OBSAH 1. ÚVOD SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL...

Transkript

1 OBSAH 1. ÚVOD SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL FÁZOVÉ SEPARACE Klasické separační techniky Extrakce do dvoufázových vodných systémů MEMBRÁNOVÉ PROCESY CHROMATOGRAFICKÉ METODY Teorie chromatografie Plynová chromatografie Kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová kolonová chromatografie Instrumentace sloupcových chromatografických metod Detekce separovaných látek Aplikace HPLC Iontová chromatografie Gelová permeační chromatografie Chromatografie na měničích iontů Chromatofokusace Chromatografie s reversní fází METODY ZALOŽENÉ NA MOLEKULOVÉM ROZPOZNÁVÁNÍ Bioafinitní chromatografie Nespecifická afinitní chromatografie Další separační techniky založené na molekulovém rozpoznávání ELEKTROMIGRAČNÍ (ELEKTROFORETICKÉ) METODY Volná elektroforéza Zonová elektroforéza Izoelektrická fokusace (IEF) Afinitní elektroforéza Dvojrozměrná elektroforéza Izolace separovaných látek z gelové matrice Vizualizace separovaných látek Imunoelektroforéza Kapilární elektroforéza Způsoby provedení kapilární elektroforézy Aplikace elektroforézy v biochemii, biotechnologii a dalších oblastech Analytické aplikace elektroforetických metod IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL ÚVOD ZÁKLADNÍ IZOLAČNÍ KROKY HOMOGENIZACE A SOLUBILIZACE MATERIÁLU SEPARACE BUNĚK Z KULTIVAČNÍHO MEDIA DEZINTEGRACE BUNĚK Fyzikální způsoby dezintegrace Chemické způsoby dezintegrace Enzymové způsoby dezintegrace KONCENTRACE A OBOHACOVÁNÍ ROZTOKŮ ZAJIŠTĚNÍ STERILITY SUROVÝCH PREPARÁTŮ

2 3.8 PURIFIKACE BIOMAKROMOLEKUL Strategie a taktika purifikace Odsolování Požadavky na čistotu preparátů Hodnocení účinnosti purifikace KONCENTRACE IZOLOVANÝCH PREPARÁTŮ A JEJICH KONEČNÁ ÚPRAVA KRITERIA ČISTOTY PREPARÁTŮ

3 1. ÚVOD Izolace chemických individuí ze směsi látek různého původu je jedním ze základních úkolů chemie. V přírodě, ale i po syntézách a chemických reakcích, se látky většinou vyskytují ve směsích. Pro studium vlastností je však třeba získat látky v čisté formě. Proto se chemik a biochemik velmi často setkává s nutností vyizolovat čistou látku ze složité směsi ev. rozdělit směs na jednotlivé složky. K tomu slouží různé separační techniky a izolační metody. Některé separační metody jsou známy již velmi dlouho. Je to např. sedimentace, čeření, extrakce, filtrace a krystalizace. Tyto klasické metody však zřídka postačí k dělení složitých směsí, v nichž se často vyskytují látky velmi podobných vlastností. Byly proto hledány nové směry v rozvíjení separačních metod, které se zaměřily zejména na - různé adsorpční vlastnosti produktů - nestejnou rozpustnost složek směsi ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách - rozdíly v rozpustnosti plynů v kapalině - rozdílnou iontovou pohyblivost - rozdílný elektrický náboj Vývoj biochemických separačních technik v posledních patnácti až dvaceti letech byl velmi rychlý. Nejvýraznější krok vpřed byl zaznamenán využitím přirozené biologické aktivity mezi biomakromolekulami a jejich komplementárními ligandy, jako jsou substráty, imuno-ligandy, hormony, nukleové kyseliny apod. Vysoce selektivní separační techniky umožnily nejen dosáhnout rychlejší a jednodušší purifikace, ale i zvolit takovou separační metodu, aby bylo dosaženo i dalších cílů. K takovým cílům může patřit snížení nákladnosti dělení, zvýšení výtěžnosti, snížená tvorba artefaktů jako jsou oligomery, agregáty s jinými bílkovinami a bílkoviny, které pozbyly terciární struktury. Jiný takový cíl může být získání látky dostatečně koncentrované a v roztoku takového složení, aby se dalo použít mrazové sublimace. Techniky separace makromolekul biologického původu se velmi liší od technik dělení nízkomolekulárních látek. Důvodů je několik: *Makromolekuly mají malou schopnost difuze, neodpařují se, ani snadno nekrystalují. Jejich dělení je proto obtížnější než dělení nízkomolekulárních látek. 5

4 *Použití adsorpčních materiálů pro jejich rozdělení je méně účinné, protože mají na svém povrchu mnoho vazebných míst. Jsou tedy obvykle adsorbovány velmi pevně a nepříliš specificky. Adsorpce bývá velmi často ireverzibilní, kromě velmi slabých adsorbentů. *Rozdělování mezi dvě fáze, vzhledem ke značné velikosti molekul a následkem toho k velkému počtu exponovaných skupin, bývá značně jednostranné, pokud obě fáze nemají velmi podobné fyzikálně-chemické vlastