrech kostní mikrostruktury. Průměr osteonů se vlivem spalování zmenšil o 16,7% a průměr Haversových kanálků se zvětšil o 10,5%. Plocha kanálku se tím v poměru k ploše celého osteonu zvětší. Tento jev je způsoben smrštěním lamel a tím i celého osteonu, vypálením lamel samotných nebo vypálením měkkých tkání uvnitř kanálku. V práci Bradtmillera a Buikstraové se rozměry osteonů během spalování zvětšovaly. Rozdílné výsledky ve změně velikosti osteonu Nelson přisuzuje tomu, že Bradtmiller a Buikstraová použili nižší teplotu spalování (600 C), krátkou dobu trvání žáru (není jisté, zda 107

108 kosti dosáhly uváděné teploty) a spalovali kosti i s měkkými tkáněmi. Pokud spalovali kosti s měkkými tkáněmi, možná nedosáhli dostatečného času k úplnému spálení kosti a jejich výsledek by byl způsoben neúplným spálením. Je snad možné, uvádí Nelson, že při nižší teplotě se osteony i celá kost nepatrně zvětšují. Oba autoři odebírali vzorky pro srovnání nativní a spálené tkáně ve vzdálenosti 10 cm od sebe, takže se mohla projevit prostorová variabilita ve velikosti struktur. Z toho důvodu Nelson odebíral řezy na kostech ve vzdálenosti 1 až 2 cm. Jiným možným vysvětlením zvětšení osteonu je nepřesná identifikace cementových linií v nativní a spálené kosti. Posledním možným vysvětlením je chyba měření způsobená měřením osteonů na zvětšených fotografiích. Nelson hodnotil struktury přímo v mikroskopu. Nelson rovněž pochybuje o závěru Bradtmillera a Buikstraové, že smrštění nemá velký vliv na přesnost odhadu dožitého věku. Harsányi (Harsányi, 1993) konstatuje, že nad teplotou 700 C již nelze jednotlivé histologické struktury kompakty spolehlivě rozlišit. Hummelová a Schutkowski (Hummel a Schutkowski, 1986) experimentálně spalovali vzorky femuru s cílem popsat smrštění kostní tkáně (N = 18; 13 mužů, 5 žen; věk let). Kosti byly spalovány při 1000 C po dobu čtyř hodin v elektrické peci. V řezech byla měřena tloušťka kompakty, vzdálenosti mikrostruktur, obsah minerálu a hustota. V délkovém směru byla na diafýze femuru zjištěna závislost mezi délkou fragmentu a mírou smrštění. Krátké fragmenty se smršťovaly více (do 20%) než dlouhé kusy (5%). Příčné smrštění kompakty bylo průměrně 27,4% a souviselo s tloušťkou kompaktní kosti. Fragmenty s tenčí kompaktou vykazují větší příčné smrštění než ty se silnější kompaktou. Smrštění celého příčného řezu a jeho jednotlivých částí se prakticky nelišilo a mělo hodnotu průměrně 27%. Závislost příčného smrštění na délce vzorku nebyla zjištěna. Jedním z důležitých poznatků s ohledem na histologický odhad věku je, že smrštění podél příčného řezu kompaktní kostí je lineární a že relativní podíly strukturních elementů na příčném řezu zůstávají i po spálení zachovány. Hummelová a Schutkowski (Schutkowski, 1991; Hummel a Schutkowski, 1993) se dále zabývali možnostmi odhadu dožitého věku na experimentálně spálených kostech (N = 18; věk let, průměrný věk 52 let). Části kostí spálili v peci při 1000 C po dobu jedné hodiny a porovnávali je s nespálenými částmi. Autoři zjistili, že i ve spálené kosti je možné provést histologický odhad věku. Na vzorcích prováděli nejprve Amprinem a Bairatim (1938) 108

109 navržený kvalitativní odhad věku a dále zkoušeli aplikovatelnost dvou kvantitativních metod odhadu věku. Kvůli variabilnímu zachování historických kremací zvolili takové metody, které se vyhýbají nutnosti rozeznávání čtyř strukturních typů, které navrhl Kerley. Použili proto postup Ahlqvista a Damstena, kde je nutné určit pouze procentuální zastoupení osteonů a fragmentů, a metodu Drusiniové (1987), kde se počítá počet osteonů na mm². Autoři zjistili, že nejlepší byla pro odhad věku metoda kvalitativní, protože u kvantitativních metod je ve spálených kostech ztíženo přesné rozpoznávání jednotlivých typů mikrostruktur. Pro kvalitativní odhad věku je ovšem nutná velká zkušenost v posuzování histologických preparátů ze spáleného kosterního materiálu. Z obou kvantitativních metod se při výzkumu spálených kostí jako lepší ukázalo zjišťování počtu osteonů na mm². Loubová (Loubová, 1999) se zabývala vlivem spalování na mikrostrukturu kompaktní kosti lidského žebra a také věkovými změnami (N = 115; věk let). Části kostí byly spalovány po dobu 45 až 60 minut při 700 C, 800 C (tj. dolní a horní hranice tzv. kritické teploty) a 1100 až 1200 C (teplota předpokládaná autorkou v moderním krematoriu). Autorka ve čtyřech kruhových polích sledovala počet kompletních osteonů, počet fragmentů osteonů, celkový počet osteonů a fragmentů, procento vnějších obvodových lamel, počet lamel v osteonu, počet non-haversových kanálků a průměr osteonu a Haversova kanálku. Studie ukázala, že počet osteonů i fragmentů s věkem roste, takže celkový počet osteonů a fragmentů měl vysokou korelaci s dožitým věkem. Průměr osteonů se s věkem zmenšuje. Počet non-haversových kanálků a procento obvodových lamel s věkem výrazně klesají, ve věku šedesáti let až k nulové hodnotě. Průměr Haversových kanálků sice do padesáti let věku roste, ale u starších jedinců je variabilní a zdá se na věku nezávislý. K největším změnám kostní mikrostruktury při spalování dochází při teplotě 700 až 800 C. Některé struktury se spalováním výrazně smršťují, např. průměr osteonu se zmenšuje o 16,2%. Při teplotě 1200 C smrštění osteonu ještě pokračuje o 0,86%. Počty struktur v pozorovaném poli se vlivem smrštění kosti zvyšují při 700 C o 5% a při vyšších teplotách o 15,9-19,86%. Rozměry Haversových kanálků vykazují při působení teploty vysokou variabilitu. Vlivem spalování dochází k výrazné destrukci obvodových lamel a jejich mikroskopické hodnocení je značně nepřesné. Na závěr autorka uvádí regresní rovnice odhadu dožitého věku pro nespálené a spálené kosti (pro každou teplotu spalování zvlášť). Hansonová a Cain (Hanson a Cain, 2007) se zaměřili na histologické odlišení spálené a nespálené kosti pro archeologické účely. Porovnávali spálené a nespálené recentní vzorky 109

110 zvířecích kostí s archeologickými nálezy (stáří a let B. P.). Také zjišťovali vlivy diageneze a fosilizace na mikrostrukturu kosti a možnost identifikace stop po vaření a jiném záměrném použití ohně v pravěku. Povětrnostní vlivy a diageneze způsobují na kosti obdobné změny jako spalování, včetně změny barvy. Proto některé fosilní kosti, které se makroskopicky jevily jako spálené, byly dle histologického obrazu ve skutečnosti nespálené. Jako dobrý indikátor spálení se ukázaly depozice uhlíku v kostní matrix a zmizení mikrostruktury. Naopak praskliny byly jak výsledkem spalování, tak i diageneze kosti. Kosti spalované s masem, které bylo ještě po spálení poživatelné, nevykazovaly známky spálení, protože teplota v nich nepřesáhla 100 C. I když byl výzkum proveden na zvířecích kostech, je dobře použitelný i pro rozlišení spálených a nespálených lidských kostí v archeologickém kontextu. Přehled dosavadních poznatků o spálených kostech přinesl Ubelaker (Ubelaker, 2009). Zaměřil se především na uplatnění poznatků ve forenzní praxi, na odkrytí pozůstatků na místě činu, identifikaci typu kosti, rekonstrukci skeletu, poznání traumat, identifikaci jedince, vliv tepla na histologickou strukturu kosti, smrštění, změnu barvy, odlišení kostí spálených s měkkými tkáněmi a bez nich, analýzu DNA a interpretaci hmotnosti pozůstatků VÝZKUMY PROVÁDĚNÉ ELEKTRONOVÝM MIKROSKOPEM Shipman a kolegové (Shipman et al., 1984) zkoumali spálené zvířecí kosti a zuby mimo jiné také pomocí skenovacího elektronového mikroskopu. Vzorky spalovali při teplotách 20 až 940 C a zaměřili se na popis barvy, mikroskopické morfologie, krystalické struktury a smrštění. Během výzkumu zjistili zvětšování velikosti krystalů hydroxyapatitu při spalování. Holden a spolupracovníci (Holden et al., 1995b) pro svůj výzkum spálených kostí použili vzorky femuru (N = 31; věk 1-97 let). Vzorky byly spalovány při teplotách 200 až 1600 C po dobu 2, 12, 18 a 24 hodin. Autoři byli schopni určit věk osoby jako mladý (1-22 let), dospělý (22-60 let) a starý (nad 60 let) a teplotu spalování v rozmezí 200 C. Tyto údaje lze zjistit podle tepelně podmíněného vzniku nových krystalů kostního minerálu, jejich morfologie a velikosti a též podle stavu a orientace kolagenních fibril. Ve svém dalším výzkumu (Holden et al., 1995a) autoři studovali ultramikroskopickou stavbu fragmentů femuru ze zpopelněných pozůstatků oběti požáru. Tato pozorování pak 110

111 porovnávali s laboratorně spáleným lidským femurem. Studie byla provedena mimo jiné za účelem zjištění, zda výsledky laboratorních pozorování lze úspěšně použít při forenzním vyšetřování. Autoři pomocí ultrastruktury kostní tkáně stanovili teplotu dosaženou v kosti, délku spalování a věk oběti. Rozdíly ve fyzikálních a chemických podmínkách spalování v laboratoři a při požáru by měly představovat limity pro určení věku zemřelého a teploty hoření. Nicméně tento výzkum nezjistil žádné významné rozdíly mezi laboratorně a forenzně spálenými vzorky. Tudíž je možné výsledky laboratorní studie použít i ve forenzním vyšetřování. Quatrehomme a kolegové (Quatrehomme et al., 1998) spalovali vzorky maxilly a mandibuly při teplotě 150 až 1150 C po dobu šedesáti minut. Zjistili, že s rostoucí teplotou jsou v kosti patrné čím dál větší změny, ale že je obtížné stanovit mezi teplotou a těmito změnami přesnou korelaci. Rozsáhlý výzkum spálených kostí provedl Thompson (Thompson, 2004). Zaměřil se na analýzu teplem indukovaných fyzikálních změn v kosti a revidoval teplotní rozmezí jednotlivých stupňů spálení. Kromě širokého spektra různých fyzikálních technik použil také skenovací elektronový mikroskop pro hodnocení fraktur v kosti. Došel k závěru, že antropologické metody aplikované na spálené kosti jsou přítomnými změnami negativně ovlivněny a jejich přesnost je omezena DALŠÍ MOŽNOSTI VÝZKUMU SPÁLENÝCH KOSTÍ Některé práce popisují strukturální změny v minerálním podílu kosti ve vztahu ke stupni spálení pomocí technik infračervené spektroskopie a rentgenování (Shipman et al., 1984; Holden et al., 1995b; Stiner et al., 1995; Rogers a Daniels, 2002; Hiller et al., 2003; Hanson a Cain, 2007; Piga et al., 2008; Thompson et al., 2009; Harbeck et al., 2011). Tyto metody umožňují odhadnout teplotu kremace a délku jejího trvání (Shipman et al., 1984) a také odlišit spálenou a nespálenou kost např. pro účely archeologie (Hanson a Cain, 2007). Používají k tomu popis struktury a složení kostního minerálu, a také poměr C/P a C/C (Thompson et al., 2009). Tepelně podmíněné změny v kostní tkáni je také možné zobrazit pomocí magnetické rezonance (Thompson a Chudek, 2007). Tato technika poskytuje 3D zobrazení celé kosti, tedy není destruktivní, přesto dovoluje studium vnitřní struktury kosti. Navíc s ní lze studovat 111

112 stále stejný úsek kosti podrobený několikanásobnému kontinuálnímu spalování, což může být výhodnější než analýza a porovnávání různých řezů kostí spálených při odlišných teplotách. V současné době se můžeme setkat také s analýzou DNA nebo stabilních izotopů ve spálených kostech (Grupe a Hummel, 1991; Brown et al., 1995; Cattaneo et al., 1999; Pusch et al., 2000; Walker et al., 2008; Ubelaker, 2009; Harbeck et al., 2011). Tyto metody mohou poskytnout doplňující informace o životě minulých populací nebo pomoci vyřešit mnoho forenzních případů. Avšak i tyto metody mají jistá omezení, protože analýza některých prvků (C, N a O) je možná pouze do teploty spalování 200 C a analýza DNA je proveditelná pouze v kostech spálených při teplotách do 600 až 700 C, v závislosti na délce spalování (Harbeck et al., 2011). 112

113 6. MATERIÁL A METODIKA 6.1. BIOLOGICKÝ MATERIÁL, SLOŽENÍ STUDOVANÝCH SOUBORŮ Biologický materiál představovaly vzorky recentních lidských žeber, které pocházely z jedinců známého věku, pohlaví a příčiny smrti (Tab. 10, Příloha 1). Materiál byl laskavě poskytnut Oddělením soudního lékařství Nemocnice Na Bulovce, Budínova 2, Praha 8. Ke každému jedinci byla poskytnuta základní dokumentace obsahující údaje o datu narození a úmrtí, datu pitvy, pohlaví, zjevných onemocněních, okolnostech a příčině smrti a zemi původu (někteří jedinci nepocházeli z České republiky, ale z okolních středoevropských zemí, např. ze Slovenska). Vzorky žeber byly cca dva až sedm centimetrů dlouhé a pocházely ze sternální třetiny třetího až desátého žebra. Kosti obsahovaly také části měkkých tkání (periost, svaly, chrupavky) a byly uskladněny v desetiprocentním roztoku formalínu. Při výzkumu se nepřihlíželo k pořadí jednotlivých žeber, neboť průběh remodelace kompaktní kosti je mezi všemi žebry obdobný a u fragmentárních nálezů nelze pořadí žebra přesně určit (Pirok et al., 1966; Frost, 1969; Crowder a Rosella, 2007; Pavón et al., 2010). Složení souborů bylo předem dáno množstvím poskytnutých kosterních vzorků, jejich věkovým a sexuálním složením. Různá délka kostních vzorků způsobila také, že při jednotlivých teplotách spalování byl spálen různý počet kostí, tzn., že z některých kostí nebylo možné získat vzorek pro všechny použité teploty spalování, protože poskytnutý vzorek kosti byl příliš krátký. Do studie byli zahrnuti pouze jedinci, kteří neměli v anamnéze žádnou chorobu ovlivňující kostní mikrostrukturu. Jeden jedinec s diabetem byl zařazen do kontrolního souboru pro zhodnocení získaných regresních rovnic. 113

114 Tab. 10. Věkové složení studijních souborů (N počet jedinců, SD směrodatná odchylka, SE střední chyba průměru). Normalita rozdělení souborů je testována pomocí šikmosti, špičatosti a Shapiro-Wilkova W testu N Aritmetický Věkové Interval spolehlivosti průměr rozpětí 95% Medián SD Nespálené 49 59, (53,89; 65,82) 63,00 20,773 Nespálené, Muži 31 54, (46,66; 61,98) 56,00 20,881 Nespálené, Ženy 19 69, (61,68; 77,90) 77,00 16, C 36 58, (51,15; 65,58) 62,50 21, C, Muži 29 51, (42,93; 60,17) 50,00 22, C, Ženy 13 69, (59,15; 80,08) 77,00 17, C 60 62, (58,12; 67,31) 63,50 17, C, Muži 46 61, (55,75; 66,99) 60,50 18, C, Ženy 24 70, (65,62; 76,30) 76,50 12,640 Variační SE koeficient ShapiroŠikmost Špičatost (%) Wilkův W test Shapiro-Wilkův W test hodnota p (α = 0,05) Nespálené 2,97 34,7-0,42-0,68 0,96 0,0620 Nespálené, Muži 3,75 38,4 0,06-0,53 0,97 0,5223 Nespálené, Ženy 3,86 24,1-1,70 2,96 0,81 0, C 3,55 36,5-0,28-0,90 0,96 0, C, Muži 4,21 44,0 0,24-0,96 0,95 0, C, Ženy 4,81 24,9-2,04 4,95 0,79 0, C 2,30 28,4-0,42-0,50 0,97 0, C, Muži 2,79 30,8-0,24-0,66 0,97 0, C, Ženy 2,58 17,8-1,15 0,78 0,88 0,

115 6.2. ZPRACOVÁNÍ BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU A TVORBA PREPARÁTŮ Postup zpracování biologického materiálu a tvorby histologických preparátů byl vytvořen na základě studia různých prací našich i zahraničních autorů (Wolf, 1954; Frost, 1958; Stout a Teitelbaum, 1976a; Wallin et al., 1985; Vacek, 1988; Herrmann, 1993; Pollett, 1994; Abou-Arab et al., 1995; Bancroft a Stevens, 1996; Čech et al., 1998; Cormier, 2003; Urbanová, 2003). Kosterní materiál byl mechanickou cestou pomocí skalpelu, kleští a chirurgické pinzety zbaven měkkých tkání včetně převážné části periostu. Takto připravené kosti byly řezány pilkou na železo na úseky dlouhé 0,5 až 1 cm (pro nativní vzorky) a 2 až 3 cm (pro spalování). Vzorky určené pro spalování byly řezány větší s ohledem na tepelně podmíněnou destrukci a smrštění tkáně. Každá kost poskytla jeden vzorek pro nativní preparát a jeden až čtyři vzorky pro spalování. Tyto odlišnosti byly způsobeny různou délkou dostupných kosterních vzorků. Nařezané vzorky kostí určené pro nativní preparáty byly připraveny pro výrobu neodvápněných neobarvených histologických výbrusů. Formalín byl ze vzorků vyprán v tekoucí vodě po dobu pěti až šesti hodin. Poté byly kosti ponechány několik dnů při pokojové teplotě k dokonalému vyschnutí. Pro odvodnění a odmaštění vzorků byla použita vzestupná řada etanolu: 70% etanol po dobu 24 hodin, 90% etanol po dobu 48 hodin, 96% etanol po dobu 3 týdnů, 100% etanol po dobu 48 hodin. Pak byly vzorky ponechány při pokojové teplotě, aby dokonale vyschly. Po těchto procedurách se mohlo přistoupit k vlastní výrobě výbrusů. Vzorky kostí byly zality do dvousložkové metylmetakrylátové licí pryskyřice pro technické použití Dentacryl technický (SpofaDental a.s., Praha, Česká republika). Při zalévání byla použita vodní vývěva pro eliminaci vzduchových bublin v zalévacím médiu, její použití však není bezpodmínečně nutné. Zalité vzorky kostí byly řezány na pile s diamantovým kotoučem IsoMet 1000 Precision Saw (Buehler Instruments, Ltd., Lake Bluff, Illinois, USA). Výsledný řez byl ihned vložen mezi dvě podložní skla spojená svorkami, aby se předešlo jeho zkroucení. Pila vytvořila nejtenčí řezy pouze o síle 1 mm, proto musela následovat fáze broušení. Každý řez byl jednou stranou přilepen na podložní sklíčko pomocí sekundového kyanakrylátového lepidla SuperBond Liquid, řada Loctite (Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf, Německo). Strana řezu určená k přilepení nebyla nijak upravována, protože řezy 115

116 vytvořené pilou IsoMet 1000 Precision Saw mají dokonale hladký povrch. Lepidlo zároveň zpevnilo dřeňovou dutinu řezu, do které většinou Dentacryl při zalévání nepronikl. Řezy byly ponechány přes noc pro dokonalé zaschnutí lepidla. Řez byl po zaschnutí lepidla broušen na vodovzdorných brusných papírech o vzestupné hrubosti (č. 240, 360, 600, 1000A, 1200, 1500A a 2000A) na požadovanou tloušťku cca 100 μm. Doporučuje se používat žluté brusné papíry na dřevo a cihlově červené na plasty. Černé brusné papíry určené na kovy jsou příliš ostré a zanášejí řezy černým prachem. Broušení probíhalo na mokrém brusném papíře, takže povrch kosti byl během broušení neustále zvlhčován. Pro zachování dokonale rovného povrchu broušené strany řezu bylo broušení prováděno na skleněné desce a jeho průběh byl průběžně vizuálně kontrolován. Po sbroušení byla volná strana řezu vyleštěna leštící pastou Pragolesk (Pragochema, spol. s r. o., Praha, Česká republika). Její použití však není bezpodmínečně nutné, protože lepidlo i Dentacryl jsou po sbroušení dokonale průhledné. Pokud po ukončení broušení ihned nenásleduje fáze montování, osvědčilo se uskladnit vybroušený řez mezi dvě podložní skla pomocí svorek, aby se zabránilo jeho zkroucení. Řez je výhodnější skladovat suchý, protože vlhkost po nějakém čase způsobuje odlepování lepidla. Výbrusy byly dále odvodněny vzestupnou řadou etanolu (70%, 96%, 100%), projasněny v xylenu a zamontovány mezi krycí a podložní sklíčko pomocí kanadského balzámu, ředěného za studena xylenem EXPERIMENTÁLNÍ SPALOVÁNÍ KOSTERNÍHO MATERIÁLU Vzorky kostí byly spalovány v mikroprocesorem řízené peci značky TC 805 Linn Elektro Therm (Linn Elektro Therm GmbH, Bad Frankenhausen, Německo) v Ústavu geochemie, mineralogie a nerostných zdrojů Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy, Albertov 6, Praha 2. Při spalování byly použity porcelánové spalovací kelímky. Od každého zkoumaného jedince byly v závislosti na délce vzorku kosti, který byl k dispozici při různých teplotách spáleny jeden, dva, tři nebo čtyři úseky téže kosti. Spalování probíhalo při teplotách 600, 700, 800 a 1000 C. Kosti byly umístěny do studené pece, uložené byly v porcelánových spalovacích kelímcích. Cílové teploty bylo dosaženo za třicet minut a při této teplotě pokračovalo spalování dalších třicet minut. Poté byly vzorky ponechány v peci až do úplného vychladnutí (cca 24 hodin). Vzorky byly z pece vyndávány již studené. To zabraňuje jejich nežádoucímu rozpadání, neboť v průběhu chladnutí se vzorky poněkud 116

117 zpevní vzdušnou vlhkostí (Dokládal, 1999a). Následující procedury zalévání, řezání, broušení a montování byly stejné jako u nativních vzorků. Preparáty nebyly barveny DIGITALIZACE MIKROSKOPICKÝCH SNÍMKŮ Digitalizace snímků z histologických preparátů byla prováděna ve světelném mikroskopu Olympus BX50 s digitálním fotoaparátem Olympus C-7070 Wide Zoom (Olympus Europa Holding GmbH, Hamburg, Německo). K co nejlepšímu zobrazení histologických struktur byl použit Nomarského diferenciální interferenční kontrast v kombinaci s různými filtry (Bright Field, fázový kontrast) nebo bez nich. Snímky byly snímány a upravovány v počítačovém programu QuickPHOTO CAMERA 2.2 (Promicra, s. r. o., Praha, Česká republika) a ukládány ve formátu JPG. Již v této fázi byl na fotografiích nastaven optimální jas a kontrast pro co nejlepší zviditelnění struktur. Mikroskopické snímky byly snímány při stonásobném zvětšení (okuláry 10 + objektiv 10 ). V nativních preparátech byla fotografována celá plocha řezu, z níž byla pro vlastní analýzu vybrána nejlépe hodnotitelná mikroskopická pole. Ve výjimečných případech nebylo možné celou plochu řezu zachytit (destrukce kompakty, artefakty v řezu znemožňující identifikaci struktur, příliš tenký nebo naopak silný výbrus). Ve spálených kostech byly vzhledem ke značné destrukci kompakty fotografovány všechny hodnotitelné úseky, ze kterých byla pro analýzu také vybrána nejlépe zachovalá mikroskopická pole. Fotografie byly opatřeny měřítkem v µm. Vyfotografované mikroskopické pole mělo při stonásobném zvětšení čtvercový tvar o velikosti µm. Mikroskopické pole vždy obsahovalo celou tloušťku kompaktní kosti včetně periostálního i endostálního okraje kompakty a části dřeňové dutiny. Některé zajímavé oblasti řezů byly vyfotografovány také při čtyřistanásobném zvětšení (okuláry 10 + objektiv 40 ) HISTOLOGICKÁ ANALÝZA VZORKŮ Pokud to bylo nutné, byla každá fotografie nejprve upravena v programu Adobe Photoshop Elements 6.0 (Adobe Systems Incorporated, Microsoft Corporation, USA). Úprava spočívala především v nastavení lepšího jasu a kontrastu pro zviditelnění struktur a dále v automatickém doostření snímku. Histologická analýza preparátů byla provedena v počítači na digitálních fotografiích za použití programu pro analýzu obrazu SigmaScan Pro 5 (Systat, Inc., Richmond, California, 117

118 USA). V každé kosti byla vybírána nejlépe zachovalá mikroskopická pole. Pole se vybírají tak, aby se vyloučily zřetelné anomálie, příčně ležící osteony, destruovaná místa, praskliny v kompaktě apod. Původní plán práce počítal se sledováním histologické stavby kosti ve čtyřech mikroskopických polích, na vnitřní a vnější straně zakřivení žebra měla být sledována dvě pole v pokud možno stejných lokalizacích u všech zkoumaných kostí. Hodnocení kosti ve čtyřech polích mělo minimalizovat možnost hodnocení atypického pole a zároveň oproti hodnocení celého příčného řezu poskytnout úsporu času při sběru dat. Vzhledem k někdy značnému poškození kostí, zejména spálených, však nebylo vždy možné toto stanovisko dodržet a kosti byly analyzovány v jednom až čtyřech polích, přičemž na každé straně žebra byla hodnocena maximálně dvě pole. Striktní analýza pouze čtyř polí by zejména u spálených kostí vedla k velkému omezení počtu analyzovaných jedinců i proměnných. Vzhledem k tomu, že mikroskopické pole obsahovalo vždy celou tloušťku kompaktní kosti včetně periostu, endostu a části dřeňové dutiny, nemělo by případné hodnocení jen jednoho pole v řezu vést k atypickým výsledkům (Dobisíková, 2010). Hodnocení v jednom až čtyřech polích naopak umožňuje analyzovat i velmi poškozené spálené kosti nebo kosti archeologického původu, u kterých často není možné nalézt čtyři dobře hodnotitelná pole. V kompaktní kosti bylo sledováno celkem 28 proměnných, všechny míry byly měřeny v mikrometrech (µm), některé byly poté převáděny na mm. Proměnné č. 24 až 28 byly analyzovány pouze u nespálených kostí, protože ve spálených kostech je nebylo možné spolehlivě identifikovat. Všechny hodnoty byly zapisovány do příslušného formuláře, znázorněného v Tabulce 11. V kostech byly hodnoceny tyto proměnné: 1. TLOUŠŤKA KOMPAKTY (TL_KOM; µm): Tloušťka kompaktní kosti je měřena kolmo k průběhu periostu a endostu. Měříme v každém pozorovaném poli pětkrát v pravidelných odstupech a zprůměrujeme. 2. POČET INTAKTNÍCH OSTEONŮ NA MM² (POC_OST; #/mm²): Počet intaktních osteonů v poli / plocha kompakty v poli * Jde o všechny intaktní osteony, včetně těch na periférii pole, pokud jsou jejich Haversovy kanálky celé viditelné v pozorovaném poli. Intaktní osteon je obklopen koncentrickými lamelami s cementovou linií na periférii a má 100% obvodu Haversova kanálku neporušených, tzn., že žádná jiná struktura jej nenarušuje. Pokud byl kanálek osteonu viditelný v poli jen zčásti, nebyl takový osteon mezi intaktní osteony počítán. 118

119 3. PROCENTO CELKOVÉ PLOCHY OSTEONŮ (PR_OST; %): Celková plocha osteonů v poli / plocha kompakty v poli * 100. Jedná se o plochu všech typů intaktních osteonů v poli, včetně těch, které byly viditelné jen částečně na periférii pole. 4. PLOCHA OSTEONU (PL_OST; µm²): Je to průměrná plocha intaktního osteonu, včetně plochy Haversova kanálku. Tato a následující proměnné (č. 4-11) se týkají pouze osteonů, které mají celou plochu viditelnou v pozorovaném poli, jsou proříznuty transverzálně a nikoli šikmo, nejsou příliš protažené nebo driftující a mají jen jeden Haversův kanálek. Ostatní typy osteonů (osteony, které byly proříznuty výrazně šikmo či podél dlouhé osy a proto měly prodloužený tvar, byly dva a vícekrát delší než širší, měly více než jeden Haversův kanálek, driftující osteony a osteony, které byly viditelné jen částečně na periférii pole) jsou zahrnuty pouze do Počtu intaktních osteonů na mm² a Procenta celkové plochy osteonů (č. 2 a 3). 5. OBVOD OSTEONU (OBV_O; µm). 6. MAXIMÁLNÍ OSA OSTEONU (MAX_O; µm). 7. MINIMÁLNÍ OSA OSTEONU (MIN_O; µm). 8. PRŮMĚR OSTEONU (PRUM_O; µm): Vypočteme z předchozích dvou proměnných podle vzorce (MAX_O + MIN_O) / FERET PRŮMĚR OSTEONU (F_PR_O; µm): Jedná se o průměr osteonu, pokud by měl při stejné ploše kruhový tvar. Tuto proměnnou počítá automaticky program SigmaScan Pro SHAPE FACTOR OSTEONU (SFAC_OST): Tato hodnota popisuje tvar objektu. Kruh má shape factor 1, přímka má shape factor 0. Shape factor je definován rovnicí: 4π * plocha objektu / obvod objektu². Tuto proměnnou rovněž počítá program SigmaScan Pro COMPACTNESS OSTEONU (C_OST): Také tato veličina popisuje tvar objektu. Kruh má compactness 12,57, compactness přímky se blíží nekonečnu. Compactness je dána rovnicí: Obvod objektu² / plocha objektu. Výpočet je také proveden automaticky v programu SigmaScan Pro PROCENTO CELKOVÉ PLOCHY HAVERSOVÝCH KANÁLKŮ (PR_KAN; %): Celková plocha Haversových kanálků v poli / plocha kompakty * 100. Protože byly kanálky často vyplněny tmavou hmotou, byla hranice kanálku stanovena jako světlý okraj kostní tkáně. 13. PLOCHA HAVERSOVA KANÁLKU (PL_KAN; µm²): Tato a další proměnné (č ) se týkají pouze Haversových kanálků, které nejsou nadměrně protažené 119

120 (dva nebo vícekrát dlouhé než široké) a nejsou tvarově zdeformovány vyústěním několika Volkmannových kanálků. Takové Haversovy kanálky byly zahrnuty pouze do Procenta celkové plochy Haversových kanálků (č. 12). 14. OBVOD HAVERSOVA KANÁLKU (OBV_K; µm). 15. MAXIMÁLNÍ OSA HAVERSOVA KANÁLKU (MAX_K; µm). 16. MINIMÁLNÍ OSA HAVERSOVA KANÁLKU (MIN_K; µm). 17. PRŮMĚR HAVERSOVA KANÁLKU (PRUM_K; µm). 18. FERET PRŮMĚR HAVERSOVA KANÁLKU (F_PR_K; µm). 19. SHAPE FACTOR HAVERSOVA KANÁLKU (SFAC_KAN). 20. COMPACTNESS HAVERSOVA KANÁLKU (C_KAN). 21. OBVOD HAVERSOVA KANÁLKU / OBVOD OSTEONU (OK_OO). 22. PLOCHA HAVERSOVA KANÁLKU / PLOCHA OSTEONU (PK_PO). 23. PRŮMĚR HAVERSOVA KANÁLKU / PRŮMĚR OSTEONU (PRK_PRO). 24. POČET NON-HAVERSOVÝCH KANÁLKŮ NA MM² (P_NON_H; #/mm²): Počet non-haversových kanálků v poli / plocha kompakty * Non-Haversův kanálek není obklopen koncentrickými lamelami a obvykle se nachází mezi obvodovými lamelami. 25. PROCENTO PLOCHY VNĚJŠÍCH OBVODOVÝCH LAMEL (PR_L_VN; %): Celková plocha vnějších obvodových lamel v poli / plocha kompakty * 100. Jedná se o obvodové lamely, které se nacházejí pod periostem. 26. PROCENTO PLOCHY VNITŘNÍCH OBVODOVÝCH LAMEL (PR_LAM; %): Celková plocha vnitřních obvodových lamel v poli / plocha kompakty * 100. Jde o obvodové lamely nacházející se v sousedství endostu. Pokud obvodové lamely vyplňují celou plochu kompaktní kosti, takže není možné rozeznat, které obvodové lamely jsou vnější, a které vnitřní, rozdělíme příslušnou plochu obsazenou lamelami na dvě stejné poloviny. Vnější a vnitřní obvodové lamely pak zabírají stejnou plochu a stejné procento kompaktní kosti. Krátké úseky obvodových lamel, které nelze rozeznat od fragmentů velkých osteonů, nepočítáme. Obvodové lamely jsou jasně patrné silně pruhované vrstvy s velkými protáhlými lakunami. Úseky s nezřetelnou strukturou, která není zřetelně paralelní s povrchem kosti, nepočítáme. Rovněž úseky, které nekomunikují s povrchem kosti a jsou uzavřené mezi osteony nebo fragmenty osteonů, nepočítáme. Mohlo by se jednat o zbytky velkých osteonů. 27. POČET RESORPČNÍCH DUTIN NA MM² (POC_DUT; #/mm²): Počet resorpčních dutin v poli / plocha kompakty * Resorpční dutina je prostor, který není obklopen souvislou vrstvou koncentrických lamel. Struktura se souvislou vrstvou koncentrických lamel je považována za mladý osteon s velkým Haversovým kanálkem. 120

121 28. PROCENTO CELKOVÉ PLOCHY RESORPČNÍCH DUTIN (PR_DUT; %): Celková plocha resorpčních dutin v poli / plocha kompakty * 100. Měříme včetně dutin viditelných jen zčásti na periférii pozorovaného pole. Při použití programu pro analýzu obrazu SigmaScan Pro 5 doporučujeme pro analýzu jednotlivých mikrostruktur použít následující barevné vrstvy: Plocha kompakty Aqua, měření osteonů Red, měření Haversových kanálků Green, měření obvodových lamel Blue, měření resorpčních dutin Yellow. Při zápisu do formuláře při zřejmé nepřítomnosti dané struktury vyplníme hodnotu 0. Při nemožnosti strukturu spolehlivě identifikovat nebo měřit necháme políčko prázdné. Průměr hodnoty pro celý řez počítáme jen z polí, kde je vyplněna nějaká hodnota, a to včetně 0 jako známky nepřítomnosti dané struktury. Pokud nejsou v pozorovaném poli přítomny žádné osteony, nevyplňujeme u rozměrů osteonů (obvod, průměr, plocha atd.) žádné hodnoty, totéž platí samozřejmě i pro Haversovy kanálky. V případě prázdných políček pak průměr pro celý řez počítáme jen z políček vyplněných, tzn. jen z těch polí, kde se osteony vyskytovaly. Tímto postupem si zajistíme získání správných průměrných hodnot jednotlivých rozměrů osteonů. Kdybychom totiž při nepřítomnosti osteonů v pozorovaném poli vyplňovali u jejich rozměrů hodnotu 0, dostali bychom při zprůměrování hodnoty pro celý řez zkreslený výsledek. Při histologické analýze mikrostruktur se vyskytlo několik obtíží, které provázejí všechny histologické metody analýzy kostní tkáně. U žebra, které má tenkou stěnu, může být při měření plochy kompakty obtížné oddělit trámce spongiózy od zbytku kosti, zvláště u velmi porózních vzorků. Trámce je nutné vždy oddělovat na jejich bázi a při nejasnostech se orientovat podle celkové tloušťky kompakty v pozorovaném poli. Někdy je totiž obtížné rozhodnout, zda to, co v kosti vidíme, je např. velká resorpční dutina nebo již spongióza. Někdy je obtížné odlišit resorpční dutinu a Haversův kanálek, pokud nejsou jasně vidět lamely tento kanálek obkružující, toto se týká mladých osteonů s velkým Haversovým kanálkem. Stejný problém se může týkat i odlišení Haversových a non-haversových kanálků, pokud mají non-haversovy kanálky několik koncentrických lamel. Rovněž přesné stanovení rozsahu obvodových lamel může být do jisté míry subjektivní, pokud se v jejich okolí vyskytují kratší úseky rovnoběžně uložených lamel zaměnitelné s fragmenty velkých osteonů. Šikmo proříznuté osteony se často jeví jako resorpční dutina. Při rozlišování oválného a šikmo proříznutého osteonu se orientujeme podle rovnoběžnosti lamel. U oválného osteonu, který je proříznutý příčně, jsou lamely všude stejně široké. U šikmo proříznutého osteonu nejsou lamely zcela rovnoběžné, nýbrž se na určitém místě zužují a jinde jsou zase nadměrně 121

122 široké. U spálených kostí lze resorpční dutiny snadno zaměnit za spongiózní dutiny, praskliny nebo Volkmannovy kanálky. Na podobné problémy, vycházející ze samotné podstaty histologických metod, upozorňoval již Lazenby (Lazenby, ). Obr. 52. Příklad poškození kompaktní kosti žárem, které znemožňuje histologickou analýzu. Teplota spalování 700 C. Zvětšení 100. Žena, 40 let. 122

123 Tab. 11. Vzor formuláře použitého pro měření vzorků Číslo vzorku: Teplota spalování: Pohlaví: Věk: 1: Měřená Pole č. proměnná (č. fotografie) Plocha kompakty v pozorovaném poli (µm²) Tloušťka kompakty (µm); (průměr z 5 měření) Počet osteonů v pozorovaném poli Počet osteonů / plocha kompakty * (počet/mm²) Plocha osteonu (včetně kanálku, µm²) Celková plocha osteonů v poli (µm²) Celková plocha osteonů / plocha kompakty * 100 (% plochy) Obvod osteonu (µm) Max. osa osteonu (µm) Min. osa osteonu (µm) Průměr osteonu (µm) Feret průměr osteonu (µm) Plocha Haversova kanálku (µm²) Celková plocha Hav. kanálků v poli (µm²) Celková plocha H. kanálků / plocha kompakty * 100 (% plochy) Obvod Hav. kanálku (µm) Max. osa Hav. kanálku (µm) Min. osa Hav. kanálku (µm) Průměr Hav. kanálku (µm) Feret průměr Hav. kanálku (µm) Obvod Hav. kanálku / obvod osteonu Plocha Hav. kanálku / plocha osteonu Průměr Hav. kanálku / průměr osteonu Počet non-havers. kanálků v poli Počet non-hav. kanálků / plocha kompakty * (počet/mm²) Celková plocha vnějších obvodových lamel v poli (µm²) Celková plocha vnitřních obvodových lamel v poli (µm²) Celk. plocha vnějš. obvod. lamel / plocha komp. * 100 (% plochy) Celk. plocha vnitř. obvod. lamel / plocha komp. * 100 (% plochy) Počet resorpčních dutin v poli Počet res. dutin / plocha kompakty * (počet/mm²) Celková plocha resorpč. dutin v poli (µm²) Celková plocha res. dutin / plocha kompakty * 100 (% plochy) Compactness osteonů Compactness Hav. kanálků Shape factor osteonů Shape factor Hav. kanálků 2: 3: 4: Průměr: 123

124 6.6. STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ DAT Statistické zpracování dat bylo provedeno v programu STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA). Ze statistického zpracování byly předem vyloučeny proměnné, které byly závislé na velikosti pozorovaného pole a sloužily jen k dílčím výpočtům ostatních proměnných (např. plocha kompaktní kosti v pozorovaném poli, počet jednotlivých proměnných v pozorovaném poli a celková plocha jednotlivých proměnných v pozorovaném poli). Proměnné závislé na velikosti pozorovaného pole jsou nevhodné z toho důvodu, že je obtížné nalézt mikroskopy produkující přesně stejná mikroskopická pole. Metoda by pak byla obtížně reprodukovatelná a opakovatelná. Vzhledem k poškození kostí a z toho vyplývající absenci dat u některých jedinců byly vyloučeny ještě některé další proměnné, které byly původně také zkoumány, např. počet a plocha fragmentů a některé ukazatele týkající se resorpčních dutin. Tyto proměnné bylo totiž možné analyzovat jen u malého množství jedinců. Původně bylo v kostech analyzováno celkem 46 proměnných, do konečného zpracování jich však bylo zařazeno jen 28. Pro odhad dožitého věku a popis změn vyvolaných spalováním byly analyzovány tři soubory jedinců: soubor nespálených kostí a soubory kostí spálených při 700 C a 800 C. U kostí spálených při 600 C byl k dispozici pouze malý počet vzorků (N = 6), proto byly ze statistického zpracování vyloučeny. Jejich struktura však byla velmi dobře zachována a většina mikrostruktur byla snadno identifikovatelná. Již ve starších studiích (Herrmann, 1977a) se uvádí, že histologická analýza kostí spálených při teplotách nižších než 700 C poskytuje stejné výsledky jako analýza nespálených kostí, protože jejich vzhled je téměř identický s nespálenou kostí. Vzorky spálené při 1000 C nemohly být analyzovány pro značnou destrukci kompaktní kosti. Jednotlivé mikrostruktury kosti, zejména osteony, Haversovy kanálky a někdy i obvodové lamely, byly sice u těchto vzorků patrné, ale kompakta byla rozpadlá, popraskaná, chyběly v ní velké úseky kosti a její vnější i vnitřní vrstvy byly často zcela destruovány. Tudíž nebylo možné provést analýzu na požadované úrovni (Obr. 52, Příloha 7). Všechny studované soubory pocházely ze skupiny biologických vzorků laskavě poskytnutých Oddělením soudního lékařství Nemocnice Na Bulovce v Praze. Analyzovány byly soubory zahrnující obě pohlaví dohromady a také zvlášť soubory mužů a žen (Tab. 10). Data histomorfologických proměnných byla u každého vzorku zprůměrována z jednoho až čtyř polí podle zachovalosti kosti (Tab ). Pokud není uvedeno jinak, byly všechny statistické operace provedeny na 5% hladině významnosti (α = 0,05). Tato hladina určuje hodnotu p, na které zamítáme nulovou hypotézu 124

125 příslušné statistické metody. Jinými slovy, nulovou hypotézu zamítáme tehdy, pokud je dosažená hodnota p < 0,05. Výsledek testu pak označujeme jako statisticky významný na dané hladině (Kubánková a Hendl, 1986) Deskriptivní statistiky výběrových souborů Pro popis dožitého věku a jednotlivých histomorfologických proměnných byly u všech souborů použity následující popisné statistiky: aritmetický průměr, medián, minimum a maximum, variační koeficient, směrodatná odchylka (SD), střední chyba průměru (SE) a 95% interval spolehlivosti pro průměr (Tab. 10, 12-22). Početní, věkové a sexuální složení výběrových souborů bylo také popsáno pomocí frekvenčních tabulek (Příloha 1). Aritmetický průměr a medián patří mezi míry polohy, které určují, kde na číselné ose je výběrová distribuce umístěna. Minimum a maximum, směrodatná odchylka, střední chyba průměru a variační koeficient jsou míry variability, které ukazují rozptýlenost dat kolem střední hodnoty a jejich rozdělení. Směrodatná odchylka ukazuje uspořádání jednotlivých prvků kolem průměru. Střední chyba průměru vyjadřuje přesnost, s jakou je odhadnut průměr a ukazuje náhodné kolísání jednotlivých hodnot kolem průměru. Variační koeficient vyjadřuje poměr směrodatné odchylky a průměru v procentech a ukazuje variabilitu souboru nezávisle na zvolených jednotkách měření. Menší hodnota variačního koeficientu v porovnání s ostatními soubory ukazuje, že variabilita daného souboru je oproti ostatním souborům menší. Interval spolehlivosti pro průměr udává interval hodnot kolem průměru, v němž očekáváme skutečný (populační) průměr daného parametru se zvolenou pravděpodobností. Šířka intervalu spolehlivosti je závislá na rozsahu výběru, neboť se stoupajícím počtem měření se interval spolehlivosti zužuje (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007) Normalita rozdělení souborů U výběrových souborů bylo zjišťováno také jejich rozdělení neboli distribuce, která ukazuje rozložení náhodných veličin. Nejdůležitějším rozložením ve statistice je normální (Gaussovo) rozdělení, které je charakterizováno průměrem μ, který určuje polohu na ose x a směrodatnou odchylkou σ, která určuje rozptýlení hodnot kolem průměru. Normální rozdělení potom zapisujeme ve tvaru N (μ; σ). Nejvyšší četnosti u normálního rozdělení dosahují hodnoty vyskytující se kolem průměru, a čím více se dané hodnoty od průměru vzdalují, tím nižší jsou jejich četnosti. Graficky lze normální rozdělení znázornit jako jednovrcholovou 125

126 symetrickou křivku. Při normálním rozdělení platí, že v intervalu μ ± σ se nachází 68,3% populace, v intervalu μ ± 2σ je to 95,5% populace a v intervalu μ ± 3σ se nachází 99,7% populace. Obráceně můžeme stanovit, že 95% populace obsahuje interval μ ± 1,96σ; 99% populace obsahuje interval μ ± 2,58σ a konečně 99,9% populace obsahuje interval μ ± 3,29σ (Kubánková a Hendl, 1986). Normalita rozdělení dožitého věku a jednotlivých proměnných se testovala pomocí histogramu, šikmosti, špičatosti a Shapiro-Wilkova W testu (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007; Tab. 10, 15, 19, 23, 54; Příloha 2). Histogram má na ose x ve zvolených intervalech zaneseny hodnoty znaku, které se ve výběru vyskytly. Nad těmito hodnotami jsou zakresleny sloupce, které svou výškou odpovídají četnosti znaku. Histogram umožňuje rychlé vizuální posouzení distribuce znaku a zároveň srovnání s proloženou křivkou normálního rozdělení. Naše histogramy dožitého věku jsou poněkud zubaté, což je dáno malou velikostí některých zkoumaných souborů. Čím více jedinců soubor obsahuje, tím více se distribuce blíží normálnímu rozdělení. Tvar histogramů lze rovněž upravit rozšířením zvolených tříd na ose x, existují rovněž i matematická pravidla pro rozdělení souboru do tříd (Hill a Lewicki, 2007). V našem případě bylo nutné zvolit desetileté věkové intervaly, tak jak je zvykem v literatuře pojednávající o tomto tématu. Šikmost a špičatost popisují tvar distribuce, u normálního rozdělení by se měla jejich hodnota přibližně rovnat 0. Koeficient šikmosti obecně nabývá hodnot od -1 do +1, záporné znaménko značí pravostranně nesymetrickou (posun distribuce k vyšším hodnotám) a kladné znaménko levostranně nesymetrickou (posun k nižším hodnotám) distribuci. Rozložení špičatější než normální má kladné znaménko, rozložení plošší záporné znaménko. Shapiro-Wilkův W test pomocí hodnoty W ukazuje, z kolika procent se rozdělení výběrového souboru blíží normálnímu. Hodnota p je nejmenší hladina, s jakou zamítáme hypotézu o normalitě rozdělení. Soubor nemá normální rozdělení, pokud je dosažená hodnota p < 0,05 (při zvolené hladině α = 0,05). Za použití histogramu byl v souboru nespálených kostí vyloučen 1 jedinec s extrémně vysokým věkem z důvodu zachování normálního rozdělení dožitého věku v souboru. V případě souboru kostí spálených při 700 C bylo takových jedinců vyloučeno 6 a v případě skupiny kostí spálených při 800 C bylo vyloučeno 10 jedinců, kteří způsobovali posun věkové distribuce směrem k vysokému věku. Pomocí tohoto postupu byla ve výběrových souborech pro obě pohlaví zachována normální distribuce dožitého věku. Ve skupinách žen nebylo možné takový postup použít kvůli malému počtu jedinců, a skupiny žen proto nemají normální rozdělení věkové distribuce. Skupiny mužů měly normální rozdělení věku bez 126

127 nutnosti dalších úprav. Normální rozdělení věkové distribuce je důležité pro správné provedení regresní analýzy odhadu dožitého věku. Rovněž u některých histomorfologických proměnných se vyskytlo nenormální rozdělení dat (Tab. 15, 19, 23). Při nenormálním rozdělení dat můžeme postupovat různými cestami. Data lze znormalizovat jejich transformací, např. pomocí přirozeného logaritmu, druhé odmocniny apod., nebo odstranit jedince s odlehlými hodnotami. Dále je možné spolehnout se na dostatečnou robusticitu použitého testu, což platí např. pro T-test. Je také možné použít různé neparametrické testy, které jsou založeny na pořadí zjištěných hodnot, jejich porovnání s mediánem, znaménku diference dvou hodnot apod. Pokud se však studovaný soubor skládá z 30 a více jedinců, můžeme rozdělení dat považovat za normální (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007) Popis věkových změn v kompaktní kosti Závislost jednotlivých proměnných na dožitém věku byla zjištěna pomocí jednoduché lineární korelace, která popisuje vztah dvou proměnných spojených lineární funkcí (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007). Pro zobrazení výsledků byla použita korelační matice, kde jsou zobrazeny vzájemné korelační koeficienty (tzv. Pearsonův korelační koeficient r) jednotlivých proměnných (Příloha 3). Korelační koeficient je mírou linearity a síly vztahu mezi dvěma náhodnými veličinami a může nabývat hodnot od -1 do +1. Záporné znaménko u korelačního koeficientu znamená pokles hodnoty dané proměnné s věkem a kladné znaménko zvyšování hodnoty proměnné s rostoucím věkem. Pokud je r = 0, mezi dvěma veličinami není žádný vztah. Korelace je tím větší, čím více se r blíží hodnotě 1 či -1. Velikost korelačního koeficientu může být také ovlivněna počtem vyšetřených jedinců nebo vychýlenými hodnotami ve výběru. Pro posouzení významnosti korelačního koeficientu se používají tabulky, kde jsou uvedeny hodnoty kritických mezí pro daný korelační koeficient v závislosti na stupních volnosti. Při použití N párových hodnot použitých k výpočtu má vypočtený korelační koeficient N 2 stupně volnosti. Pokud absolutní hodnota vypočteného korelačního koeficientu přesahuje hodnotu uvedenou v tabulce pro požadovanou hladinu významnosti, je korelace statisticky významná a vztah mezi dvěma veličinami je prokázán (Kubánková a Hendl, 1986). Věkové změny jednotlivých proměnných byly také znázorněny graficky pomocí bodového grafu (Categorized Scatterplot), na kterém je vyznačena regresní přímka (Příloha 4). Změny byly sledovány jak pro obě pohlaví dohromady, tak i zvlášť. Již samotným 127

128 vizuálním prošetřením bodového grafu je možné zjistit, zda je mezi uvažovanými veličinami lineární vztah. V bodových grafech byla na osu x umístěna data jednotlivých proměnných a na osu y dožitý věk. Počítačový program Statistica 6.0 při takovém uspořádání os u každého grafu také vypočítal jednoduchou lineární regresní rovnici odhadu dožitého věku pro příslušnou proměnnou. Tyto rovnice byly v grafech ponechány jen pro ilustraci, protože vztahy mezi mikrostrukturami lidské kompaktní kosti a dožitým věkem nelze pravděpodobně dostatečně popsat jednoduchou lineární regresní rovnicí, která je založena vždy jen na jedné proměnné. Grafy s vyznačenou regresní přímkou umožňují sledovat zvyšování nebo snižování hodnot jednotlivých proměnných s dožitým věkem a také porovnat chování proměnných s rostoucím věkem u jednotlivých pohlaví, zda je stejné nebo se liší Rozdíly mezi pohlavími Pro analýzu odlišností mikrostruktur mezi pohlavími byl použit Mann-Whitney U test, který je neparametrickou obdobou T-testu pro dva nezávislé soubory (Tab ; Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007). Tento test byl použit proto, že analyzované soubory žen neměly příliš vysoký počet jedinců a neměly normální rozdělení věkové distribuce i některých proměnných (Tab. 15, 19, 23). Při tomto testu je nutné mít jednu nezávislou proměnnou, která zařazuje jedince do dvou porovnávaných skupin, v našem případě je to pohlaví. MannWhitney U test je pořadový test, takže je počítán na základě součtu pořadí a ne na základě průměru. Hodnota U udává pořadovou veličinu a hodnota Z vyjadřuje její převedení na normální rozdělení. Hodnota p je nejmenší hladina pro hodnotu Z, na které se zamítá hypotéza, že veličiny obou porovnávaných souborů jsou stejné. Při zvolené hladině α = 0,05 tedy platí, že pokud je p < 0,05, tak se oba porovnávané soubory v dané proměnné liší (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007). Protože skupiny žen u kostí nespálených i kostí spálených při 700 a 800 C zahrnovaly jedince převážně ve vyšším věku, byla obě pohlaví porovnána také pomocí analýzy kovariance. Tato analýza umožňuje zhodnotit vliv pohlaví na jednotlivé proměnné s vyloučením vlivu dožitého věku (Kubánková a Hendl, 1986) Popis změn vyvolaných spalováním Pro vzájemné porovnávání souborů nespálených kostí a kostí spálených při 700 a 800 C byly použity následující testy: T-test pro závislé soubory, Wilcoxonův párový test a T128

129 test pro nezávislé soubory (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007). Pro popis změn vyvolaných v kostech spalováním byly použity pouze soubory obsahující obě pohlaví dohromady, protože při rozdělení souborů na jednotlivá pohlaví se zejména u žen vyskytoval malý počet jedinců, takže zde bylo nebezpečí nenormální distribuce některých proměnných a také věku (Tab. 10, 15, 19, 23). Soubory kostí nespálených a spálených při 700 C a 800 C byly mezi sebou porovnány nejprve pomocí T-testu pro závislé soubory, kdy byly pro testování vybrány dvojice stejných jedinců zastoupených v obou porovnávaných souborech. Tento postup byl použit proto, že zastoupení jedinců v našich souborech nebylo zcela identické (Tab. 10). Soubory sice obsahovaly převážně stejné jedince, ale byly v nich i někteří jedinci navíc, kteří se nevyskytovali v ostatních souborech. Bylo to způsobeno jednak tím, že poskytnuté kosterní vzorky byly různě velké a ne všechny bylo možné rozdělit na tolik částí, aby mohly být spáleny při všech použitých teplotách, a pak také poškozením některých vzorků při spalování nebo při tvorbě výbrusů, kde pak nebylo možné provést histologickou analýzu. Výběrem dvojic stejných jedinců je tedy možné sledovat účinek spalování na jednotlivé jedince, protože je odstraněn vliv různého složení porovnávaných souborů. Párový T-test je založen na průměrném rozdílu mezi hodnotami obou porovnávaných souborů. Když platí nulová hypotéza, že se dané soubory neliší, bude se průměrný rozdíl mezi hodnotami obou souborů pohybovat kolem 0. Při dosažené hladině p < 0,05 zamítáme nulovou hypotézu, podle které se oba soubory v dané proměnné neliší (Kubánková a Hendl, 1986). Protože skupina dvojic pro kosti spálené při 700 a 800 C obsahovala pouze 28 jedinců, a tedy zde bylo nebezpečí nenormálního rozdělení některých proměnných, byla tato skupina porovnána také pomocí neparametrického Wilcoxonova párového testu. Tento test pracuje s mediánem, je založený na pořadí hodnot diferencí mezi oběma soubory a testuje nulovou hypotézu, že mezi středními hodnotami proměnných není rozdíl. Veličina T představuje pořadovou statistiku daných dvojic v závislosti na jejich vzdálenosti od mediánu, hodnota Z její převedení na normální rozdělení. Hodnota p je dosažená hladina pro Z, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se porovnávané soubory neliší. Tedy při zvolené hladině α = 0,05 se oba soubory v dané proměnné liší, pokud je p < 0,05 (Kubánková a Hendl, 1986). Wilcoxonův párový test byl pro zajímavost použit i u dalších dvou případů porovnávání dvojic stejných jedinců (nespálené 700 C a nespálené 800 C). Nakonec byly soubory spálených a nespálených kostí porovnány také pomocí T-testu pro dva nezávislé soubory. V tomto případě byli již v souborech ponecháni všichni jedinci, i ti, kteří neměli odpovídající dvojici v druhém porovnávaném souboru. Protože soubory 129

130 obsahovaly více než 30 jedinců, předpokládá se u všech dat normální rozdělení. T-test pro dva nezávislé soubory testuje nulovou hypotézu, že průměr hodnot obou porovnávaných náhodných výběrů se neliší. Nulová hypotéza se zamítá, pokud je dosažená hladina p < 0,05 (Kubánková a Hendl, 1986). Výsledky všech tří typů testů byly vzájemně porovnány (Tab. 41). Graficky byl pro vyjádření změn způsobených spalováním použit tzv. Box &Whisker plot, pomocí kterého se sleduje vliv spalování na mikrostrukturu kompaktní kosti u jednotlivých pohlaví (Příloha 5). Tento graf ukazuje rozpětí nebo distribuci hodnot vybraných proměnných a je možné ho zobrazit pro jednotlivé skupiny případů zvlášť podle určitých proměnných, v našem případě podle teploty spalování a pohlaví. Graf má tvar krabice s vybíhajícími úsečkami. Uprostřed krabice je znázorněn průměr nebo medián, rozsah krabice a úseček zobrazuje různé ukazatele variability, např. kvartily, směrodatnou odchylku nebo střední chybu průměru. Často bývá krabice ohraničena dolním a horním kvartilem, které ze souboru oddělují 25% prvků na každé straně a v boxu je tak uzavřeno 50% výběru. Úsečky mohou být také ohraničeny maximální a minimální hodnotou ve výběru. Odlehlé hodnoty bývají na grafu vyznačeny jako samostatné body (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007). Jako míry polohy a variability jsou v našem box-plotu použity aritmetický průměr, směrodatná odchylka (SD) a interval 1,96SD, ve kterém se při normálním rozdělení nachází 95% populace (Kubánková a Hendl, 1986) Regresní analýza, regresní rovnice a jejich kontrola Závislost jednotlivých proměnných na věku a závislost proměnných navzájem byla zjištěna pomocí jednoduché lineární korelace vyjádřené ve formě korelační matice (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007; Příloha 3). Znalost vzájemné závislosti proměnných je důležitá pro konstruování regresních rovnic, do kterých mohou vstupovat pouze vzájemně nezávislé proměnné. Jednoduchá korelace umožňuje stanovit vztah dvou kvantitativních veličin měřených na objektech základního souboru. Síla vztahu je popsána pomocí Pearsonova korelačního koeficientu r, který nabývá hodnot od +1 do -1. Pokud má r kladnou hodnotu, obě veličiny zároveň rostou nebo klesají. Při záporném r jedna veličina roste, zatímco druhá klesá (Kubánková a Hendl, 1986). Pro výpočet regresních rovnic odhadu dožitého věku byla použita mnohonásobná lineární regrese ve formě schodovité regrese a standardní regrese, které se od sebe liší v postupu zařazení jednotlivých nezávislých proměnných do regresní rovnice (Hill a Lewicki, 130

131 2007). Mnohonásobná lineární regrese byla zvolena proto, že se předpokládá, že odhad dožitého věku nelze založit na sledování pouze jednoho prediktoru. Odhady dožitého věku založené jen na jedné proměnné jsou v literatuře považovány za nespolehlivé. Oba uvedené typy mnohonásobné lineární regresní analýzy byly použity zároveň a rovnice pak byly vybrány podle mnohonásobného korelačního koeficientu, koeficientu determinace a střední chyby odhadu. Použití mnohorozměrné analýzy dat umožňuje vyvozovat globálnější a rozmanitější závěry než izolovaná analýza jednotlivých proměnných (Kubánková a Hendl, 1986). V regresní analýze se studuje vztah mezi jednou závislou proměnnou (Y) a několika dalšími nezávislými proměnnými (X). Vztah je vyjádřen matematickým modelem, což je regresní rovnice udávající výpočet závislé proměnné na základě hodnot nezávislých proměnných. Regresní analýzu použijeme obvykle ve třech typech zkoumání. Jednak je to výzkum, při kterém chceme poznat efekt, který mají na cílovou veličinu Y změny ovlivňujících parametrů Xi. Dále použijeme regresní analýzu, když chceme predikovat hodnotu závislé veličiny Y pro budoucí hodnoty pomocí nezávislých veličin Xi, tzv. prediktorů. A nakonec použijeme regresní analýzu tehdy, když chceme najít statistické vztahy mezi sledovanými veličinami (Kubánková a Hendl, 1986). Regresní funkce, vyjadřující vztah mezi závislou proměnnou Y a nezávislými proměnnými Xi (i = 1, 2,, k) má obecně tvar: Y = f(x1, x2,, xk; β0, β1,, βm), kde β0, β1,, βm jsou parametry upřesňující tvar funkce. Pro výpočet se používá matice měření, která obsahuje naměřené hodnoty závislé proměnné Y a hodnoty nezávislých proměnných Xi. Výsledná funkce by měla co nejlépe prokládat hodnoty závisle proměnné Y v matici hodnot X. V praxi se nejčastěji používá lineární vztah mezi závislou a nezávislými proměnnými, zejména proto, že tento vztah je pro popis závislosti v případě mnohorozměrného rozložení dat optimální (Kubánková a Hendl, 1986). Regresní funkce má potom následující tvar: Y = β0 + β1x1 + β2x2 + + βkxk Každá regresní rovnice se vyznačuje několika ukazateli, jako je mnohonásobný korelační koeficient r, koeficient determinace r² a střední chyba odhadu SEE. Mnohonásobný korelační koeficient r udává celkovou sílu vztahu mezi závislou veličinou Y (v našem případě dožitým věkem) a predikujícími veličinami (v našem případě různými histomorfometrickými proměnnými) a je číselnou mírou možnosti predikce cílové veličiny Y pomocí predikujících veličin. Rozsah mnohonásobného korelačního koeficientu r se pohybuje od 0 do 1. Hodnoty 131

132 blízké 0 ukazují na statistickou nezávislost Y na množině veličin Xi, zatímco hodnota 1 označuje dokonalou lineární vazbu vyjádřenou danou regresní funkcí. Koeficient determinace r² udává v procentech tu část celkové variability veličiny Y, která je vysvětlena pomocí nezávislých proměnných. Střední chyba odhadu (SEE) ukazuje přesnost odhadu veličiny Y a udává rozptyl hodnot Y od regresní přímky. Je mírou chyby, které se dopouštíme při odhadu závisle proměnné Y pomocí nezávislých proměnných. Přitom platí, že za předpokladu normálního rozdělení se v intervalu ± 1SEE nachází 67% populace a v intervalu ± 2SEE 95% populace. Tento předpoklad platí i pro budoucí pozorování (Kubánková a Hendl, 1986). Proto byl jako míra úspěšnosti našich regresních rovnic zvolen interval ± 1SEE, protože interval ± 2SEE je již pro účely odhadu dožitého věku příliš široký (Kubánková a Hendl, 1986). Regresní analýza byla v našem výzkumu provedena tak, že byly vypočítány regrese všech možných kombinací nezávislých proměnných na Y. Výsledkem tohoto postupu bylo několik desítek regresních rovnic pro každý zkoumaný soubor jedinců. Mezi nimi byly vybrány ty rovnice, které měly nejvyšší hodnoty r a r² a zároveň neměly příliš vysoké SEE, a ty byly aplikovány na kontrolní soubory (Tab. 43, 45, 47, 49, 51, 53, 54). Aplikace regresní funkce na kontrolní soubor a analýza rozložení reziduálních hodnot ve zkušebním souboru patří mezi metody zjištění vhodnosti nalezené regresní funkce (Kubánková a Hendl, 1986). Úspěšnost dané rovnice v odhadu dožitého věku u kontrolního souboru byla posuzována podle toho, kolik procent kontrolního souboru mělo odhad věku v limitu ± 1SEE. Podle toho byly pak pro každou teplotu spalování vybrány nejlepší rovnice odhadu dožitého věku pro obě pohlaví dohromady a pro muže (Tab ). Pro porovnání, zda se průměr skutečného a odhadnutého věku liší, byl použit Wilcoxonův párový test, který ukazuje, zda daná rovnice odhad průměru věku významně posunuje (Kubánková a Hendl, 1986). Pro zjištění korelace mezi skutečným a odhadnutým věkem byla použita Spearmanova korelace. Spearmanův korelační koeficient r měří sílu vztahu tam, kde nelze předpokládat normální rozdělení dat, nabývá hodnot od +1 do -1 a počítá se na základě pořadí hodnot xi a yi vzhledem k ostatním hodnotám výběru seřazeného podle velikosti. Statistická významnost Spearmanova r se zjišťuje porovnáním s tabulkami (Kubánková a Hendl, 1986; Hill a Lewicki, 2007). Pro porovnání skutečného a odhadnutého věku byly použity tyto dvě neparametrické metody, protože zkušební soubory měly malý počet jedinců. Rozdíl mezi skutečným a odhadnutým věkem se nazývá reziduální hodnota. O rozložení reziduálních hodnot v lineární regresi předpokládáme, že je normální, má nulovou střední hodnotu a konstantní rozptyl. Použitím histogramu a případně některého 132

133 testu, např. Shapiro-Wilkova W testu, se přesvědčíme o normálním rozdělení diferencí mezi skutečným a odhadnutým věkem (Kubánková a Hendl, 1986; Příloha 6) Zjištění chyby měření Chybou měření se rozumí odchylka naměřené hodnoty od skutečné hodnoty, která může být způsobena vyšetřujícím, měřicím přístrojem nebo použitou metodou (Šmahel, 2001). Náhodná chyba mění rozptyl znaku (distribuci a směrodatnou odchylku), systematická chyba posunuje průměr hodnoty výše či níže. Odhalíme ji výměnou vyšetřujícího, přístroje nebo metody. Spolehlivost měření nám udává míru správné opakovatelnosti měření. Může jít o tzv. interobserver error, kdy se zjišťuje chyba měření mezi dvěma či více pozorovateli, kteří stejným postupem změří daný objekt. V případě tzv. intraobserver error stejný pozorovatel změří daný objekt v určitém časovém odstupu, kdy se předpokládá, že zapomněl hodnoty z původního měření (Šmahel, 2001). Statistické postupy pro hodnocení opakovaného měření jsou různé. V našem případě byl použit Wilcoxonův párový test pro porovnání prvního a druhého měření pro zjištění, zda mezi měřeními dochází k posunu průměrné hodnoty znaku, a také Pearsonův a Spearmanův korelační koeficient mezi oběma měřeními. Dále byly použity výpočty navržené Šmahelem pro zjištění chybové směrodatné odchylky, chybového variačního koeficientu a koeficientu reliability (Šmahel, 2001). Chybová směrodatná odchylka slouží k posouzení přesnosti měření a počítá se jako odmocnina z chybového rozptylu. Chybový rozptyl se počítá podle následujícího vzorce: s²ch = (x1-x2)²/2n kde x1 a x2 jsou hodnoty proměnné v prvním a druhém měření a N je počet opakovaně měřených jedinců. Počet měřených jedinců se násobí dvěma, protože v prvním i druhém měření je možné udělat chybu. Pokud se chybová směrodatná odchylka vydělí průměrem hodnoceného znaku z obou měření, získáme chybový variační koeficient Vch. Ten je mírou přesnosti měření znaku a neměl by překročit 5% (Šmahel, 2001). Nejvýznamnější charakteristikou pro posouzení přesnosti měření je však tzv. koeficient reliability, který udává spolehlivost měření. Počítá se podle následujícího vzorce: R = (s²celk - s²ch)/ s²celk kde s²celk je rozptyl znaku, který se uvádí u každého znaku v popisné statistice, a s²ch je chybový rozptyl, vypočtený podle vzorce uvedeného výše. Koeficient reliability má pokud 133

134 možno dosahovat hodnot nad 0,9. Pokud je jeho hodnota menší než 0,8, měření nemá smysl, protože více než 20% rozptylu znaku je způsobeno chybou měření (Šmahel, 2001). 134

135 7. VÝSLEDKY 7.1. ZACHOVALOST SPÁLENÝCH KOSTÍ Celková zachovalost spálených kostí byla na dobré úrovni, ale míra jejich poškození se zvyšovala úměrně s teplotou spalování (Příloha 7). Spálené kosti byly smrštěné, zkroucené, deformované, popraskané, kompaktní kost se místy odlupovala a její okraje byly někdy otočené směrem vzhůru. Spongiózní kost někdy obsahovala zbytky spálené měkké tkáně a měla oranžový nádech. Kosti byly křehké, i když pevné. Na mikroskopické úrovni se v kosti postupně zvyšovalo množství prasklin, části kompaktní kosti byly destruovány, jednotlivé mikrostruktury byly stále hůře viditelné. Kosti spálené při 1000 C byly natolik poškozeny, že nebylo možné provést plnohodnotnou morfometrickou analýzu jejich histologické stavby BARVA SPÁLENÝCH KOSTÍ Spálené kosti vykazovaly velké množství barevných odstínů, které se s rostoucí teplotou spalování postupně měnily. Vzorky kostí spálené při 600 C měly středně tmavě šedou barvu bez výraznějšího modravého nádechu. Kosti spalované při 700 C projevily bohatší barevnou škálu (Obr. 53, 54). Vyskytovala se zde barva čistě bílá, šedobílá, šedomodrá či tmavě šedá až do modra. Některé kosti se vyznačovaly šedými šmouhami, někdy byly šmouhy velmi tmavé až černé. Umístění vzorků v peci nemělo na tyto barevné změny vliv, protože se kosti čistě bílé i kosti šedé vyskytovaly vedle sebe. Na první pohled se zdálo, že tmavší barvu mají spíše vzorky větších rozměrů, zatímco malé vzorky (velikost kolem 1 cm) jsou bílé. Spongióza většinou postrádala oranžový odstín a často se v ní vyskytovaly zbytky spálené měkké tkáně. Možná má na tyto barevné změny vliv např. obsah tuku a vody v kosti, tato otázka však nebyla předmětem výzkumu. Jinou možnou příčinou může být také to, že při teplotě 700 C dochází u některých kostí již k dokonalému spálení (bílá barva), zatímco u jiných nikoli (vzorky s různými odstíny šedé). Kosti spalované při 800 a 1000 C měly všechny v podstatě stejnou bílou barvu, někdy s malou příměsí žlutého odstínu, spongióza vykazovala světle oranžový nádech. Jen několik málo vzorků mělo tmavší žlutý odstín. Některé kosti spálené při 800 C měly na povrchu kompakty drobné černé a šedé tečky, které se nevyskytovaly při teplotě spalování 1000 C. 135

136 Barevná škála spálených kostí zvláště při teplotě spalování 700 C ukazuje, že podle barvy spálených kosterních pozůstatků nelze spolehlivě určit přesnou teplotu spalování. Lze pouze konstatovat, zda byla kost spálena dokonale či nedokonale, případně říci, zda teplota spalování dosáhla pravděpodobně 700 C (různé odstíny šedé, modré apod.) nebo 700 C (různé odstíny bílé barvy). Obr. 53. Barva kostí spálených při 700 C (I). První skupina spalovaných jedinců. 136

137 Obr. 54. Barva kostí spálených při 700 C (II). Druhá skupina spalovaných jedinců. Odstup v datu spalování mezi oběma skupinami byl 24 hodin ROZLIŠITELNOST HISTOLOGICKÝCH STRUKTUR VE SVĚTELNÉM MIKROSKOPU Studium experimentálně spáleného kosterního materiálu ve světelném mikroskopu ukázalo, že na rozdíl od některých předchozích prací (Heussner, 1987, 1990a; Harsányi, 1993; Hummel a Schutkowski, 1993; Stloukal et al., 1999) byly mikrostruktury v kosti patrné i při teplotě spalování 1000 C, tedy nad Herrmannem stanovenou tzv. kritickou teplotou (Herrmann, 1977a). V tomto ohledu náš nález souhlasí s tvrzením některých novějších prací, podle kterých jsou mikrostruktury patrné i u kostí spálených při 800 až 1200 C (Ubelaker, 2009). Vzájemná odlišitelnost struktur je však ve spálených kostech značně ztížena, dobře jsou identifikovatelné hlavně kompletní osteony a Haversovy kanálky. Většina struktur, jako např. fragmenty osteonů, spolu splývá a nelze je hodnotit. Obvodové lamely jsou často úplně zničeny nebo nejsou identifikovatelné. Jednotlivé lamely v osteonu většinou nelze rozlišit vůbec. Velkým problémem při hodnocení spálených kostí je ztráta povrchových vrstev kompakty, praskliny a místy i úplný rozpad kosti. V tomto směru byly nejvíce poškozeny kosti spálené při 800 a 1000 C. Tyto kosti byly popraskané, rozpadaly se, vrchní vrstvy kompakty se odlupovaly a histologické struktury byly obtížně identifikovatelné (Příloha 7). 137

138 Při tvorbě výbrusů výše popsanou metodou bez většího technického vybavení je velkým problémem správně odhadnout finální tloušťku výbrusu. Pro správné odlišení struktur je potřebná určitá tloušťka řezu, v příliš tenkých řezech nelze hranice mezi jednotlivými strukturami dobře rozeznat. Výbrusy musí být mnohem tenčí než u nativních kostí a je zde velká šance, že výbrus bude příliš tenký nebo silný. V obou případech je pak jeho histologická analýza značně ztížena pro špatnou odlišitelnost struktur DESKRIPTIVNÍ STATISTIKY MĚŘENÝCH SOUBORŮ U všech měřených souborů byly dožitý věk a jednotlivé proměnné popsány pomocí těchto popisných statistik: aritmetický průměr, medián, minimum a maximum, variační koeficient, směrodatná odchylka (SD), střední chyba průměru (SE) a 95% interval spolehlivosti pro průměr (Tab ). Složení souborů bylo také popsáno pomocí frekvenčních tabulek (Příloha 1). Normalita rozdělení dožitého věku a jednotlivých proměnných se testovala pomocí histogramu, šikmosti, špičatosti a Shapiro-Wilkova W testu (Tab. 10, 15, 19, 23, 54; Příloha 2). 138

139 Tab. 12. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u nespálených kostí (N = 49). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 517,60 481,26 241, ,93 37,7 195,251 27,89 (461,52; 573,68) POC_OST 14,09 14,05 4,88 22,11 27,8 3,913 0,56 (12,96; 15,21) 49045,42 31,3 8802, ,49 (25561,51; 30618,20) PL_OST 28089, , ,66 PR_OST 39,80 39,92 18,70 59,41 26,7 10,639 1,52 (36,74; 42,85) OBV_O 654,18 655,97 472,82 926,80 16,3 106,778 15,25 (623,51; 684,85) MAX_O 230,32 227,42 165,45 355,10 16,9 39,013 5,57 (219,12; 241,53) MIN_O 157,00 159,91 101,96 207,73 16,3 25,617 3,66 (149,64; 164,36) PRUM_O 193,66 193,94 139,43 267,93 16,1 31,166 4,45 (184,71; 202,61) F_PR_O 179,30 178,97 128,77 243,24 15,9 28,496 4,07 (171,11; 187,48) PL_KAN 2172, , , ,06 49,1 1066, ,29 (1866,07; 2478,46) PR_KAN 3,24 2,95 1,19 6,58 36,9 1,194 0,17 (2,90; 3,59) OBV_K 166,12 163,01 120,13 249,67 16,5 27,398 3,91 (158,25; 173,99) MAX_K 59,25 57,86 44,04 88,05 17,1 10,119 1,45 (56,35; 62,16) MIN_K 39,97 39,13 26,45 63,76 17,2 6,860 0,98 (38,00; 41,94) PRUM_K 49,61 49,01 35,25 75,77 16,5 8,207 1,17 (47,26; 51,97) F_PR_K 46,92 46,31 32,95 71,78 16,4 7,702 1,10 (44,70; 49,13) OK_OO 0,26 0,25 0,20 0,41 15,4 0,040 0,01 (0,25; 0,27) PK_PO 0,08 0,07 0,05 0,28 48,8 0,039 0,01 (0,07; 0,09) PRK_PRO 0,26 0,26 0,20 0,41 15,4 0,040 0,01 (0,25; 0,27) C_OST 16,93 16,87 15,38 18,91 4,0 0,681 0,10 (16,73; 17,13) C_KAN 16,00 15,94 15,22 17,98 3,6 0,583 0,08 (15,83; 16,16) SFAC_OST 0,75 0,75 0,69 0,82 3,6 0,027 0,00 (0,75; 0,76) SFAC_KAN 0,79 0,80 0,71 0,83 3,0 0,024 0,00 (0,79; 0,80) P_NON_H 0,21 0,00 0,00 2,39 196,7 0,413 0,06 (0,09; 0,33) PR_LAM 14,56 13,47 1,07 34,95 57,4 8,355 1,19 (12,16; 16,96) POC_DUT 0,84 0,56 0,00 3,49 112,1 0,942 0,14 (0,57; 1,11) PR_DUT 1,71 1,14 0,00 8,20 111,5 1,907 0,27 (1,16; 2,26) PR_L_VN 4,54 2,93 0,00 26,78 130,8 5,939 0,85 (2,84; 6,25) 139

140 Tab. 13. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u nespálených kostí, muži (N = 31). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 567,29 558,65 242,25 840,82 31,5 178,508 32,06 (501,82; 632,77) POC_OST 14,26 14,33 4,88 22,11 26,4 3,763 0,68 (12,88; 15,64) 49045,42 31,1 9287, ,05 (26471,39; 33284,60) PL_OST 29877, , ,66 PR_OST 42,96 43,58 23,70 59,41 24,0 10,295 1,85 (39,18; 46,74) OBV_O 676,42 667,74 472,82 926,80 16,8 113,417 20,37 (634,81; 718,02) MAX_O 238,35 232,15 165,45 355,10 17,6 41,922 7,53 (222,98; 253,73) MIN_O 161,81 160,32 101,96 207,73 16,0 25,928 4,66 (152,30; 171,32) PRUM_O 200,08 195,95 139,43 267,93 16,5 32,965 5,92 (187,99; 212,17) F_PR_O 185,03 182,74 128,77 243,24 16,1 29,799 5,35 (174,10; 195,96) PL_KAN 2104, , , ,67 36,7 773, ,86 (1820,80; 2387,98) PR_KAN 3,36 3,09 1,19 6,58 36,5 1,227 0,22 (2,91; 3,81) OBV_K 166,16 163,63 120,13 239,37 16,5 27,371 4,92 (156,12; 176,20) MAX_K 59,46 57,91 44,04 88,05 17,5 10,386 1,87 (55,65; 63,27) MIN_K 39,65 39,72 26,45 54,16 16,1 6,392 1,15 (37,30; 41,99) PRUM_K 49,55 49,14 35,25 71,10 16,3 8,086 1,45 (46,59; 52,52) F_PR_K 46,77 46,31 32,95 66,84 16,1 7,527 1,35 (44,01; 49,53) OK_OO 0,25 0,25 0,20 0,29 10,4 0,026 0,00 (0,24; 0,26) PK_PO 0,07 0,07 0,05 0,13 25,7 0,018 0,00 (0,07; 0,08) PRK_PRO 0,25 0,25 0,20 0,29 10,0 0,025 0,00 (0,24; 0,26) C_OST 16,99 16,93 15,98 18,53 3,0 0,511 0,09 (16,80; 17,17) C_KAN 16,08 16,01 15,26 17,98 3,9 0,621 0,11 (15,85; 16,31) SFAC_OST 0,75 0,75 0,69 0,80 2,8 0,021 0,00 (0,74; 0,76) SFAC_KAN 0,79 0,79 0,71 0,83 3,2 0,025 0,00 (0,78; 0,80) P_NON_H 0,18 0,00 0,00 1,03 153,3 0,276 0,05 (0,07; 0,28) PR_LAM 13,31 11,44 1,07 33,24 55,6 7,399 1,33 (10,60; 16,03) POC_DUT 0,70 0,52 0,00 3,44 117,6 0,823 0,15 (0,40; 1,00) PR_DUT 1,44 0,95 0,00 5,46 104,5 1,505 0,27 (0,89; 1,99) PR_L_VN 4,65 3,31 0,00 26,78 125,0 5,810 1,04 (2,52; 6,79) 140

141 Tab. 14. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u nespálených kostí, ženy (N = 19). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 440,39 394,51 241, ,93 44,4 195,720 44,90 (346,05; 534,72) POC_OST 13,55 12,78 6,85 21,42 31,5 4,267 0,98 (11,49; 15,61) 39403,11 27,6 6935, ,03 (21776,24; 28461,51) PL_OST 25118, , ,50 PR_OST 33,81 31,23 18,70 50,77 27,1 9,157 2,10 (29,40; 38,22) OBV_O 616,00 611,15 492,34 761,90 13,2 81,532 18,70 (576,70; 655,29) MAX_O 216,70 220,51 170,97 270,85 13,3 28,778 6,60 (202,83; 230,57) MIN_O 148,25 147,14 112,32 185,46 15,5 22,917 5,26 (137,20; 159,29) PRUM_O 182,48 177,03 149,06 228,16 13,3 24,210 5,55 (170,81; 194,14) F_PR_O 169,16 164,39 140,02 213,39 13,6 23,077 5,29 (158,03; 180,28) PL_KAN 2411, , , ,06 62,8 1515, ,57 (1680,94; 3141,38) PR_KAN 3,12 2,95 1,58 6,47 37,1 1,156 0,27 (2,56; 3,67) OBV_K 168,71 163,01 135,35 249,67 17,7 29,787 6,83 (154,35; 183,07) MAX_K 60,10 56,23 47,44 87,78 18,3 10,972 2,52 (54,81; 65,39) MIN_K 40,75 37,89 31,96 63,76 18,7 7,604 1,74 (37,09; 44,42) PRUM_K 50,43 49,01 40,43 75,77 17,8 8,954 2,05 (46,11; 54,74) F_PR_K 47,77 46,96 38,39 71,78 17,6 8,388 1,92 (43,72; 51,81) OK_OO 0,28 0,26 0,23 0,41 19,6 0,055 0,01 (0,26; 0,31) PK_PO 0,10 0,08 0,05 0,28 56,0 0,056 0,01 (0,08; 0,13) PRK_PRO 0,28 0,26 0,23 0,41 19,3 0,054 0,01 (0,26; 0,31) C_OST 16,88 16,65 15,38 18,91 5,4 0,909 0,21 (16,44; 17,32) C_KAN 15,90 15,83 15,22 17,06 3,3 0,522 0,12 (15,65; 16,15) SFAC_OST 0,76 0,77 0,70 0,82 4,3 0,033 0,01 (0,74; 0,77) SFAC_KAN 0,80 0,80 0,75 0,83 2,9 0,023 0,01 (0,79; 0,81) P_NON_H 0,26 0,00 0,00 2,39 219,6 0,571 0,13 (-0,02; 0,53) PR_LAM 17,09 15,75 3,49 34,95 55,6 9,503 2,18 (12,51; 21,67) POC_DUT 1,12 0,97 0,00 3,49 96,1 1,076 0,25 (0,60; 1,64) PR_DUT 2,32 1,80 0,00 8,20 105,0 2,435 0,56 (1,15; 3,49) PR_L_VN 4,12 1,46 0,00 20,78 151,0 6,223 1,43 (1,12; 7,12) 141

142 Tab. 15. Normalita rozdělení jednotlivých proměnných, nespálené kosti. Použita šikmost, špičatost a Shapiro-Wilkův W test (W hodnota W testu, p dosažená hladina p, na které zamítáme hypotézu, že rozdělení není normální na hladině α = 0,05) Nespálené (N = 49) Nespálené, muži (N = 31) Nespálené, ženy (N = 19) Šikm. Špič. W p Šikm. Špič. W p Šikm. Špič. W p TL_KOM 0,59-0,30 0,95 0,0258-0,05-1,09 0,95 0,1939 1,94 4,74 0,82 0,0021 POC_OST -0,05 0,24 0,97 0,2804-0,36 1,15 0,95 0,1568 0,47-0,36 0,95 0,3193 PL_OST 0,59-0,33 0,96 0,0677 0,44-0,56 0,96 0,2297 0,47-0,72 0,94 0,3118 PR_OST -0,02-0,90 0,98 0,4176-0,21-0,97 0,96 0,3622 0,15-0,91 0,97 0,7975 OBV_O 0,48-0,23 0,97 0,3244 0,33-0,42 0,97 0,6254 0,24-1,07 0,96 0,4885 MAX_O 0,85 0,95 0,96 0,0602 0,77 0,64 0,96 0,2740 0,25-1,05 0,95 0,4584 MIN_O 0,03-0,67 0,98 0,6432-0,20-0,20 0,97 0,5863 0,42-1,07 0,92 0,1072 PRUM_O 0,42-0,38 0,97 0,3331 0,24-0,49 0,97 0,5628 0,39-0,91 0,95 0,3375 F_PR_O 0,35-0,57 0,97 0,3502 0,16-0,57 0,97 0,5481 0,49-0,82 0,94 0,2118 PL_KAN 3,15 13,96 0,71 0,0000 1,18 1,23 0,90 0,0073 2,66 7,93 0,67 0,0000 PR_KAN 1,04 1,05 0,93 0,0041 0,84 0,52 0,94 0,0856 1,32 2,68 0,91 0,0619 OBV_K 1,06 1,20 0,93 0,0056 0,78 0,41 0,96 0,2146 1,29 1,71 0,89 0,0348 MAX_K 1,12 1,19 0,91 0,0016 1,00 0,81 0,93 0,0455 1,22 1,22 0,89 0,0281 MIN_K 1,13 2,05 0,93 0,0055 0,50 0,23 0,97 0,3976 1,69 3,62 0,85 0,0066 PRUM_K 1,10 1,50 0,93 0,0051 0,73 0,45 0,96 0,2752 1,41 2,27 0,88 0,0225 F_PR_K 1,09 1,60 0,93 0,0048 0,72 0,54 0,96 0,2454 1,42 2,40 0,88 0,0218 OK_OO 1,74 4,50 0,87 0,0001-0,24-0,88 0,97 0,4548 1,16 0,41 0,86 0,0081 PK_PO 3,25 13,70 0,68 0,0000 0,81 0,76 0,95 0,1244 1,97 4,26 0,78 0,0006 PRK_PRO 1,79 4,67 0,86 0,0000-0,23-0,73 0,98 0,6512 1,16 0,41 0,86 0,0093 C_OST 0,65 1,35 0,96 0,0685 0,88 2,18 0,94 0,0624 0,62 0,16 0,96 0,5443 C_KAN 1,33 2,18 0,90 0,0005 1,44 2,19 0,88 0,0018 0,63-0,31 0,95 0,3329 SFAC_OST -0,28 0,68 0,98 0,4831-0,81 1,95 0,96 0,2100-0,24-0,34 0,97 0,6926 SFAC_KAN -1,10 1,58 0,93 0,0052-1,23 1,81 0,91 0,0123-0,58-0,26 0,95 0,4626 P_NON_H 3,51 15,94 0,57 0,0000 1,78 2,50 0,70 0,0000 3,25 11,78 0,52 0,0000 PR_LAM 0,73 0,00 0,94 0,0213 0,65 0,15 0,95 0,1958 0,47-0,68 0,94 0,2852 POC_DUT 1,61 2,04 0,80 0,0000 2,05 4,24 0,76 0,0000 1,07 0,60 0,86 0,0107 PR_DUT 1,65 3,01 0,82 0,0000 1,19 0,61 0,85 0,0005 1,28 1,28 0,85 0,0064 PR_L_VN 2,16 4,56 0,72 0,0000 2,50 7,06 0,70 0,0000 1,92 2,86 0,69 0,0000 Proměnná 142

143 Tab. 16. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 700 C (N = 36). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 372,85 356,39 147,26 826,81 39,9 148,933 24,82 (322,46; 423,24) POC_OST 16,85 16,53 3,80 33,95 33,7 5,684 0,95 (14,92; 18,77) 46046,16 34,4 7395, ,59 (19002,43; 24007,00) PL_OST 21504, , ,08 PR_OST 35,18 34,57 14,51 52,90 29,8 10,468 1,75 (31,64; 38,72) OBV_O 591,78 582,30 427,87 900,72 17,7 104,927 17,49 (556,28; 627,28) MAX_O 209,93 201,39 157,19 316,06 18,1 37,970 6,33 (197,08; 222,78) MIN_O 133,42 130,74 91,41 195,44 17,7 23,659 3,94 (125,41; 141,42) PRUM_O 171,67 168,55 124,30 255,75 17,1 29,421 4,90 (161,72; 181,63) F_PR_O 157,41 155,20 112,88 231,79 16,7 26,285 4,38 (148,51; 166,30) PL_KAN 1659, ,45 787, ,77 42,0 697, ,22 (1423,08; 1894,97) PR_KAN 2,99 2,80 0,82 6,19 39,6 1,183 0,20 (2,59; 3,39) OBV_K 148,14 144,72 104,17 226,49 18,3 27,179 4,53 (138,94; 157,34) MAX_K 54,05 51,82 39,37 84,55 19,1 10,348 1,73 (50,55; 57,56) MIN_K 34,17 33,08 21,95 55,97 21,0 7,189 1,20 (31,74; 36,61) PRUM_K 43,98 42,83 30,66 67,16 18,5 8,126 1,35 (41,23; 46,73) F_PR_K 41,74 40,71 28,79 64,63 18,7 7,799 1,30 (39,10; 44,38) OK_OO 0,25 0,25 0,20 0,32 14,0 0,035 0,01 (0,24; 0,27) PK_PO 0,08 0,07 0,04 0,14 28,8 0,023 0,00 (0,07; 0,09) PRK_PRO 0,26 0,25 0,20 0,33 13,9 0,036 0,01 (0,25; 0,27) C_OST 17,89 17,81 16,25 19,88 5,3 0,945 0,16 (17,57; 18,21) C_KAN 16,02 15,93 14,78 19,41 5,8 0,936 0,16 (15,70; 16,33) SFAC_OST 0,72 0,72 0,66 0,78 4,7 0,034 0,01 (0,71; 0,73) SFAC_KAN 0,80 0,80 0,68 0,85 4,6 0,037 0,01 (0,78; 0,81) 143

144 Tab. 17. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 700 C, muži (N = 29). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 395,44 377,56 148,05 759,33 37,6 148,474 27,57 (338,96; 451,92) POC_OST 16,69 16,24 3,80 33,95 36,3 6,052 1,12 (14,39; 19,00) 46046,16 35,9 8147, ,98 (19605,45; 25803,87) PL_OST 22704, , ,08 PR_OST 36,11 35,29 14,51 52,90 28,4 10,270 1,91 (32,20; 40,02) OBV_O 610,71 590,02 427,87 900,72 18,6 113,527 21,08 (567,52; 653,89) MAX_O 217,61 204,09 157,19 316,06 19,1 41,577 7,72 (201,80; 233,43) MIN_O 135,61 131,95 91,41 195,44 18,1 24,544 4,56 (126,27; 144,95) PRUM_O 176,61 169,71 124,30 255,75 18,0 31,804 5,91 (164,51; 188,71) F_PR_O 161,45 155,81 112,88 231,79 17,6 28,427 5,28 (150,64; 172,27) PL_KAN 1620, ,34 648, ,77 43,7 707, ,43 (1351,10; 1889,55) PR_KAN 2,93 2,86 0,82 6,19 42,2 1,235 0,23 (2,46; 3,40) OBV_K 146,63 146,01 95,06 226,49 20,0 29,323 5,45 (135,48; 157,78) MAX_K 53,81 52,31 34,61 84,55 21,0 11,311 2,10 (49,51; 58,12) MIN_K 33,39 32,69 21,48 55,97 22,1 7,367 1,37 (30,59; 36,19) PRUM_K 43,43 42,76 28,05 67,16 20,0 8,700 1,62 (40,12; 46,74) F_PR_K 41,19 40,75 26,59 64,63 20,2 8,316 1,54 (38,03; 44,35) OK_OO 0,24 0,24 0,19 0,32 13,8 0,033 0,01 (0,23; 0,26) PK_PO 0,08 0,07 0,04 0,33 65,0 0,052 0,01 (0,06; 0,10) PRK_PRO 0,25 0,24 0,18 0,33 14,0 0,035 0,01 (0,23; 0,26) C_OST 18,09 17,94 16,29 19,88 4,9 0,882 0,16 (17,75; 18,42) C_KAN 16,10 16,10 14,78 19,41 6,0 0,968 0,18 (15,73; 16,47) SFAC_OST 0,71 0,71 0,66 0,78 4,4 0,031 0,01 (0,70; 0,72) SFAC_KAN 0,79 0,79 0,68 0,85 4,8 0,038 0,01 (0,78; 0,81) 144

145 Tab. 18. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 700 C, ženy (N = 13). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 356,46 342,10 147,26 826,81 49,9 177,775 49,31 (249,04; 463,89) POC_OST 15,04 14,47 6,69 22,12 30,5 4,586 1,27 (12,27; 17,81) 36411,44 35,2 7070, ,13 (15825,47; 24371,34) PL_OST 20098, , ,41 PR_OST 29,14 30,61 13,81 47,10 34,1 9,944 2,76 (23,14; 35,15) OBV_O 557,22 538,91 436,05 736,27 16,3 90,599 25,13 (502,47; 611,97) MAX_O 195,33 193,51 160,99 249,60 14,6 28,436 7,89 (178,14; 212,51) MIN_O 132,31 124,38 97,87 191,78 20,8 27,539 7,64 (115,67; 148,95) PRUM_O 163,82 156,97 129,43 219,92 16,8 27,472 7,62 (147,22; 180,42) F_PR_O 152,25 144,13 120,23 210,27 17,5 26,603 7,38 (136,18; 168,33) PL_KAN 1583, ,21 893, ,41 40,6 642, ,24 (1194,99; 1971,71) PR_KAN 2,50 2,27 0,97 4,78 46,7 1,167 0,32 (1,79; 3,21) OBV_K 145,19 142,59 112,77 190,92 16,0 23,251 6,45 (131,14; 159,24) MAX_K 52,24 50,47 40,43 69,31 15,4 8,024 2,23 (47,39; 57,09) MIN_K 34,21 34,28 23,94 45,22 20,3 6,955 1,93 (30,01; 38,42) PRUM_K 43,22 42,89 33,53 57,26 16,6 7,170 1,99 (38,89; 47,56) F_PR_K 41,08 40,66 31,71 54,32 17,0 6,969 1,93 (36,87; 45,29) OK_OO 0,27 0,28 0,18 0,32 15,2 0,041 0,01 (0,24; 0,29) PK_PO 0,09 0,09 0,03 0,14 33,3 0,030 0,01 (0,07; 0,10) PRK_PRO 0,27 0,28 0,18 0,33 16,3 0,044 0,01 (0,24; 0,30) C_OST 17,11 16,85 15,76 18,44 4,9 0,832 0,23 (16,60; 17,61) C_KAN 15,92 15,67 15,00 17,25 4,7 0,749 0,21 (15,47; 16,37) SFAC_OST 0,75 0,75 0,70 0,80 3,9 0,029 0,01 (0,73; 0,77) SFAC_KAN 0,80 0,81 0,75 0,84 4,0 0,032 0,01 (0,78; 0,82) 145

146 Tab. 19. Normalita rozdělení jednotlivých proměnných, kosti spálené při 700 C. Použita šikmost, špičatost a Shapiro-Wilkův W test (W hodnota W testu, p dosažená hladina p, na které zamítáme hypotézu, že rozdělení není normální, na hladině α = 0,05) 700 C (N = 36) 700 C, muži (N = 29) 700 C, ženy (N = 13) Šikm. Špič. W p Šikm. Špič. W p Šikm. Špič. W p TL_KOM 0,93 1,20 0,95 0,0767 0,54-0,14 0,97 0,4468 1,55 3,42 0,87 0,0585 POC_OST 0,23 1,94 0,95 0,1373 0,41 1,70 0,96 0,2952-0,37-0,62 0,96 0,7655 PL_OST 1,30 2,18 0,91 0,0060 1,10 1,22 0,93 0,0430 1,48 1,57 0,83 0,0153 PR_OST -0,18-0,71 0,97 0,3286-0,21-0,58 0,96 0,3577 0,07-0,62 0,97 0,8393 OBV_O 0,83 0,66 0,95 0,0972 0,64 0,14 0,97 0,4901 0,99 0,46 0,90 0,1180 MAX_O 0,87 0,29 0,93 0,0241 0,68-0,28 0,94 0,1230 0,91 0,17 0,90 0,1378 MIN_O 0,55 0,34 0,97 0,3851 0,41 0,12 0,98 0,7103 1,07 0,91 0,89 0,0903 PRUM_O 0,78 0,48 0,96 0,1468 0,62 0,08 0,97 0,5125 1,10 0,59 0,88 0,0768 F_PR_O 0,80 0,53 0,96 0,1586 0,64 0,15 0,97 0,5011 1,24 1,00 0,88 0,0649 PL_KAN 1,80 3,65 0,82 0,0001 2,01 5,12 0,79 0,0001 0,98 0,25 0,90 0,1314 PR_KAN 0,89 1,01 0,95 0,0720 0,94 1,43 0,93 0,0507 0,72-0,45 0,93 0,3262 OBV_K 1,21 1,97 0,91 0,0058 1,08 2,09 0,91 0,0169 0,51-0,30 0,97 0,8351 MAX_K 1,08 1,17 0,92 0,0147 0,88 0,97 0,95 0,1571 0,68 0,29 0,97 0,8465 MIN_K 0,90 1,39 0,95 0,1140 1,07 2,45 0,92 0,0223 0,10-1,23 0,96 0,7136 PRUM_K 1,21 2,03 0,91 0,0062 1,11 2,32 0,90 0,0125 0,46-0,37 0,97 0,8212 F_PR_K 1,23 2,11 0,91 0,0064 1,16 2,49 0,90 0,0109 0,43-0,50 0,96 0,7895 OK_OO 0,32-0,78 0,96 0,1926 0,61 0,15 0,96 0,4026-1,07 0,67 0,90 0,1186 PK_PO 0,77 0,04 0,94 0,0474 4,09 19,42 0,54 0,0000-0,19 0,22 0,97 0,9075 PRK_PRO 0,38-0,64 0,96 0,2057 0,60 0,60 0,96 0,4197-0,95 0,33 0,92 0,2246 C_OST 0,19-0,65 0,97 0,5230 0,17-0,65 0,97 0,6091 0,25-0,80 0,96 0,7155 C_KAN 1,54 3,71 0,88 0,0012 1,50 3,78 0,88 0,0038 0,78-0,71 0,90 0,1162 SFAC_OST 0,02-0,82 0,97 0,3281 0,07-0,84 0,96 0,3616 0,04-0,65 0,98 0,9806 SFAC_KAN -1,04 1,54 0,93 0,0232-1,00 1,75 0,94 0,0738-0,69-0,87 0,90 0,1274 Proměnná 146

147 Tab. 20. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 800 C (N = 60). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 286,18 269,44 127,38 570,93 36,4 104,254 13,46 (259,25; 313,11) POC_OST 20,99 20,35 7,69 42,48 32,5 6,811 0,88 (19,23; 22,75) 8175, ,46 31,6 4710, ,09 (13709,26; 16142,83) PL_OST 14926, ,97 PR_OST 30,82 31,22 11,84 58,52 33,6 10,340 1,34 (28,15; 33,49) OBV_O 491,44 478,27 349,82 718,98 15,3 75,304 9,72 (471,99; 510,90) MAX_O 178,55 176,85 126,13 254,32 15,3 27,397 3,54 (171,47; 185,62) MIN_O 109,34 106,23 76,96 170,45 16,9 18,507 2,39 (104,56; 114,12) PRUM_O 143,94 140,49 103,45 210,21 15,2 21,935 2,83 (138,28; 149,61) F_PR_O 131,73 128,79 97,53 190,17 15,1 19,921 2,57 (126,58; 136,88) PL_KAN 1211, ,66 487, ,07 42,1 510,410 65,89 (1079,33; 1343,04) PR_KAN 2,58 2,53 0,82 6,03 43,4 1,120 0,15 (2,29; 2,87) OBV_K 126,32 126,21 86,99 183,23 16,7 21,061 2,72 (120,88; 131,77) MAX_K 46,87 47,00 32,42 65,43 16,6 7,785 1,01 (44,85; 48,88) MIN_K 27,43 26,91 17,71 42,18 19,1 5,249 0,68 (26,08; 28,79) PRUM_K 37,15 36,80 25,32 53,81 16,9 6,288 0,81 (35,53; 38,77) F_PR_K 34,67 34,82 23,48 51,17 17,2 5,973 0,77 (33,13; 36,22) OK_OO 0,26 0,26 0,17 0,40 18,5 0,048 0,01 (0,25; 0,27) PK_PO 0,08 0,08 0,03 0,20 43,8 0,035 0,00 (0,07; 0,09) PRK_PRO 0,26 0,26 0,17 0,41 18,9 0,049 0,01 (0,25; 0,27) C_OST 17,76 17,69 15,92 20,71 5,7 1,006 0,13 (17,50; 18,02) C_KAN 16,99 16,84 15,50 18,92 4,8 0,823 0,11 (16,78; 17,20) SFAC_OST 0,72 0,72 0,62 0,79 5,0 0,036 0,01 (0,71; 0,73) SFAC_KAN 0,75 0,76 0,69 0,81 3,9 0,029 0,00 (0,75; 0,76) 147

148 Tab. 21. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 800 C, muži (N = 46). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 305,28 284,10 142,46 570,93 33,6 102,659 15,14 (274,79; 335,77) POC_OST 22,05 21,70 7,69 42,48 33,1 7,287 1,07 (19,88; 24,21) 8896, ,46 30,0 4590, ,79 (13916,72; 16642,96) PL_OST 15279, ,44 PR_OST 32,83 34,07 11,84 58,52 31,4 10,322 1,52 (29,77; 35,90) OBV_O 498,11 485,14 367,37 718,98 14,7 73,360 10,82 (476,32; 519,89) MAX_O 181,36 177,01 142,16 254,32 14,9 26,940 3,97 (173,36; 189,36) MIN_O 110,01 108,07 76,96 170,45 16,0 17,569 2,59 (104,80; 115,23) PRUM_O 145,69 143,21 109,86 210,21 14,6 21,291 3,14 (139,37; 152,01) F_PR_O 133,21 130,58 99,19 190,17 14,5 19,319 2,85 (127,47; 138,95) PL_KAN 1154, ,16 487, ,35 36,7 423,502 62,44 (1029,17; 1280,70) PR_KAN 2,60 2,53 0,82 5,49 42,5 1,106 0,16 (2,27; 2,93) OBV_K 124,52 124,44 86,99 162,92 15,5 19,350 2,85 (118,78; 130,27) MAX_K 46,39 46,01 32,42 60,85 15,9 7,369 1,09 (44,20; 48,58) MIN_K 26,75 26,65 17,71 37,67 17,0 4,537 0,67 (25,40; 28,10) PRUM_K 36,57 36,67 25,32 48,54 15,6 5,705 0,84 (34,88; 38,27) F_PR_K 34,04 34,25 23,48 45,69 15,6 5,295 0,78 (32,47; 35,62) OK_OO 0,25 0,25 0,17 0,35 16,8 0,042 0,01 (0,24; 0,26) PK_PO 0,08 0,08 0,03 0,15 35,0 0,028 0,00 (0,07; 0,08) PRK_PRO 0,25 0,26 0,17 0,35 17,2 0,043 0,01 (0,24; 0,26) C_OST 17,83 17,84 15,92 20,16 5,0 0,894 0,13 (17,57; 18,10) C_KAN 17,05 16,97 15,70 18,81 4,7 0,792 0,12 (16,82; 17,29) SFAC_OST 0,72 0,72 0,64 0,79 4,3 0,031 0,00 (0,71; 0,73) SFAC_KAN 0,75 0,75 0,69 0,81 3,9 0,029 0,00 (0,74; 0,76) 148

149 Tab. 22. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 800 C, ženy (N = 24). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru Variační Průměr Medián Minimum Maximum koeficient SD SE (%) Interval spolehlivosti 95% TL_KOM 245,90 244,29 126,58 506,51 36,4 89,450 18,26 (208,13; 283,67) POC_OST 18,69 18,08 7,82 29,82 26,3 4,918 1,00 (16,61; 20,76) 4561, ,13 34,6 4746, ,96 (11713,06; 15721,95) PL_OST 13717, ,51 PR_OST 25,96 27,25 3,56 42,90 33,7 8,759 1,79 (22,27; 29,66) OBV_O 468,69 463,82 279,09 617,19 17,4 81,580 16,65 (434,24; 503,14) MAX_O 169,14 172,94 102,41 217,33 17,0 28,671 5,85 (157,03; 181,25) MIN_O 105,75 105,51 59,46 153,53 19,6 20,709 4,23 (97,01; 114,50) PRUM_O 137,45 134,36 80,94 183,46 17,4 23,971 4,89 (127,33; 147,57) F_PR_O 125,85 124,34 74,89 170,80 17,3 21,791 4,45 (116,65; 135,05) PL_KAN 1317, ,03 632, ,07 45,1 594, ,27 (1066,27; 1568,00) PR_KAN 2,56 2,43 0,50 6,03 47,7 1,222 0,25 (2,04; 3,07) OBV_K 129,03 128,66 98,78 183,23 16,9 21,803 4,45 (119,83; 138,24) MAX_K 47,43 47,91 36,07 65,43 16,3 7,707 1,57 (44,17; 50,68) MIN_K 28,69 28,75 20,43 42,18 20,1 5,769 1,18 (26,25; 31,12) PRUM_K 38,06 37,99 29,04 53,81 17,4 6,613 1,35 (35,26; 40,85) F_PR_K 35,75 35,76 27,48 51,17 18,0 6,419 1,31 (33,04; 38,46) OK_OO 0,28 0,28 0,21 0,40 18,6 0,052 0,01 (0,26; 0,30) PK_PO 0,10 0,09 0,05 0,20 40,0 0,040 0,01 (0,08; 0,12) PRK_PRO 0,28 0,28 0,21 0,41 18,6 0,052 0,01 (0,26; 0,31) C_OST 17,70 17,70 16,35 20,71 6,0 1,066 0,22 (17,25; 18,15) C_KAN 16,76 16,62 15,50 18,92 4,5 0,752 0,15 (16,45; 17,08) SFAC_OST 0,73 0,72 0,62 0,78 5,2 0,038 0,01 (0,71; 0,74) SFAC_KAN 0,76 0,77 0,71 0,81 3,2 0,024 0,00 (0,75; 0,77) 149

150 Tab. 23. Normalita rozdělení jednotlivých proměnných, kosti spálené při 800 C. Použita šikmost, špičatost a Shapiro-Wilkův W test (W hodnota W testu, p dosažená hladina p, na které zamítáme hypotézu, že rozdělení není normální, na hladině α = 0,05) 800 C (N = 60) 800 C, muži (N = 46) 800 C, ženy (N = 24) Šikm. Špič. W p Šikm. Špič. W p Šikm. Špič. W p TL_KOM 0,83 0,37 0,94 0,0086 0,76 0,25 0,95 0,0512 1,04 1,77 0,93 0,0980 POC_OST 0,62 0,78 0,98 0,2411 0,40 0,40 0,99 0,8478 0,11 0,50 0,98 0,9414 PL_OST 1,23 1,71 0,91 0,0003 1,37 2,37 0,90 0,0007 0,61 0,60 0,96 0,4902 PR_OST 0,36 0,07 0,98 0,3226 0,18 0,22 0,98 0,6406-0,49 0,54 0,97 0,7701 OBV_O 0,75 0,95 0,96 0,0359 0,96 1,35 0,94 0,0176-0,19 0,19 0,99 0,9725 MAX_O 0,73 0,81 0,96 0,0341 1,01 0,98 0,92 0,0042-0,36-0,07 0,98 0,8640 MIN_O 0,88 1,28 0,95 0,0169 0,87 1,95 0,96 0,0817 0,34 1,01 0,96 0,4774 PRUM_O 0,79 0,92 0,95 0,0233 0,98 1,34 0,94 0,0160-0,13 0,44 0,98 0,9236 F_PR_O 0,82 0,83 0,95 0,0181 0,94 1,25 0,95 0,0307 0,02 0,59 0,98 0,9595 PL_KAN 0,97 0,99 0,93 0,0028 0,35-0,78 0,96 0,1180 1,14 0,94 0,89 0,0138 PR_KAN 0,75 0,42 0,96 0,0368 0,63 0,01 0,97 0,1755 1,00 1,71 0,95 0,2077 OBV_K 0,19-0,25 0,99 0,6614-0,08-0,47 0,98 0,7183 0,54 0,11 0,95 0,2489 MAX_K 0,08-0,52 0,99 0,7232-0,00-0,47 0,98 0,6074 0,29-0,19 0,95 0,3120 MIN_K 0,44 0,11 0,98 0,5572-0,00-0,20 0,99 0,7959 0,65-0,23 0,94 0,1802 PRUM_K 0,20-0,29 0,99 0,6459-0,08-0,40 0,98 0,7548 0,50-0,19 0,95 0,2366 F_PR_K 0,27-0,12 0,98 0,5826-0,11-0,34 0,98 0,6653 0,58-0,16 0,94 0,1838 OK_OO 0,45 0,36 0,98 0,2634 0,23-0,15 0,97 0,3448 0,52-0,28 0,96 0,3385 PK_PO 1,12 1,95 0,93 0,0014 0,57 0,34 0,97 0,2567 1,05 0,66 0,91 0,0274 PRK_PRO 0,44 0,48 0,98 0,3036 0,12-0,30 0,98 0,4714 0,63-0,04 0,95 0,3310 C_OST 0,48 0,11 0,97 0,2036 0,13-0,05 0,99 0,9955 0,86 1,09 0,92 0,0663 C_KAN 0,53-0,25 0,96 0,0764 0,41-0,32 0,97 0,2792 1,10 1,86 0,93 0,0878 SFAC_OST -0,33 0,05 0,98 0,4950 0,12 0,11 0,99 0,9877-0,78 0,86 0,93 0,1196 SFAC_KAN -0,17-0,39 0,98 0,5020-0,08-0,34 0,98 0,6901-0,33 0,09 0,97 0,7509 Proměnná 150

151 7.5. VĚKOVÉ ZMĚNY KOSTNÍ MIKROSTRUKTURY V rámci předložené studie byly popsány věkové změny mikrostruktur kompaktní kosti lidského žebra (Tab. 24; Příloha 4, 8). Změny proměnných s dožitým věkem byly popsány pouze na základě nespálených kostí, protože u kostí spálených hraje významnou roli také teplota spalování, která může vliv věku na jednotlivé proměnné překrývat a její vliv je obtížně oddělitelný od vlivu stárnutí. Pro zjištění korelačních koeficientů histologických proměnných s dožitým věkem byla použita jednoduchá lineární korelace, kdy byly korelační koeficienty sestaveny do korelační matice (Příloha 3). Nejvyšší korelační koeficienty s dožitým věkem měly ve všech třech porovnávaných souborech rozměry osteonu, z nichž vůbec nejvyšší korelační koeficient měla maximální osa osteonu (MAX_O). Korelační koeficienty proměnných s dožitým věkem byly u spálených kostí oproti nespáleným někdy méně statisticky významné (Tab. 24). U nespálených kostí mělo deset proměnných statisticky významnou korelaci s dožitým věkem na 1% hladině významnosti (p < 0,01) a devět proměnných na 5% hladině významnosti (p < 0,05). Devět proměnných nemělo statisticky významnou korelaci s dožitým věkem (Tab. 24). U kostí spálených při 700 C mělo pět proměnných statisticky významnou korelaci s dožitým věkem na 1% hladině významnosti (p < 0,01) a šest proměnných na 5% hladině významnosti (p < 0,05). U dvanácti proměnných nebyla korelace statisticky významná (Tab. 24). U kostí spálených při 800 C mělo devět proměnných statisticky významnou korelaci s dožitým věkem na 1% hladině významnosti (p < 0,01) a jedna proměnná na 5% hladině významnosti (p < 0,05). Třináct proměnných nemělo s dožitým věkem statisticky významnou korelaci (Tab. 24). S rostoucím věkem dochází v kompaktní kosti lidského žebra ke zvyšování počtu osteonů na mm² příčného řezu, zatímco všechny rozměry osteonů a Haversových kanálků se s rostoucím věkem zmenšují. Haversův kanálek však u starších jedinců zabírá větší procento plochy, obvodu i průměru osteonu, jak nám napovídá růst indexů OK_OO (obvod Haversova kanálku / obvod osteonu), PK_PO (plocha Haversova kanálku / plocha osteonu) a PRK_PRO (průměr Haversova kanálku / průměr osteonu). To znamená, že velikost osteonu se s věkem 151

152 zmenšuje rychleji než velikost Haversova kanálku. Tvar příčného průřezu osteonů se s rostoucím věkem mění z oválného v kruhovitý, jak ukazuje změna compactness a shape faktoru osteonu. Změna tvaru Haversova kanálku nebyla v naší studii statisticky významná. Procentuální zastoupení vnějších obvodových lamel na ploše řezu a tloušťka kompaktní kosti se s rostoucím věkem snižují. Věkové změny v parametrech non-haversových kanálků, resorpčních dutin a vnitřních obvodových lamel nebyly v naší studii statisticky významné (Tab. 24). 152

153 Tab. 24. Vztah mikrostruktur kompaktní kosti k věku a ke spalování. Jednoduchá lineární korelace, uvedeny Pearsonovy korelační koeficienty (r) s dožitým věkem. V případě, kdy jsou změny proměnných s věkem uvedeny v závorce, je tím znázorněn fakt, že příslušný korelační koeficient proměnné s věkem nebyl statisticky významný. Věkové a teplotní změny v kompaktní kosti viz také tab. 31, příloha 4, 5 a 8 * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 Proměnná TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO PK_PO PRK_PRO C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN P_NON_H PR_LAM POC_DUT PR_DUT PR_L_VN Změna hodnoty proměnné s věkem Klesá Roste Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá (Klesá) (Roste) Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Roste (Roste) Roste Klesá (Klesá) Roste (Roste) (Klesá) (Klesá) (Roste) (Roste) Klesá Nespálené N = C N = C N = 60 r r r -0,56 ** 0,44 ** -0,70 ** -0,29 * -0,72 ** -0,75 ** -0,60 ** -0,72 ** -0,70 ** -0,16 0,05-0,36 * -0,38 ** -0,31 * -0,36 * -0,35 * 0,36 * 0,27 0,35 * -0,29 * -0,13 0,32 * 0,12-0,16-0,10 0,23 0,09-0,47 ** -0,32 0,07-0,40 * -0,23-0,44 ** -0,55 ** -0,19-0,43 ** -0,40 * -0,02-0,08-0,12-0,24 0,15-0,08-0,04 0,39 * 0,34 * 0,42 * -0,35 * -0,44 ** 0,32 0,45 ** - -0,18 0,22-0,47 ** -0,14-0,50 ** -0,54 ** -0,33 ** -0,48 ** -0,47 ** 0,07 0,17-0,02-0,06 0,08-0,00 0,02 0,40 ** 0,38 ** 0,40 ** -0,19-0,28 * 0,18 0,24 - Změna hodnoty proměnné vlivem žáru Klesá Roste Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Klesá Nemění se Nemění se Nemění se Roste Roste Klesá Klesá - 153

154 7.6. ODLIŠNOSTI MEZI POHLAVÍMI U některých histomorfologických proměnných se vyskytly odlišnosti mezi pohlavími, které byly analyzovány pomocí Mann-Whitney U testu pro dva nezávislé soubory (Tab. 2527). Tento test byl použit proto, že soubory žen ve všech třech analyzovaných skupinách kostí (nespálené, spálené při 700 a 800 C) byly málopočetné a neměly normální rozdělení dožitého věku i některých proměnných (Tab. 10, 15, 19, 23; Příloha 2). Protože soubory žen obsahovaly převážně starší jedince, existuje zde nebezpečí, že některé odlišnosti mezi pohlavími mohou být způsobeny také vlivem věku. Pro vyloučení vlivu věku v jednotlivých skupinách byl proto vliv pohlaví na jednotlivé proměnné testován také metodou analýzy kovariance, kde věk vystupoval jako doprovodná proměnná (Tab ). U nespálených kostí se muži a ženy podle Mann-Whitney U testu lišili na hladině p < 0,01 v tloušťce kompakty (TL_KOM) a procentu celkové plochy osteonů (PR_OST). Na hladině p < 0,05 se obě pohlaví lišila v minimální ose osteonu (MIN_O), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO) a průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO). Při použití analýzy kovariance se však obě pohlaví u nespálených kostí lišila pouze v procentu celkové plochy osteonů (PR_OST) na hladině p < 0,05. Znamená to, že u ostatních proměnných se projevil vliv vyššího věku u žen spíše než vliv pohlaví. U kostí spálených při 700 C se podle Mann-Whitney U testu obě pohlaví na hladině p < 0,01 lišila v compactness osteonu (C_OST) a shape factoru osteonu (SFAC_OST), jejich osteony tedy mají odlišný tvar na příčném řezu. Na hladině p < 0,05 se muži a ženy lišili v procentu celkové plochy osteonů (PR_OST), obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO) a průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO). Podle analýzy kovariance a tedy při eliminaci vlivu věku se u kostí spálených při 700 C obě pohlaví lišila pouze v compactness osteonu (C_OST) a shape factoru osteonu (SFAC_OST). Tyto dvě proměnné se u mužů a žen chovaly odlišně vlivem vysoké teploty při spalování. V souboru vzorků spálených při 800 C se muži a ženy za použití Mann-Whitney U testu na hladině p < 0,01 lišili v procentu celkové plochy osteonů (PR_OST). Na hladině p < 0,05 se obě pohlaví lišila v tloušťce kompakty (TL_KOM), počtu intaktních osteonů na mm² (POC_OST), obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO) a průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO). Při vyloučení vlivu věku pomocí analýzy kovariance se obě pohlaví u kostí 154

155 spálených při 800 C na hladině p < 0,05 lišila v procentu celkové plochy osteonů (PR_OST), minimální ose Haversova kanálku (MIN_K), obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO) a průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO). Odlišnosti mezi pohlavími se po vyloučení vlivu dožitého věku týkaly především proměnných souvisejících s osteony, včetně vzájemného poměru mezi osteonem a Haversovým kanálkem. Nalezené rozdíly mezi pohlavími mají několik vysvětlení. Některé rozdíly jsou způsobeny skutečností, že určité proměnné se u obou pohlaví chovaly odlišně s rostoucím věkem (Příloha 4). To platí např. pro procento celkové plochy osteonů, které se mezi pohlavími lišilo u kostí nespálených a spálených při 800 C. Shape factor osteonu a compactness osteonu, které se lišily mezi pohlavími u kostí spálených při 700 C, se chovaly u obou pohlaví odlišně při spalování. Compactness osteonu u žen při spalování rostla. U mužů tato proměnná při 700 C také rostla, ale při 800 C opět klesala. Shape factor osteonu vykazoval odpovídající změnu. Tyto tvarové změny osteonu také ovlivnily vzájemný vztah mezi osteonem a Haversovým kanálkem, vyjádřený třemi indexy, které se mezi pohlavími lišily u kostí spálených při 800 C (OK_OO obvod Haversova kanálku / obvod osteonu, PK_PO plocha Haversova kanálku / plocha osteonu, PRK_PRO průměr Haversova kanálku / průměr osteonu). Většina mikrostruktur se s rostoucím věkem u obou pohlaví chovala stejně, ale i zde se vyskytly výjimky, jak bylo zjištěno pomocí bodových grafů (Categorized Scatterplot), do kterých byly zaneseny jednotlivé proměnné vzhledem k věku a jedinci se rozdělili podle pohlaví (Příloha 4). Procento celkové plochy osteonů (PR_OST) u žen s věkem roste, ale u mužů klesá. Všechny rozměry Haversova kanálku (obvod - OBV_K; maximální osa MAX_K; minimální osa - MIN_K; průměr - PRUM_K a feret průměr - F_PR_K) se u žen s věkem téměř nemění nebo mírně rostou, zatímco u mužů se zmenšují. Všechny proměnné, které se chovaly s rostoucím věkem odlišně u obou pohlaví, měly statisticky významnou korelaci s dožitým věkem pouze u nespálených kostí (Tab. 24). Pro proměnné, které neměly významnou korelaci s dožitým věkem, nebyly bodové grafy sestrojeny, protože zde nelze vyvozovat žádné závěry. 155

156 Tab. 25. Mann-Whitney U test pro dva nezávislé soubory mezi muži (N = 31) a ženami (N = 19), nespálené kosti. U pořadová statistika; Z pořadová statistika převedená na normální rozdělení; p nejmenší hladina pro hodnotu Z, na které se zamítá hypotéza, že veličiny obou souborů jsou stejné * - statisticky významné na hladině p < 0,05; ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 Mann-Whitney U Test (Nespálené) Podle proměnné: SEX U Z TL_KOM 164-2,608 0,0091** POC_OST 241-1,069 0,2849 PL_OST 208-1,729 0,0838 PR_OST 151-2,868 0,0041** OBV_O 197-1,949 0,0513 MAX_O 202-1,849 0,0645 MIN_O 196-1,969 0,0490* PRUM_O 199-1,909 0,0563 F_PR_O 199-1,909 0,0563 PL_KAN 284 0,210 0,8338 PR_KAN 254-0,810 0,4182 OBV_K 285 0,190 0,8494 MAX_K 287 0,150 0,8808 MIN_K 285 0,190 0,8494 PRUM_K 284 0,210 0,8338 F_PR_K 276 0,370 0,7116 OK_OO 204 1,799 0,0721 PK_PO 187 2,149 0,0317* PRK_PRO 194 1,999 0,0456* C_OST 253-0,830 0,4068 C_KAN 247-0,949 0,3424 SFAC_OST 243 1,029 0,3033 SFAC_KAN 247 0,939 0,3475 P_NON_H 274-0,400 0,6894 PR_LAM 229 1,309 0,1905 POC_DUT 219 1,509 0,1313 PR_DUT 245 0,990 0,3225 PR_L_VN 233-1,230 0,2190 Proměnná p 156

157 Tab. 26. Mann-Whitney U test pro dva nezávislé soubory mezi muži (N = 29) a ženami (N = 13), kosti spálené při 700 C. U pořadová statistika; Z pořadová statistika převedená na normální rozdělení; p nejmenší hladina pro hodnotu Z, na které se zamítá hypotéza, že veličiny obou souborů jsou stejné * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 Mann-Whitney U Test (700 C) Podle proměnné: SEX U Z TL_KOM 154 0,939 0,3479 POC_OST 160 0,775 0,4381 PL_OST 146 1,156 0,2476 PR_OST 112 2,081 0,0374* OBV_O 137 1,401 0,1612 MAX_O 129 1,619 0,1055 MIN_O 158 0,830 0,4066 PRUM_O 141 1,292 0,1962 F_PR_O 145 1,184 0,2366 PL_KAN 178 0,286 0,7751 PR_KAN 144 1,211 0,2260 OBV_K 187-0,041 0,9675 MAX_K 182 0,177 0,8596 MIN_K 172-0,449 0,6535 PRUM_K 188-0,014 0,9892 F_PR_K 184-0,122 0,9026 OK_OO 109-2,149 0,0316* PK_PO 143-1,238 0,2157 PRK_PRO 115-2,000 0,0455* C_OST 73 3,143 0,0017** C_KAN 175 0,367 0,7134 SFAC_OST 71-3,183 0,0015** SFAC_KAN 173-0,422 0,6732 Proměnná p 157

158 Tab. 27. Mann-Whitney U test pro dva nezávislé soubory mezi muži (N = 46) a ženami (N = 24), kosti spálené při 800 C. U pořadová statistika; Z pořadová statistika převedená na normální rozdělení; p nejmenší hladina pro hodnotu Z, na které se zamítá hypotéza, že veličiny obou souborů jsou stejné * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 Mann-Whitney U Test (800 C) Podle proměnné: SEX U Z TL_KOM 360 2,376 0,0175* POC_OST 393 1,967 0,0492* PL_OST 443 1,349 0,1775 PR_OST 337 2,660 0,0078** OBV_O 440 1,386 0,1658 MAX_O 447 1,299 0,1939 MIN_O 470 1,015 0,3103 PRUM_O 442 1,361 0,1735 F_PR_O 444 1,336 0,1815 PL_KAN 481-0,879 0,3797 PR_KAN 531 0,254 0,7998 OBV_K 495-0,705 0,4807 MAX_K 517-0,433 0,6650 MIN_K 476-0,940 0,3470 PRUM_K 490-0,767 0,4430 F_PR_K 479-0,903 0,3664 OK_OO 351-2,487 0,0129* PK_PO 346-2,543 0,0110* PRK_PRO 364-2,320 0,0203* C_OST 486 0,810 0,4177 C_KAN 422 1,602 0,1091 SFAC_OST 482-0,860 0,3898 SFAC_KAN 422-1,602 0,1091 Proměnná p 158

159 Tab. 28. Analýza kovariance mezi muži a ženami s vyloučením vlivu dožitého věku a porovnání výsledku s výsledkem Mann-Whitney U testu. Nespálené kosti. Uvedeny dosažené hodnoty p * - statisticky významné na hladině p < 0,05; ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 Nespálené Analýza kovariance zda má Mann-Whitney U test zda se pohlaví vliv na danou proměnnou pohlaví v dané proměnné liší s vyloučením vlivu věku p p TL_KOM 0,2181 0,0091** POC_OST 0,0839 0,2849 PL_OST 0,8264 0,0838 PR_OST 0,0244* 0,0041** OBV_O 0,8283 0,0513 MAX_O 0,9294 0,0645 MIN_O 0,7421 0,0490* PRUM_O 0,8357 0,0563 F_PR_O 0,8446 0,0563 PL_KAN 0,2957 0,8338 PR_KAN 0,2787 0,4182 OBV_K 0,3249 0,8494 MAX_K 0,4057 0,8808 MIN_K 0,1915 0,8494 PRUM_K 0,2866 0,8338 F_PR_K 0,2503 0,7116 OK_OO 0,0705 0,0721 PK_PO 0,0611 0,0317* PRK_PRO 0,0601 0,0456* C_OST 0,9695 0,4068 C_KAN 0,3062 0,3424 SFAC_OST 0,7048 0,3033 SFAC_KAN 0,3198 0,3475 P_NON_H 0,2149 0,6894 PR_LAM 0,0856 0,1905 POC_DUT 0,3681 0,1313 PR_DUT 0,2486 0,3225 PR_L_VN 0,2490 0,

160 Tab. 29. Analýza kovariance mezi muži a ženami s vyloučením vlivu dožitého věku a porovnání výsledku s výsledkem Mann-Whitney U testu. Kosti spálené při 700 C. Uvedeny dosažené hodnoty p * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0, C Analýza kovariance Mann-Whitney U zda má pohlaví vliv na test zda se pohlaví danou proměnnou v dané proměnné s vyloučením vlivu věku liší p p TL_KOM 0,4354 0,3479 POC_OST 0,6051 0,4381 PL_OST 0,8655 0,2476 PR_OST 0,5350 0,0374* OBV_O 0,6453 0,1612 MAX_O 0,6922 0,1055 MIN_O 0,9882 0,4066 PRUM_O 0,8182 0,1962 F_PR_O 0,9300 0,2366 PL_KAN 0,7508 0,7751 PR_KAN 0,8091 0,2260 OBV_K 0,6072 0,9675 MAX_K 0,6285 0,8596 MIN_K 0,7266 0,6535 PRUM_K 0,6241 0,9892 F_PR_K 0,6607 0,9026 OK_OO 0,1296 0,0316* PK_PO 0,3347 0,2157 PRK_PRO 0,2000 0,0455* C_OST 0,0171* 0,0017** C_KAN 0,5840 0,7134 SFAC_OST 0,0072** 0,0015** SFAC_KAN 0,4767 0,

161 Tab. 30. Analýza kovariance mezi muži a ženami s vyloučením vlivu dožitého věku a porovnání výsledku s výsledkem Mann-Whitney U testu. Kosti spálené při 800 C. Uvedeny dosažené hodnoty p * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0, C Analýza kovariance Mann-Whitney U zda má pohlaví vliv na test zda se pohlaví danou proměnnou v dané proměnné s vyloučením vlivu věku liší p p TL_KOM 0,1123 0,0175* POC_OST 0,0510 0,0492* PL_OST 0,6850 0,1775 PR_OST 0,0494* 0,0078** OBV_O 0,5717 0,1658 MAX_O 0,4030 0,1939 MIN_O 0,9868 0,3103 PRUM_O 0,6234 0,1735 F_PR_O 0,6456 0,1815 PL_KAN 0,0832 0,3797 PR_KAN 0,6473 0,7998 OBV_K 0,1533 0,4807 MAX_K 0,2731 0,6650 MIN_K 0,0480* 0,3470 PRUM_K 0,1345 0,4430 F_PR_K 0,0934 0,3664 OK_OO 0,0194* 0,0129* PK_PO 0,0121* 0,0110* PRK_PRO 0,0243* 0,0203* C_OST 0,6925 0,4177 C_KAN 0,3164 0,1091 SFAC_OST 0,5582 0,3898 SFAC_KAN 0,1717 0,

162 7.7. ZMĚNY KOSTNÍ MIKROSTRUKTURY VLIVEM ŽÁRU Vlivem spalování dochází v kostech k mnoha změnám na makroskopické i mikroskopické úrovni. Jako nejvýrazněji působící aspekt se jeví smrštění kosti, které vede ke změnám téměř všech studovaných mikrostruktur. Při spalování dochází ke zvyšování počtu jednotlivých mikrostruktur na mm², ke zmenšování jejich velikosti (délkových rozměrů i plochy) a k poklesu procentuálního zastoupení jednotlivých struktur na ploše řezu (Tab. 1214, 16-18, 20-22, 24, 31). Míra změn se zvyšuje s rostoucí teplotou spalování. Zásadním poznatkem se ukázal fakt, že změny vyvolané spalováním jsou u většiny proměnných stejného typu jako změny vyvolané stárnutím (Tab. 24). To má fatální vliv na pokusy o odhad dožitého věku na spálených kostech, protože vlivem spalování dochází ke snižování statistické významnosti korelačních koeficientů některých proměnných s dožitým věkem. Vlivem žáru také dochází k poškození kosti, což vede k tomu, že se počet typů struktur použitelných pro analýzu zmenšuje. U většiny spálených kostí také není možné analyzovat všechna čtyři mikroskopická pole, jak bylo původně zamýšleno. To opět vede ke zhoršeným možnostem odhadu dožitého věku. U spálených kostí se také vzájemná korelační závislost jednotlivých proměnných stává rozsáhlejší, což ztěžuje nalezení jejich vhodných kombinací při konstruování regresních rovnic odhadu dožitého věku, protože do regresní analýzy mohou vstupovat jen vzájemně nezávislé proměnné (Příloha 3). Pro porovnání mezi různými teplotami spalování byly použity jen proměnné č Proměnné č nebyly u spálených kostí měřeny, protože nebyly u většiny vzorků spolehlivě identifikovatelné. Soubory kostí nespálených a spálených při 700 C a 800 C byly mezi sebou nejprve porovnány pomocí T-testu pro závislé soubory, a to tak, že pro testování byly vybrány dvojice stejných jedinců zastoupených v obou porovnávaných souborech. Tímto testem sledujeme účinek spalování na stejné jedince a zároveň eliminujeme vliv ne zcela identického složení porovnávaných souborů. Soubory kostí nespálených a spálených při 700 C (dvojice jedinců, N = 36; průměrný věk = 58,47; věkové rozpětí = 19-95; směrodatná odchylka = 22,361; střední chyba průměru = 3,73; variační koeficient = 38,2) se vzájemně lišily v celkem 18 proměnných (Tab. 32). Oba soubory se nelišily v obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO), průměru Haversova kanálku / průměru osteonu 162

163 (PRK_PRO), compactness Haversova kanálku (C_KAN) a shape factoru Haversova kanálku (SFAC_KAN). Soubory kostí spálených při 700 a 800 C (dvojice jedinců, N = 28; průměrný věk = 63,14; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 20,024; střední chyba průměru = 3,78; variační koeficient = 31,7) se od sebe lišily v celkem 15 proměnných (Tab. 34). Soubory se nelišily v tloušťce kompakty (TL_KOM), procentu celkové plochy osteonů (PR_OST), procentu celkové plochy Haversových kanálků (PR_KAN), obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO), průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO), compactness osteonu (C_OST) a shape factoru osteonu (SFAC_OST). Soubory kostí nespálených a spálených při 800 C (dvojice jedinců, N = 38; průměrný věk = 63,95; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 17,717; střední chyba průměru = 2,87; variační koeficient = 27,7) se lišily celkem ve 20 proměnných (Tab. 36). Soubory se nelišily pouze v obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO) a průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO). Soubory obsahující dvojice stejných jedinců byly porovnány také pomocí Wilcoxonova párového testu (Tab. 33, 35, 37). Tento neparametrický test byl použit zejména kvůli porovnání skupin vzorků spálených při 700 a 800 C, kde bylo k dispozici jen dvacet osm dvojic jedinců, a tedy zde bylo nebezpečí nenormálního rozdělení dat. Test byl aplikován i na zbylé dva případy porovnávání dvojic stejných jedinců. Výsledek Wilcoxonova párového testu byl ve všech třech případech porovnávání dvojic zcela identický s výsledkem T-testu pro závislé soubory (Tab. 41). Soubory kostí nespálených a spálených při 700 a 800 C byly mezi sebou porovnány také pomocí T-testu pro dva nezávislé soubory. Tento test byl použit proto, že zastoupení jedinců v analyzovaných souborech nebylo vlivem poškození kostí při spalování a následném zpracování zcela identické (Tab. 10) a při použití tohoto typu T-testu byly v souborech ponecháni i ti jedinci, kteří neměli odpovídající dvojici v ostatních souborech. Soubory kostí nespálených a spálených při 700 C se lišily v celkem sedmnácti proměnných (Tab. 38). Soubory se nelišily v procentu celkové plochy Haversových kanálků (PR_KAN), obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova 163

164 kanálku / ploše osteonu (PK_PO), průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO), compactness Haversova kanálku (C_KAN) a shape factoru Haversova kanálku (SFAC_KAN). S výjimkou procenta celkové plochy Haversových kanálků (PR_KAN) je výsledek stejný jako při použití T-testu pro závislé soubory a Wilcoxonova párového testu (Tab. 41). Soubory kostí spálených při 700 a 800 C se navzájem lišily v sedmnácti proměnných (Tab. 39). Oba soubory se nelišily v procentu celkové plochy Haversových kanálků (PR_KAN), obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO), průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO), compactness osteonu (C_OST) a shape factoru osteonu (SFAC_OST). S výjimkou tloušťky kompakty (TL_KOM) a procenta celkové plochy osteonů (PR_OST), které se u tohoto testu mezi soubory lišily, jde jinak o stejné proměnné, ve kterých se kosti spálené při 700 a 800 C nelišily ani u T-testu pro závislé soubory a Wilcoxonova párového testu. Kromě compactness a shape factoru osteonů a Haversových kanálků se jinak kosti spálené při 700 a 800 C od sebe nelišily ve stejných proměnných, které se při použití T-testu pro nezávislé soubory nelišily i mezi kostmi nespálenými a spálenými při 700 C. Soubory kostí nespálených a kostí spálených při 800 C se lišily v celkem dvaceti proměnných (Tab. 40). Soubory se nelišily v obvodu Haversova kanálku / obvodu osteonu (OK_OO), ploše Haversova kanálku / ploše osteonu (PK_PO) a průměru Haversova kanálku / průměru osteonu (PRK_PRO), stejně jako při použití T-testu pro závislé soubory a Wilcoxonova párového testu. Jak vidíme, nespálené kosti a kosti spálené při různých teplotách se mezi sebou lišily ve většině sledovaných proměnných, a to včetně těch, které měly nejvyšší korelační koeficienty s dožitým věkem (Tab. 24, 31-41). Rozdíl byl největší mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 800 C, to znamená, že rozdíly v parametrech jednotlivých mikrostruktur se vlivem stoupající teploty spalování zvýrazňují a k největším změnám v kosti dochází při 800 C, jak bylo potvrzeno již v předchozích pracích (Herrmann, 1976, 1977a; Loubová, 1999). Při použití T-testů pro závislé a nezávislé soubory a Wilcoxonova párového testu byla množina proměnných, ve kterých se soubory nelišily, až na malé výjimky stejná. Všechny použité typy testů ukázaly především jiné hladiny významnosti u jednotlivých proměnných. Příčinou je pravděpodobně mírně odlišné složení porovnávaných souborů při použití T-testů 164

165 pro závislé a nezávislé soubory a také různé matematické postupy používané jednotlivými metodami. Všechny soubory dohromady se nelišily pouze ve třech parametrech (OK_OO, PK_PO, PRK_PRO). Tyto tři proměnné jsou tedy nezávislé na stupni spálení, a tudíž by byly vhodné pro odhad dožitého věku jedince. Obvod Haversova kanálku / obvod osteonu (OK_OO) uvádí, kolik procent obvodu osteonu představuje obvod Haversova kanálku. Plocha Haversova kanálku / plocha osteonu (PK_PO) říká, kolik procent plochy osteonu zabírá plocha Haversova kanálku. Průměr Haversova kanálku / průměr osteonu (PRK_PRO) vypovídá o tom, kolik procent průměru osteonu připadá na průměr Haversova kanálku. Vzájemný prostorový vztah osteonu a Haversova kanálku není tedy spalováním ovlivněn. Odpovídá tomu i procentuální změna jednotlivých velikostních a plošných měr obou struktur, která je u osteonu i Haversova kanálku obdobná (Tab ). Použití těchto tří proměnných samotných však nevedlo k výpočtu uspokojivých rovnic odhadu dožitého věku, přesto, že jejich korelační koeficienty s dožitým věkem byly statisticky významné (Tab. 24). Z uvedeného plyne, že v naší studii bylo nutné konstruovat regresní rovnice odhadu dožitého věku pro každou teplotu spalování zvlášť, protože zkoumané soubory se ve většině sledovaných proměnných lišily, a proto je nebylo možné sloučit do jednoho souboru. Rovněž je jasné, že není v žádném případě možné používat rovnice vytvořené na souborech nespálených kostí pro odhad dožitého věku na spálených kostech. Vlivem spalování dochází v kostech k intenzivnímu zmenšování jednotlivých rozměrů mikrostruktur a také jejich plochy. Díky smrštění kosti jako celku se zvyšuje počet osteonů na mm² příčného řezu kompaktní kostí. Zároveň se ale zmenšuje procentuální zastoupení celkové plochy osteonů a celkové plochy Haversových kanálků na ploše řezu. To znamená, že smrštění jednotlivých mikrostruktur je intenzivnější, než smrštění kompaktní kosti jako celku. Během spalování se mění i tvar průřezu osteonů a Haversových kanálků, které se vlivem spalování stávají oválnějšími. Tloušťka kompaktní kosti se snižuje (Tab. 24, 31). Grafické znázornění teplotních změn je patrné v Příloze 5. Rozdíly mezi soubory se s rostoucí teplotou spalování stávají statisticky významnějšími (Tab ). 165

166 Tab. 31. Hodnoty jednotlivých proměnných u nespálených kostí a kostí spálených při 700 a 800 C (N počet jedinců, SD směrodatná odchylka) Nespálené (N = 49) 700 C (N = 36) 800 C (N = 60) Proměnná Průměr SD Průměr SD Průměr SD TL_KOM 517,60 195, ,85 148, ,18 104,254 POC_OST 14,09 3,913 16,85 5,684 20,99 6,811 PL_OST 28089, , , , , ,255 PR_OST 39,80 10,639 35,18 10,468 30,82 10,340 OBV_O 654,18 106, ,78 104, ,44 75,304 MAX_O 230,32 39, ,93 37, ,55 27,397 MIN_O 157,00 25, ,42 23, ,34 18,507 PRUM_O 193,66 31, ,67 29, ,94 21,935 F_PR_O 179,30 28, ,41 26, ,73 19,921 PL_KAN 2172, , ,02 697, ,19 510,410 PR_KAN 3,24 1,194 2,99 1,183 2,58 1,120 OBV_K 166,12 27, ,14 27, ,32 21,061 MAX_K 59,25 10,119 54,05 10,348 46,87 7,785 MIN_K 39,97 6,860 34,17 7,189 27,43 5,249 PRUM_K 49,61 8,207 43,98 8,126 37,15 6,288 F_PR_K 46,92 7,702 41,74 7,799 34,67 5,973 OK_OO 0,26 0,040 0,25 0,035 0,26 0,048 PK_PO 0,08 0,039 0,08 0,023 0,08 0,035 PRK_PRO 0,26 0,040 0,26 0,036 0,26 0,049 C_OST 16,93 0,681 17,89 0,945 17,76 1,006 C_KAN 16,00 0,583 16,02 0,936 16,99 0,823 SFAC_OST 0,75 0,027 0,72 0,034 0,72 0,036 SFAC_KAN 0,79 0,024 0,80 0,037 0,75 0,

167 Tab. 32. T-test pro závislé soubory mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 700 C (dvojice jedinců, N = 36; df = 35; průměrný věk = 58,47; věkové rozpětí = 19-95; směrodatná odchylka = 22,361; střední chyba průměru = 3,73; variační koeficient = 38,2). SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0,0001 Nespálené 700 C Rozdíl, SD pro nespálené rozdíl 700 C pozorování t p 164, 894 6,76 +2,24 5,201-2,58 0,0141* 7579, ,9 7084,303 6,19 33,45 11,138-7,19 8,400 5,14 113, ,57 105,837-70,59 95,975 4,41 0,0001*** 233,55 41, ,29 38,148-23,26 33,154 4,21 0,0002*** MIN_O 160,15 25, ,22 24,480-25,93 24,406 6,38 PRUM_O 196,85 32, ,26 29,893-24,59 26,664 5,53 F_PR_O 182,36 29, ,24 27,025-24,12 24,175 5,99 PL_KAN 2084,29 762, ,31 607, ,98 666,335 4,92 PR_KAN 3,18 1,207 2,64 1,112-0,54 0,796 4,05 0,0003*** OBV_K 165,98 26, ,88 25,595-22,10 23,870 5,56 MAX_K 59,30 10,194 52,55 10,115-6,75 8,749 4,63 MIN_K 39,79 6,421 33,09 6,478-6,69 7,217 5,57 PRUM_K 49,54 7,952 42,68 7,604-6,86 7,254 5,67 F_PR_K 46,78 7,404 40,51 7,246-6,27 7,070 5,32 OK_OO 0,26 0,037 0,25 0,036-0,01 0,042 1,30 0,2010 PK_PO 0,08 0,027 0,07 0,023-0,01 0,030 0,58 0,5644 PRK_PRO 0,26 0,037 0,25 0,038-0,01 0,042 0,77 0,4478 C_OST 16,84 0,590 17,83 1,017 +0,99 1,116-5,33 C_KAN 16,04 0,644 16,02 0,950-0,02 0,914 0,12 0,9053 SFAC_OST 0,76 0,025 0,72 0,037-0,04 0,041 5,40 SFAC_KAN 0,79 0,027 0,80 0,038 +0,01 0,038-0,76 0,4531 Proměnná Průměr SD Průměr SD TL_KOM 539,29 202, ,60 131, ,69 POC_OST 13,80 4,037 16,04 5,712 PL_OST 29028, , ,89 PR_OST 40,64 10,660 OBV_O 664,16 MAX_O 167

168 Tab. 33. Wilcoxonův párový test mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 700 C (dvojice jedinců, N = 36; průměrný věk = 58,47; věkové rozpětí = 19-95; směrodatná odchylka = 22,361; střední chyba průměru = 3,73; variační koeficient = 38,2). T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0,0001 Nespálené Proměnná Medián 700 C 25% 75% kvantil kvantil Medián 25% 75% kvantil kvantil T Z p TL_KOM 515,29 377,60 710,17 338,76 265,63 463, ,90 POC_OST 13,81 11,52 15,44 16,24 12,89 18, ,03 0,0427* PL_OST 28632, , , , , , ,73 PR_OST 41,04 31,09 50,11 33,66 23,72 40, ,96 0,0001*** OBV_O 665,63 565,46 732,24 582,30 514,28 667, ,57 0,0004*** MAX_O 233,85 200,49 255,12 201,39 183,55 242, ,39 0,0007*** MIN_O 160,27 137,68 180,82 130,74 119,72 142, ,81 PRUM_O 195,61 168,41 218,24 168,55 150,02 190, ,23 F_PR_O 182,46 157,24 203,98 155,20 138,88 171, ,49 PL_KAN 1916, , , , , , ,97 0,0001*** PR_KAN 2,74 2,39 3,85 2,61 1,80 3, ,37 0,0008*** OBV_K 163,32 145,13 181,81 143,01 127,93 157, ,30 MAX_K 57,63 51,36 64,39 50,90 45,96 58, ,68 0,0002*** MIN_K 39,53 34,91 43,19 32,67 29,49 36, ,32 PRUM_K 49,07 43,20 54,63 42,24 38,08 46, ,38 F_PR_K 46,45 40,84 51,70 40,25 36,93 43, ,26 OK_OO 0,25 0,23 0,27 0,24 0,22 0, ,25 0,2117 PK_PO 0,07 0,06 0,09 0,07 0,06 0, ,82 0,4140 PRK_PRO 0,25 0,23 0,27 0,25 0,23 0, ,89 0,3747 C_OST 16,84 16,44 17,15 17,81 17,22 18, ,13 C_KAN 15,99 15,55 16,22 15,79 15,30 16, ,57 0,5717 SFAC_OST 0,76 0,74 0,77 0,72 0,69 0, ,08 SFAC_KAN 0,79 0,78 0,81 0,80 0,78 0, ,93 0,

169 Tab. 34. T-test pro závislé soubory mezi kostmi spálenými při 700 a 800 C (dvojice jedinců, N = 28; df = 27; průměrný věk = 63,14; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 20,024; střední chyba průměru = 3,78; variační koeficient = 31,7). SD směrodatná odchylka p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0, C Proměnná 800 C Rozdíl, SD pro 700 C rozdíl 800 C pozorování t p Průměr SD Průměr SD TL_KOM 358,82 155, ,35 114,692-49,47 176,500 1,48 0,1496 POC_OST 15,43 4,415 22,57 7,528 +7,14 6,099-6,20 PL_OST 21918, , , , ,2 7438,205 4,23 0,0002*** PR_OST 33,61 10,956 34,44 11,482 +0,83 11,474-0,39 0,7036 OBV_O 598,49 115, ,87 87,908-92,62 114,473 4,28 0,0002*** MAX_O 211,64 41, ,95 32,274-28,69 41,734 3,64 0,0011** MIN_O 134,79 26, ,44 20,313-21,35 23,955 4,72 0,0001*** PRUM_O 173,21 32, ,19 25,381-25,02 31,929 4,15 0,0003*** F_PR_O 158,67 29, ,00 22,695-22,68 27,773 4,32 0,0002*** PL_KAN 1612,49 720, ,17 395, ,31 739,949 2,68 0,0123* PR_KAN 2,72 1,297 2,87 1,205 +0,15 1,021-0,77 0,4496 OBV_K 146,89 28, ,36 17,339-18,52 29,024 3,38 0,0022** MAX_K 53,29 10,903 47,53 6,497-5,76 10,877 2,80 0,0092** MIN_K 34,47 7,298 28,04 4,539-6,43 7,834 4,35 0,0002*** PRUM_K 43,71 8,513 37,78 5,243-5,92 8,819 3,55 0,0014** F_PR_K 41,60 8,188 35,30 4,947-6,30 8,444 3,95 0,0005*** OK_OO 0,25 0,033 0,26 0,050 +0,01 0,046-0,93 0,3584 PK_PO 0,08 0,021 0,08 0,034 0,00 0,031-0,90 0,3739 PRK_PRO 0,26 0,035 0,26 0,051 0,00 0,048-0,50 0,6199 C_OST 17,99 0,845 17,60 0,887-0,39 1,123 1,85 0,0754 C_KAN 15,84 0,924 16,85 0,768 +1,01 0,975-5,50 SFAC_OST 0,71 0,030 0,73 0,032 +0,02 0,039-2,04 0,0516 SFAC_KAN 0,81 0,036 0,76 0,029-0,05 0,037 6,59 169

170 Tab. 35. Wilcoxonův párový test mezi kostmi spálenými při 700 a 800 C (dvojice jedinců, N = 28; průměrný věk = 63,14; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 20,024; střední chyba průměru = 3,78; variační koeficient = 31,7). T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0, C Proměnná Medián 800 C 25% 75% kvantil kvantil Medián 25% 75% kvantil kvantil T Z p TL_KOM 316,41 265,63 463,93 296,52 215,44 346, ,66 0,0965 POC_OST 15,59 12,89 18,88 20,85 16,65 25,29 5 4,51 PL_OST 19642, , , , , , ,64 0,0003*** PR_OST 34,57 23,72 40,20 35,06 25,19 38, ,43 0,6653 OBV_O 569,65 514,28 667,04 496,67 461,81 521, ,55 0,0004*** MAX_O 199,19 183,55 242,99 178,64 163,25 192, ,05 0,0023** MIN_O 128,91 119,72 142,86 112,94 100,01 117, ,76 0,0002*** PRUM_O 166,55 150,02 190,50 145,98 134,05 153, ,44 0,0006*** F_PR_O 154,00 138,88 171,11 132,70 123,19 138, ,62 0,0003*** PL_KAN 1458, , , ,81 930, , ,53 0,0115* PR_KAN 2,55 1,80 3,22 2,67 1,89 3, ,75 0,4524 OBV_K 144,72 127,93 157,93 129,78 116,84 136, ,01 0,0026** MAX_K 51,82 45,96 58,90 48,25 42,57 50, ,50 0,0123* MIN_K 34,75 29,49 36,39 28,53 23,73 30, ,64 0,0003*** PRUM_K 42,83 38,08 46,54 38,18 34,32 40, ,17 0,0015** F_PR_K 40,71 36,93 43,94 35,62 31,56 37, ,42 0,0006*** OK_OO 0,25 0,22 0,28 0,26 0,23 0, ,46 0,1450 PK_PO 0,07 0,06 0,09 0,08 0,06 0, ,16 0,2455 PRK_PRO 0,25 0,23 0,28 0,27 0,23 0, ,13 0,2588 C_OST 17,93 17,22 18,68 17,63 17,37 18, ,59 0,1109 C_KAN 15,58 15,30 16,31 16,66 16,38 17, ,73 0,0002*** SFAC_OST 0,71 0,69 0,74 0,73 0,70 0, ,75 0,0795 SFAC_KAN 0,82 0,78 0,83 0,77 0,74 0, ,04 0,0001*** 170

171 Tab. 36. T-test pro závislé soubory mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 800 C (dvojice jedinců, N = 38; df = 37; průměrný věk = 63,95; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 17,717; střední chyba průměru = 2,87; variační koeficient = 27,7). SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0,0001 Nespálené Proměnná 800 C Rozdíl, SD pro nespálené rozdíl 800 C pozorování t p Průměr SD Průměr SD TL_KOM 497,19 165, ,90 105, ,29 143,139 8,88 POC_OST 14,67 3,830 21,69 7,293 +7,02 6,771-6,39 PL_OST 26355, , , , , ,666 11,60 PR_OST 39,20 11,133 32,48 11,698-6,72 11,058 3,75 0,0006*** OBV_O 633,40 92, ,11 80, ,29 78,815 10,97 MAX_O 221,94 31, ,86 29,015-43,07 27,985 9,49 MIN_O 153,24 24, ,53 19,566-43,72 21,634 12,46 PRUM_O 187,59 27, ,20 23,329-43,39 23,392 11,44 F_PR_O 173,87 25, ,96 20,680-41,91 20,875 12,38 PL_KAN 2204, , ,66 510, , ,513 5,50 PR_KAN 3,33 1,199 2,63 1,141-0,70 1,300 3,31 0,0021** OBV_K 164,86 29, ,07 20,921-38,79 30,369 7,87 MAX_K 58,71 11,043 46,62 7,337-12,09 10,908 6,83 MIN_K 39,86 7,502 27,61 5,657-12,24 7,784 9,70 PRUM_K 49,29 8,996 37,12 6,328-12,17 9,099 8,24 F_PR_K 46,66 8,468 34,72 6,141-11,93 8,680 8,48 OK_OO 0,27 0,044 0,26 0,049-0,01 0,049 0,62 0,5416 PK_PO 0,09 0,044 0,08 0,034-0,01 0,045 0,52 0,6043 PRK_PRO 0,27 0,044 0,26 0,050-0,01 0,051 0,59 0,5603 C_OST 16,89 0,668 17,77 0,877 +0,88 0,917-5,92 C_KAN 15,91 0,543 16,87 0,793 +0,96 0,843-6,99 SFAC_OST 0,76 0,025 0,72 0,032-0,04 0,033 6,44 SFAC_KAN 0,80 0,023 0,76 0,030-0,04 0,033 7,21 171

172 Tab. 37. Wilcoxonův párový test mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 800 C (dvojice jedinců, N = 38; průměrný věk = 63,95; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 17,717; střední chyba průměru = 2,87; variační koeficient = 27,7). T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0,0001 Nespálené Proměnná Medián 800 C 25% 75% kvantil kvantil Medián 25% 75% kvantil kvantil T Z p TL_KOM 456,50 377,60 710,17 279,99 215,44 346, ,21 POC_OST 14,32 11,52 15,44 20,85 16,65 25, ,89 PL_OST 25666, , , , , ,30 0 5,37 PR_OST 38,93 31,09 50,11 33,65 25,19 38, ,20 0,0014** OBV_O 621,36 565,46 732,24 493,34 461,81 521,51 3 5,33 MAX_O 221,62 200,49 255,12 179,31 163,25 192, ,21 MIN_O 153,04 137,68 180,82 109,56 100,01 117,66 1 5,36 PRUM_O 184,01 168,41 218,24 144,58 134,05 153,18 3 5,33 F_PR_O 172,32 157,24 203,98 131,87 123,19 138,49 0 5,37 PL_KAN 1875, , , ,52 930, , ,72 PR_KAN 3,21 2,39 3,85 2,50 1,89 3, ,72 0,0065** OBV_K 157,89 145,13 181,81 128,26 116,84 136, ,11 MAX_K 55,43 51,36 64,39 47,82 42,57 50, ,88 MIN_K 38,00 34,91 43,19 28,22 23,73 30,55 3 5,33 PRUM_K 47,43 43,20 54,63 37,40 34,32 40, ,20 F_PR_K 44,87 40,84 51,70 35,15 31,56 37, ,21 OK_OO 0,26 0,23 0,27 0,26 0,23 0, ,12 0,2610 PK_PO 0,07 0,06 0,09 0,08 0,06 0, ,37 0,7115 PRK_PRO 0,26 0,23 0,27 0,26 0,23 0, ,92 0,3571 C_OST 16,87 16,44 17,15 17,79 17,37 18, ,44 C_KAN 15,76 15,55 16,22 16,67 16,38 17, ,97 SFAC_OST 0,76 0,74 0,77 0,72 0,70 0, ,65 SFAC_KAN 0,80 0,78 0,81 0,77 0,74 0, ,90 172

173 Tab. 38. T-test pro dva nezávislé soubory mezi kostmi nespálenými a spálenými při 700 C. Df = 83; SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0,0001 Nespálené 700 C Rozdíl N = 49 N = 36 mezi nesp. t p Průměr SD Průměr SD a 700 C (%) VĚK 59,86 20,773 58,36 21, ,32 0,7464 TL_KOM 517,60 195, ,85 148,933-28,0 3,72 0,0004*** POC_OST 14,09 3,913 16,85 5, ,6-2,65 0,0095** -23,4 3,64 0,0005*** PL_OST 28089, , , ,518 PR_OST 39,80 10,639 35,18 10,468-11,6 1,99 0,0498* OBV_O 654,18 106, ,78 104,927-9,5 2,68 0,0088** MAX_O 230,32 39, ,93 37,970-8,9 2,41 0,0183* MIN_O 157,00 25, ,42 23,659-15,0 4,33 PRUM_O 193,66 31, ,67 29,421-11,4 3,29 0,0015** F_PR_O 179,30 28, ,41 26,285-12,2 3,62 0,0005*** PL_KAN 2172, , ,02 697,335-23,6 2,52 0,0137* 3,24 1,194 2,99 1,183-7,7 0,98 0,3319 OBV_K 166,12 27, ,14 27,179-10,8 3,00 0,0036** MAX_K 59,25 10,119 54,05 10,348-8,8 2,32 0,0229* MIN_K 39,97 6,860 34,17 7,189-14,5 3,77 0,0003*** PRUM_K 49,61 8,207 43,98 8,126-11,3 3,14 0,0023** F_PR_K 46,92 7,702 41,74 7,799-11,0 3,04 0,0031** OK_OO 0,26 0,040 0,25 0,035-3,8 0,77 0,4417 PK_PO 0,08 0,039 0,08 0,023 0,0 0,48 0,6345 PRK_PRO 0,26 0,040 0,26 0,036 0,0 0,31 0,7540 C_OST 16,93 0,681 17,89 0,945 +5,7-5,42 C_KAN 16,00 0,583 16,02 0,936 +0,1-0,12 0,9011 SFAC_OST 0,75 0,027 0,72 0,034-4,0 5,51 SFAC_KAN 0,79 0,024 0,80 0,037 +1,3-0,47 0,6401 PR_KAN 173

174 Tab. 39. T-test pro dva nezávislé soubory mezi kostmi spálenými při 700 a 800 C. Df = 94; SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0, C 800 C Rozdíl mezi N = 36 N = a 800 C t p Průměr SD Průměr SD (%) VĚK 58,36 21,322 62,72 17, ,08 0,2843 TL_KOM 372,85 148, ,18 104,254-23,3 3,35 0,0012** POC_OST 16,85 5,684 20,99 6, ,6-3,06 0,0029** -30,6 5,33 PL_OST 21504, , , ,255 PR_OST 35,18 10,468 30,82 10,340-12,4 1,99 0,0493* OBV_O 591,78 104, ,44 75,304-17,0 5,44 MAX_O 209,93 37, ,55 27,397-14,9 4,69 MIN_O 133,42 23, ,34 18,507-18,0 5,55 PRUM_O 171,67 29, ,94 21,935-16,2 5,26 F_PR_O 157,41 26, ,73 19,921-16,3 5,41 PL_KAN 1659,02 697, ,19 510,410-27,0 3,62 0,0005*** PR_KAN 2,99 1,183 2,58 1,120-13,7 1,69 0,0943 OBV_K 148,14 27, ,32 21,061-14,7 4,40 MAX_K 54,05 10,348 46,87 7,785-13,3 3,86 0,0002*** MIN_K 34,17 7,189 27,43 5,249-19,7 5,29 PRUM_K 43,98 8,126 37,15 6,288-15,5 4,61 F_PR_K 41,74 7,799 34,67 5,973-16,9 5,00 OK_OO 0,25 0,035 0,26 0,048 +4,0-0,70 0,4851 PK_PO 0,08 0,023 0,08 0,035 0,0-0,51 0,6098 PRK_PRO 0,26 0,036 0,26 0,049 0,0-0,24 0,8137 C_OST 17,89 0,945 17,76 1,006-0,7 0,62 0,5399 C_KAN 16,02 0,936 16,99 0,823 +6,1-5,33 SFAC_OST 0,72 0,034 0,72 0,036 0,0-0,76 0,4463 SFAC_KAN 0,80 0,037 0,75 0,029-6,3 6,19 174

175 Tab. 40. T-test pro dva nezávislé soubory mezi kostmi nespálenými a spálenými při 800 C. Df = 107; SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení * - statisticky významné na hladině p < 0,05 ** - statisticky významné na hladině p < 0,01 *** - statisticky významné na hladině p < 0,001 **** - statisticky významné na hladině p < 0,0001 Nespálené 800 C Rozdíl mezi N = 49 N = 60 nesp. a 800 C t p Průměr SD Průměr SD (%) VĚK 59,86 20,773 62,72 17, ,77 0,4407 TL_KOM 517,60 195, ,18 104,254-44,7 7,91 POC_OST 14,09 3,913 20,99 6, ,0-6,29-46,9 9,97 PL_OST 28089, , , ,255 PR_OST 39,80 10,639 30,82 10,340-22,6 4,45 OBV_O 654,18 106, ,44 75,304-24,9 9,31 MAX_O 230,32 39, ,55 27,397-22,5 8,12 MIN_O 157,00 25, ,34 18,507-30,4 11,26 PRUM_O 193,66 31, ,94 21,935-25,7 9,75 F_PR_O 179,30 28, ,73 19,921-26,5 10,23 PL_KAN 2172, , ,19 510,410-44,2 6,17 PR_KAN 3,24 1,194 2,58 1,120-20,4 2,98 0,0035** OBV_K 166,12 27, ,32 21,061-24,0 8,57 MAX_K 59,25 10,119 46,87 7,785-20,9 7,22 MIN_K 39,97 6,860 27,43 5,249-31,4 10,81 PRUM_K 49,61 8,207 37,15 6,288-25,1 8,97 F_PR_K 46,92 7,702 34,67 5,973-26,1 9,34 OK_OO 0,26 0,040 0,26 0,048 0,0 0,00 0,9962 PK_PO 0,08 0,039 0,08 0,035 0,0 0,02 0,9853 PRK_PRO 0,26 0,040 0,26 0,049 0,0 0,05 0,9602 C_OST 16,93 0,681 17,76 1,006 +4,9-4,91 C_KAN 16,00 0,583 16,99 0,823 +6,2-7,12 SFAC_OST 0,75 0,027 0,72 0,036-4,0 4,99 SFAC_KAN 0,79 0,024 0,75 0,029-5,1 7,52 175

176 Tab. 41. Přehledné porovnání výsledků T-testu pro závislé soubory, Wilcoxonova párového testu a T-testu pro nezávislé soubory mezi kostmi nespálenými a spálenými při 700 a 800 C. Proměnné, ve kterých se soubory neliší, mají červeně vyznačenou hodnotu p. T-test pro závislé soubory a Wilcoxonův párový test použity dvojice stejných jedinců, T-test pro nezávislé soubory použiti všichni jedinci * - statisticky významné na hladině p < 0,05; ** - statisticky významné na hladině p < 0,01; *** - statisticky významné na hladině p < 0,001; **** - statisticky významné na hladině p < 0,0001 Nespálené 700 C Proměnná T-test pro závislé soubory p Wilcoxonův párový test p 700 C 800 C T-test pro nezávislé soubory p T-test pro závislé soubory p Wilcoxonův párový test p T-test pro nezávislé soubory p TL_KOM 0,0004*** 0,1496 0,0965 0,0012** POC_OST 0,0141* 0,0427* 0,0095** 0,0029** PL_OST 0,0005*** 0,0002*** 0,0003*** PR_OST 0,0001*** 0,0498* 0,7036 0,6653 0,0493* OBV_O 0,0001*** 0,0004*** 0,0088** 0,0002*** 0,0004*** MAX_O 0,0002*** 0,0007*** 0,0183* 0,0011** 0,0023** MIN_O 0,0001*** 0,0002*** PRUM_O 0,0015** 0,0003*** 0,0006*** F_PR_O 0,0005*** 0,0002*** 0,0003*** PL_KAN 0,0001*** 0,0137* 0,0123* 0,0115* 0,0005*** PR_KAN 0,0003*** 0,0008*** 0,3319 0,4496 0,4524 0,0943 OBV_K 0,0036** 0,0022** 0,0026** MAX_K 0,0002*** 0,0229* 0,0092** 0,0123* 0,0002*** MIN_K 0,0003*** 0,0002*** 0,0003*** PRUM_K 0,0023** 0,0014** 0,0015** F_PR_K 0,0031** 0,0005*** 0,0006*** OK_OO 0,2010 0,2117 0,4417 0,3584 0,1450 0,4851 PK_PO 0,5644 0,4140 0,6345 0,3739 0,2455 0,6098 PRK_PRO 0,4478 0,3747 0,7540 0,6199 0,2588 0,8137 C_OST 0,0754 0,1109 0,5399 C_KAN 0,9053 0,5717 0,9011 0,0002*** SFAC_OST 0,0516 0,0795 0,4463 SFAC_KAN 0,4531 0,3505 0,6401 0,0001*** 176

177 Tab. 41. pokračování Nespálené 800 C Proměnná T-test pro závislé soubory p Wilcoxonův párový test p T-test pro nezávislé soubory p TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST 0,0006*** 0,0014** OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN 0,0021** 0,0065** 0,0035** OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO 0,5416 0,2610 0,9962 PK_PO 0,6043 0,7115 0,9853 PRK_PRO 0,5603 0,3571 0,9602 C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN Různé chování mikrostruktur při spalování u obou pohlaví Některé mikrostruktury se u obou pohlaví chovaly při spalování odlišně (Příloha 5). Procento celkové plochy osteonů (PR_OST) u žen při spalování klesalo. U mužů se při teplotě 700 C procento celkové plochy osteonů také snížilo, ale při 800 C se zvýšilo. Plocha Haversova kanálku (PL_KAN) se u žen při spalování zmenšila, ale mezi 700 a 800 C se již 177

178 neměnila. U mužů se plocha Haversova kanálku při teplotě 800 C ještě dále zmenšovala. To značí poněkud odlišné procesy smršťování kompaktní kosti jako celku a jejích jednotlivých složek u obou pohlaví. Compactness osteonu (C_OST) se u žen vlivem žáru zvyšovala, osteony se na příčném řezu stávaly oválnějšími protahovaly se. Změna byla patrná zejména při 700 C. U mužů se compactness osteonu při 700 C také zvýšila, ale při 800 C opět klesla. To znamená, že se osteony vracely zpět k původnímu tvaru. Toho však při teplotě 800 C nedosáhly a zůstaly oproti osteonům z nespálených kostí protažené. Tento proces potvrdila i odpovídající změna shape factoru osteonu (SFAC_OST) ODHAD DOŽITÉHO VĚKU Pro výpočet regresních rovnic odhadu dožitého věku byla použita mnohonásobná lineární regrese ve formě schodovité a standardní regrese. Vzhledem k tomu, že skupina žen v analyzovaných souborech kostí byla malá a neměla normální rozdělení, byly regresní rovnice odhadu dožitého věku vypracovány jen pro obě pohlaví dohromady a pro muže. Při konstruování regresních rovnic odhadu dožitého věku byla využita korelační matice proměnných pro každý soubor, kde byly vyznačeny jejich vzájemné závislosti (Příloha 3). Kombinace proměnných byly na základě korelační matice vytvářeny ručně. Při výpočtu rovnic byly vyzkoušeny všechny existující kombinace proměnných, které mezi sebou nesmějí být vzájemně závislé. Složitá vzájemná závislost jednotlivých histologických proměnných byla největším problémem při tvorbě regresních rovnic, zejména u spálených kostí. Tato závislost velmi ztěžovala nalezení vhodných kombinací proměnných pro výpočet regresních rovnic odhadu dožitého věku. U každé hodnocené skupiny jedinců bylo vybráno několik desítek nejlepších rovnic, které měly uspokojivé ukazatele (r, r², SEE) a ty byly poté aplikovány na kontrolní soubory (Tab. 54; Příloha 2). Kontrolní soubory pocházely ze stejné skupiny biologických vzorků jako studijní soubory. Podle úspěšnosti odhadu věku u kontrolního souboru byla pak pro každou skupinu vzorků vybrána nejspolehlivější regresní rovnice odhadu dožitého věku. Úspěšnost v odhadu dožitého věku byla stanovena podle toho, u kolika procent jedinců z kontrolního souboru se odhad věku pohyboval v intervalu ± 1SEE. Tento interval byl vybrán jednak s ohledem na literaturu a také podle toho, že do intervalu ± 1SEE padne při normálním rozdělení dožitého věku 67% zkoumané populace (Kubánková a Hendl, 1986). Dále byl 178

179 stanoven Spearmanův korelační koeficient mezi odhadnutým a skutečným věkem a také to, zda se průměr skutečného a odhadnutého věku mezi sebou statisticky významně liší či nikoliv. Do regresních rovnic se dosazují průměry hodnot z jednoho až čtyř mikroskopických polí v závislosti na zachovalosti kostního vzorku, zaokrouhlené na tři desetinná místa. Nejlepší získané rovnice a jejich aplikace na kontrolní soubory jsou prezentovány v Tabulkách Odhad dožitého věku na nespálených kostech Regresní rovnice odhadu dožitého věku pro nespálené kosti mají ze všech vypočtených regresních rovnic nejvyšší hodnoty mnohonásobného korelačního koeficientu r a koeficientu determinace r² a nejnižší hodnoty střední chyby odhadu SEE (Tab. 42, 44, 58). Tento výsledek byl očekáván s ohledem na značný vliv spalování na kompaktní kost. Ačkoli u nespálených kostí bylo až na několik výjimek téměř vždy možné analyzovat všechna čtyři mikroskopická pole v řezu, poskytuje rovnice odhadu dožitého věku pro nespálené kosti při aplikaci na kontrolní soubor uspokojivé výsledky pouze pro obě pohlaví dohromady (Tab. 42, 43). Rovnice pro muže (Tab. 44) sice má lepší hodnoty ukazatelů než rovnice pro obě pohlaví dohromady (pro muže: r = 0,79, r² = 0,63, SEE = 13,18 roku; pro obě pohlaví dohromady: r = 0,76, r² = 0,58, SEE = 13,93 roku), ale nedává spolehlivé výsledky u kontrolního souboru, u něhož se do limitu ± 1SEE vešlo pouze 40% jedinců a rozdíl mezi průměrem skutečného a odhadnutého věku činil -2,96 let (Tab. 45). Rozdíl průměru skutečného a odhadnutého věku u regresní rovnice pro obě pohlaví dohromady je oproti tomu pouze -1,30 roku, vzájemná korelace skutečného a odhadnutého věku je na hladině α = 0,05 statisticky významná (p = 0,0054) a dosahuje Spearmanova korelačního koeficientu r = 0,60 (Tab. 42). Proto pro praktické použití u nespálených kostí doporučujeme pouze regresní rovnici pro obě pohlaví dohromady. Rovnice odhadu věku pro obě pohlaví dohromady i rovnice pro muže mají tendenci nadhodnocovat odhadnutý věk u mladších věkových kategorií a u starších jedinců jej naopak podhodnocovat (Tab. 43, 45). Věková kategorie, kdy se nadhodnocování změní v podhodnocování, se pohybuje kolem 60 let dožitého věku. Tento jev je způsoben věkovým složením zkoumaného biologického materiálu, ve kterém převažovali jedinci starší 60 let. Tuto skutečnost nebylo možné ze strany řešitelů této studie nijak ovlivnit. 179

180 U regresních rovnic byl ověřen nutný předpoklad regresní analýzy, a to normální rozdělení diferencí mezi skutečným a odhadnutým věkem, které bylo potvrzeno pomocí histogramu a Shapiro-Wilkova W testu (Příloha 6). 180

181 Tab. 42. Regresní analýza nespálených kostí, obě pohlaví dohromady (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace) Nespálené, Pohlaví dohromady Regresní rovnice odhadu dožitého věku Y = 228,2824-0,14(OBV_O)-0,4667(PR_LAM) 4,1378(C_OST) r 0,76 r² 0,58 SEE 13,93 p p < 0,00000 Počet jedinců ve výběrovém souboru 49 Počet jedinců v kontrolním souboru 20 Kolik % jedinců z kontrolního souboru mělo 60% odhad věku uvnitř ± 1 SEE Průměr skutečného věku ± SD 58,35 ± 22,14 Průměr odhadnutého věku ± SD 57,05 ± 14,68 Rozdíl průměru skutečného a odhadnutého věku -1,30 r mezi skutečným a odhadnutým věkem Spearmanovo r = 0,60 (α = 0,05) p = 0,0054 Zda se skutečný a odhadnutý věk liší Wilcoxonův párový test (α = 0,05) Neliší; T = 100; Z = 0,187; p = 0,

182 Tab. 43. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. Nespálené kosti, obě pohlaví dohromady. 1 muž, 0 žena VĚK SEX VĚKODH ROZDÍL ,20 19, ,95 0, ,76 28, ,95 12, ,63 7, ,80 13, ,80 18, ,77-5, ,61 6, ,16-17, ,51 11, ,81-0, ,03-19, ,72-2, ,28-25, ,70-4, ,76-17, ,04-5, ,75-11, ,77-36,23 58,35-57,05-1,30 182

183 Tab. 44. Regresní analýza nespálených kostí, muži (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace) Nespálené, Muži Regresní rovnice odhadu dožitého věku Y = 270,456-0,407(MAX_O)-150,751(SFAC_KAN) r 0,79 r² 0,63 SEE 13,18 p p < 0,0000 Počet jedinců ve výběrovém souboru 31 Počet jedinců v kontrolním souboru 10 Kolik % jedinců z kontrolního souboru mělo 40% odhad věku uvnitř ± 1 SEE Průměr skutečného věku ± SD 52,10 ± 23,00 Průměr odhadnutého věku ± SD 49,14 ± 14,92 Rozdíl průměru skutečného a odhadnutého věku -2,96 r mezi skutečným a odhadnutým věkem Spearmanovo r = 0,54 (α = 0,05) p = 0,1111 Zda se skutečný a odhadnutý věk liší Wilcoxonův párový test (α = 0,05) Neliší; T = 25; Z = 0,255; p = 0,7989 Tab. 45. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. Nespálené kosti, muži. 1 muž VĚK SEX VĚKODH ROZDÍL 23, ,99 1,99 26, ,97 21,97 28, ,90 11,90 40, ,90-0,10 50, ,64 24,64 53, ,33 2,33 60, ,91-24,09 75, ,33-16,68 82, ,42-15,58 84, ,05-35,95 52,10-49,14-2,96 183

184 Odhad dožitého věku na spálených kostech Největším problémem při pokusech o odhad dožitého věku u spálených kostí se ukázal fakt, že účinek spalování překrývá vlivy stárnutí, neboť druh změn kostní mikrostruktury je v obou případech obdobný. Jedná se např. o zvyšování počtu mikrostruktur na mm² nebo zmenšování jejich rozměrů a plochy, které je způsobováno stárnutím a zároveň i spalováním (Tab. 24). Další překážkou při konstruování regresních rovnic odhadu dožitého věku byla skutečnost, že se zvyšující se teplotou spalování se vzájemná závislost jednotlivých proměnných stávala rozsáhlejší, takže bylo obtížné najít takové kombinace proměnných, které by dávaly regresní rovnice s uspokojivými ukazateli (r, r², SEE) a zároveň byly úspěšné při aplikaci na kontrolní soubor. Regresní analýza vyžaduje použití dat, která vykazují normální rozdělení v souboru. Naše rovnice odhadu dožitého věku pro mužské kosti spálené při 700 C byla vypracována na souboru, který obsahoval pouze 29 jedinců, takže je zde nebezpečí nenormálního rozdělení některých proměnných. Avšak všechny tři proměnné, které jsou v příslušné regresní rovnici použity (MAX_O, SFAC_KAN a PRK_PRO), měly u toho souboru normální rozdělení (Tab. 19). Přesto je vzhledem k charakteru použitých dat při přenosu výsledků na základní soubor nutné dbát zvýšené opatrnosti. Ostatní soubory použité pro výpočty regresních rovnic odhadu dožitého věku se skládaly z více než 30 jedinců, tedy můžeme rozdělení jejich proměnných považovat za normální (Kubánková a Hendl, 1986). Regresní rovnice odhadu dožitého věku pro spálené kosti byly rovněž ověřeny na kontrolních souborech (Tab. 47, 49, 54). I u spálených kostí mají rovnice tendenci jedince do cca 60 let věku nadhodnocovat, zatímco ve starších věkových kategoriích je věk obvykle podhodnocen (Tab. 47, 49, 51, 53; Příloha 6). U kostí spálených při 700 C byly při použití u kontrolního souboru úspěšné rovnice jak pro obě pohlaví dohromady, tak pro muže (Tab ). Jejich mnohonásobný korelační koeficient r dosahoval u obou pohlaví dohromady hodnotu 0,67 a u mužů 0,71. Koeficient determinace r² měl u obou pohlaví dohromady hodnotu 0,45 a u mužů 0,50. Úspěšnost těchto rovnic však může být ovlivněna také tím, že mají poměrně vysokou střední chybu odhadu (SEE = 16,25, resp. 16,95 let), takže se velké procento jedinců z kontrolního souboru vešlo do limitu odhadu věku ± 1SEE, který byl stanoven jako měřítko úspěšnosti použití rovnice v praxi. Konkrétně to bylo 75% jedinců u obou pohlaví dohromady a 80% jedinců u mužů. 184

185 Rovnice odhadu věku pro kosti spálené při 800 C nejsou v praxi použitelné, neboť mají nízký mnohonásobný korelační koeficient a koeficient determinace (obě pohlaví dohromady: r = 0,58, r² = 0,33; pro muže: r = 0,58, r² = 0,34) a vysokou SEE (14,90, resp. 15,73 roku). SEE je sice u těchto rovnic nižší než u rovnic pro kosti spálené při 700 C, ale regresní rovnice odhadu věku pro kosti spálené při 800 C neposkytly uspokojivé výsledky při aplikaci na kontrolní soubory, neboť do limitu ± 1 SEE se umístilo jen 55% kontrolních jedinců u obou pohlaví dohromady a 50% u mužů (Tab ). Tento zjevný neúspěch je zřejmě způsoben devastujícím vlivem spalování na zachovalost a jednotlivé mikrostruktury kompaktní kosti lidského žebra a překrýváním vlivů dožitého věku s vlivem vysokých teplot. Také u regresních rovnic pro spálené kosti bylo ověřeno normální rozdělení rozdílů mezi skutečným a odhadnutým věkem pomocí histogramu a Shapiro-Wilkova W testu (Příloha 6). Protože se kostní vzorky spálené při 700 a 800 C od sebe lišily v téměř všech zkoumaných proměnných, nebylo možné sloučit obě skupiny do jedné. Proto nebylo možné sestavit rovnice odhadu dožitého věku pro spálené kosti bez ohledu na teplotu spalování. To může představovat komplikaci při analýze spálených kostí neznámého původu, u nichž neznáme teplotu, při které byly spáleny. A jak víme z našeho experimentálního spalování kostních vzorků, nelze teplotu spalování spolehlivě určit podle barvy spálených kostí. 185

186 Tab. 46. Regresní analýza kostí spálených při 700 C, obě pohlaví dohromady (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace) 700 C, Pohlaví dohromady Regresní rovnice odhadu dožitého věku Y = -59,8169-0,2822(MAX_O) + 222,6290(SFAC_KAN) r 0, 67 r² 0,45 SEE 16,25 p p < 0,0001 Počet jedinců ve výběrovém souboru 36 Počet jedinců v kontrolním souboru 20 Kolik % jedinců z kontrolního souboru 75% mělo odhad věku uvnitř ± 1 SEE Průměr skutečného věku ± SD 66,05 ± 18,61 Průměr odhadnutého věku ± SD 61,61 ± 12,76 Rozdíl průměru skutečného a odhadnutého -4,44 věku r mezi skutečným a odhadnutým věkem Spearmanovo r = 0,57 (α = 0,05) p = 0,0085 Zda se skutečný a odhadnutý věk liší Wilcoxonův párový test (α = 0,05) Neliší; T = 65; Z = 1,493; p = 0,

187 Tab. 47. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 700 C, obě pohlaví dohromady. 1 muž, 0 žena VĚK SEX VĚKODH ROZDÍL 26, ,98 +2,98 28, ,05 +9,05 45, ,32 +15,32 53, ,99 +19,99 54, ,53 +12,53 56, ,92-7,08 62, ,04-3,96 63, ,98 +7,98 63, ,04-3,96 65, ,53-10,47 67, ,83-7,17 74, ,55-21,45 77, ,51-6,49 78, ,31-0,69 79, ,88-16,12 81, ,90-19,10 84, ,66-5,34 85, ,08-13,92 86, ,31-18,69 95, ,74-22,26 66,05-61,61-4,44 187

188 Tab. 48. Regresní analýza kostí spálených při 700 C, muži (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace) 700 C, Muži Regresní rovnice odhadu dožitého věku Y = -130,312-0,195(MAX_O) + 221,827(SFAC_KAN) + 194,113(PRK_PRO) r 0,71 r² 0,50 SEE 16,95 p p < 0,0005 Počet jedinců ve výběrovém souboru 29 Počet jedinců v kontrolním souboru 10 Kolik % jedinců z kontrolního souboru 80% mělo odhad věku uvnitř ± 1 SEE Průměr skutečného věku ± SD 58,00 ± 21,97 Průměr odhadnutého věku ± SD 54,14 ± 16,58 Rozdíl průměru skutečného a odhadnutého -3,86 věku r mezi skutečným a odhadnutým věkem Spearmanovo r = 0,70 (α = 0,05) p = 0,0251 Zda se skutečný a odhadnutý věk liší Wilcoxonův párový test (α = 0,05) Neliší; T = 19; Z = 0,866; p = 0,3863 Tab. 49. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 700 C, muži. 1 muž VĚK SEX VĚKODH ROZDÍL 26, ,08-0,92 28, ,23 +5,23 45, ,24 +0,24 53, ,36 +15,36 56, ,01-6,99 62, ,59-9,41 63, ,20 +16,20 67, ,83-8,17 85, ,96-20,04 95, ,89-30,11 58,00-54,14-3,86 188

189 Tab. 50. Regresní analýza kostí spálených při 800 C, obě pohlaví dohromady (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace) 800 C, Pohlaví dohromady Regresní rovnice odhadu dožitého věku Y = 100,5203-0,353(MAX_O) + 0,4769(F_PR_K) + 0,4136(POC_OST) r 0,58 r² 0,33 SEE 14,90 p p < 0,0000 Počet jedinců ve výběrovém souboru 60 Počet jedinců v kontrolním souboru 20 Kolik % jedinců z kontrolního souboru 55% mělo odhad věku uvnitř ± 1 SEE Průměr skutečného věku ± SD 52,95 ± 18,34 Průměr odhadnutého věku ± SD 62,55 ± 7,93 Rozdíl průměru skutečného a odhadnutého +9,60 věku r mezi skutečným a odhadnutým věkem Spearmanovo r = 0,01 (α = 0,05) p = 0,9699 Zda se skutečný a odhadnutý věk liší Wilcoxonův párový test (α = 0,05) Neliší; T = 59; Z = 1,717; p = 0,

190 Tab. 51. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 800 C, obě pohlaví dohromady. 1 muž, 0 žena VĚK SEX VĚKODH ROZDÍL 19, ,26 +44,26 23, ,83 +38,83 25, ,82 +22,82 37, ,32 +27,32 37, ,39 +39,39 43, ,48 +19,48 47, ,00 +7,00 51, ,31 +24,31 51, ,67 +8,67 54, ,34 +18,34 55, ,37 +6,37 55, ,94 +6,94 59, ,17-7,83 60, ,92-3,08 65, ,23-0,77 67, ,04-8,96 76, ,51-5,49 77, ,47-9,53 78, ,91-26,09 80, ,99-10,01 52,95-62,55 +9,60 190

191 Tab. 52. Regresní analýza kostí spálených při 800 C, muži (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace) 800 C, Muži Regresní rovnice odhadu dožitého věku Y = 117,4118-0,3626(MAX_O) + 0,4406(POC_OST) r 0,58 r² 0,34 SEE 15,73 p p < 0,0001 Počet jedinců ve výběrovém souboru 46 Počet jedinců v kontrolním souboru 10 Kolik % jedinců z kontrolního souboru mělo 50% odhad věku uvnitř ± 1 SEE Průměr skutečného věku ± SD 42,00 ± 16,39 Průměr odhadnutého věku ± SD 59,78 ± 13,04 Rozdíl průměru skutečného a odhadnutého +17,78 věku r mezi skutečným a odhadnutým věkem Spearmanovo r = -0,10 (α = 0,05) p = 0,7763 Zda se skutečný a odhadnutý věk liší Wilcoxonův párový test (α = 0,05) Liší; T = 7; Z = 2,090; p = 0,0367 Tab. 53. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 800 C, muži. 1 muž VĚK SEX VĚKODH ROZDÍL 19, ,48 +36,48 23, ,37 +39,37 25, ,60 +15,60 37, ,19 +31,19 37, ,93 +42,93 47, ,93 +4,93 51, ,77 +28,77 55, ,06 +0,06 59, ,62-12,38 67, ,88-9,12 42,00-59,78 +17,78 191

192 Tab. 54. Věkové složení kontrolních souborů (N počet jedinců, SD směrodatná odchylka, SE střední chyba průměru) N Aritmetický Věkové Interval spolehlivosti průměr rozmezí 95% Medián SD Nespálené 20 58, (47,99; 68,71) 61,50 22,141 Nespálené, Muži 10 52, (35,65; 68,55) 51,50 22, C 20 66, (57,34; 74,76) 66,00 18, C, Muži 10 58, (42,29; 73,71) 59,00 21, C 20 52, (44,37; 61,53) 54,50 18, C, Muži 10 42, (30,27; 53,73) 42,00 16,391 Variační SE koeficient Šikmost Špičatost (%) Shapiro-Wilkův W test Shapiro-Wilkův W test hodnota p (α = 0,05) Nespálené 4,95 38,0-0,45-1,27 0,89 0,0261 Nespálené, Muži 7,27 44,1 0,15-1,49 0,92 0, C 4,16 28,2-0,27-1,13 0,94 0, C, Muži 6,95 37,9 0,12-0,31 0,96 0, C 4,10 34,6-0,29-0,67 0,95 0, C, Muži 5,18 39,0-0,02-1,30 0,95 0, CHYBA MĚŘENÍ Pro zjištění chyby měření bylo náhodně vybráno dvacet jedinců ze skupiny nespálených kostí (N = 20; 10 mužů a 10 žen; průměrný věk = 66,15; věkové rozpětí 39-95; směrodatná odchylka = 16,230; střední chyba průměru = 3,63) a bylo provedeno opakované měření stejným pozorovatelem. Odstup mezi oběma měřeními byl tři roky, měření bylo provedeno stejným počítačovým programem, ale na jiném počítači. Měření bylo provedeno na nespálených kostech z toho důvodu, že na nich lze měřit všechny v této studii analyzované proměnné, tedy lze výsledek aplikovat i na kosti spálené, kde některé proměnné měřeny nebyly z důvodu jejich obtížné identifikovatelnosti. Pro porovnání prvního a druhého měření byl použit Wilcoxonův párový test, tento neparametrický test byl použit z důvodu nižšího počtu měřených jedinců (N = 20). Dále byly 192

193 vypočteny Pearsonův a Spearmanův korelační koeficient mezi prvním a druhým měřením, Spearmanův korelační koeficient byl použit rovněž z důvodu nižšího počtu jedinců. Dále byly spočteny chybová směrodatná odchylka, chybový variační koeficient a koeficient reliability (Šmahel, 2001). Chybový variační koeficient by neměl překročit 5%, koeficient reliability má pokud možno dosahovat hodnot nad 0,9 nebo alespoň nad 0,8 (Šmahel, 2001). Pomocí Wilcoxonova párového testu bylo zjištěno, že u tloušťky kompakty, počtu osteonů na mm² a procenta celkové plochy osteonů dochází mezi prvním a druhým měřením na 5% hladině významnosti k posunu střední hodnoty. To ukazuje na jistou systematickou chybu v měření, i když absolutní hodnoty rozdílu nebyly příliš vysoké (Tab. 55). Korelační koeficienty mezi prvním a druhým měřením však u těchto tří proměnných ukázaly statisticky významnou korelaci a rovněž chybový variační koeficient a zejména koeficient reliability dosahovaly uspokojivých hodnot. Pouze procento celkové plochy osteonů mělo vyšší chybový variační koeficient (Tab. 56, 57). V případě počtu non-haversových kanálků na mm² ukázaly korelační koeficienty, že korelace mezi oběma měřeními není statisticky významná, i když Wilcoxonův párový test rozdíl nezaznamenal. Tato proměnná měla také zcela neuspokojivé hodnoty chybového variačního koeficientu a koeficientu reliability (Tab ). U non-haversových kanálků může být nepřesnost dána tím, že se tato proměnná vyskytovala jen u malého počtu zkoumaných jedinců a pokud se v kosti vyskytovaly, bylo obtížné rozlišit je od kanálků Volkmannových nebo od malých resorpčních dutin. I přes uvedené nepřesnosti považujeme námi zvolenou metodu měření a jednotlivé proměnné za opakovatelné dalšími badateli. Pro praktické použití nedoporučujeme pouze proměnnou počet non-haversových kanálků na mm² (P_NON_H), protože její opakované měření se ukázalo jako nespolehlivé. 193

194 Tab. 55. Zjištění chyby měření. SD směrodatná odchylka. Wilcoxonův párový test: T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z. Ve vyznačených případech se obě měření od sebe liší na 5% hladině významnosti Původní měření Opakované měření Rozdíl Wilcoxonův párový test mezi měřeními T Z -6, ,165 0,0304* 4,256 +0, ,053 0,0401* 25731, ,243-21, ,784 0, ,539 41,04 11,316 +1, ,464 0,0137* 625,43 97, ,39 87,992 +3, ,784 0,4331 MAX_O 220,11 34, ,90 30,426 +0, ,635 0,5257 MIN_O 149,82 25, ,97 23,359 +1, ,307 0,1913 PRUM_O 184,97 28, ,93 26,140 +0, ,635 0,5257 F_PR_O 170,84 27, ,12 24,870 +1, ,083 0,2790 PL_KAN 2084,07 965, ,21 687,478-87, ,485 0,6275 PR_KAN 3,23 0,943 3,33 0,851 +0, ,232 0,2180 OBV_K 162,32 29, ,86 25,240-0, ,299 0,7652 MAX_K 58,20 11,750 57,46 10,047-0, ,269 0,2043 MIN_K 38,54 5,813 38,83 5,213 +0, ,560 0,5755 PRUM_K 48,37 8,499 48,15 7,385-0, ,747 0,4553 F_PR_K 45,73 7,767 45,59 6,719-0, ,373 0,7089 OK_OO 0,26 0,034 0,26 0,037 0, ,419 0,1560 PK_PO 0,08 0,028 0,08 0,030 0, ,409 0,1590 PRK_PRO 0,26 0,034 0,26 0,038 0, ,605 0,1084 C_OST 17,07 0,777 17,01 0,590-0, ,075 0,9405 C_KAN 16,02 0,588 16,08 0,591 +0, ,045 0,2959 SFAC_OST 0,75 0,028 0,75 0,022 0, ,448 0,6542 SFAC_KAN 0,79 0,025 0,79 0,025 0, ,531 0,1259 P_NON_H 0,28 0,547 0,33 0,707 +0, ,067 0,2860 PR_LAM 12,09 6,127 12,32 6,126 +0, ,149 0,8813 POC_DUT 1,12 1,187 1,02 0,937-0, ,523 0,6009 PR_DUT 2,29 2,422 1,99 2,288-0, ,449 0,1474 PR_L_VN 4,01 5,237 3,27 4,356-0, ,810 0,0703 Proměnná Průměr SD Průměr SD TL_KOM 495,75 180, ,29 183,582 POC_OST 15,60 4,254 16,04 PL_OST 25753, ,061 PR_OST 39,37 OBV_O p 194

195 Tab. 56. Pearsonův a Spearmanův korelační koeficient mezi prvním a druhým měřením vyznačená hodnota r není statisticky významná na 5% hladině významnosti Proměnná Pearsonův korelační Spearmanův korelační koeficient koeficient Pearsonovo r p Spearmanovo r p TL_KOM 1,00 0,0000 1,00 0,0000 POC_OST 0,98 0,0000 0,97 0,0000 PL_OST 0,96 0,0000 0,91 0,0000 PR_OST 0,98 0,0000 0,97 0,0000 OBV_O 0,96 0,0000 0,93 0,0000 MAX_O 0,95 0,0000 0,94 0,0000 MIN_O 0,97 0,0000 0,98 0,0000 PRUM_O 0,96 0,0000 0,90 0,0000 F_PR_O 0,97 0,0000 0,90 0,0000 PL_KAN 0,91 0,0000 0,84 0,0000 PR_KAN 0,86 0,0000 0,90 0,0000 OBV_K 0,93 0,0000 0,86 0,0000 MAX_K 0,92 0,0000 0,87 0,0000 MIN_K 0,93 0,0000 0,85 0,0000 PRUM_K 0,93 0,0000 0,85 0,0000 F_PR_K 0,93 0,0000 0,86 0,0000 OK_OO 0,91 0,0000 0,90 0,0000 PK_PO 0,90 0,0000 0,89 0,0000 PRK_PRO 0,91 0,0000 0,94 0,0000 C_OST 0,85 0,0000 0,83 0,0000 C_KAN 0,90 0,0000 0,84 0,0000 SFAC_OST 0,88 0,0000 0,82 0,0000 SFAC_KAN 0,91 0,0000 0,86 0,0000 P_NON_H 0,43 0,0560 0,44 0,0515 PR_LAM 0,96 0,0000 0,97 0,0000 POC_DUT 0,93 0,0000 0,88 0,0000 PR_DUT 0,96 0,0000 0,93 0,0000 PR_L_VN 0,95 0,0000 0,79 0,

196 Tab. 57. Zjištění dalších charakteristik pro popis chyby měření. Vyznačené hodnoty chybového variačního koeficientu a koeficientu reliability nesplňují doporučenou hranici 5% v případě chybového variačního koeficientu a 0,80 v případě koeficientu reliability Proměnná Rozptyl Rozptyl Chybová Chybový Koeficient reliability celkový chybový směrodatná variační s²celk - s²ch s²celk s²ch odchylka koeficient sch Vch s²celk R= TL_KOM 32670, ,252 10,062 2,0 0,99 POC_OST 18,101 0,478 0,692 4,4 0,97 PL_OST , , ,911 6,0 0,97 PR_OST 133,143 4,419 2,102 5,2 0,97 OBV_O 9411, ,754 20,044 3,2 0,96 MAX_O 1164,802 57,491 7,582 3,4 0,95 MIN_O 651,497 18,617 4,315 2,9 0,97 PRUM_O 829,381 31,688 5,629 3,0 0,96 F_PR_O 740,275 24,987 4,999 2,9 0,97 PL_KAN , , ,815 15,4 0,89 PR_KAN 0,890 0,118 0,344 10,5 0,87 OBV_K 862,133 57,622 7,591 4,7 0,93 MAX_K 138,066 10,659 3,265 5,6 0,92 MIN_K 33,789 2,190 1,480 3,8 0,94 PRUM_K 72,226 4,904 2,215 4,6 0,93 F_PR_K 60,327 3,813 1,953 4,3 0,94 OK_OO 0,001 0,0001 0,011 4,0 0,90 PK_PO 0,001 0, ,009 10,8 0,93 PRK_PRO 0,001 0,0001 0,011 4,2 0,90 C_OST 0,604 0,084 0,290 1,7 0,86 C_KAN 0,346 0,036 0,190 1,2 0,90 SFAC_OST 0,001 0,0001 0,01 1,3 0,90 SFAC_KAN 0,001 0, ,009 1,1 0,93 P_NON_H 0,300 0,222 0, ,9 0,26 PR_LAM 37,541 1,606 1,267 10,4 0,96 POC_DUT 1,409 0,114 0,338 31,6 0,92 PR_DUT 5,865 0,281 0,530 24,8 0,95 PR_L_VN 27,427 1,636 1,279 35,1 0,94 196

197 8. DISKUSE Identifikace spálených lidských pozůstatků přichází v úvahu především ve dvou vědních oborech - při výzkumu žárových pohřbů z archeologických výzkumů a při kriminalistické identifikaci obětí trestných činů, požárů, havárií, hromadných neštěstí, válečných událostí, teroristických útoků apod. Tyto případy dostatečně zdůvodňují potřebu co nejspolehlivější identifikace spálených kosterních pozůstatků. Při identifikaci spálených lidských kostí se dlouho používaly stejné metody a kritéria, které byly používány při zpracování nespáleného kosterního materiálu. Tento postup však nebyl úplně oprávněný, protože nebyl brán v úvahu fakt, že kosti prodělávají vlivem vysoké teploty při spalování řadu závažných změn, které postihují jejich barvu, povrch, velikost, tvar a vnitřní strukturu. Z tohoto důvodu nemohou být výsledky aplikace těchto metod na spálené kosti zcela spolehlivé a bez výhrad použitelné (Dokládal, 1999a). Antropologický rozbor spálených kostí je obtížný a většinou nepřináší tak spolehlivé výsledky jako zpracování nespáleného kosterního materiálu. Přesto je v antropologické praxi alespoň určitý stupeň analýzy spálených kostí nutný. Mezi antropology existují různé názory na spolehlivost analýzy spálených kostí, za všechny uveďme výrok předního českého antropologa Milana Stloukala (Dokládal, 1999a): Rozbor a hodnocení žárových pohřbů mají stále ještě v práci antropologů dosti problematické místo. Názory na jejich spolehlivost kolísají od téměř naprosté skepse až po krajní optimismus, který klade možnosti tohoto rozboru téměř na úroveň výzkumům pohřbů kostrových. Určování věku na základě makroskopické i mikroskopické struktury kostí je obtížné. Při tvorbě takové metodiky je nutné nalézt znaky, které jeví větší či menší závislost na věku. Ideálním cílem každé takové metody je přiměřeně jednoduchý a prakticky použitelný postup odhadu dožitého věku s přesností alespoň ± 5 let, navrhované metody však takové přesnosti obvykle nedosahují (Fiala, 1978). Složení souboru ovlivňuje přesnost metody v různých věkových kategoriích. Fiala (Fiala, 1978) k tomu poznamenává: Zdá se, že není možné nalézt takovou strukturu, která by se zcela pravidelně měnila po celý život jedince. Proto je nejvýhodnější použít kombinace několika proměnných a je nezbytné určit standardní přístup pro odběr kostních vzorků a pro hodnocení vybraných struktur (Fiala, 1978). Použití histologických metod odhadu věku vyvinutých na jedné populaci poskytuje u jiných populací jen velmi slabé odhady věku (Thompson a Gunness-Hey, 1981). Proto je nutné pro každou 197

198 populaci vyvinout vlastní metody odhadu věku a populačně specifické regresní rovnice na základě studia jedinců známého věku a pohlaví. Protože tradiční makroskopické metody odhadu dožitého věku neposkytují dostatečně přesný a spolehlivý odhad věku u dospělých jedinců staršího věku, spálených a fragmentárních kostí, je v těchto případech nutné použít histologické metody odhadu dožitého věku. Histologické metody rovněž poskytují objektivní metodiku založenou na statistické analýze spíše než na subjektivním posouzení stupně vývoje určitých makroskopických kritérií. Použití mikroskopických metod odhadu věku je však stále relativně vzácné (Uytterschaut, 1993). Může to být způsobeno např. technickými problémy přípravy řezů či výbrusů kostí, účinky rozdílné velikosti pole při použití mikroskopických metod a obtížemi v rozeznávání a definicích jednotlivých mikroskopických struktur. Jiným problémem je výběr pozorovaných polí, která mají vhodnou velikost a jejich lokalizace, která by byla skutečně reprezentativní pro celý řez danou kostí (Bertelsen et al., 1995). Podle Ericksenové (Ericksen, 1991) patří mezi nejdůležitější problémy při použití histologických metod odhadu věku choroby, nutrice a jiné prvky osobní historie, které mají vliv na remodelaci kostí a tím ovlivňují individuální odhad věku. Dále sem můžeme počítat obtíže přesného opakování popsaných technik odhadu věku a rozmanité a často vágní definice použitých histologických struktur. Dalším problémem je malá velikost a šikmost některých studovaných souborů. Přesto jsou histologické metody odhadu dožitého věku nezbytné především pro jedince nad padesát let věku, kdy jsou již makroskopické věkové změny na kostře prakticky nepoužitelné. Histologický odhad věku na výbrusech spálenou kostí se často prováděl podle kritérií platných pro nespálené kosti, aniž byla tato převoditelnost na spálený materiál experimentálně ověřena. Rozhodující přínos měla proto práce Hummelové a Schutkowskiho (Hummel a Schutkowski, 1986), která se zabývala tepelně indukovaným smrštěním spálených kostí. Jejich výzkum ukázal, že smrštění vzdáleností jednotlivých částí příčného řezu kompaktou je konstantní, takže relativní podíly mikrostruktur na příčném řezu kompaktou zůstávají zachovány. Tím je zaručen důležitý předpoklad pro spolehlivé posouzení věku na spálených kostech. Všechny pro histologický odhad věku relevantní strukturní elementy zůstávají ve spálených kostech zachovány a jsou obvykle dobře rozeznatelné (Hummel a Schutkowski, 1986). Dlouhé kosti, které většinou figurují v histologických metodách odhadu dožitého věku, je někdy obtížné či nemožné v kremacích identifikovat (Herrmann, 1977a). Navíc jsou tyto kosti obvykle využívány pro osteologická měření a badatelé je proto nechtějí poškozovat 198

199 odběrem příčného řezu. Proto byly v této studii použity broušené příčné řezy ze sternální třetiny třetího až desátého lidského žebra z recentní středoevropské populace. Použití žebra má na rozdíl od dlouhých kostí několik výhod. Žebro je velmi dobře identifikovatelné v žárových hrobech díky svému plochému průřezu (Stloukal et al., 1999; Dobisíková, 2004) a je snadno přístupné k odběru díky své poloze pod povrchem těla (Dobisíková, 2004; Streeter, 2010). Žebro není využíváno pro běžné osteologické analýzy a není ovlivněno lokomocí nebo porody (Stout a Paine, 1992; Dudar et al., 1993; Crowder a Rosella, 2007; Cannet et al., 2011). Jelikož žebra nejsou vystavena velké fyzické zátěži, neměly by existovat velké histomorfologické rozdíly mezi jednotlivými místy odběru histologického vzorku (Iwaniec et al., 1998; Dobisíková, 2004; Crowder a Rosella, 2007). Žebra na rozdíl od dlouhých kostí vykazují velmi stálou remodelační dynamiku, která není ovlivněna úrovní fyzické aktivity jedince (Tommerup et al., 1993; Robling a Stout, 2003; Pavón et al., 2010). Při analýze žeber není nutná jejich přesná identifikace, protože průběh remodelace kompaktní kosti je mezi jednotlivými žebry navzájem srovnatelný (Pirok et al., 1966; Frost, 1969; Crowder a Rosella, 2007; Pavón et al., 2010). Žebra mají rychlý obrat kostní hmoty, takže věkové změny by u nich měly být dobře hodnotitelné (Frost, 1969). Použití žebra může být výhodné při analýze fragmentárních archeologických nálezů nebo forenzních případů především tam, kde chybí dlouhé kosti. Ericksenová zdůrazňuje (Ericksen, 1991; Thomas et al., 2000), že histologické metody odhadu věku jsou zamýšleny pro aplikaci na individua, jejichž životní okolnosti a zdravotní stav nejsou známy, a proto by tyto metody neměly být odvozeny ze selektivního souboru. Soubor použitý v této studii tuto podmínku splnil, neboť šlo o osoby zemřelé z plného zdraví a vzhledem k indikaci pitev jsou v rámci zdravotního stavu osoby pitvané na odděleních soudního lékařství vždy brány jako náhodný výběr z populace (Dobisíková, 2004). Celkový zdravotní stav těchto osob však nebyl ve většině případů znám, to znamená, že u nich mohly být přítomny i choroby, které ovlivňují histologické struktury. Nicméně pokud se v kosti objeví známky patologických procesů, např. zánětu nebo tumoru, pak není hodnocení histologické struktury možné, případně vinou strukturálních změn kostní tkáně může jejich histologické vyšetření dávat zavádějící výsledky (Harsányi, 1993). Je zjištěno, že změny způsobené stárnutím a nemocí nemusí být od sebe vždy oddělitelné (Grimm, 1990). Při metabolických chorobách dochází k abnormálnímu zvýšení či snížení remodelace kosti, některé metabolické kostní choroby remodelaci zrychlují. Histologický odhad věku by pak byl příliš vysoký (Stout, 1989a). U sekundárního hyperparathyroidismu je díky zvýšené 199

200 hladině parathyroidního hormonu v krvi stimulována formace i resorpce kosti a výsledkem je abnormálně zvýšený počet osteonů na jednotku plochy. Senilní osteopenie (např. senilní a postmenopauzální osteoporóza) naopak způsobuje snížený počet osteonů na jednotku plochy. Jelikož je tato choroba obvyklá v mnoha lidských populacích, má značný význam pro histologické metody odhadu věku, zvláště u jedinců v páté dekádě života a starších. Jiné choroby jsou charakterizovány redukcí Haverské remodelace. U diabetes mellitus nacházíme redukovaný počet osteonů na jednotku plochy a totéž platí pro jedince léčené adrenálními kortikosteroidy (Stout, 1989a). Proto by měly být při konstruování histologických metod odhadu věku vyloučeny patologické vzorky nebo alespoň vzorky, u nichž je známo, že tito jedinci trpěli chorobou ovlivňující kostní mikrostrukturu. V naší práci byli vyloučeni všichni jedinci s takovými nemocemi v anamnéze. Herrmann (Herrmann, 1976) pochyboval o možnostech histologického využití spálených kostí jako celku. Tvrdil, že broušené řezy jsou nepoužitelné, protože ukazují kalcinovanou kost jako homogenní plochu, která je přerušována jen Haversovými kanálky a osteocytárními lakunami. Tyto jeho předpoklady byly v naší studii vyvráceny, neboť při všech použitých teplotách spalování byly mikrostruktury viditelné na neobarvených řezech ve světelném mikroskopu. Jediným problémem bylo, že u některých proměnných nebylo možné exaktně stanovit jejich hranice, i když bylo jasně patrné, že jsou v kosti přítomny. Tento jev se týkal např. fragmentů osteonů. Změny způsobené spalováním mohou pokusy o histologický odhad dožitého věku individua značně komplikovat (Herrmann, 1977a). Pokud je vnější třetina kompakty destruována, ztrácí Kerleyova a podobné mikroskopické metody, značně na přesnosti. Vlivem smrštění navíc dochází ke zvýšení počtu struktur na jednotku plochy či na pozorované pole a odhadnutý věk je potom v důsledku toho nadhodnocený (Herrmann, 1990; Holden et al., 1995b). Proto je zapotřebí vypracovat metodiku odhadu věku zvlášť pro spálené kosti. Vysoké teploty také mohou zapříčinit horší rozlišitelnost jednotlivých histologických struktur nutných pro odhad věku. Rovněž použití morfometrie je kvůli smrštění mikrostruktur ve spálené kosti omezené. Žebra jsou po spálení zachována ve formě četných úlomků, které jsou velmi defektní, mají pukliny, jsou deformované, vykazují nefyziologická ohnutí i pokroucení (Dokládal, 1999a). Všechna tato pozorování byla v našem výzkumu potvrzena. Díky své tenké kompaktní kosti je žebro po kremaci velmi často poškozeno, kosti jsou popraskané, kompakta se odloupává a kroutí, poškozena je i mikrostruktura. Přesto si kosti zachovaly dostatečnou 200

201 pevnost pro tvorbu výbrusů. Se zvyšující se teplotou spalování se rozlišitelnost jednotlivých mikrostruktur postupně zhoršovala. Nejlépe identifikovatelnou a často také jedinou exaktně rozeznatelnou mikrostrukturou byl u spálených žeber intaktní osteon a Haversův kanálek. Proto bylo možné naše rovnice pro spálené kosti konstruovat pouze na základě parametrů těchto dvou mikrostruktur a jejich vzájemných indexů. Díky poškození kostí nakonec do analýzy nemohly být zařazeny vzorky spálené při 1000 C. Tyto skutečnosti jsou limitujícím faktorem pro úspěšné vytvoření regresních rovnic odhadu dožitého věku pro spálené kosti. Malá tloušťka kompaktní kosti žebra navíc způsobuje, že příčné smrštění je vyšší, než by bylo při stejné teplotě dosaženo u kostí se silnou kompaktou, jakou má např. femur. Bylo totiž experimentálně zjištěno, že příčné smrštění kompaktní kosti je ovlivněno její tloušťkou (Hummel a Schutkowski, 1986; Schutkowski, 1991). Nicméně míra smrštění jednotlivých částí příčného řezu by měla být lineární a konstantní (Hummel a Schutkowski, 1986). Větším problémem než samotné smrštění tedy bude poškození kosti žárem způsobující její popraskání a rozpadávání, ztrátu některých částí a obtížnou rozpoznatelnost struktur. Teploty spalování 700 a 800 C byly zvoleny na dolní a horní hranici Herrmannovy tzv. kritické hladiny, kdy by mělo docházet v kostech k největším změnám (Herrmann, 1977a). Dále bylo zvoleno rozmezí teplot s ohledem na analýzy kosterních pozůstatků obětí požárů a kriminálních činů, pozůstatků z krematorií a v neposlední řadě také archeologických nálezů. Teploty 700, 800 a 1000 C se vyskytují při požáru (Holden et al., 1995a, 1995b; Quatrehomme et al., 1998) a jsou používány v moderních krematoriích (Heussner, 1990a; Dunlop, 2004; Ubelaker, 2009). Prehistorické kremace měly teplotu pravděpodobně v rozmezí 500 až 900 C, výjimečně i 1000 C (Heussner, 1987, 1990a, 1990b; Schutkowski, 1991; Harsányi, 1993; Holden et al., 1995a; Dokládal, 1999a, 1999b; Hanson a Cain, 2007). Oheň zapálený venku na dřevěné hranici, který může souviset např. s kriminální aktivitou vedoucí k odklizení těla oběti, dosahuje 400 až 980 C (Heussner, 1990a; Hanson a Cain, 2007; Ubelaker, 2009). V případě prehistorických kremací nebo forenzních případů hraje velkou roli počasí, roční období, druh topiva (použité dřevo na pohřební hranici, materiály hořící při požáru apod.), přítomnost měkkých tkání a oblečení, různé zasažení jednotlivých částí těla ohněm, různá poloha těla na kremační hranici, výška dosažené teploty a délka trvání žáru, hašení, diageneze kostí v půdě apod. Přesto není při vytváření metodiky pro spálené kosti jiná cesta, než použít kosti spálené při uměle vytvořených podmínkách. Experimentální spalování kostí na venkovním ohni a v laboratorní peci prokázalo, že oba typy spalování poskytují podobné 201

202 změny kostní mikrostruktury, a že tedy můžeme poznatky získané při experimentálním spalování kostí aplikovat i na případy z praxe (Holden et al., 1995a; Quatrehomme et al., 1998; Hanson a Cain, 2007). Co se týče archeologických nálezů, jsou histologické struktury v archeologických kosterních nálezech obvykle dost dobře zachovány, aby dovolily určení různých ukazatelů kostní remodelace, včetně odhadu věku (Stout a Teitelbaum, 1976b; Stout, 1989b). Věkové změny v kostní histomorfologii u minulých populací zůstaly nezměněny po dobu alespoň 1600 let, neboť i u takto starého nálezu souhlasily všechny histomorfometrické parametry s očekávanými hodnotami pro zdravého jedince stejného věku a pohlaví ze současné populace (Stout a Teitelbaum, 1976b). Proto je histologická metoda odhadu dožitého věku použitelná i pro archeologické vzorky. Původním záměrem studie bylo hodnotit kostní vzorky ve čtyřech mikroskopických polích, a to ve dvou polích na vnitřní i vnější straně žebra. Hodnocení kosti ve čtyřech polích minimalizuje možnost analýzy atypického pole a na rozdíl od analýzy celé plochy řezu šetří čas během sběru dat, jak doporučuje např. Stout (Stout, 1992). Navíc měl tento postup umožnit využití i poškozených kostí. Základem pro toto rozhodnutí byla práce Iwaniecové (Iwaniec et al., 1998), která zjistila, že i relativně malá část řezu je schopna předpovědět hodnoty proměnných pro celý řez. Poškození zejména spálených kostí však vedlo k tomu, že tento předpoklad nemohl být vždy splněn u všech vzorků nebo proměnných. Proto byla nakonec v analýze použita data získaná z jednoho až čtyř mikroskopických polí. Vzhledem k tomu, že pozorované pole obsahovalo celou tloušťku kompaktní kosti včetně periostu, endostu a části dřeňové dutiny, je nebezpečí hodnocení atypického pole minimální. Vycházelo se také z toho, že i v některých jiných pracích bylo použito méně než čtyři mikroskopická pole (Singh a Gunberg, 1970; Thompson, 1979; Samson a Branigan, 1987), a že obě strany žebra se od sebe v převážné většině histologických struktur statisticky významně neliší (Cannet et al., 2011). Proto se předpokládá, že ani použití menšího počtu polí než čtyř nebude mít na přesnost dané metody vliv. Je známo, že různé mikroskopy, objektivy a okuláry produkují rozdílné velikosti mikroskopického pole, a že na velikosti tohoto pole a stupni zvětšení závisí počet a velikost struktur viděných v pozorovaném mikroskopickém poli (Stout a Gehlert, 1982; Lazenby, ; Harsányi, 1993). Proto je doporučeno použití té velikosti pole, která byla použita v původní metodě, a pro odlišnou velikost pole byly zavedeny tzv. korekční faktory (Kerley a Ubelaker, 1978). Nicméně kvůli prostorové variabilitě mikrostruktur uvnitř kompaktní kosti má pouhá úprava dat korekčním faktorem jistá omezení. Bylo zjištěno, že jak rozdíl mezi 202

203 velikostí pozorovaného a doporučeného pole roste, stoupá i rozdíl mezi známým a odhadnutým věkem, což vede k významné redukci spolehlivosti odhadu věku (Stout a Gehlert, 1982). Z tohoto důvodu se v naší práci všechny hodnoty převáděly na počet struktur na mm² nebo na jejich procentuální zastoupení na ploše řezu. Tím je rozdílná velikost pozorovaného pole eliminována. Problémy s velikostí pole a interpretací struktur na jeho periferii mohou být vyřešeny také počítáním struktur na fotografiích, které navíc poskytují trvalý záznam každého mikroskopického pole a pomocí příslušného počítačového programu i záznam jeho analýzy (Ericksen, 1991; Stout, 1992). Stout (Stout, 1992) doporučuje vyznačit si obrysy identifikovaných struktur tužkou, což v našem případě bylo uskutečněno obtažením obrysů struktur v počítačovém programu SigmaScan Pro 5. V kompaktní kosti žeber mělo být podle původních předpokladů studie analyzováno co možná nejvíce histologických proměnných, protože při odhadu dožitého věku neznámých kosterních pozůstatků je vhodné mít velký počet věkových prediktorů (Singh a Gunberg, 1970; Dudar et al., 1993; Kim et al., 2007). Bohužel, některé mikrostruktury nebyly u spálených kostí dobře identifikovatelné, bezpečně rozeznatelné byly pouze intaktní osteony a Haversovy kanálky. Non-Haversovy kanálky a resorpční dutiny bylo obvykle obtížné odlišit od poškození vzniklých ohněm. Obvodové lamely často úplně chyběly, což potvrzují i předchozí práce (Loubová, 1999), fragmenty osteonů spolu splývaly. Proto byla nakonec analýza spálených kostí omezena pouze na parametry intaktních osteonů a Haversových kanálků. Tento poznatek je v souladu s některými staršími studiemi, které také doporučují při analýze spálených kostí použít intaktní osteony (Hummel a Schutkowski, 1993). Fragmenty osteonů nebyly nepoužity, protože byly obtížně počitatelné a nejsou doporučovány ani v jiných pracích z důvodu nejasné definice a možnosti záměny se šikmo proříznutými osteony (Singh a Gunberg, 1970; Keough et al., 2009). Při analýze kompaktní kosti žebra bývá rovněž problémem stanovit hranice kompaktní kosti od trámců spongiózy, hlavně u vzorků s velkou porozitou. Při aplikaci metod odhadu věku musí proměnné souhlasit podle definice s těmi, které byly použity autorem metody. To je zvláště důležité např. při odlišení intaktních a fragmentárních osteonů (Lazenby, ). Vyvstává však otázka, co přesně je intaktní osteon? Existuje mnoho definic intaktního osteonu, jejichž interpretace může být do jisté míry subjektivní. Intaktní osteon je např. systém, který má kompletní Haversův kanálek a alespoň 80% své plochy intaktní (Kerley, 1965); neremodelovaný systém (Wu et al., 1970); systém, kde Haversův kanálek je intaktní (Ortner, 1970); struktura s 90% obvodu Haversova kanálku 203

204 intaktní (Stout a Teitelbaum, 1976b; Stout, 1983); struktura zformovaná v resorpčním prostoru a tedy formovaná odstraněním primární kosti; systém, jehož obrácená linie je intaktní; struktura s koncentrickými lamelami obklopujícími Haversův kanál (Thompson, 1978); systém, který má více než 90% Haversova kanálku intaktní (Iwaniec et al., 1998); struktura se 100% obvodu Haversova kanálu intaktní (Singh a Gunberg, 1970; Ericksen, 1980; Burr et al., 1990), struktura s alespoň 80% cementové linie intaktními (Cannet et al., 2011) apod. Např. u Kerleyho (Kerley, 1965) je intaktní osteon takový, který je z osmdesáti a více procent kompletní. Takové hodnocení je však naprosto subjektivní, způsobující chybu měnící se od badatele k badateli a se stupněm zkušenosti. Ahlqvist a Damsten (Ahlqvist a Damsten, 1969) nabízejí řešení v podobě sloučení osteonů a fragmentů do jedné kategorie remodelovaná kost. Ta se rozlišuje od neremodelované čili obvodové lamelární kosti. Jejich postup však vyžaduje hodnocení čtverců v počítací mřížce. Každý čtverec se počítá jako remodelovaná kost, pokud je z padesáti a více procent vyplněn osteony a fragmenty. Takové hodnocení je opět subjektivní. Problémem také je, kam zařadit např. resorpční dutiny nebo formující se osteony, u kterých může centrální kanálek zabírat několik čtverců. Měly by být klasifikovány jako remodelovaná kost, protože jsou součástí remodelačního procesu, ale metoda to výslovně neříká (Lazenby, ). V naší práci byl intaktní osteon definován jako útvar, který má neporušený obvod Haversova kanálku. Základním rysem funkčního osteonu je totiž kanálek, ve kterém se nacházejí cévy a nervy. Pokud je kanálek narušen, tuto funkci ztrácí a osteon přestává plnit své úkoly v kostní tkáni. Histomorfometrie kosti vyžaduje striktní metodologické podmínky, protože bezchybná kvalitativní identifikace a popis měřených parametrů je základním předpokladem jakékoli kvantitativní analýzy (Boivin a Meunier, 1993). Bohužel bez ohledu na to, kolik a jaké struktury daná metoda používá a definuje, není bezchybná identifikace všech předepsaných struktur v kosti vždy možná. Platí to především pro spálené kosti, kde se rozeznatelnost struktur se zvyšující se teplotou spalování zhoršuje. Osteonální drift (Kim et al., 2007) je proces, který vytváří transversálně prodloužený osteon. Pro měření driftujících osteonů nebyla bohužel dosud publikována žádná kritéria. Kim a kolegové (Kim et al., 2007) neměřili u těchto osteonů jejich rozměry ani plochu, pouze je počítali do počtu osteonů. Tím se vyhnuli podhodnocení počtu osteonů a zároveň nadhodnocení průměrné plochy osteonu. V naší práci byl u driftujících a nadměrně protáhlých osteonů měřen pouze jejich počet; jejich plocha se započítávala do procenta celkové plochy 204

205 osteonů. Rozměry ani jiné individuální míry nebyly u těchto osteonů zjišťovány. Došlo by tak totiž ke zkreslení např. průměrné plochy osteonu, maximální a minimální osy, průměru aj. Některé práce týkající se odhadu věku doporučují též využití počtu lamel v osteonu (Fiala, 1978). Hodnocení počtu lamel v osteonu je však dosti problematické. Je to dáno tím, že osteon je prostorový útvar probíhající rovnoběžně s dlouhou osou kosti, který má různou šířku měnící se v jeho podélném průběhu. Počet lamel se proto mění na různé úrovni řezu. Navíc pro zjištění počtu lamel je zapotřebí zhotovit řezy o tloušťce 8 až 10 μm, což je často technicky obtížně splnitelné (Fiala, 1978). Nelson (Nelson, 1992) se pokusil o zjišťování počtu koncentrických lamel v osteonu, ale při hodnocení spálených kostí to bylo často neproveditelné, protože hranice mezi lamelami nebyly vždy rozeznatelné. Některé novější práce navíc uvádějí, že počet lamel v osteonu nemá téměř žádnou korelaci s dožitým věkem a je obtížně opakovatelný ostatními autory (Keough et al., 2009). V naší práci nebyl počet lamel v osteonu hodnocen, protože jeho určování je značně subjektivní a nepřesné (Keough et al., 2009) a jak bylo během naší práce zjištěno, závisí také na zaostření a různém zvětšení mikroskopu (Obr. 55). Ve spálených kostech navíc nebyly jednotlivé lamely v drtivé většině případů rozeznatelné. Někteří autoři používají pro odhad věku také fragmenty osteonů (Kerley, 1965; Fiala, 1978). V naší studii byly fragmenty osteonů nakonec z analýzy vyloučeny z několika důvodů. Většina intersticiální kosti se ve skutečnosti skládá z fragmentů, které je obtížné počítat a stanovení jejich počtu je proto značně subjektivní. Navíc osteony nejsou vždy orientovány paralelně k dlouhé ose kosti a některé z nich jsou proříznuty šikmo. V příčných řezech se pak mohou jevit jako fragmenty a výsledkem by byla chyba ve výpočtu (Singh a Gunberg, 1970). U spálených kostí byly fragmenty osteonů vzájemně obtížně rozlišitelné, místy úplně splývaly a jejich počet by tak byl stanovován značně subjektivně. U většiny spálených kostí navíc vůbec nebylo možné počet fragmentů stanovit. S přibývajícím věkem se v kompaktní kosti femuru zmenšuje procento obvodové lamelární kosti, která mizí v širokém rozmezí od dvaceti pěti do šedesáti let (Kerley, 1965; Loubová, 1999). U lidského žebra je podíl vnějších obvodových lamel na věku jen mírně závislý a v šedesáti letech má klesat až k nulové hodnotě (Loubová, 1999). Singh a Gunberg (Singh a Gunberg, 1970; Stloukal et al., 1999) upozorňují, že počet obvodových lamel může u jedinců nad čtyřicet let věku kolísat a podávat zavádějící výsledky. Rovněž v naší studii docházelo k poklesu procenta plochy obvodových lamel s věkem. Korelace procenta plochy 205

206 Obr. 55. Změna počtu lamel v osteonu v závislosti na nepatrné změně v zaostření. Zvětšení 400. Žena, 78 let. vnitřních obvodových lamel s věkem nebyla statisticky významná. Mohlo to být způsobeno tím, že je zde obtížné a mnohdy subjektivní určení hranic kompaktní kosti oproti spongióze, 206

207 zejména u jedinců s velkou kortikální porozitou. Korelace procenta plochy vnějších obvodových lamel k věku byla statisticky významná na 1% hladině významnosti (r = -0,47). Nulová hodnota vnějších obvodových lamel se objevila nejdříve u jedinců po čtyřicátém roce věku, avšak vyskytl se i jedinec starší devadesáti let, který měl vnější obvodové lamely dosud zachovány. Výskyt obvodových lamel v souboru byl tedy kolísající, jak již uvedli Singh a Gunberg (Singh a Gunberg, 1970; Stloukal et al., 1999). Na femuru se Non-Haversovy systémy hojně vyskytují u dětí, s rostoucím věkem ubývají a po padesátém pátém roce věku je již v kosti nenajdeme (Kerley, 1965). V naší práci počet non-haversových kanálků na mm² s věkem sice také klesal, ale korelace nebyla statisticky významná. U Kerleyho (Kerley, 1965) počet osteonů lépe koreloval s věkem než procento obvodových lamel nebo počet non-haversových kanálků. Je to způsobeno zřejmě tím, že na femuru starších jedinců se obvodové lamely a non-haversovy kanálky již nevyskytují. V naší práci byla korelace počtu osteonů na mm² a procenta vnějších obvodových lamel s věkem shodně statisticky významná na 1% hladině významnosti. Počet osteonů na mm² měl korelační koeficient o něco nižší (r = 0,44) než procento plochy vnějších obvodových lamel (r = -0,47). Počet non-haversových kanálků na mm² neměl statisticky významnou korelaci s dožitým věkem. Stout a Stanleyová (Stout a Stanley, 1991) zjistili u radia, tibie a fibuly, že počet osteonů má významnou korelaci s věkem, zatímco procento plochy osteonů nikoli. Za nedostatek statisticky významné korelace mezi procentem plochy osteonů a věkem by podle obou autorů mohly odpovídat věkové změny rozměrů osteonů a kortikální drift, který se objevuje s některými patologiemi a v odpovědi na biomechanické nároky na kost. Uytterschautová (Uytterschaut, 1993) naproti tomu měla mezi věkem a procentem plochy osteonů významnou korelaci. Ortner (Ortner, 1975) rovněž zjistil na tibii úzký vztah mezi procentem plochy osteonů a věkem. Podle Thompsona je procento plochy osteonů nejlepším kritériem pro odhad dožitého věku (Stloukal et al., 1999). Na žebru je počet osteonů považován za významný ukazatel dožitého věku (Cannet et al., 2011). V naší práci byla korelace v počtu osteonů na mm² statisticky významná na 1% hladině významnosti (r = 0,44), zatímco korelace procenta celkové plochy osteonů s věkem byla významná jen na 5% hladině významnosti (r = -0,29). Podle Loubové (Loubová, 1999) je v kompaktě dlouhých kostí a žeber průměr osteonů a Haversových kanálků variabilní a na věku málo závislý až nezávislý. Podle jiných (Barer a 207

208 Jowsey, 1967) průměr osteonů na žebru s věkem klesá, ale změna není statisticky významná. Rovněž Thompson (Thompson a Gunness-Hey, 1981) nezaznamenal žádnou změnu ve velikosti osteonů s věkem. Naproti tomu Watanabe (Watanabe et al., 1998) měl na femuru u rozměrů osteonů vysokou korelaci s dožitým věkem (r > 0,77), zatímco u Haversových kanálků byla korelace nízká (r < 0,11). V rámci naší práce byla zaznamenána korelace průměru osteonu s věkem jako velmi vysoká a statisticky významná na 1% hladině významnosti (r = -0,72). S průměrem úzce související maximální osa osteonu měla nejvyšší korelační koeficient s dožitým věkem ze všech studovaných proměnných a byla statisticky významná na 1% hladině významnosti (r = -0,75). Korelace mezi průměrem Haversova kanálku a dožitým věkem byla statisticky významná na 5% hladině významnosti (r = -0,36). Rovněž údaje o obvodu Haversova kanálku se různí. Podle Barera a Jowseyové (Barer a Jowsey, 1967) se obvod Haversova kanálku na žebru s rostoucím věkem téměř nemění. V naší práci se oproti tomu korelace mezi obvodem Haversova kanálku a věkem ukázala jako statisticky významná na 5% hladině významnosti (r = -0,36). Na žebru (Barer a Jowsey, 1967) dochází s věkem k progresivní ztrátě endostální kosti, což vede k významnému poklesu kortikální tloušťky. Pokles tloušťky kompakty je významný i přesto, že vzrůst resorpce a ztráta kostní hmoty jsou celkově malé. Je to způsobeno malou velikostí žebra. Toto pozorování bylo potvrzeno, neboť korelace mezi tloušťkou kompaktní kosti a dožitým věkem vyšla jako statisticky významná na 1% hladině významnosti (r = -0,56). Jak vidíme, mohou se údaje o závislosti jednotlivých proměnných na věku mezi různými studiemi dosti lišit. Zřejmě se zde projevuje vliv různého etnického původu studijních souborů, svou roli hraje také počet jedinců, početní zastoupení jednotlivých pohlaví, skryté choroby, věková distribuce souboru, ale také definice použitých struktur a jejich více nebo méně subjektivní hodnocení autorem. Existují čtyři velké oblasti variability při měření kostní mikrostruktury (Wu et al., 1970; Stout, 1989a). Je to jednak interpersonální variabilita, která sestává z rozdílů vyskytujících se mezi individui za dlouhé časové období. Značnou variabilitu v remodelaci mezi individui může kromě věku způsobovat mnoho faktorů. Pohlaví a zdravotní stav také ovlivňují remodelaci kosti. Tuto variabilitu omezíme použitím metod vyvinutých na souborech sestavených s ohledem na pohlaví a zdravotní stav (Stout, 1989a). Pak je to časová variabilita, což jsou rozdíly objevující se ve stejném skeletu v různých dnech, měsících a sezónách. Tato variabilita vyplývá např. z cyklických či vývojových hormonálních změn, sezónních a nepředvídatelných dietních změn, sezónních 208

209 rozdílů v expozici sluneční radiaci nebo z cirkadiánních rytmů ve fyziologii tvrdých tkání. Tuto variabilitu lze limitovat pouze užitím takových proměnných, které odrážejí remodelaci v periodách delších než jeden týden. Jelikož metody odhadu věku využívají proměnné, které odrážejí remodelační aktivitu v období celého života jedince, je časová variabilita bezpředmětná. Dále je to prostorová variabilita neboli systematické změny mezi různými kostmi, nebo mezi částmi téže kosti, vzory opakující se pravidelně u různých individuí i u různých druhů. Tento druh variability minimalizujeme zvýšením množství analyzovaných vzorků. Vždy jsou badatelé nicméně limitováni takovými faktory, jako je použitá technika, čas a velikost souboru. Poslední je tzv. inkoherence neboli náhodné časové rozdíly mezi částmi jednoho vzorku. Čím menší je skutečně měřená celková plocha příčného řezu, tím větší je inkoherence. U dat založených na zkoumání populace (souboru) hraje největší roli interpersonální variabilita, protože zprůměrování dat na dekády účinně eliminuje časovou variabilitu i inkoherenci. Získání standardního místa odběru kostního vzorku minimalizuje prostorovou variabilitu. Oproti údajům uváděným v některých předchozích pracích (Heussner, 1987, 1990a; Harsányi, 1993; Hummel a Schutkowski, 1993; Stloukal et al., 1999; Squires et al., 2011) byly v našem výzkumu mikrostruktury kompaktní kosti viditelné i při teplotě spalování 1000 C. Z důvodu značného poškození kompaktní kosti ale nebylo možné provést plnohodnotnou histologickou analýzu těchto vzorků. Z tohoto důvodu není žebro zcela vhodným objektem pro analýzu kremace, protože jeho tenká stěna se žárem velmi poškozuje. Rovněž byly ze statistického zpracování vynechány vzorky kostí spálených při 600 C, protože jich byl k dispozici jen malý počet. Mikroskopický vzhled těchto vzorků však byl víceméně podobný nespáleným kostem, poškození žárem nebylo příliš velké. Teploty nižší než 700 C, tj. pod dolní hranicí Herrmannovy kritické hladiny, způsobují neúplné spálení kosti a jen nepatrné smrštění. Struktura neúplně spálených kostí je téměř identická s čerstvou kostí a jejich histologická analýza má proto stejnou vypovídací hodnotu (Herrmann, 1977a; Holden et al., 1995b). Překvapujícím objevem se stala široká paleta barev u kostí spálených při 700 C. Tmavší barva se vyskytovala u větších kusů kostí, zatímco ty menší (velikost kolem 1 cm) byly bílé. Při 700 C pravděpodobně dochází k různému stupni spálení kosti, který může do jisté míry souviset s velikostí kostního vzorku. To znamená, že při 700 C jsou některé kosti již úplně spáleny (bílá barva) a jiné nikoli (šedá, modrá atd.). Barevná škála spálených kostí ukazuje, že barvu nelze použít pro spolehlivý odhad teploty spalování. Můžeme pouze 209

210 stanovit, zda kost byla spálena úplně nebo neúplně, případně můžeme říci, že teplota pravděpodobně dosáhla 700 C (šedá, modrá apod.) nebo 700 C (bílá barva). Toto tvrzení je v souladu s některými staršími studiemi, podle kterých ani barva ani tvrdost kosti nejsou dostatečnými kritérii pro posouzení stupně spálení (Herrmann, 1976, 1977a; Thompson, 2005; Walker et al., 2008; Harbeck et al., 2011; Squires et al., 2011). Bohužel mnoho badatelů barvu spálených kostí rutinně používá pro odhad teploty kremace, zejména v archeologických výzkumných zprávách (Lorencová, 1961; Pavelčík, 1966, 1972; Dokládal, 1999b). Rovněž analýza barvy příčného řezu kostí je sporná. Barva příčného řezu se totiž mění i s typem mikroskopu, světelným zdrojem, tloušťkou řezu a subjektivním vnímáním badatele (Hanson a Cain, 2007). Proto je zřejmě jakékoli hodnocení barvy u spálených kostí pouze doplňkové a orientační. Vlivem teploty spalování dochází ke smrštění spálených kostí. Smršťují se makroskopické i mikroskopické rozměry kompaktní kosti. Smrštění způsobuje výraznou změnu velikosti a počtu mikrostruktur na jednotku plochy kompaktní kosti a kosti nespálené a kosti spálené při různých teplotách se ve většině sledovaných proměnných statisticky významně liší. Proto není v žádném případě možné používat pro analýzu spálených kostí metody vypracované na nespálených kostech, protože takový postup vede k mylným závěrům a zavádějícím výsledkům (Heussner, 1987, 1990a; Bruchhaus, 1990; Herrmann, 1990; Ullrich, 1990). Odlišnosti ve sledovaných proměnných mezi jednotlivými teplotami spalování také naznačují, že histomorfologické metody vypracované pro spálené kosti jako celek mají určité limity, a je tím omezena možnost analýzy případů, kde není známa přesná teplota spalování. Již Golubovich napsal, že vzhledem k rozdílnému poškození a deformaci kostí při různém stupni spálení je při každém použití výzkumných metod na spálených kostech nutné vědět, jaký stupeň spálení měly kosti použité pro vývoj originální metody, a proto pravděpodobně nelze vytvořit metodu, která by byla použitelná na všechny spálené kosti bez ohledu na stupeň jejich spálení (Golubovich, 1990). V našem výzkumu byl jeho předpoklad potvrzen. Bohužel teplotu spalování nelze spolehlivě určit podle barvy spálených kostí a různé biologické a fyzikální metody stále ještě nedovedou u spálených kostí určit teplotu spalování zcela přesně (Squires et al., 2011). Přesto je histologická analýza spálených kostí stále nepostradatelná, protože v některých případech poskytuje přesnější výsledky než některé moderní metody, jako jsou např. biomolekulární analýzy (Cattaneo et al., 1999). Jelikož se skupiny kostí spálených při 700 a 800 C lišily ve většině histologických proměnných, a protože nebylo možné sestavit spolehlivou regresní rovnici z těch 210

211 proměnných, které se mezi těmito dvěma skupinami nelišily, nebylo možné vypočítat regresní rovnice odhadu dožitého věku pro spálené kosti jako celek. Jelikož díky poškození kostí spálených při 1000 C nebylo možné vyšetřit histologické změny u kostí spálených při větší šíři teplot, nelze říci, zda jsou naše rovnice vhodné pouze pro tyto dvě teploty spalování (700 a 800 C) nebo spíše pro rozpětí teplot 700 C, případně 800 C. Pokud by tyto rovnice byly vhodné pouze pro každou teplotu spalování zvlášť, silně by to omezovalo pokusy o odhad dožitého věku u těch spálených kostí, kde neznáme přesnou teplotu spalování. Z tohoto důvodu tato tématika vyžaduje ještě další výzkum. V některých předchozích pracích jsou uváděny rozdílné údaje o vlivu teploty na kompaktní kost. V práci Bradtmillera a Buikstraové (Bradtmiller a Buikstra, 1984) se uvádí, že se rozměry osteonů vlivem spalování zvětšují. Ostatní práce naopak uvádějí jejich zmenšení (Herrmann, 1976, 1977a; Nelson, 1992; Hummel a Schutkowski, 1993). Některé práce (Nelson, 1992; Squires et al., 2011) uvádějí zmenšování rozměrů osteonů, ale zároveň zvětšování rozměrů Haversových kanálků. V naší studii docházelo ke zmenšení rozměrů osteonů i Haversových kanálků a toto zmenšení se zintenzivňovalo se zvyšující se teplotou spalování. Výsledky v práci Bradtmillera a Buikstraové (Bradtmiller a Buikstra, 1984) byly zřejmě způsobeny tím, že v jejich studii byly kosti spalovány při teplotě 600 C, kdy může docházet k přechodnému natažení kosti nebo je smrštění kosti tak malé, že není zachyceno použitými měřícími metodami a přístroji (Schutkowski, 1991; Nelson, 1992; Thompson, 2005). V některých případech je změna ve velikosti kosti ovlivněna také délkou doby chladnutí (Thompson, 2005). Rozdíl oproti práci Nelsona (Nelson, 1992) je zřejmě ovlivněn jiným typem použité kosti (femur) nebo možnou nízkou teplotou dosaženou v kostech v jeho práci (kosti byly spalovány při 537 a 815 C). V některých studiích (Hummel a Schutkowski, 1986; Schutkowski, 1991; Hummel a Schutkowski, 1993) se rovněž uvádí, že jelikož je smrštění příčného řezu lineární, zůstává relativní uspořádání strukturních elementů a jejich relativní velikostní poměry stálé. V naší studii však došlo i k určitým změnám relativního zastoupení mikrostruktur na ploše řezu. Konkrétně došlo ke statisticky významnému poklesu procentuálního zastoupení osteonů a Haversových kanálků na ploše řezu, přičemž pokles procenta osteonů byl statisticky významnější (Tab ). Také se změnila prostorová podoba osteonu a Haversova kanálku, což bylo vyjádřeno změnou jejich compactness a shape factoru. Jediné ukazatele, které zůstaly beze změny, byly vzájemné plošné a měrné vztahy mezi osteonem a Haversovým kanálkem, vyjádřené pomocí tří indexů (OK_OO obvod Haversova kanálku / obvod 211

212 osteonu, PK_PO plocha Haversova kanálku / plocha osteonu, PRK_PRO průměr Haversova kanálku / průměr osteonu). Protože bylo zjištěno, že se obě pohlaví v některých parametrech liší, bylo plánováno spočítat také regresní rovnice pro jednotlivá pohlaví. Bohužel početní zastoupení žen v našem souboru nebylo příliš vysoké a jejich skupina neměla normální rozdělení dožitého věku, které je nutným předpokladem pro regresní analýzu. Malé zastoupení žen a jejich převážně vysoký věk byl způsoben složením souboru, který pocházel z Ústavu soudního lékařství. Ženy se obecně dožívají vyššího věku než muži a mají také méně podezřelých úmrtí, která se na soudně lékařských pracovištích prošetřují (pracovní úrazy, dopravní nehody, sebevraždy). Proto byly nakonec vypočteny regresní rovnice jen pro muže a pro obě pohlaví dohromady. Popis odlišností v histomorfologii kostní tkáně mezi pohlavími se také mezi různými studiemi liší. Zatímco v některých pracích autoři neuvádějí žádné sexuální rozdíly (Kerley, 1965; Singh a Gunberg, 1970; Stout et al., 1994; Han et al., 2009), jinde jsou tyto rozdíly popisovány pro femur, humerus, tibii, ulnu a žebro (Thompson, 1979; Ruff a Hayes, 1982; Samson a Branigan, 1987; Ericksen, 1991; Doktorov et al., 2002; Streeter a Stout, 2003; Kim et al., 2007). Náš nález sexuálních rozdílů se týkal jen některých proměnných, proto nemusely být tyto rozdíly v některých výzkumech zachyceny. Závisí to totiž do značné míry na výběru a definici analyzovaných mikrostruktur a také na složení studijních souborů. V našem případě mělo složení souborů na sexuální odlišnosti vliv, protože po vyloučení vlivu dožitého věku pomocí analýzy kovariance se počet struktur, které se mezi pohlavími lišily, snížil. Některé práce (Doktorov et al., 2002; Kim et al., 2007) také uvádějí pohlavní rozdíly v remodelaci žeber, ale výčet proměnných je odlišný od naší studie. V těchto dvou pracích (Doktorov et al., 2002; Kim et al., 2007) se odlišnosti mezi pohlavími týkaly plochy kompakty, počtu osteonů, počtu fragmentů, plochy osteonu a plochy Haversova kanálku, zatímco v naší studii se muži a ženy u nespálených kostí po vyloučení vlivu věku lišili pouze v procentu celkové plochy osteonů. Námi vypočtené regresní rovnice odhadu dožitého věku byly porovnány s některými předchozími studiemi (Tab. 58). Koeficient determinace (r²) a střední chyba odhadu (SEE) se u rovnic pro nespálené kosti nachází v rozmezí hodnot uváděných i u starších prací. Koeficient determinace (r²) pro kosti spálené při 700 C se rovněž nachází v rozmezí hodnot uváděných u starších prací, ale SEE je poměrně vysoká a tyto hodnoty překračuje. Koeficient determinace (r²) a SEE u rovnic pro kosti spálené při 800 C se nacházejí mimo rozpětí dat uváděných u ostatních prací. Z našich regresních rovnic lze v praxi použít regresní rovnici 212

213 odhadu dožitého věku pro nespálené kosti pro obě pohlaví dohromady a je možné použít i regresní rovnice pro kosti spálené při 700 C, ale zde je třeba mít na paměti vysoké hodnoty SEE u těchto rovnic. I přes vysoké SEE se však přesnost těchto rovnic neliší od některých starších prací (Holden et al., 1995b), v nichž byly vzorky spálených kostí určovány v širokém rozmezí jako mladý (1-22 let), dospělý (22-60 let) a starý (nad 60 let). Rovnice pro muže u nespálených kostí sice vykazuje uspokojivé hodnoty r, r² a SEE, nebyla však úspěšná při aplikaci na kontrolní soubor. Její použití proto nedoporučujeme. Rovnice odhadu věku pro kosti spálené při 800 C jsou v praxi nepoužitelné, protože mají nízké r a r² a vysoké SEE a navíc neposkytly uspokojivé výsledky při aplikaci na kontrolní soubory (Tab. 59). Maat a kolegové (Maat et al., 2006) ve své práci uvádějí, že jednotlivé metody odhadu dožitého věku se příliš neliší svou přesností. Zatímco jejich metoda měla koeficient determinace (r²) mezi 0,608 a 0,799, u Kerleyho to bylo 0,756 a u Ericksenové dokonce jen 0,480 až 0,720. Rovněž SEE v jejich metodě se od uvedených metod příliš neliší a obdobné výsledky panují dokonce i u makroskopických metod. Autoři proto vyvozují, že všechny pokusy o zvýšení přesnosti odhadu dožitého věku jsou předem odsouzeny k nezdaru. Limitujícím faktorem je zde zřejmě přirozená variabilita v rychlosti stárnutí mezi individui. Výsledky analýz mohou být též ovlivněny neodhalenými nemocemi. Jedinou cestou, jak zúžit věkové rozpětí v odhadech, je podle Maata a kolegů používat více různých metod odhadu věku najednou. Ke stejnému závěru došel i Stout (Stout, 1989a), který uvádí, že aplikace rovnic odhadu věku na jiné soubory, než na jakých byly vyvinuty, často poskytuje méně přesné výsledky než bychom očekávali podle publikovaných korelačních koeficientů. Rovněž Vystrčilová (Vystrčilová, 2002) uvádí, že histologický odhad dožitého věku nemusí být vždy přesnější než odhad získaný na základě makroskopických metod. Udávaná přesnost odhadu věku u určité metody vypracované na určité populaci nemusí vždy platit i pro jiné populace a závěry získané na jednom souboru se nemusí shodovat se závěry z jiných souborů. Tento jev je ovlivněn řadou faktorů, jako je výživa, genetické faktory, biomechanická zátěž apod. Jednotlivé metodiky odhadu dožitého věku se mezi sebou mohou lišit svou přesností, vyjádřenou např. pomocí SEE. Přesnost odhadu a jiné statistické ukazatele příslušné metody závisejí mimo jiné na složení studovaného souboru, to znamená, že metody s malou střední chybou odhadu měly buď malý počet jedinců v souboru nebo nesprávné věkové složení (malé početní zastoupení mladých nebo starších jedinců). Odlišnosti mezi jednotlivými metodami jsou dále ovlivněny lokalizací kostního vzorku, rozdíly v metodice a technickém zpracování, volbou studované kosti, opakovatelností jednotlivých proměnných mezi různými 213

214 pozorovateli, přirozenou variabilitou v procesu stárnutí dané populace a nakonec i volbou určité statistické metody (Cannet et al., 2011). Otázkou je také aplikace různých metod dohadu věku na archeologické populace (Vystrčilová, 2002). Proces stárnutí v referenčních populacích totiž jednak vykazuje populační variabilitu a jednak je zřejmě odlišný od průběhu věkových změn použitých znaků v archeologických populacích. Demografické charakteristiky archeologických populací tak mohou být do jisté míry zkresleny, protože odhad věku archeologické populace závisí také na charakteru referenčního souboru pro danou metodiku (např. věkové rozpětí, početní zastoupení jednotlivých věkových tříd apod.). Tab. 58. Porovnání výsledků naší studie s některými předchozími pracemi (r² - koeficient determinace; SEE střední chyba odhadu; N počet jedinců) Studie r² SEE (roky) Použitá kost N Kerley, ,27-13,85 Femur, tibia, fibula 126 Ahlqvist a Damsten, ,71 Femur 20 Singh a Gunberg, ,889-0,979 2,55-5,01 Femur a tibia Kerley a Ubelaker, ,66-14,62 Femur, tibia, fibula Thompson, ,428-0,744 7,07-10,57 Femur, tibia, humerus, ulna 116 Ericksen, ,48-0,72 9,96-12,21 Femur 328 Stout a Paine, ,699-0, Žebro a klavikula 40 Hummel a Schutkowski, ,5; 14,4; 10,9 Spálený femur 18 Stout et al., ,693; 0,865 10,430; 7,182 Žebro histol. + morfol. 60 Watanabe et al., ,887; 0,948 6,390; 4,884 Femur 98 Cho et al., ,569 12,68 Žebro Maat et al., ,608-0,799 9,162-14,786 Femur 162 Kim et al., ,826; 0,839 4,971; 4,821 Žebro 64 Han et al., ,763; 0,789 6,994; 6,650 Femur 72 Martrille et al., ,68-0, Femur 29 Naše studie: Nespálené 0,58; 0,63 13,93; 13,18 Žebro 49; C 0,45; 0,50 16,25; 16,95 36; C 0,33; 0,34 14,90; 15,73 60; 46 Předložená studie odhadu dožitého věku ukázala, že ve spáleném i nespáleném lidském žebru existují mikrostruktury vhodné pro odhad dožitého věku a lze je dobře identifikovat. Výhodou popsané metodiky je jednoduchá a levná příprava příčných výbrusů kostí, která nevyžaduje velké přístrojové vybavení a lze ji provádět z větší části ručně. Použití 214

215 mikrofotografií poskytuje trvalý záznam analyzovaného vzorku a jejich analýza pomocí počítače je snazší a objektivnější než analýza přímo v mikroskopu (Ericksen, 1991). Využití počtů struktur na mm² nebo jejich procentuálního zastoupení na ploše kompaktní kosti činí metodu nezávislou na různé velikosti mikroskopického pole. V případě spálených kostí se vliv teploty spalování na mikrostrukturu kompaktní kosti lidského žebra ukázal jako hlavní překážka v pokusech o odhad dožitého věku jedince. Změny mikrostruktur způsobené spalováním jsou obvykle stejného typu jako změny způsobené stárnutím. Konkrétně jde o zmenšování rozměrů mikrostruktur a zvyšování jejich počtu na mm², které jsou způsobeny stárnutím, ale v rámci stejné věkové skupiny také spalováním. Proto je vliv věku u spálených kostí překryt změnami vyvolanými spalováním, což vede ke snížení přesnosti a aplikovatelnosti regresních rovnic odhadu dožitého věku, zejména nad kritickou teplotou 800 C. Poškození způsobené žárem v tenké stěně žebra ovlivňuje téměř všechny parametry nezbytné pro výpočet odhadu dožitého věku jedince a často znemožňuje analýzu dostatečně velké plochy řezu. Výpočet regresních rovnic odhadu dožitého věku je dále komplikován velkou vzájemnou závislostí jednotlivých proměnných, která omezuje výběr jejich možných kombinací vstupujících do regresní analýzy. Protože se soubory kostí spálených při různých teplotách od sebe lišily ve většině sledovaných histologických proměnných, nebylo možné vypočítat regresní rovnici odhadu dožitého věku pro spálené kosti jako celek. Ani na základě proměnných, které se mezi kostmi spálenými při 700 a 800 C nelišily, se nepodařilo sestavit spolehlivou regresní rovnici. Tento fakt limituje použití metodiky pro odhad dožitého věku u nálezů spálených kostí, kde není známa přesná teplota spalování. Přesnou teplotu spalování však nelze stanovit podle barvy spálených kostí. Z těchto a podobných důvodů většina badatelů pokládá identifikaci jedince na základě spálených kostí za jeden z nejobtížnějších oborů kosterní antropologie (Herrmann, 1976). 215

216 Tab. 59. Shrnutí údajů o námi vypočtených regresních rovnicích odhadu dožitého věku a jejich aplikaci na kontrolní soubory (Y odhadnutý věk; r korelační koeficient; r² koeficient determinace; SEE střední chyba odhadu) Cílová Regresní rovnice odhadu dožitého skupina věku Nespálené, Y=228,2824-0,14(OBV_O)- dohromady 0,4667(PR_LAM)-4,1378(C_OST) Nespálené, Y=270,456-0,407(MAX_O)- muži 150,751(SFAC_KAN) 700 C, Y=-59,8169-0,2822(MAX_O)+ dohromady 222,6290(SFAC_KAN) 700 C, Y=-130,312-0,195(MAX_O)+ muži 221,827(SFAC_KAN)+ r r² SEE Kolik % Rozdíl kontroly skutečného a bylo uvnitř odhadnutého ± 1 SEE věku 0,76 0,58 13,93 60% 1,30 0,79 0,63 13,18 40% 2,96 0,67 0,45 16,25 75% 4,44 0,71 0,50 16,95 80% 3,86 0,58 0,33 14,90 55% 9,60 0,58 0,34 15,73 50% 17,78 194,113(PRK_PRO) 800 C, Y=100,5203-0,353(MAX_O)+ dohromady 0,4769(F_PR_K)+ 0,4136(POC_OST) 800 C, Y=117,4118-0,3626(MAX_O)+ muži 0,4406(POC_OST) 216

217 9. ZÁVĚR Předložená práce se zabývala možnostmi odhadu dožitého věku na podkladě histologické analýzy spálené a nespálené kompaktní kosti lidského žebra. K výzkumu byly použity recentní vzorky pocházející od jedinců známého věku, pohlaví a příčiny smrti. Biologický materiál byl experimentálně spalován za předem stanovených podmínek (cílová teplota, doba spalování). Vedle preparátů ze spáleného materiálu byly vytvořeny také histologické výbrusy z nespálených kostí. Mikrostrukturální data byla studována na mikrofotografiích příčných výbrusů kosti a analyzována pomocí počítačového programu pro analýzu obrazu SigmaScan Pro 5. Pro statistické zpracování dat byl použit program Statistica 6. Výsledkem práce je sada regresních rovnic pro odhad dožitého věku jedince podle spálené a nespálené kompaktní kosti žebra. Regresní rovnice odhadu dožitého věku u nespálených kostí pro obě pohlaví dohromady a pro kosti spálené při 700 C pro obě pohlaví dohromady a pro muže lze použít pro odhad dožitého věku české, případně středoevropské, populace. Výhodou metody je její malá invazivnost při odběru biologického materiálu, levná a snadná příprava příčných výbrusů kostí a využití mikrofotografií, které poskytují trvalý záznam analyzovaného pole. Metoda využívající žebro nebrání aplikaci dalších antropologických analýz, např. osteologických metod na dlouhých kostech končetin. 217

218 10. SOUHRN Práce obsahuje úvod do problematiky histologie kostní tkáně člověka, popisuje změny probíhající v kosti vlivem stárnutí a spalování, uvádí přehled dosavadních metod odhadu dožitého věku individua na základě histologického zkoumání kompaktní kosti a také přehled výzkumů zabývajících se vlivem vysokých teplot na kostní tkáň. Hlavní částí práce je vlastní experimentální výzkum, založený na studiu kompaktní kosti lidského žebra. Biologický materiál sloužil k tvorbě histologických výbrusů z nespálených kostí a po experimentálním spalování také k výrobě výbrusů ze spálených kostí. Výstupem práce je popis věkových změn kostní tkáně, popis změn vyvolaných v kostní tkáni vlivem žáru a regresní rovnice pro odhad dožitého věku jedince na základě spálených a nespálených kosterních vzorků. Byl shromážděn studijní soubor recentního kosterního materiálu pocházejícího od jedinců známého věku, pohlaví a příčiny smrti. Zkoumaný kosterní materiál představovaly části žeber, odebírané v jejich přední třetině. Kosterní materiál byl experimentálně spalován za předem daných podmínek při teplotách 600, 700, 800 a 1000 C po dobu 1 hodiny (30 minut nárůst teploty na cílovou hodnotu, 30 minut spalování při cílové teplotě). Ze spálených i nespálených kostí byly zhotoveny neodvápněné neobarvené histologické výbrusy. Digitalizace histologických snímků byla prováděna na světelném mikroskopu Olympus BX50 s digitálním fotoaparátem Olympus C-7070 Wide Zoom. Snímky byly digitalizovány za použití počítačového programu QuickPHOTO CAMERA 2.2 a ukládány ve formátu JPG. Výbrusy kostí byly fotografovány při stonásobném a čtyřsetnásobném zvětšení. V každém preparátu byla při stonásobném zvětšení vyfotografována celá plocha řezu, u spálených kostí všechny zachovalé úseky. Výbrusy byly potom analyzovány v jednom až čtyřech vybraných polích v závislosti na zachovalosti dané kosti. Při čtyřsetnásobném zvětšení byly fotografovány různé zajímavosti ve stavbě kompaktní kosti. Mikroskopické snímky byly hodnoceny v počítačovém programu pro analýzu obrazu SigmaScan Pro 5. V každém histologickém řezu bylo analyzováno celkem 28 histologických proměnných. Využití kalibrovaného počítačového programu pro měření struktur eliminuje problémy při měření v mikroskopu vzniklé použitím různých okulárů a 218

219 objektivů, počítacích mřížek a mikrometrů. Také umožňuje zachovat trvalý záznam jak samotného mikroskopického pole, tak i jeho analýzy a měření. Histomorfometrická data byla statisticky zpracována v počítačovém programu Statistica 6. Byly použity parametrické i neparametrické testy, T-testy pro závislé i nezávislé soubory, jednoduchá lineární korelace, korelační matice, mnohonásobná lineární regresní analýza, analýza chyby měření. Změny vyvolané stárnutím nebo spalováním a rozdíly mezi pohlavími byly popsány také pomocí bodových grafů (Categorized Scatterplot) a krabicových grafů (Box &Whisker plot). Histologické změny pozorované v kompaktní kosti byly použity k sestrojení regresních rovnic pro odhad dožitého věku neznámého individua, konkrétně pro kosti nespálené a kosti spálené při 700 a 800 C, pro obě pohlaví dohromady a pro muže. V praxi je použitelná regresní rovnice odhadu dožitého věku pro nespálené kosti pro obě pohlaví dohromady a rovnice pro kosti spálené při 700 C jak pro obě pohlaví dohromady, tak pro muže. Rovnice pro kosti spálené při 800 C nelze v praxi použít. Variabilita barevných změn spálených kostí ukázala, že při stanovení teploty spalování nelze vycházet z barvy spálených kostí. Je možné pouze konstatovat, že kost byla spálena úplně nebo neúplně, případně, že byla spálena při teplotě 700 C nebo 700 C. Při hodnocení spálené kompaktní kosti žebra se ukázalo jako nejvhodnější zaměřit se na sledování kompletních sekundárních osteonů a Haversových kanálků, protože ostatní histologické struktury jsou ve spálené kostní tkáni obtížně identifikovatelné. Kosti nespálené a kosti spálené při různých teplotách se od sebe statisticky významně lišily ve většině sledovaných proměnných, proto nebylo možné vypočítat regresní rovnici odhadu dožitého věku pro spálené kosti jako celek bez ohledu na teplotu spalování. Z tohoto faktu také vyplývá, že není možné používat pro analýzu spálených kostí metody vypracované na nespálených kostech. Odhad dožitého věku na spálených kostech je významně komplikován faktem, že většina změn vyvolaných v kostní tkáni spalováním je stejného druhu jako změny vyvolané stárnutím. U kostí spálených při teplotě 800 C byl vliv spalování již natolik velký, že vypočtené regresní rovnice odhadu věku nelze v praxi použít a jejich aplikace na kontrolní soubory byla neúspěšná. 219

220 11. PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY A PRAMENŮ Abbott, S., Trinkaus, E., Burr, D. B Dynamic bone remodeling in later Pleistocene fossil hominids. Am. J. Phys. Anthropol. 99: Abou-Arab, M., Thomsen, J. L., Frohlich, B., Lynnerup, N Technical note: Histological staining of secondary osteons. Am. J. Phys. Anthropol. 98: Ahlqvist, J., Damsten, O A modification of Kerley s method for the microscopic determination of age in human bone. J. Forensic Sci. 14: Amprino, J., Bairati, E. A Processi di recostruzione e di riassorbimento nella sostansa compatta delle osa dell nomo. Richerche see cento soggetti della nascita sino a tarda eta. Z. Zellforsch Mikrosk Anat 24: Arnold, J. S., Bartley, M. H., Tont, S. A., Jenkins, D. P Skeletal changes in aging and disease. Clin. Orthop. 49: Atkinson, P. J Structural aspects of ageing bone. Gerontologia 15: Aulický, J Ředitel Kanceláře SH ČMS, Praha 2. Osobní sdělení. Bancroft, J. D., Stevens, A Theory and Practice of Histological Techniques. 4th ed., Churchill Livingstone, Edinburgh. Barer, M., Jowsey, J Bone formation and resorption in normal human rib. A study of persons from 11 to 88 years of age. Clin. Orthop. 52: Bass, W. M Recent developments in the identification of human skeletal material. Am. J. Phys. Anthropol. 30(3): Bass, W. M A Laboratory and Field Manual. Missouri Archaeological Society, Inc., Columbia. Bass, W. M., Driscoll, P. A Summary of skeletal identification in Tennessee: J. Forensic Sci. 28: Bednarek, J Methods of age at death estimation based on compact bone histomorphometry. Arch. Med. Sadowej Kryminol Oct-Dec; 58(4): Bertelsen, P. K., Clement, J. G., Thomas, C. D. L A morphometric study of the cortex of the human femur from early childhood to advanced old age. Forensic Sci. Int. 74: Boivin, G., Schoenboerner, A., Baud, C. A Human compact bone: Structural changes with aging (abstract). Acta Anat 110:

221 Boivin, G., Meunier, P. J Histomorphometric methods applied to bone. In: Grupe, G., Garland, A. N. (eds.): Histology of ancient human bone: Methods and diagnosis, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp Borovanský, L., Hromada, J., Kos, J., Zrzavý, J., Žlábek, K Soustavná anatomie člověka, díl I. Avicenum, zdravotnické nakladatelství. Bouvier, M., Ubelaker, D. H A comparison of two methods for the microscopic determination of age at death. Am. J. Phys. Anthropol. 46(3): Bradtmiller, B., Buikstra, J. E Effects of burning on human bone microstructure: A preliminary study. J. Forensic Sci. 29(2): Brown, K. A., O Donoghue, K., Brown, T. A DNA in cremated bones from an early bronze age cemetery cairn. Int. J. Osteoarchaeol. 5: Bruchhaus, H Zur histologischen Sterbealterbestimmung von Leichenbränden. Anmerkungen zu methodischen Voraussetzungen und zur Verfahrensweise von Heussner 1987, Ethnogr.-Archäol. Z. 31: Burr, D. B., Ruff, C. B., Thompson, D. D Patterns of skeletal histologic change through time: Comparison of an archaic Native American population with modern populations. Anat. Rec. 226: Cannet, C., Baraybar, J. P., Kolopp, M., Meyer, P., Ludes, B Histomorphometric estimation of age in paraffin-embedded ribs: A feasibility study. Int. J. Legal Med. 125: Cattaneo, C., DiMartino, S., Scali, S., Craig, O. E., Grandi, M., Sokol, R. J Determining the human origin of fragments of burnt bone: a comparative study of histological, immunological and DNA techniques. Forensic Sci. Int. 102: Chan, A. H. W., Crowder, C. M., Rogers, T. L Variation in cortical bone histology within the human femur and its impact on estimating age at death. Am. J. Phys. Anthropol Jan; 132(1): Chatterji, S., Jeffery, J. W Changes in structure of human bone with age. Nature 219(153): Cho, H., Stout, S. D., Madsen, R. W., Streeter, M. A Population-specific histological age estimating method: a model for known African-American and European-American skeletal remains. J. Forensic Sci. 4781: Cho, H., Stout, S. D Bone remodeling and age-associated bone loss in the past: a histomorphometric analysis of the Imperial Roman skeletal population of Isola Sacra. 221

222 In: Agarwal, S. C., Stout, S. D. (eds.): Bone loss and osteoporosis: An anthropological perspective. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, pp Clarke, D. F Histological and radiographic variation in the parietal bone in a cadaveric population. Thesis. Anatomy Department, University of Queensland. In Stloukal, M., Dobisíková, M., Kuželka, V., Stránská, P., Velemínský, P., Vyhnánek, L., Zvára, K Antropologie. Příručka pro studium kostry. Národní muzeum, Praha. Cool, S. M., Hendrikz, J. K., Wood, W. B Microscopic age changes in the human occipital bone. J. Forensic Sci. 40(5): Cormier, J. M Microstructural and mechanical properties of human ribs. Faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, Virginia. Crowder, C., Rosella, L Assessment of intra- and intercostal variation in rib histomorphometry: Its impact on evidentiary examination. J. Forensic Sci. 52(2): Cunha, E., Baccino, E., Martrille, L., Ramsthaler, F., Prieto, J., Schuliar, Y., Lynnerup, N., Cattaneo, C The problem of aging human remains and living individuals: A review. Forensic Sci. Int. 193:1 13. Currey, J. D Some effects of ageing in human Haversian systems. J. Anat. 98: Čech, S., Horký, D., Lauschová, I., Sedláčková, M., Šťastná, J Histologická praktika a metody vyšetřování tkání a orgánů. Masarykova univerzita, Lékařská fakulta. Brno. Dalitz, B., Hunger, H Zu anthropologischen Leichenbranduntersuchungen unter Einbeziehung histomorphometrischer Methoden. Bemerkungen zur Dissertation von B. Heussner, Berlin Ethnogr.-Archäol. Z. 31: Dobisíková, M Národní muzeum v Praze. Osobní sdělení. Dobisíková, M Národní muzeum v Praze. Osobní sdělení. Dokládal, M. 1999a. Morfologie spálených kostí. Význam pro identifikaci osob. Lékařská fakulta Masarykovy univerzity v Brně. Brno. Dokládal, M. 1999b. Antropologický posudek č.j. 1607/99. Archiv Archeologického ústavu AVČR Brno. Doktorov, A. A., Denisov-Nikolskii, Iu. I., Pak, G. C Structural organization of compact and cancellous tissue of human rib in aging. Morfologia 122(6): Dominok, G. W Der altersbedingte Wandel des feingeweblichen Bildes menschlicher Knochen. Ergebnisse d. allg. Pathol. u. pathol. Anat. 49: Berlin (West)Göttingen-Heidelberg. 222

223 Drusini, A. G Sampling location in cortical bone histology. Am. J. Phys. Anthropol. 100: Dudar, J. C., Pfeiffer, S., Saunders, S. R Evaluation of morphological and histological adult skeletal age-at-death estimation techniques using ribs. J. Forensic Sci. 38(3): Dunlop, J. M Cremation of body parts and fetuses. J. Obstet. Gynaecol. 24(4): Eidlin, L. M О возможности определения по микроструктуре костей видовой принадлежности и возраста (Обзор). Sud. Med. Ekspert. 17(2):3 8. Epker, B. N., Frost, H. M The parabolic index: A proposed index of the degree of osteoporosis in the ribs. J. Gerontol. 19: Ericksen, M. F Age-related bone remodeling in three aboriginal American populations. Unpublished Ph.D. dissertation, George Washington University, Washington, DC. In Stout, S. D. 1989b. Histomorphometric analysis of human skeletal remains. In: İşcan, M. Y. and Kennedy, K. A. R. (eds.): Reconstruction of Life From the Skeleton. 1st edn., Alan R. Liss Inc., New York, pp Ericksen, M. F Cortical bone loss with age in three native American populations. Am. J. Phys. Anthropol. 45: Ericksen, M. F Patterns of microscopic bone remodeling in three aboriginal American populations. In: D.L. Browman (ed.): Early Native Americans: Prehistoric Demography, Economy, and Technology. The Hague: Mouton Publishers, pp Ericksen, M. F Aging changes in thickness of the proximal femoral cortex. Am. J. Phys. Anthropol. 59: Ericksen, M. F Histologic estimation of age at death using the anterior cortex of the femur. Am. J. Phys. Anthropol. 84: Ericksen, M. F., Stix, A. I Histologic examination of age of the first african baptist church adults. Am. J. Phys. Anthropol. 85: Fanton, L., Gustin, M. P., Paultre, U., Schrag, B., Malicier, D Critical study of observation of the sternal end of the right 4th rib. J. Forensic Sci. 55(2): Fiala, P Současné možnosti určování věku člověka na podkladě mikroskopických změn ve struktuře kostní tkáně. Zprávy čs. společnosti antropologické při ČSAV 31(1):1 10. Fiala, P Určování věku člověka na podkladě kostní mikrostruktury. Kandidátská práce, PřF UK Praha. 223

224 Fojtík, P., Hložek, M Možnosti aplikace přírodovědných analýz při zkoumání kremačních pozůstatků z pravěkých hrobů a pohřebišť. Archeologické rozhledy LIV: Frost, H. M Preparation of thin undecalcified bone sections by rapid manual method. Stain Technol. 33: Frost, H. M Tetracycline-based histological analysis of bone remodeling. Calcif. Tissue Res. 3: Frost, H. M. 1987a. Secondary osteon populations: An algorithm for determining mean bone tissue age. Yrbk. Phys. Anthropol. 30: Frost, H. M. 1987b. Secondary osteon population densities: An algorithm for estimating the missing osteons. Yrbk. Phys. Anthropol. 30: Frost, H. M On changing views about age-related bone loss. In: Agarwal, S. C., Stout, S. D. (eds.): Bone loss and osteoporosis: An anthropological perspective. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, pp Golubovich, L. L Судебно-медицинское исследование золы с мелкими кусочками костей (эксперименталъное исследование). Sud. Med. Ekspert 18(2): Golubovich, L. L Судебно-медицинская экспертиза сожженных костных останков. Sud. Med. Ekspert. 33(2): Golubovich, L. L., Talanov, N. S Современное состояние и перспективы развития судебно-медицинской идентификации личности по костям, подвергшимся воздействию высокой температуры. Sud. Med. Ekspert 33(4): Grimm, H Zur Notwendigkeit von histomorphometrischen Kennzahlen und von identifizierten Schliffbildern in einer fortgeschrittenen Leichenbrand-Analyse. Bemerkungen zur Dissertation von B. Heussner, Berlin Ethnogr.-Archäol. Z. 31: Grupe, G., Hummel, S Trace element studies on experimentally cremated bone. I. Alteration of the chemical composition at high temperatures. J. Archaeol. Sci. 18(2): Grynpas, M. D The role of bone quality on bone loss and bone fragility. In: Agarwal, S. C., Stout, S. D. (eds.): Bone loss and osteoporosis: An anthropological perspective. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, pp

225 Han, S. H., Kim, S. H., Ahn, Y. W., Huh, G. Y., Kwak, D. S., Park, D. K., Lee, U. Y., Kim, Y. S Microscopic age estimation from the anterior cortex of the femur in Korean adults. J. Forensic Sci May; 54(3): Hanson, M., Cain, C. R Examining histology to identify burned bone. J. Archaeol. Sci. 34: Harbeck, M., Schleuder, R., Schneider, J., Wiechmann, I., Schmahl, W. W., Grupe, G Research potential and limitations of trace analyses of cremated remains. Forensic Sci. Int. 204: Harsányi, L Differential diagnosis of human and animal bone. In: Grupe, G., Garland, A. N. (eds.): Histology of ancient human bone: Methods and diagnosis. SpringerVerlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp Herrmann, B Neuere Ergebnisse zur Beurteilung menschlicher Brandknochen. Z Rechtsmed. 77(3): Herrmann, B. 1977a. On histological investigations of cremated human remains. J. Human Evol. 6: Herrmann, B. 1977b. Über die Abhängigkeit der Schrumpfung vom Mineralgehalt bei experimentell verbrannten Knochen. Anthrop. Anz. 36:7 12. Herrmann, B Neue Aussagemöglichkeiten anthropologisher Leichenbranduntersuchungen unter Einbeziehung histomorphometrischer Methoden? Anmerkungen zur gleichnamigen Arbeit von B. Heussner, Schwerin Ethnogr.Archäol. Z. 31: Herrmann, B Light microscopy of excavated human bone. In: Grupe, G., Garland, A. N. (eds.): Histology of ancient human bone: Methods and diagnosis. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp Heuck, F. W Comparative histological and microradiographic investigations of human bone. In: Grupe, G., Garland, A. N. (eds.): Histology of ancient human bone: Methods and diagnosis. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp Heuler, K. M Besteht eine Korrelation zwischen Alter und Knochenstruktur? Z. f. Zellforsch. u. mikroskop. Anat. 7: Heussner, B Neue Aussagemöglichkeiten anthropologisher Leichenbranduntersuchungen unter Einbeziehung histomorphometrischer Methoden. Museum für Ur- und Frühgeschichte Schwerin, pp

226 Heussner, B. 1990a. Neue Aussagemöglichkeiten anthropologisher Leichenbranduntersuchungen unter Einbeziehung histomorphometrischer Methoden. Ethnogr.-Archäol. Z. 31: Heussner, B. 1990b. Neue Aussagemöglichkeiten anthropologisher Leichenbranduntersuchungen unter Einbeziehung histomorphometrischer Methoden. Bemerkungen zur Diskussion meiner Arbeit (Heussner 1987). Ethnogr.-Archäol. Z. 31: Hill, T., Lewicki, P STATISTICS Methods and Applications. StatSoft, Tulsa, OK, USA. Hiller, J. C., Thompson, T. J. U., Evison, M. P., Chamberlain, A. T., Wess, T. J Bone mineral change during experimental heating: an X-ray scattering investigation. Biomaterials 24: Holck, P Cremated bones: A medical and anthropological study of an archeological material on cremation burials. PhD. thesis, Anatomical Institute, University of Oslo. In Holden, J. L., Phakey, P. P., Clement, J. G. 1995b. Scanning electron microscope observations of heat-treated human bone. Forensic Sci. Int. 74(1-2): Holden, J. L., Phakey, P. P., Clement, J. G. 1995a. Scanning electron microscope observations of incinerated human femoral bone: a case study. Forensic Sci. Int. 74: Holden, J. L., Phakey, P. P., Clement, J. G. 1995b. Scanning electron microscope observations of heat-treated human bone. Forensic Sci. Int. 74(1-2): Hummel, S Skript zum Praktikum. Die Bearbeitung von menschlichen Leichenbränden. In: Seminar der Ur- und Frühgeschichte, Universität Basel, pp 32. Hummel, S., Schutkowski, H Das Verhalten von Knochengewebe unter dem Einfluss höherer Temperaturen. Bedeutungen für die Leichenbranddiagnose. Z. Morphol. Anthropol. 77(1):1 9. Hummel, S., Schutkowski, H Approaches to the histological age determination of cremated human remains. In: Grupe, G., Garland, A. N. (eds.): Histology of ancient human bone: Methods and diagnosis. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp İşcan, M. Y., Loth, S. R Osteological manifestations of age in the adult. In: İşcan, M. Y., Kennedy, K. A. R. (eds.): Reconstruction of Life From the Skeleton. 1st edn., Alan R. Liss Inc., New York, pp

227 Iwaniec, U. T., Crenshaw, T. D., Schoeninger, M. J., Stout, S. D., Ericksen, M. F Methods for improving the efficiency of estimating total osteon density in the human anterior mid-diaphyseal femur. Am. J. Phys. Anthropol. 107: Jowsey, J Age changes in human bone. Clin. Orthop. 17: Junqueira, L. C., Carneiro, J., Kelley, R. O Základy histologie. H&H, Jinočany. Keough, N., L Abbé, E. N., Steyn, M The evaluation of age-related histomorphometric variables in a cadaver sample of lower socioeconomic status: implications for estimating age at death. Forensic Sci. Int Oct 30; 191(1-3):114.e1 114.e6. Epub 2009 Aug 12. Kerley, E. R The microscopic determination of age in human bone. Am. J. Phys. Anthropol. 23(2): Kerley, E. R., Ubelaker, D. H Revisions in the microscopic method of estimating age at death in human cortical bone. Am. J. Phys. Anthropol. 49: Kim, Y. S., Kim, D. I., Park, D. K., Lee, J. H., Chung, N. E., Lee, W. T., Han, S. H Assessment of histomorphological features of the sternal end of the fourth rib for age estimation in Koreans. J. Forensic Sci. 52(6): Kósa, F., Antal, A., Farkas, I Scanning electron microscopic study of the human adult bones for determining the individual age. Anthropologie XXX/1: Kubánková, V., Hendl, J Statistika pro zdravotníky. Zdravotnické aktuality 208. Avicenum / Zdravotnické nakladatelství, Ministerstvo zdravotnictví ČSR. Praha. Landeros, O., Frost, H. M The cross section size of the osteon. Henry Ford Hosp. Med. Bull. 12: Lazenby, R. A Inherent deficiencies in cortical bone microstructural age estimation techniques. Ossa 9-11: Lorencová, A Žárové hroby ze Staré Břeclavě. SPFFBU E 6: Loubová, E Vliv tepla na mikrostrukturu lidské kompaktní kosti. Závěrečná zpráva grantu GA UK 228/1999/B-BIO/PřF. Lynnerup, N., Thomsen, J. L., Frohlich, B Intra- and inter-observer variation in histological criteria used in age at death determination based on femoral cortical bone. Forensic Sci. Int. 91: Maat, G. J. R., Maes, A., Aarents, M. J., Nagelkerke, N. J. D Histological age prediction from the femur in a contemporary Dutch sample. The decrease of nonremodeled bone in the anterior cortex. J. Forensic Sci. 51(2):

228 Martin, D. L., Magennis, A. L., Rose, J. C Cortical bone maintenance in an historic Afro-American cemetery sample from Cedar Grove, Arkansas. Am. J. Phys. Anthropol. 74: Martrille, L., Irinopoulou, T., Bruneval, P., Baccino, E., Fornes, P Age at death estimation in adults by computer-assisted histomorphometry of decalcified femur cortex. J. Forensic Sci. 54(6): Matonoha, P LF MU v Brně. Sdělení v rámci přednášek. Měřínský, Z České země od příchodu Slovanů po Velkou Moravu I. Praha. Mlčoch, J Ředitel Pohřebního ústavu hl. m. Prahy. Osobní sdělení. Nelson, R A microscopic comparison of fresh and burned bone. J. Forensic Sci. 37(4): Novotný, Vl Katedra antropologie PřF MU v Brně. Sdělení v rámci přednášek. Ortner, D. J Aging effects on osteon remodeling. Calcif. Tissue Res. 18(1): Pacovský, V Živá kost. Vesmír 67/7: Paine, R. R Histological aging utilizing clavicles and ribs. Unpublished MA research paper, Department of Anthropology, University of Missouri, Columbia. In Stout, S. D. 1989b. Histomorphometric analysis of human skeletal remains. In: İşcan, M. Y. and Kennedy, K. A. R. (eds.): Reconstruction of Life From the Skeleton. 1st edn., Alan R. Liss Inc., New York, pp Paine, R. R., Brenton, B. P Dietary health does affect histological age assessment: an evaluation of the Stout and Paine (1992) age estimation equation using secondary osteons from the rib. J. Forensic Sci. 51(3): Parfitt, A. M New concepts of bone remodeling: A unified spatial and temporal model with physiologic and pathophysiologic implications. In: Agarwal, S. C., Stout, S. D. (eds.): Bone loss and osteoporosis: An anthropological perspective. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, pp Pavelčík, J Antropologický posudek k nálezové zprávě V. Dohnala z roku Archiv Archeologického ústavu AVČR Brno. Pavelčík, J Antropologický posudek k nálezové zprávě č.j. 722/72 a 265/71. Archiv Archeologického ústavu AVČR Brno. Pavón, M. V., Cucina, A., Tiesler, V New formulas to estimate age at death in Maya populations using histomorphological changes in the fourth human rib. J. Forensic Sci. 55(2):

229 Pfeiffer, S Bone-remodeling age estimates compared with estimates by other techniques. Curr. Anthropol. 21:793. Pfeiffer, S., Lazenby, R., Chiang, J Brief communication: Cortical remodeling data are affected by sampling location. Am. J. Phys. Anthropol. 96: Piga, G., Maigosa, A., Thompson, T. J. U., Enzo, S A new calibration of the XRD technique for the study of archaeological burned human remains. J. Archaeol. Sci. 35(8): Pigolkin, Iu. I., Bogomolov, D. V., Fedulova, M. V., Zolotenkova, G. V., Samokhodskaia, O. V., Bogomolova, I. N Age-specific changes in bone tissue microstructure and potential for use for human identification. Sud. Med. Ekspert. 45(2): Pirok, D. J., Ramser, J. R., Takahashi, H., Villanueva, A. R., Frost, H. M Normal histological tetracycline and dynamic parameters in human mineralized bone sections. Henry Ford Hosp. Med. Bull. 14: Pollett, W. M Cortical Bone Thin-Sectioning Manual. Ptáček, B Základy požární taktiky: Parametry požáru. Konspekty odborné přípravy jednotek požární ochrany. Sdružení požárního a bezpečnostního inženýrství v Ostravě, Ostrava. Pusch, C. M., Broghammer, M., Scholz, M Cremation practises and the survival of ancient DNA: burnt bone analyses via RAPD-mediated PCR. Anthropol. Anz. 58(3): Quatrehomme, G., Bolla, M., Muller, M., Rocca, J. P., Grévin, G., Bailet, P., Ollier, A Experimental single controlled study of burned bones: Contribution of scanning electron microscopy. J. Forensic Sci. 43(2): Richman, E. A., Ortner, D. J., Schulter-Ellis, F. P Differences in intracortical bone remodeling in three aboriginal American populations: possible dietary factors. Calcif. Tissue Int. 28: Robling, A. G., Stout, S. D Histomorphology, geometry, and mechanical loading in past populations. In: Agarwal, S. C., Stout, S. D. (eds.): Bone loss and osteoporosis: An anthropological perspective. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, pp Rogers, K. D., Daniels, P An X-ray diffraction study of the effects of heat treatment on bone mineral microstructure. Biomaterials 23(12):

230 Rother, P., Krüger, G., Machlitt, J., Hunger, H Histomorphometrische sowie regressions- und faktoranalytische Untersuchungen von Altersveränderungen des Humerus. Anat. Anz. 144: Ruff, C. B., Hayes, W. C Subperiosteal expansion and cortical remodeling of the human femur and tibia with aging. Science 217(4563): Samson, C., Branigan, C A new method of estimating age at death from fragmentary and weathered bone. In: Boddington, A., Garland, A. N., Janaway, R. C. (eds.): Death, decay and reconstruction: Approaches to archaeology and forensic science. Manchester, UK: Manchester University Press, pp Schutkowski, H Experimentelle Befunde an Brandknochen und ihre Bedeutung für die Diagnose von Leichenbränden. Archäol. Informationen 14(2): Sedlin, E. D The ratio of cortical area to total cross-section area in rib diaphysis: A quantitative index of osteoporosis. Clin. Orthop. Rel. Res. 36: Sedlin, E. D., Frost, H. M., Villanueva, A. R. 1963a. Age changes in resorption in human rib cortex. J. Gerontol. 18: Sedlin, E. D., Frost, H. M., Villanueva, A. R. 1963b. Variations in cross-section area of rib cortex with age. J. Gerontol. 18(1):9 13. Sedlin, E. D., Villanueva, A. R., Frost, H. M. 1963c. Age variations in the specific surface of Howship s Lacunae as an index of human bone resorption. Anat. Rec. 146: Shipman, P., Foster, G., Schoeninger, M Burnt bones and teeth: an experimental study of color, morphology, crystal structure and shrinkage. J. Archaeol. Sci. 11(4): Singh, I. J., Gunberg, D. L Estimation of age at death in human males from quantitative histology of bone fragments. Am. J. Phys. Anthropol. 33(3): Sobotková, E Biomechanika kosti změny s věkem. Vesmír 68/10: Squires, K. E., Thompson, T. J. U., Islam, M., Chamberlain, A The application of histomorphometry and Fourier Transform Infrared Spectroscopy to the analysis of early Anglo-Saxon burned bone. J. Archaeol. Sci. 38: Stiner, M. C., Kuhn, S. L., Weiner, S., Bar-Yosef O Differential burning, recrystallization, and fragmentation of archaeological bone. J. Archaeol. Sci. 22: Stloukal, M Antropologický posudek k nálezové zprávě č.j. 1357/59. Archiv Archeologického ústavu AVČR Brno. 230

231 Stloukal, M Antropologický posudek č.j k nálezové zprávě č.j. 1217/67. Archiv Archeologického ústavu AVČR Brno. Stloukal, M., Dobisíková, M., Kuželka, V., Stránská, P., Velemínský, P., Vyhnánek, L., Zvára, K Antropologie. Příručka pro studium kostry. Národní muzeum, Praha. Stout, S. D The application of histomorphometric analysis to ancient skeletal remains. Anthropos (Greece) 10: Stout, S. D The use of bone histomorphology in skeletal identification: The case of Francisco Pizarro. J. Forensic Sci 31(1): Stout, S. D. 1989a. The use of cortical bone histology to estimate age at death. In: İşcan, M. Y. (ed.): Age Markers on the Human Skeleton. Springfield, IL, CC Thomas, pp Stout, S. D. 1989b. Histomorphometric analysis of human skeletal remains. In: İşcan, M. Y. and Kennedy, K. A. R. (eds.): Reconstruction of Life From the Skeleton. 1st edn., Alan R. Liss Inc., New York, pp Stout, S. D Methods of determining age at death using bone microstructure. In: Saunders, S. R., Katzenberg, M. A. (eds.): Skeletal Biology of Past Peoples: Research Methods. New York; Wiley-Liss, Inc., pp Stout, S. D., Dietze, W. H., İşcan, M. Y., Loth, S. R Estimation of age at death using cortical histomorphometry of the sternal end of the fourth rib. J. Forensic Sci. 39(3): Stout, S. D., Gehlert, S. J The relative accuracy and reliability of histological aging methods. Forensic Sci. Int. 15: Stout, S. D., Gehlert, S. J Effects of field size when using Kerley s histological method for determination of age at death. Am. J. Phys. Anthropol. 58: Stout, S. D., Lueck, R Bone remodeling rates and skeletal maturation in three archaeological skeletal populations. Am. J. Phys. Anthropol. 98: Stout, S. D., Paine, R. R Brief communication: Histological age estimation using rib and clavicle. Am. J. Phys. Anthropol. 87(1): Stout, S. D., Paine, R. R Brief communication: Bone remodeling rates: A test of an algorithm for estimating missing osteons. Am. J. Phys. Anthropol. 93: Stout, S. D., Stanley, S. C Percent osteonal bone versus osteon counts: The variable of choice for estimating age at death. Am. J. Phys. Anthropol. 86:

232 Stout, S. D., Teitelbaum, S. L. 1976a. Histological analysis of undecalcified thin sections of archaeological bone. Am. J. Phys. Anthropol. 44: Stout, S. D., Teitelbaum, S. L. 1976b. Histomorphometric determination of formation rates of archaeological bone. Calcif. Tissue Res. 21(3): Streeter, M A four-stage method of age at death estimation for use in the subadult rib cortex. J. Forensic Sci. 55(4): Streeter, M., Stout, S. D The histomorphometry of the subadult rib: Age-associated changes in bone mass and the creation of peak bone mass. In: Agarwal, S. C., Stout, S. D. (eds.): Bone loss and osteoporosis: An anthropological perspective. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, pp Streeter, M., Stout, S. D., Trinkaus, E., Burr, D Brief communication: Bone remodeling rates in Pleistocene humans are not slower than the rates observed in modern populations: A reexamination of Abbott et al. (1996). Am. J. Phys. Anthropol. 141: Sýkorová, H Mikroskopická determinácia veku na základe mikroštruktúry ľudských kompaktných kostí. Diplomová práca. Katedra antropológie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita J. A. Komenského v Bratislave, Bratislava. Swegle, M A study of experimentally cremated bone. Unpublished manuscript, Bloomington. In Bradtmiller, B., Buikstra, J. E Effects of burning on human bone microstructure: A preliminary study. J. Forensic Sci. 29(2): Šmahel, Z Principy, teorie a metody auxologie. Učební texty Univerzity Karlovy v Praze. Karolinum, Praha. Takahashi, H., Frost, H. M Age and sex related changes in the amount of cortex of normal human ribs. Acta Orthop. Scandinav. 37: Thomas, C. D. L., Stein, M. S., Feik, S. A., Wark, J. D., Clement, J. G Determination of age at death using combined morphology and histology of the femur. J. Anat. 196: Thompson, D. D Age related changes in osteon remodeling and bone mineralization. PhD. thesis, University of Connecticut. In Iwaniec, U. T., Crenshaw, T. D., Schoeninger, M. J., Stout, S. D., Ericksen, M. F Methods for improving the efficiency of estimating total osteon density in the human anterior mid-diaphyseal femur. Am. J. Phys. Anthropol. 107:

233 Thompson, D. D The core technique in the determination of age at death in skeletons. J. Forensic Sci. 24: Thompson, D. D., Gunness-Hey, M Bone mineral-osteon analysis of Yupik-Inupiaq skeletons. Am. J. Phys. Anthropol. 55:1 7. Thompson, T. J. U Recent advances in the study of burned bone and their implications for forensic anthropology. Forensic Sci. Int. 146S:S203 S205. Thompson, T. J. U Heat-induced dimensional changes in bone and their consequences for forensic anthropology. J. Forensic Sci. 50(5): Thompson, T. J. U., Chudek, J. A A novel approach to the visualisation of heatinduced structural change in bone. Science and Justice 47: Thompson, T. J. U., Gauthier, M., Islam, M The application of a new method of Fourier Transform Infrared Spectroscopy to the analysis of burned bone. J. Archaeol. Sci. 36: Tommerup, L. J., Raab, D. M., Crenshaw, T. D., Smith, E. L Does weight-bearing exercise affect non-weight-bearing bone? J. Bone Miner. Res. 9: Trňáčková, Z Časně slovanská žárová pohřebiště v Pomoraví a jejich charakter. In: IV. medzinárodný kongres slovanskej archeologie Sofia , Nitra, pp Ubelaker, D. H Approaches to demographic problems in the northeast. In: Snow, D. R. (ed.): Foundations of northeastern archaeology. Academic Press, New York, London, pp Ubelaker, D. H The forensic evaluation of burned skeletal remains: A synthesis. Forensic Sci. Int. 183:1 5. Ullrich, H Zur Anwendbarkeit histomorphometrischen Methoden für anthropologische Leichenbranduntersuchungen. Bemerkungen zur Dissertation von B. Heussner, Berlin Ethnogr.-Archäol. Z. 31: Urbanová, P Rozlišení zvířecích a lidských kostí. Histologická komparativní studie pro forenzní antropologii a kriminalistiku. Diplomová práce. PřF MU v Brně, katedra antropologie, Brno. Uytterschaut, H Human bone remodeling and aging. In: Grupe, G., Garland, A. N. (eds.): Histology of ancient human bone: Methods and diagnosis. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp Vacek, Z Histologie a histologická technika. Učebnice pro zdravotnické školy. Avicenum/Zdravotnické nakladatelství, Praha. 233

234 Vacek, Z Embryologie pro pediatry. Učebnice pro lékařské fakulty. Univerzita Karlova, Nakladatelství a vydavatelství JP, Praha. Van Vark, G. N Some statistical procedures for the investigation of prehistoric human skeletal material. Rijksuniversiteit te Groningen, Groningen. Vystrčilová, M Určování dožitého věku podle kostry. Disertační práce. Katedra antropologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně. Brno. Wallin, J. A., Tkocz, I., Levinsen, J A simplified procedure for preparation of undecalcified human bone sections. Stain Technol. 60(6): Walker, P. L., Miller, K. W. P., Richman, R Time, temperature, and oxygen availability: An experimental study of the effects of environmental conditions on the color and organic content of cremated bone. In: Schmidt, C. W., Symes, S. A. (eds): The Analysis of Burned Human Remains. Academic Press, London, pp Watanabe, Y., Konishi, M., Shimada, M., Ohara, H., Iwamoto, S Estimation of age from the femur of Japanese cadavers. Forensic Sci Int. 98(1-2): Weinmann, J. P., Sicher, H Bone and bones, fundamentals of bone biology. London, Henry Kimpton. Wolf, J Mikroskopická technika, optická a elektronová pro biologické účely. Státní zdravotnické nakladatelství, Praha. Wu, K., Schubeck, K. E., Frost, H. M., Villanueva, A Haversian bone formation rates determined by a new method in a mastodon, and in human diabetes mellitus and osteoporosis. Calcif. Tissue Res. 6(3): Zemková, D LF UK v Praze. Sdělení v rámci přednášek. 234

235 12. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK #/mm² - počet na mm2 * statisticky významné na hladině p < 0,05 ** statisticky významné na hladině p < 0,01 *** statisticky významné na hladině p < 0,001 **** statisticky významné na hladině p < 0,0001 registrovaná ochranná známka (Registered trade mark) C stupeň Celsia 3D prostorový (Three-dimensional) a.s. akciová společnost AIDS Syndrom získaného selhání imunity (Acquired Immune Deficiency Syndrome nebo též Acquired Immunodeficiency Syndrome) B. P. před současností (Before Present) BMU Basic Multicellular Unit C uhlík Ca vápník cm centimetr CO2 oxid uhličitý Df počet stupňů volnosti (Degree of Freedom) DNA deoxyribonukleová kyselina (Deoxyribonucleic acid) et al. a kolektiv (lat.) GmbH společnost s ručením omezeným (Gesellschaft mit beschränkter Haftung) Hav. Haversův hyper- nadbytečný, přehnaný, velký hypo- malý, nedostatečný, dolní IGF inzulínu podobný růstový faktor (insulin-like growth factor) Inc. zapsaný v obchodním rejstříku (Incorporated) JPG Joint Photographic Experts Group, přípona souborů označující bitmapovou grafiku (např. fotografie) K draslík Ltd. omezené ručení (angl. akciová společnost Limited Company) Max. maximální 235

236 Mg hořčík Min. minimální mm milimetr N dusík N počet jedinců Na sodík nesp. nespálené Non- předpona ne- (angl.) O kyslík Obr. obrázek OPD hustota populace osteonů (The osteon population density) P fosfor p hodnota, na které se zamítá nulová hypotéza R koeficient reliability r korelační koeficient (Pearsonův, Spearmanův) r2 koeficient determinace res. resorpční s. r. o. společnost s ručením omezeným s²celk rozptyl znaku (celkový rozptyl) s²ch chybový rozptyl SD směrodatná odchylka SE střední chyba průměru SEE střední chyba odhadu sch chybová směrodatná odchylka spol. s r. o. společnost s ručením omezeným t kritická hodnota pro T rozdělení T statistický ukazatel Wilcoxonova párového testu Tab. tabulka neregistrovaná obchodní značka, používaná k propagaci nebo pro značkové zboží U statistický ukazatel Mann Whitney U testu USA Spojené státy americké věkodh odhadnutý věk Vch chybový variační koeficient 236

237 vs. versus W statistický ukazatel Shapiro-Wilkova W testu X nezávislá proměnná Y závislá proměnná Z statistický ukazatel Mann Whitney U testu Z statistický ukazatel Wilcoxonova párového testu α hladina významnosti μ průměr μm mikrometr σ směrodatná odchylka Zkratky histologických proměnných: TL_KOM tloušťka kompakty POC_OST počet intaktních osteonů na mm² PR_OST procento celkové plochy osteonů PL_OST plocha osteonu OBV_O obvod osteonu MAX_O maximální osa osteonu MIN_O minimální osa osteonu PRUM_O průměr osteonu F_PR_O feret průměr osteonu SFAC_OST shape factor osteonu C_OST compactness osteonu PR_KAN procento celkové plochy Haversových kanálků PL_KAN plocha Haversova kanálku OBV_K obvod Haversova kanálku MAX_K maximální osa Haversova kanálku MIN_K minimální osa Haversova kanálku PRUM_K průměr Haversova kanálku F_PR_K feret průměr Haversova kanálku SFAC_KAN shape factor Haversova kanálku C_KAN compactness Haversova kanálku OK_OO obvod Haversova kanálku / obvod osteonu 237

238 PK_PO plocha Haversova kanálku / plocha osteonu PRK_PRO průměr Haversova kanálku / průměr osteonu P_NON_H počet non-haversových kanálků na mm² PR_L_VN procento plochy vnějších obvodových lamel PR_LAM procento plochy vnitřních obvodových lamel POC_DUT počet resorpčních dutin na mm² PR_DUT procento celkové plochy resorpčních dutin 238

239 13. SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1. Uspořádání sekundární kostní tkáně do lamel. Mezi lamelami se nacházejí lakuny osteocytů (šipka). Zvětšení 400. Muž, 61 let. Obr. 2. Lakuny osteocytů jsou v obvodových lamelách (šipka) oproti zbytku kosti větší a protáhlé. Zvětšení 400. Muž, 61 let. Obr. 3. Stavba kompaktní kosti: vnější obvodové lamely (A), osteony (B) a fragmenty osteonů (C), vnitřní obvodové lamely (D). Zvětšení 100. Muž, 75 let. Obr. 4. Kompaktní kost s již odbouranými vnějšími obvodovými lamelami (šipky označují vnější okraj kompaktní kosti). Zvětšení 100. Muž, 57 let. Obr. 5. Vnější obvodové lamely (prázdná šipka) se sekundárním osteonem (plná šipka). Zvětšení 400. Muž, 23 let. Obr. 6. Vnitřní obvodové lamely částečně překrývající sekundární osteony. Zvětšení 400. Žena, 51 let. Obr. 7. Nově uložené vnitřní obvodové lamely (A), na opačné straně kosti jsou viditelné stopy resorpce (B) Zvětšení 400. Muž, 58 let. Obr. 8. Driftující osteon (směr driftu ukazuje šipka) vrůstající do vnitřních obvodových lamel. Zvětšení 400. Muž, 75 let. Obr. 9. Vnitřní obvodové lamely (A), tenká vrstva kompaktní kosti s osteonem a fragmenty osteonů, periostální okraj kosti (B). Zvětšení 400. Muž, 67 let. Obr. 10. Osteony nacházející se ve vnitřních obvodových lamelách. Zvětšení 400. Muž, 26 let. Obr. 11. Nově uložené obvodové lamely (šipka). Zvětšení 400. Muž, 26 let. Obr. 12. Vnější obvodové lamely (A) s non-haversovými kanálky. Zvětšení 100. Muž, 19 let. Obr. 13. Non-Haversův kanálek, označený na předchozím obrázku šipkou, zobrazený ve zvětšení 400. Muž, 19 let. Obr. 14. Non-Haversův kanálek (A). Kost spálená při 1000 C. Zvětšení 400. Muž, 19 let. Obr. 15. Non-Haversovy kanálky (šipky). Kost spálená při 1000 C. Zvětšení 400. Muž, 19 let. Obr. 16. Sekundární osteony a fragmenty osteonů. Zvětšení 400. Žena, 40 let. 239

240 Obr. 17. Lamely tvořící stěnu osteonu. Zvětšení 400. Žena, 51 let. Obr. 18. Lamely tvořící stěnu osteonu a obvodové lamely (oblouky lamel v pravém a levém dolním rohu obrázku). Zvětšení 400. Muž, 75 let. Obr. 19. Sekundární osteon proříznutý v místě rozvětvení Haversova kanálku. Zvětšení 400. Muž, 75 let. Obr. 20. Osteony propojené pomocí Volkmannova kanálku. Zvětšení 400. Muž, 90 let. Obr. 21. Volkmannovy kanálky v kostní tkáni (šipky). Zvětšení 100. Muž, 61 let. Obr. 22. Osteony odbourávané činností periostu (A), na opačné straně se nacházejí endostální lamely (B). Zvětšení 400. Muž, 58 let. Obr. 23. V horní části obrázku se nacházejí vnitřní obvodové lamely s velkými protáhlými lakunami vzniklé činností endostu, jako podklad jim slouží zbytky kompaktní kosti s fragmenty osteonů. Zvětšení 400. Muž, 58 let. Obr. 24. Spojení osteonu s cévami periostu pomocí kanálku probíhajícího kolmo k povrchu kosti (A). Zvětšení 400. Muž, 61 let. Obr. 25. Kanálek vedoucí do kostní dřeně (šipka). Zvětšení 400. Muž, 84 let. Obr. 26. Účinky růstu (A), kortikálního driftu (B) a růstu spojeného s kortikálním driftem (C) na histomorfologii kompaktní kosti (Podle Stout, 1992). Obr. 27. Projevy kortikálního driftu ve stěně žebra stěna je tvořena výhradně obvodovými lamelami. Zvětšení 100. Muž, 84 let. Obr. 28. Projevy kortikálního driftu ve stěně žebra. Zvětšení 100. Muž, 84 let. Obr. 29. Projevy kortikálního driftu u muže starého 20 let. Zvětšení 100. Obr. 30. Resorpční prostor s přívodním Volkmannovým kanálkem pro krevní cévu (šipka). Zvětšení 400. Muž, 26 let. Obr. 31. Osteon tvořící se v resorpčním prostoru. Zvětšení 400. Muž, 20 let. Obr. 32. Osteony typu II (šipky). Zvětšení 400. Žena, 77 let. Obr. 33. Osteon s dočasně pozastaveným a opět obnoveným procesem uzavírání Haversova kanálku (šipka). Zvětšení 400. Muž, 65 let. Obr. 34. Sekundární osteon s dvěma soustřednými cementovými liniemi (šipka). Zvětšení 400. Žena, 58 let. Obr. 35. Struktura osteonu uvnitř osteonu (šipka). Zvětšení 400. Žena, 77 let. 240

241 Obr. 36. Částečně odbourané osteony na periostálním povrchu kosti. Zvětšení 400. Muž, 58 let. Obr. 37. Stopy absorpce neznámé látky, snad léčiv, v kostní tkáni (žluté linie v kosti). Zvětšení 100. Muž, 37 let. Obr. 38. Sekundární osteon driftující skrz obvodové lamely (směr driftu ukazuje šipka). Zvětšení 400. Žena, 42 let. Obr. 39. Sekundární osteon driftující a zároveň zvětšující svou velikost (směr driftu a zvětšování ukazují šipky). Zvětšení 400. Žena, 65 let. Obr. 40. Sekundární osteon driftující a neměnící svou velikost (směr driftu ukazuje šipka). Zvětšení 400. Žena, 65 let. Obr. 41. Vznik osteonu v obvodových lamelách. Uprostřed kosti se vyskytuje resorpční dutina (A), do které přicházejí krevní cévy skrz Volkmannovy kanálky (B). Dutina bude posléze vyplněna lamelami a vznikne sekundární osteon podobný tomu, který se nachází v levé části obrázku (C). Zvětšení 100. Muž, 60 let. Obr. 42. Mladý osteon s velkým Haversovým kanálkem. Cirkulární lamely obkružují Haversův kanálek po celém jeho obvodu. Zvětšení 400. Žena, 58 let. Obr. 43. Trámce spongiózy (šipky) zakomponované do kompaktní kosti v průběhu modelace kosti. Zvětšení 100. Muž, 84 let. Obr. 44. Tentýž jev u muže starého 20 let. Zvětšení 100. Obr. 45. Kost spálená při 600 C. Zvětšení 400. Muž, 62 let. Obr. 46. Osteony v kosti spálené při 700 C. Zvětšení 400. Muž, 67 let. Obr. 47. Osteon a vnitřní obvodové lamely v kosti spálené při 700 C. Zvětšení 400. Muž, 67 let. Obr. 48. Osteony a fragmenty osteonů v kompaktní kosti spálené při 800 C. Zvětšení 400. Muž, 42 let. Obr. 49. Osteony, fragmenty osteonů, vnitřní obvodové lamely a část resorpční dutiny (bílá skvrna vpravo dole) v kompaktní kosti spálené při 800 C. Zvětšení 400. Muž, 75 let. Obr. 50. Kompaktní kost spálená při 1000 C, identifikovatelné jsou především intaktní osteony. Zvětšení 400. Muž, 67 let. Obr. 51. Vnitřní obvodové lamely a osteony v kosti spálené při 1000 C. Zvětšení 400. Muž, 65 let. 241

242 Obr. 52. Příklad poškození kompaktní kosti žárem, které znemožňuje histologickou analýzu. Teplota spalování 700 C. Zvětšení 100. Žena, 40 let. Obr. 53. Barva kostí spálených při 700 C (I). První skupina spalovaných jedinců. Obr. 54. Barva kostí spálených při 700 C (II). Druhá skupina spalovaných jedinců. Odstup v datu spalování mezi oběma skupinami byl 24 hodin. Obr. 55. Změna počtu lamel v osteonu v závislosti na nepatrné změně v zaostření. Zvětšení 400. Žena, 78 let. 242

243 14. SEZNAM TABULEK Tab. 1. Faktory, které mohou způsobit regionální akcelerační fenomén (Podle Stout, 1992). Tab. 2. Faktory, které ovlivňují remodelaci kostí a tvorbu osteonů (Podle Frost, 1987a; Stout, 1989b, 1992). Tab. 3. Přehled struktur kostní tkáně, které se mění v průběhu lidského života (Podle Bruchhaus, 1990). Tab. 4. Změny kostní tkáně v závislosti na teplotě spalování (Podle Harsányi, 1993; Dokládal, 1999a; Thompson, 2004; Hanson a Cain, 2007; Ubelaker, 2009). Tab. 5. Smrštění kompaktní kosti ze středu diafýzy femuru v závislosti na teplotě spalování a délce fragmentu (Podle Bruchhaus, 1990). Tab. 6. Změny velikosti a počtu mikrostruktur kompakty lidského žebra vlivem žáru (Podle Loubová, 1999). Tab. 7. Změny mikrostruktur kompaktní kosti lidského žebra způsobené rostoucím věkem a spalováním (Podle Loubová, 1999). Tab. 8. Teplota plamene hořících materiálů (Podle Ptáček, 1999; Aulický, 2006). Tab. 9. Pořadí Kerleyho a Ahlqvistovy-Damstenovy histologické metody odhadu dožitého věku podle jejich přesnosti a spolehlivosti zhodnocené na nezávislém souboru. Tab. 10. Věkové složení studijních souborů (N počet jedinců, SD směrodatná odchylka, SE střední chyba průměru). Normalita rozdělení souborů je testována pomocí šikmosti, špičatosti a Shapiro-Wilkova W testu. Tab. 11. Vzor formuláře použitého pro měření vzorků. Tab. 12. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u nespálených kostí (N = 49). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 13. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u nespálených kostí, muži (N = 31). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 14. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u nespálených kostí, ženy (N = 19). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 15. Normalita rozdělení jednotlivých proměnných, nespálené kosti. Použita šikmost, špičatost a Shapiro-Wilkův W test (W hodnota W testu, p dosažená hladina p, na které zamítáme hypotézu, že rozdělení není normální na hladině α = 0,05). 243

244 Tab. 16. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 700 C (N = 36). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 17. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 700 C, muži (N = 29). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 18. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 700 C, ženy (N = 13). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 19. Normalita rozdělení jednotlivých proměnných, kosti spálené při 700 C. Použita šikmost, špičatost a Shapiro-Wilkův W test (W hodnota W testu, p dosažená hladina p, na které zamítáme hypotézu, že rozdělení není normální, na hladině α = 0,05). Tab. 20. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 800 C (N = 60). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 21. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 800 C, muži (N = 46). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 22. Deskriptivní statistiky histologických proměnných u kostí spálených při 800 C, ženy (N = 24). SD směrodatná odchylka; SE střední chyba průměru. Tab. 23. Normalita rozdělení jednotlivých proměnných, kosti spálené při 800 C. Použita šikmost, špičatost a Shapiro-Wilkův W test (W hodnota W testu, p dosažená hladina p, na které zamítáme hypotézu, že rozdělení není normální, na hladině α = 0,05). Tab. 24. Vztah mikrostruktur kompaktní kosti k věku a ke spalování. Jednoduchá lineární korelace, uvedeny Pearsonovy korelační koeficienty (r) s dožitým věkem. V případě, kdy jsou změny proměnných s věkem uvedeny v závorce, je tím znázorněn fakt, že příslušný korelační koeficient proměnné s věkem nebyl statisticky významný. Věkové a teplotní změny v kompaktní kosti viz také tab. 31, příloha 4, 5 a 8. Tab. 25. Mann-Whitney U test pro dva nezávislé soubory mezi muži (N = 31) a ženami (N = 19), nespálené kosti. U pořadová statistika; Z pořadová statistika převedená na normální rozdělení; p nejmenší hladina pro hodnotu Z, na které se zamítá hypotéza, že veličiny obou souborů jsou stejné. Tab. 26. Mann-Whitney U test pro dva nezávislé soubory mezi muži (N = 29) a ženami (N = 13), kosti spálené při 700 C. U pořadová statistika; Z pořadová statistika převedená na normální rozdělení; p nejmenší hladina pro hodnotu Z, na které se zamítá hypotéza, že veličiny obou souborů jsou stejné. 244

245 Tab. 27. Mann-Whitney U test pro dva nezávislé soubory mezi muži (N = 46) a ženami (N = 24), kosti spálené při 800 C. U pořadová statistika; Z pořadová statistika převedená na normální rozdělení; p nejmenší hladina pro hodnotu Z, na které se zamítá hypotéza, že veličiny obou souborů jsou stejné. Tab. 28. Analýza kovariance mezi muži a ženami s vyloučením vlivu dožitého věku a porovnání výsledku s výsledkem Mann-Whitney U testu. Nespálené kosti. Uvedeny dosažené hodnoty p. Tab. 29. Analýza kovariance mezi muži a ženami s vyloučením vlivu dožitého věku a porovnání výsledku s výsledkem Mann-Whitney U testu. Kosti spálené při 700 C. Uvedeny dosažené hodnoty p. Tab. 30. Analýza kovariance mezi muži a ženami s vyloučením vlivu dožitého věku a porovnání výsledku s výsledkem Mann-Whitney U testu. Kosti spálené při 800 C. Uvedeny dosažené hodnoty p. Tab. 31. Hodnoty jednotlivých proměnných u nespálených kostí a kostí spálených při 700 a 800 C (N počet jedinců, SD směrodatná odchylka). Tab. 32. T-test pro závislé soubory mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 700 C (dvojice jedinců, N = 36; df = 35; průměrný věk = 58,47; věkové rozpětí = 19-95; směrodatná odchylka = 22,361; střední chyba průměru = 3,73; variační koeficient = 38,2). SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení. Tab. 33. Wilcoxonův párový test mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 700 C (dvojice jedinců, N = 36; průměrný věk = 58,47; věkové rozpětí = 19-95; směrodatná odchylka = 22,361; střední chyba průměru = 3,73; variační koeficient = 38,2). T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z. Tab. 34. T-test pro závislé soubory mezi kostmi spálenými při 700 a 800 C (dvojice jedinců, N = 28; df = 27; průměrný věk = 63,14; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 20,024; střední chyba průměru = 3,78; variační koeficient = 31,7). SD směrodatná odchylka p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení. Tab. 35. Wilcoxonův párový test mezi kostmi spálenými při 700 a 800 C (dvojice jedinců, N = 28; průměrný věk = 63,14; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 245

246 20,024; střední chyba průměru = 3,78; variační koeficient = 31,7). T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z. Tab. 36. T-test pro závislé soubory mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 800 C (dvojice jedinců, N = 38; df = 37; průměrný věk = 63,95; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 17,717; střední chyba průměru = 2,87; variační koeficient = 27,7). SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení. Tab. 37. Wilcoxonův párový test mezi kostmi nespálenými a kostmi spálenými při 800 C (dvojice jedinců, N = 38; průměrný věk = 63,95; věkové rozpětí = 20-95; směrodatná odchylka = 17,717; střední chyba průměru = 2,87; variační koeficient = 27,7). T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z. Tab. 38. T-test pro dva nezávislé soubory mezi kostmi nespálenými a spálenými při 700 C. Df = 83; SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení. Tab. 39. T-test pro dva nezávislé soubory mezi kostmi spálenými při 700 a 800 C. Df = 94; SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení. Tab. 40. T-test pro dva nezávislé soubory mezi kostmi nespálenými a spálenými při 800 C. Df = 107; SD směrodatná odchylka, p dosažená hladina, na které zamítáme nulovou hypotézu, že se oba soubory vzájemně neliší, t kritická hodnota pro T rozdělení. Tab. 41. Přehledné porovnání výsledků T-testu pro závislé soubory, Wilcoxonova párového testu a T-testu pro nezávislé soubory mezi kostmi nespálenými a spálenými při 700 a 800 C. Proměnné, ve kterých se soubory neliší, mají červeně vyznačenou hodnotu p. T-test pro závislé soubory a Wilcoxonův párový test použity dvojice stejných jedinců, T-test pro nezávislé soubory použiti všichni jedinci. Tab. 42. Regresní analýza nespálených kostí, obě pohlaví dohromady (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace). Tab. 43. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. Nespálené kosti, obě pohlaví dohromady. 1 muž, 0 žena. Tab. 44. Regresní analýza nespálených kostí, muži (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace). 246

247 Tab. 45. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. Nespálené kosti, muži. 1 muž. Tab. 46. Regresní analýza kostí spálených při 700 C, obě pohlaví dohromady (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² koeficient determinace). Tab. 47. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 700 C, obě pohlaví dohromady. 1 muž, 0 žena. Tab. 48. Regresní analýza kostí spálených při 700 C, muži (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace). Tab. 49. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 700 C, muži. 1 muž. Tab. 50. Regresní analýza kostí spálených při 800 C, obě pohlaví dohromady (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² koeficient determinace). Tab. 51. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 800 C, obě pohlaví dohromady. 1 muž, 0 žena. Tab. 52. Regresní analýza kostí spálených při 800 C, muži (SEE střední chyba odhadu, roky; SD směrodatná odchylka; r korelační koeficient; r² - koeficient determinace). Tab. 53. Aplikace regresní rovnice odhadu dožitého věku na kontrolní soubor. 800 C, muži. 1 muž. Tab. 54. Věkové složení kontrolních souborů (N počet jedinců, SD směrodatná odchylka, SE střední chyba průměru). Tab. 55. Zjištění chyby měření. SD směrodatná odchylka. Wilcoxonův párový test: T pořadová statistika; Z její převedení na normální rozdělení; p dosažená hladina pro Z. Ve vyznačených případech se obě měření od sebe liší na 5% hladině významnosti. Tab. 56. Pearsonův a Spearmanův korelační koeficient mezi prvním a druhým měřením vyznačená hodnota r není statisticky významná na 5% hladině významnosti. Tab. 57. Zjištění dalších charakteristik pro popis chyby měření. Vyznačené hodnoty chybového variačního koeficientu a koeficientu reliability nesplňují doporučenou hranici 5% v případě chybového variačního koeficientu a 0,80 v případě koeficientu reliability. 247

248 Tab. 58. Porovnání výsledků naší studie s některými předchozími pracemi (r² - koeficient determinace; SEE střední chyba odhadu; N počet jedinců). Tab. 59. Shrnutí údajů o námi vypočtených regresních rovnicích odhadu dožitého věku a jejich aplikaci na kontrolní soubory (Y odhadnutý věk; r korelační koeficient; r² koeficient determinace; SEE střední chyba odhadu). 248

249 15. SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1: Frekvenční tabulky ukazující složení studijních souborů. Příloha 2: Histogramy dožitého věku u jednotlivých studijních souborů. Příloha 3: Korelační matice pro jednotlivé studijní soubory. Příloha 4: Změny proměnných s rostoucím věkem u mužů a žen u nespálených kostí. SEX 0 = ženy, SEX 1 = muži. Uvádíme pouze ty proměnné, jejichž Pearsonův korelační koeficient s dožitým věkem byl statisticky významný. Čárkované linie vyznačují 95% interval spolehlivosti pro průměr. Uvedeny jsou také rovnice odhadu dožitého věku na základě jednoduché lineární regrese pro danou proměnnou. Příloha 5: Grafické znázornění teplotních změn jednotlivých proměnných. Sex 0 = ženy, 1 = muži. Teplota 0 = nespálené kosti, 1 = 700 C, 2 = 800 C. Příloha 6: Ověření normálního rozložení diferencí mezi skutečným a odhadnutým věkem (histogram a Shapiro-Wilkův W test pro rozdíly mezi skutečným a odhadnutým věkem). Příloha 7: Postupné změny vyvolané v kompaktní kosti zvyšující se teplotou spalování. Neobarvené, neodvápněné broušené příčné řezy, zvětšení 100. Muž, 20 let, příčina smrti: podezření na otravu neznámou látkou. Příloha 8: Kostní tkáň lidského žebra v jednotlivých dekádách života. Příloha 9: Publikační a prezentační aktivita autorky, životopis. 249

250 16. PŘÍLOHY 250

251 Příloha 1: Frekvenční tabulky ukazující složení studijních souborů. Frekvenční tabulka pro soubor nespálených kostí. Proměnná: Věk Kategorie 10 <x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 90<x<=100 Počet Kumulativní počet Procento 4,1 8,2 6,1 12,3 14,3 20,4 18,4 14,3 2,0 Kumulativní procento 4,1 12,3 18,4 30,6 44,9 65,3 83,7 98,0 100,0 Frekvenční tabulka pro soubor nespálených kostí, muži. Proměnná: Věk Kategorie Počet 10<x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 90<x<= Kumulativní počet Procento 6,5 9,7 6,5 19, 4 16,2 22,6 6,5 9,7 3,2 Kumulativní procento 6,5 16,1 22, 6 41,9 58,1 80,7 87,1 96,8 100,0 Frekvenční tabulka pro soubor nespálených kostí, ženy. Proměnná: Věk Kategorie Počet 10<x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<= Kumulativní počet Procento 0,0 5,3 5,3 0,0 10,5 15,8 42,1 21,1 Kumulativní procento 0,0 5,3 10,5 10,5 21,1 36,8 79,0 100,0 Frekvenční tabulka pro soubor kostí spálených při 700 C. Proměnná: Věk Kategorie 10<x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 90<x<=100 Počet Kumulativní počet Procento 5,6 8,3 8,3 13,9 11,1 19,4 16,7 13,9 2,8 Kumulativní procento 5,6 13,9 22,2 36,1 47,2 66,7 83,3 97,2 100,0 251

252 Frekvenční tabulka pro soubor kostí spálených při 700 C, muži. Proměnná: Věk Kategorie 10<x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 90<x<=100 Počet Kumulativní počet Procento 6,9 17,2 10,4 17,2 10,4 17,2 6,9 10,4 3,5 Kumulativní procento 6,9 24,1 34,5 51,7 62,1 79,3 86,2 96,6 100,0 Frekvenční tabulka pro soubor kostí spálených při 700 C, ženy. Proměnná: Věk Kategorie 10<x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 Počet Kumulativní počet Procento 0,0 7,7 0,0 0,0 7,7 23,1 38,5 23,1 Kumulativní procento 0,0 7,7 7,7 7,7 15,4 38,5 76,9 100,0 Frekvenční tabulka pro soubor kostí spálených při 800 C. Proměnná: Věk Kategorie 10<x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 90<x<=100 Počet Kumulativní počet Procento 1,7 3,3 8,3 11,7 18,3 20,0 18,3 16,7 1,7 Kumulativní procento 1,7 5,0 13,3 25,0 43,3 63,3 81,7 98,3 100,0 Frekvenční tabulka pro soubor kostí spálených při 800 C, muži. Proměnná: Věk Kategorie 10<x<=20 20<x<=30 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 90<x<=100 Počet Kumulativní počet Procento 2,2 4,4 8,7 13,0 21,7 17,4 6,5 23,9 2,2 Kumulativní procento 2,2 6,5 15,2 28,3 50,0 67,4 73,9 97,8 100,0 252

253 Frekvenční tabulka pro soubor kostí spálených při 800 C, ženy. Proměnná: Věk Kategorie 30<x<=40 40<x<=50 50<x<=60 60<x<=70 70<x<=80 80<x<=90 Počet Kumulativní počet Procento 4,2 4,2 12,5 16, 7 45,8 16, 7 Kumulativní procento 4,2 8,3 20,8 37,5 83,3 100,0 253

254 Příloha 2: Histogramy dožitého věku u jednotlivých studijních souborů. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,96, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor nespálených kostí, obě pohlaví dohromady. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,97, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor nespálených kostí, muži. 254

255 Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,81, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor nespálených kostí, ženy. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,96, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor kostí spálených při 700 C, obě pohlaví dohromady. 255

256 Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,95, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor kostí spálených při 700 C, muži. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,79, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor kostí spálených při 700 C, ženy. 256

257 Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,97, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor kostí spálených při 800 C, obě pohlaví dohromady. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,97, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor kostí spálených při 800 C, muži. 257

258 Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,88, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro soubor kostí spálených při 800 C, ženy. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,89, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro kontrolní soubor nespálených kostí, obě pohlaví dohromady. 258

259 Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,92, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro kontrolní soubor nespálených kostí, muži. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,94, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro kontrolní soubor kostí spálených při 700 C, obě pohlaví dohromady. 259

260 Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,96, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro kontrolní soubor kostí spálených při 700 C, muži. Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,95, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro kontrolní soubor kostí spálených při 800 C, obě pohlaví dohromady. 260

261 Histogram: VEK Shapiro-Wilk W = 0,95, p = 0, X <= Hranice kategorie Histogram pro kontrolní soubor kostí spálených při 800 C, muži. 261

262 Příloha 3: Korelační matice pro jednotlivé studijní soubory. Korelační matice pro soubor nespálených kostí, vyznačené korelace jsou významné na hladině p < 0,05, N = 49 Proměnná VEK TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO PK_PO PRK_PRO C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN P_NON_H PR_LAM POC_DUT PR_DUT PR_L_VN VEK 1,00-0,56 0,44-0,70-0,29-0,72-0,75-0,60-0,72-0,70-0,16 0,05-0,36-0,38-0,31-0,36-0,35 0,36 0,27 0,35-0,29-0,13 0,32 0,12-0,16-0,10 0,23 0,09-0,47 TL_KOM -0,56 1,00-0,34 0,73 0,45 0,71 0,68 0,73 0,73 0,73 0,23 0,15 0,43 0,45 0,35 0,42 0,41-0,28-0,22-0,29-0,05 0,18 0,04-0,18 0,03-0,17-0,31-0,12 0,42 POC_OST 0,44-0,34 1,00-0,48 0,44-0,47-0,50-0,37-0,47-0,47-0,35 0,36-0,42-0,41-0,41-0,43-0,42-0,04-0,15-0,05-0,07 0,03 0,05-0,02-0,20-0,33 0,01-0,18-0,47 PL_OST -0,70 0,73-0,48 1,00 0,52 0,99 0,97 0,94 0,99 1,00 0,39 0,15 0,60 0,63 0,50 0,60 0,58-0,38-0,23-0,38 0,12 0,17-0,15-0,16-0,02-0,13-0,37-0,21 0,27 PR_OST -0,29 0,45 0,44 0,52 1,00 0,51 0,44 0,60 0,52 0,53 0,05 0,53 0,20 0,21 0,12 0,18 0,17-0,40-0,37-0,42-0,04 0,17-0,02-0,15-0,22-0,44-0,45-0,49-0,18 OBV_O -0,72 0,71-0,47 0,99 0,51 1,00 0,98 0,93 1,00 0,99 0,36 0,13 0,58 0,60 0,47 0,57 0,55-0,42-0,26-0,41 0,21 0,18-0,24-0,17 0,02-0,13-0,34-0,19 0,31 MAX_O -0,75 0,68-0,50 0,97 0,44 0,98 1,00 0,85 0,98 0,96 0,35 0,10 0,58 0,62 0,43 0,56 0,54-0,40-0,25-0,40 0,31 0,28-0,34-0,27 0,10-0,10-0,29-0,14 0,36 MIN_O -0,60 0,73-0,37 0,94 0,60 0,93 0,85 1,00 0,95 0,96 0,36 0,18 0,55 0,55 0,53 0,56 0,55-0,38-0,23-0,38-0,09-0,02 0,05 0,03-0,15-0,19-0,46-0,29 0,18 PRUM_O -0,72 0,73-0,47 0,99 0,52 1,00 0,98 0,95 1,00 1,00 0,37 0,14 0,59 0,61 0,49 0,58 0,56-0,41-0,25-0,40 0,16 0,17-0,19-0,15 0,00-0,14-0,37-0,20 0,30 F_PR_O -0,70 0,73-0,47 1,00 0,53 0,99 0,96 0,96 1,00 1,00 0,38 0,15 0,60 0,62 0,51 0,59 0,58-0,39-0,23-0,39 0,09 0,14-0,13-0,13-0,04-0,14-0,40-0,23 0,27 PL_KAN -0,16 0,23-0,35 0,39 0,05 0,36 0,35 0,36 0,37 0,38 1,00 0,62 0,90 0,86 0,90 0,91 0,92 0,59 0,78 0,60-0,11-0,09 0,14 0,09 0,11-0,24 0,01 0,19 0,08 PR_KAN 0,05 0,15 0,36 0,15 0,53 0,13 0,10 0,18 0,14 0,15 0,62 1,00 0,60 0,59 0,53 0,58 0,58 0,43 0,46 0,42-0,10 0,14 0,09-0,13-0,02-0,47-0,05-0,04-0,24 OBV_K -0,36 0,43-0,42 0,60 0,20 0,58 0,58 0,55 0,59 0,60 0,90 0,60 1,00 0,99 0,93 1,00 0,99 0,48 0,56 0,48-0,07 0,09 0,09-0,08 0,14-0,24-0,13 0,09 0,20 MAX_K -0,38 0,45-0,41 0,63 0,21 0,60 0,62 0,55 0,61 0,62 0,86 0,59 0,99 1,00 0,86 0,98 0,96 0,44 0,50 0,44-0,01 0,23 0,02-0,22 0,18-0,22-0,13 0,09 0,22 MIN_K -0,31 0,35-0,41 0,50 0,12 0,47 0,43 0,53 0,49 0,51 0,90 0,53 0,93 0,86 1,00 0,95 0,97 0,53 0,64 0,55-0,23-0,26 0,25 0,27 0,02-0,23-0,13 0,10 0,12 262

263 Korelační matice pro soubor nespálených kostí pokračování Proměnná VEK TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO PK_PO PRK_PRO C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN P_NON_H PR_LAM POC_DUT PR_DUT PR_L_VN PRUM_K -0,36 0,42-0,43 0,60 0,18 0,57 0,56 0,56 0,58 0,59 0,91 0,58 1,00 0,98 0,95 1,00 1,00 0,49 0,58 0,50-0,10 0,03 0,12-0,02 0,12-0,23-0,14 0,10 0,19 F_PR_K -0,35 0,41-0,42 0,58 0,17 0,55 0,54 0,55 0,56 0,58 0,92 0,58 0,99 0,96 0,97 1,00 1,00 0,51 0,60 0,51-0,12-0,03 0,14 0,04 0,12-0,24-0,14 0,10 0,18 OK_OO 0,36-0,28-0,04-0,38-0,40-0,42-0,40-0,38-0,41-0,39 0,59 0,43 0,48 0,44 0,53 0,49 0,51 1,00 0,91 1,00-0,31-0,12 0,37 0,11 0,16-0,05 0,19 0,28-0,08 PK_PO 0,27-0,22-0,15-0,23-0,37-0,26-0,25-0,23-0,25-0,23 0,78 0,46 0,56 0,50 0,64 0,58 0,60 0,91 1,00 0,92-0,23-0,22 0,29 0,22 0,17-0,08 0,23 0,32-0,05 PRK_PRO 0,35-0,29-0,05-0,38-0,42-0,41-0,40-0,38-0,40-0,39 0,60 0,42 0,48 0,44 0,55 0,50 0,51 1,00 0,92 1,00-0,29-0,16 0,35 0,16 0,16-0,05 0,21 0,30-0,08 C_OST -0,29-0,05-0,07 0,12-0,04 0,21 0,31-0,09 0,16 0,09-0,11-0,10-0,07-0,01-0,23-0,10-0,12-0,31-0,23-0,29 1,00 0,39-0,99-0,36 0,48 0,05 0,36 0,30 0,32 C_KAN -0,13 0,18 0,03 0,17 0,17 0,18 0,28-0,02 0,17 0,14-0,09 0,14 0,09 0,23-0,26 0,03-0,03-0,12-0,22-0,16 0,39 1,00-0,42-0,99 0,29 0,02 0,02-0,03 0,14 SFAC_OST 0,32 0,04 0,05-0,15-0,02-0,24-0,34 0,05-0,19-0,13 0,14 0,09 0,09 0,02 0,25 0,12 0,14 0,37 0,29 0,35-0,99-0,42 1,00 0,40-0,39-0,07-0,31-0,24-0,30 SFAC_KAN 0,12-0,18-0,02-0,16-0,15-0,17-0,27 0,03-0,15-0,13 0,09-0,13-0,08-0,22 0,27-0,02 0,04 0,11 0,22 0,16-0,36-0,99 0,40 1,00-0,29-0,03-0,02 0,03-0,12 P_NON_H -0,16 0,03-0,20-0,02-0,22 0,02 0,10-0,15 0,00-0,04 0,11-0,02 0,14 0,18 0,02 0,12 0,12 0,16 0,17 0,16 0,48 0,29-0,39-0,29 1,00 0,04 0,28 0,38 0,45 PR_LAM -0,10-0,17-0,33-0,13-0,44-0,13-0,10-0,19-0,14-0,14-0,24-0,47-0,24-0,22-0,23-0,23-0,24-0,05-0,08-0,05 0,05 0,02-0,07-0,03 0,04 1,00-0,12-0,22 0,31 POC_DUT 0,23-0,31 0,01-0,37-0,45-0,34-0,29-0,46-0,37-0,40 0,01-0,05-0,13-0,13-0,13-0,14-0,14 0,19 0,23 0,21 0,36 0,02-0,31-0,02 0,28-0,12 1,00 0,86 0,01 PR_DUT 0,09-0,12-0,18-0,21-0,49-0,19-0,14-0,29-0,20-0,23 0,19-0,04 0,09 0,09 0,10 0,10 0,10 0,28 0,32 0,30 0,30-0,03-0,24 0,03 0,38-0,22 0,86 1,00 0,12 PR_L_VN -0,47 0,42-0,47 0,27-0,18 0,31 0,36 0,18 0,30 0,27 0,08-0,24 0,20 0,22 0,12 0,19 0,18-0,08-0,05-0,08 0,32 0,14-0,30-0,12 0,45 0,31 0,01 0,12 1,00 263

264 Korelační matice pro soubor kostí spálených při 700 C, vyznačené korelace jsou významné na hladině p < 0,05, N = 36 Proměnná VEK TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO PK_PO PRK_PRO C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN VEK 1,00-0,32 0,07-0,40-0,23-0,44-0,55-0,19-0,43-0,40-0,02-0,08-0,12-0,24 0,15-0,08-0,04 0,39 0,34 0,42-0,35-0,44 0,32 0,45 TL_KOM -0,32 1,00-0,19 0,52 0,19 0,46 0,44 0,49 0,48 0,49 0,30 0,19 0,32 0,30 0,23 0,30 0,29-0,17-0,15-0,19-0,05 0,11 0,06-0,09 POC_OST 0,07-0,19 1,00-0,52 0,57-0,52-0,51-0,48-0,52-0,54-0,35 0,35-0,43-0,40-0,42-0,44-0,44 0,07 0,06 0,05-0,07 0,18 0,09-0,21 PL_OST -0,40 0,52-0,52 1,00 0,32 0,98 0,95 0,94 0,99 0,99 0,64 0,23 0,72 0,72 0,57 0,70 0,70-0,29-0,24-0,29 0,29-0,01-0,28 0,03 PR_OST -0,23 0,19 0,57 0,32 1,00 0,33 0,30 0,36 0,33 0,32 0,20 0,66 0,20 0,24 0,11 0,18 0,17-0,17-0,15-0,19 0,25 0,10-0,22-0,11 OBV_O -0,44 0,46-0,52 0,98 0,33 1,00 0,98 0,91 1,00 0,99 0,58 0,17 0,68 0,70 0,53 0,66 0,66-0,36-0,31-0,35 0,44 0,01-0,43 0,02 MAX_O -0,55 0,44-0,51 0,95 0,30 0,98 1,00 0,81 0,97 0,95 0,53 0,13 0,66 0,71 0,44 0,63 0,61-0,37-0,33-0,36 0,50 0,14-0,49-0,12 MIN_O -0,19 0,49-0,48 0,94 0,36 0,91 0,81 1,00 0,93 0,95 0,63 0,25 0,66 0,61 0,64 0,66 0,68-0,27-0,20-0,27 0,14-0,23-0,14 0,25 PRUM_O -0,43 0,48-0,52 0,99 0,33 1,00 0,97 0,93 1,00 1,00 0,59 0,19 0,69 0,70 0,54 0,67 0,67-0,35-0,29-0,34 0,38 0,00-0,37 0,02 F_PR_O -0,40 0,49-0,54 0,99 0,32 0,99 0,95 0,95 1,00 1,00 0,61 0,19 0,70 0,71 0,57 0,68 0,68-0,32-0,27-0,32 0,30-0,03-0,29 0,05 PL_KAN -0,02 0,30-0,35 0,64 0,20 0,58 0,53 0,63 0,59 0,61 1,00 0,62 0,96 0,89 0,91 0,97 0,97 0,49 0,55 0,49 0,00-0,17 0,02 0,18 PR_KAN -0,08 0,19 0,35 0,23 0,66 0,17 0,13 0,25 0,19 0,19 0,62 1,00 0,56 0,54 0,46 0,55 0,53 0,48 0,50 0,44-0,04 0,05 0,07-0,06 264

265 Korelační matice pro soubor kostí spálených při 700 C pokračování Proměnná VEK TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO PK_PO PRK_PRO C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN OBV_K -0,12 0,32-0,43 0,72 0,20 0,68 0,66 0,66 0,69 0,70 0,96 0,56 1,00 0,96 0,88 1,00 0,99 0,43 0,45 0,43 0,12-0,05-0,09 0,06 MAX_K -0,24 0,30-0,40 0,72 0,24 0,70 0,71 0,61 0,70 0,71 0,89 0,54 0,96 1,00 0,75 0,94 0,92 0,36 0,36 0,35 0,21 0,14-0,17-0,13 MIN_K 0,15 0,23-0,42 0,57 0,11 0,53 0,44 0,64 0,54 0,57 0,91 0,46 0,88 0,75 1,00 0,91 0,94 0,47 0,53 0,51-0,02-0,48 0,02 0,50 PRUM_K -0,08 0,30-0,44 0,70 0,18 0,66 0,63 0,66 0,67 0,68 0,97 0,55 1,00 0,94 0,91 1,00 1,00 0,45 0,47 0,46 0,10-0,12-0,08 0,13 F_PR_K -0,04 0,29-0,44 0,70 0,17 0,66 0,61 0,68 0,67 0,68 0,97 0,53 0,99 0,92 0,94 1,00 1,00 0,44 0,47 0,45 0,08-0,21-0,06 0,22 OK_OO 0,39-0,17 0,07-0,29-0,17-0,36-0,37-0,27-0,35-0,32 0,49 0,48 0,43 0,36 0,47 0,45 0,44 1,00 0,95 0,99-0,40-0,08 0,42 0,06 PK_PO 0,34-0,15 0,06-0,24-0,15-0,31-0,33-0,20-0,29-0,27 0,55 0,50 0,45 0,36 0,53 0,47 0,47 0,95 1,00 0,96-0,33-0,19 0,35 0,18 PRK_PRO 0,42-0,19 0,05-0,29-0,19-0,35-0,36-0,27-0,34-0,32 0,49 0,44 0,43 0,35 0,51 0,46 0,45 0,99 0,96 1,00-0,34-0,17 0,35 0,15 C_OST -0,35-0,05-0,07 0,29 0,25 0,44 0,50 0,14 0,38 0,30 0,00-0,04 0,12 0,21-0,02 0,10 0,08-0,40-0,33-0,34 1,00 0,21-0,99-0,18 C_KAN -0,44 0,11 0,18-0,01 0,10 0,01 0,14-0,23 0,00-0,03-0,17 0,05-0,05 0,14-0,48-0,12-0,21-0,08-0,19-0,17 0,21 1,00-0,15-0,99 SFAC_OST 0,32 0,06 0,09-0,28-0,22-0,43-0,49-0,14-0,37-0,29 0,02 0,07-0,09-0,17 0,02-0,08-0,06 0,42 0,35 0,35-0,99-0,15 1,00 0,12 SFAC_KAN 0,45-0,09-0,21 0,03-0,11 0,02-0,12 0,25 0,02 0,05 0,18-0,06 0,06-0,13 0,50 0,13 0,22 0,06 0,18 0,15-0,18-0,99 0,12 1,00 265

266 Korelační matice pro soubor kostí spálených při 800 C, vyznačené korelace jsou významné na hladině p < 0,05, N = 60 Proměnná VEK TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO PK_PO PRK_PRO C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN VEK 1,00-0,18 0,22-0,47-0,14-0,50-0,54-0,33-0,48-0,47 0,07 0,17-0,02-0,06 0,08 0,00 0,02 0,40 0,38 0,40-0,19-0,28 0,18 0,24 TL_KOM -0,18 1,00-0,01 0,56 0,47 0,54 0,47 0,57 0,53 0,54 0,18 0,23 0,21 0,21 0,18 0,21 0,20-0,22-0,11-0,21 0,00 0,04 0,02-0,03 POC_OST 0,22-0,01 1,00-0,28 0,65-0,21-0,18-0,27-0,23-0,27-0,28 0,45-0,23-0,19-0,28-0,23-0,25-0,03-0,05-0,03 0,27 0,17-0,32-0,20 PL_OST -0,47 0,56-0,28 1,00 0,43 0,97 0,93 0,95 0,98 0,99 0,25 0,05 0,37 0,39 0,28 0,36 0,34-0,44-0,35-0,44 0,00 0,12 0,05-0,08 PR_OST -0,14 0,47 0,65 0,43 1,00 0,48 0,47 0,42 0,47 0,44-0,01 0,50 0,08 0,12 0,00 0,07 0,05-0,35-0,31-0,35 0,23 0,16-0,24-0,15 OBV_O -0,50 0,54-0,21 0,97 0,48 1,00 0,98 0,91 1,00 0,98 0,18 0,05 0,31 0,34 0,20 0,29 0,27-0,52-0,40-0,52 0,21 0,20-0,16-0,16 MAX_O -0,54 0,47-0,18 0,93 0,47 0,98 1,00 0,82 0,97 0,94 0,09-0,01 0,23 0,28 0,09 0,21 0,18-0,58-0,48-0,59 0,31 0,32-0,25-0,28 MIN_O -0,33 0,57-0,27 0,95 0,42 0,91 0,82 1,00 0,93 0,96 0,33 0,12 0,44 0,43 0,42 0,44 0,44-0,33-0,24-0,33-0,13-0,07 0,18 0,11 PRUM_O -0,48 0,53-0,23 0,98 0,47 1,00 0,97 0,93 1,00 0,99 0,20 0,04 0,33 0,35 0,23 0,32 0,30-0,50-0,40-0,51 0,14 0,17-0,08-0,13 F_PR_O -0,47 0,54-0,27 0,99 0,44 0,98 0,94 0,96 0,99 1,00 0,25 0,06 0,37 0,39 0,29 0,36 0,35-0,45-0,36-0,46 0,03 0,11 0,02-0,07 PL_KAN 0,07 0,18-0,28 0,25-0,01 0,18 0,09 0,33 0,20 0,25 1,00 0,64 0,95 0,91 0,94 0,95 0,96 0,63 0,70 0,63-0,34-0,32 0,35 0,33 PR_KAN 0,17 0,23 0,45 0,05 0,50 0,05-0,01 0,12 0,04 0,06 0,64 1,00 0,62 0,61 0,60 0,63 0,63 0,46 0,55 0,47-0,07-0,19 0,04 0,18 266

267 Korelační matice pro soubor kostí spálených při 800 C pokračování Proměnná VEK TL_KOM POC_OST PL_OST PR_OST OBV_O MAX_O MIN_O PRUM_O F_PR_O PL_KAN PR_KAN OBV_K MAX_K MIN_K PRUM_K F_PR_K OK_OO PK_PO PRK_PRO C_OST C_KAN SFAC_OST SFAC_KAN OBV_K -0,02 0,21-0,23 0,37 0,08 0,31 0,23 0,44 0,33 0,37 0,95 0,62 1,00 0,99 0,93 1,00 0,99 0,59 0,61 0,58-0,30-0,21 0,31 0,23 MAX_K -0,06 0,21-0,19 0,39 0,12 0,34 0,28 0,43 0,35 0,39 0,91 0,61 0,99 1,00 0,86 0,98 0,95 0,54 0,56 0,53-0,22-0,07 0,23 0,08 MIN_K 0,08 0,18-0,28 0,28 0,00 0,20 0,09 0,42 0,23 0,29 0,94 0,60 0,93 0,86 1,00 0,95 0,97 0,63 0,67 0,63-0,44-0,52 0,45 0,54 PRUM_K 0,00 0,21-0,23 0,36 0,07 0,29 0,21 0,44 0,32 0,36 0,95 0,63 1,00 0,98 0,95 1,00 0,99 0,60 0,63 0,59-0,32-0,26 0,33 0,28 F_PR_K 0,02 0,20-0,25 0,34 0,05 0,27 0,18 0,44 0,30 0,35 0,96 0,63 0,99 0,95 0,97 0,99 1,00 0,61 0,65 0,61-0,36-0,34 0,37 0,36 OK_OO 0,40-0,22-0,03-0,44-0,35-0,52-0,58-0,33-0,50-0,45 0,63 0,46 0,59 0,54 0,63 0,60 0,61 1,00 0,95 1,00-0,42-0,36 0,39 0,34 PK_PO 0,38-0,11-0,05-0,35-0,31-0,40-0,48-0,24-0,40-0,36 0,70 0,55 0,61 0,56 0,67 0,63 0,65 0,95 1,00 0,96-0,30-0,39 0,28 0,37 PRK_PRO 0,40-0,21-0,03-0,44-0,35-0,52-0,59-0,33-0,51-0,46 0,63 0,47 0,58 0,53 0,63 0,59 0,61 1,00 0,96 1,00-0,39-0,38 0,35 0,36 C_OST -0,19 0,00 0,27 0,00 0,23 0,21 0,31-0,13 0,14 0,03-0,34-0,07-0,30-0,22-0,44-0,32-0,36-0,42-0,30-0,39 1,00 0,54-0,99-0,50 C_KAN -0,28 0,04 0,17 0,12 0,16 0,20 0,32-0,07 0,17 0,11-0,32-0,19-0,21-0,07-0,52-0,26-0,34-0,36-0,39-0,38 0,54 1,00-0,55-0,98 SFAC_OST 0,18 0,02-0,32 0,05-0,24-0,16-0,25 0,18-0,08 0,02 0,35 0,04 0,31 0,23 0,45 0,33 0,37 0,39 0,28 0,35-0,99-0,55 1,00 0,51 SFAC_KAN 0,24-0,03-0,20-0,08-0,15-0,16-0,28 0,11-0,13-0,07 0,33 0,18 0,23 0,08 0,54 0,28 0,36 0,34 0,37 0,36-0,50-0,98 0,51 1,00 267

268 Příloha 4: Změny proměnných s rostoucím věkem u mužů a žen u nespálených kostí. SEX 0 = ženy, SEX 1 = muži. Uvádíme pouze ty proměnné, jejichž Pearsonův korelační koeficient s dožitým věkem byl statisticky významný. Čárkované linie vyznačují 95% interval spolehlivosti pro průměr. Uvedeny jsou také rovnice odhadu dožitého věku na základě jednoduché lineární regrese pro danou proměnnou. TL_KOM Categ. Scatterplot: SEX VEK SEX VEK :0 :1 vs.vek = 89,0706-0,0456*x = 86,9101-0,0574*x VEK SEX SEX :0 :1 TL_KOM 95% confidence Tloušťka kompakty. Categ. Scatterplot: SEX VEK SEX VEK :0 :1 POC_OST vs.vek = 40,8851+2,0666*x = 15,7634+2,7047*x VEK SEX SEX :0 :1 POC_OST 95% confidence Počet osteonů na mm². 268

269 Categ. Scatterplot: PL_OST vs.vek SEX : 0 VEK = 96,0602-0,0011*x SEX : 1 VEK = 105,1167-0,0017*x VEK SEX SEX :0 :1 PL_OST 95% confidence Plocha osteonu. Categ. Scatterplot: PR_OST vs.vek SEX : 0 VEK = 62,763+0,1929*x SEX : 1 VEK = 80,1933-0,6022*x VEK SEX SEX :0 :1 PR_OST 95% confidence Procentuální zastoupení osteonů na ploše řezu. 269

270 Categ. Scatterplot: SEX :0 SEX :1 OBV_O vs.vek VEK = 130,4875-0,0992*x VEK = 150,2001-0,1417*x VEK SEX SEX :0 :1 OBV_O 95% confidence Obvod osteonu. Categ. Scatterplot: SEX :0 SEX :1 MAX_O vs.vek VEK = 143,7951-0,3437*x VEK = 146,0463-0,3848*x VEK SEX SEX :0 :1 MAX_O 95% confidence Maximální osa osteonu. 270

271 MIN_O Categ. Scatterplot: SEX :0 SEX :1 VEK vs.vek = 95,7842-0,1775*x VEK = 146,2347-0,568*x VEK SEX SEX :0 :1 MIN_O 95% confidence Minimální osa osteonu. Categ. Scatterplot: SEX VEK SEX VEK :0 :1 PRUM_O vs.vek = 128,1201-0,3216*x = 151,7383-0,4869*x VEK SEX SEX :0 :1 PRUM_O 95% confidence Průměr osteonu. 271

272 Categ. Scatterplot: SEX :0 SEX :1 VEK F_PR_O vs.vek = 119,7301-0,2971*x VEK = 154,2115-0,5398*x VEK SEX SEX :0 :1 F_PR_O 95% confidence Feret průměr osteonu. Categ. Scatterplot: OBV_K vs.vek SEX : 0 VEK = 70,0653-0,0041*x SEX : 1 VEK = 127,2389-0,4388*x VEK SEX SEX :0 :1 OBV_K 95% confidence Obvod Haversova kanálku. 272

273 Categ. Scatterplot: SEX MAX_K vs.vek VEK :0 = 73,5356-0,0704*x : 1 VEK = 120,3753-1,1109*x SEX VEK SEX SEX :0 :1 MAX_K 95% confidence Maximální osa Haversova kanálku. Categ. Scatterplot: MIN_K vs.vek SEX : 0 VEK = 62,4353+0,1715*x SEX : 1 VEK = 132,4899-1,9716*x VEK SEX SEX :0 :1 MIN_K 95% confidence Minimální osa Haversova kanálku. 273

274 Categ. Scatterplot: SEX PRUM_K vs.vek VEK :0 = 68,2586+0,0227*x : 1 VEK = 130,2489-1,5322*x SEX VEK SEX SEX :0 :1 PRUM_K 95% confidence Průměr Haversova kanálku. Categ. Scatterplot: SEX F_PR_K vs.vek VEK :0 = 68,7041+0,0145*x : 1 VEK = 130,1002-1,6203*x SEX VEK SEX SEX :0 :1 F_PR_K 95% confidence Feret průměr Haversova kanálku. 274

275 Categ. Scatterplot: OK_OO vs.vek SEX : 0 VEK = 44, ,0153*x SEX : 1 VEK = -6, ,9306*x VEK ,16 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 0,40 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 0,40 0,18 0,22 0,26 0,30 0,34 0,38 0,42 0,18 0,22 0,26 0,30 0,34 0,38 0,42 SEX SEX :0 :1 OK_OO 95% confidence Obvod Haversova kanálku / obvod osteonu. Categ. Scatterplot: SEX PRK_PRO vs.vek VEK :0 = 43,633+91,8577*x : 1 VEK = -2, ,406*x SEX VEK ,18 0,22 0,26 0,30 0,34 0,38 0,42 0,18 0,22 0,26 0,30 0,34 0,38 0,42 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 0,40 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 0,40 SEX SEX :0 :1 PRK_PRO 95% confidence Průměr Haversova kanálku / průměr osteonu. 275

276 Categ. Scatterplot: C_OST vs.vek SEX : 0 VEK = 161,0225-5,4434*x SEX : 1 VEK = 261, ,2194*x VEK ,0 15,5 16,0 16,5 17,0 17,5 18,0 18,5 19,0 15,0 19,5 15,5 16,0 16,5 SEX 17,0 17,5 18,0 18,5 19,0 19,5 SEX :0 :1 C_OST 95% confidence Compactness osteonu. Categ. Scatterplot: SEX :0 SEX :1 SFAC_OST vs.vek VEK = -30, ,4608*x VEK = -190, ,0636*x VEK ,66 0,68 0,70 0,72 0,74 0,76 0,78 0,80 0,82 0,84 0,66 0,68 0,70 SEX 0,72 0,74 0,76 0,78 0,80 0,82 0,84 SEX :0 :1 SFAC_OST 95% confidence Shape factor osteonu. 276

277 Categ. Scatterplot: PR_L_VN vs.vek SEX : 0 VEK = 78,328-2,0549*x SEX : 1 VEK = 60,3951-1,3048*x VEK SEX SEX :0 :1 PR_L_VN 95% confidence Procentuální zastoupení vnějších obvodových lamel na ploše řezu. 277

278 Příloha 5: Grafické znázornění teplotních změn jednotlivých proměnných. Sex 0 = ženy, 1 = muži. Teplota 0 = nespálené kosti, 1 = 700 C, 2 = 800 C. Box & Whisker Plot: TL_KOM TL_KOM SEX 1 2 Mean ±SD ±1,96*SD 2 Mean ±SD ±1,96*SD SEX :0 :1 TEPL Tloušťka kompakty. Box & Whisker Plot: POC_OST POC_OST SEX 1 SEX :0 :1 TEPL Počet osteonů na mm². 278

279 Box & Whisker Plot: PL_OST PL_OST SEX 2 Mean ±SD ±1,96*SD 2 Mean ±SD ±1,96*SD SEX :0 :1 TEPL Plocha osteonu. Box & Whisker Plot: PR_OST PR_OST SEX 1 SEX :0 :1 TEPL Procentuální zastoupení osteonů na ploše řezu. 279

280 Box & Whisker Plot: OBV_O OBV_O SEX 1 2 Mean ±SD ±1,96*SD 2 Mean ±SD ±1,96*SD SEX :0 :1 TEPL Obvod osteonu. Box & Whisker Plot: MAX_O MAX_O SEX 1 SEX :0 :1 TEPL Maximální osa osteonu. 280

281 Box & Whisker Plot: MIN_O MIN_O SEX 1 2 Mean ±SD ±1,96*SD 2 Mean ±SD ±1,96*SD SEX :0 :1 TEPL Minimální osa osteonu. Box & Whisker Plot: PRUM_O PRUM_O SEX 1 SEX :0 :1 TEPL Průměr osteonu. 281

282 Box & Whisker Plot: F_PR_O F_PR_O SEX 2 Mean ±SD ±1,96*SD 2 Mean ±SD ±1,96*SD 1 SEX :0 :1 TEPL Feret průměr osteonu. Box & Whisker Plot: PL_KAN PL_KAN SEX 1 SEX :0 :1 TEPL Plocha Haversova kanálku. 282

283 Box & Whisker Plot: PR_KAN PR_KAN SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Procentuální zastoupení Haversových kanálků na ploše řezu. Box & Whisker Plot: OBV_K OBV_K SEX 1 SEX :0 :1 2 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Obvod Haversova kanálku. 283

284 Box & Whisker Plot: MAX_K MAX_K SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Maximální osa Haversova kanálku. Box & Whisker Plot: MIN_K MIN_K SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Minimální osa Haversova kanálku. 284

285 Box & Whisker Plot: PRUM_K PRUM_K SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Průměr Haversova kanálku Box & Whisker Plot: F_PR_K F_PR_K SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Feret průměr Haversova kanálku. 285

286 Box & Whisker Plot: OK_OO 0,42 0,40 0,38 0,36 0,34 0,32 0,30 OK_OO 0,28 0,26 0,24 0,22 0,20 0,18 0,16 0,14 0, SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Obvod Haversova kanálku / obvod osteonu. Box & Whisker Plot: PK_PO 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 PK_PO 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00-0, SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Plocha Haversova kanálku / plocha osteonu. 286

287 Box & Whisker Plot: PRK_PRO 0,42 0,40 0,38 0,36 0,34 0,32 0,30 PRK_PRO 0,28 0,26 0,24 0,22 0,20 0,18 0,16 0,14 0, SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Průměr Haversova kanálku / průměr osteonu. Box & Whisker Plot: C_OST C_OST SEX 1 SEX :0 :1 2 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Compactness osteonu. 287

288 Box & Whisker Plot: C_KAN C_KAN SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Compactness Haversova kanálku. Box & Whisker Plot: SFAC_OST 0,84 0,82 0,80 0,78 0,76 SFAC_OST 0,74 0,72 0,70 0,68 0,66 0,64 0, SEX 1 SEX :0 :1 2 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Shape factor osteonu. 288

289 Box & Whisker Plot: SFAC_KAN 0,90 0,88 0,86 0,84 0,82 SFAC_KAN 0,80 0,78 0,76 0,74 0,72 0,70 0, SEX 1 2 SEX :0 :1 Mean ±SD ±1,96*SD TEPL Shape factor Haversova kanálku. 289

290 Příloha 6: Ověření normálního rozložení diferencí mezi skutečným a odhadnutým věkem (histogram a Shapiro-Wilkův W test pro rozdíly mezi skutečným a odhadnutým věkem). Histogram: ROZDÍL Shapiro-Wilk W = 0,99, p = 0,9818 Expected Normal X <= Hranice kategorie Nespálené kosti, obě pohlaví dohromady Histogram: ROZDÍL Shapiro-Wilk W = 0,96, p = 0,7744 Expected Normal X <= Hranice kategorie Nespálené kosti, muži 290

291 Histogram: ROZDÍL Shapiro-Wilk W = 0,95, p = 0,4291 Expected Normal X <= Hranice kategorie Spálené při 700 C, obě pohlaví dohromady Histogram: ROZDÍL Shapiro-Wilk W = 0,96, p = 0,8029 Expected Normal X <= Hranice kategorie Spálené při 700 C, muži 291

292 Histogram: ROZDÍL Shapiro-Wilk W = 0,96, p = 0,5433 Expected Normal X <= Hranice kategorie Spálené při 800 C, obě pohlaví dohromady Histogram: ROZDÍL Shapiro-Wilk W = 0,91, p = 0,2664 Expected Normal X <= Hranice kategorie Spálené při 800 C, muži 292

293 Příloha 7: Postupné změny vyvolané v kompaktní kosti zvyšující se teplotou spalování. Neobarvené, neodvápněné broušené příčné řezy, zvětšení 100. Muž, 20 let, příčina smrti: podezření na otravu neznámou látkou. Nespálená kost. Kost spálená při 600 C. 293

294 Kost spálená při 700 C. Kost spálená při 800 C. 294

295 Kost spálená při 1000 C. 295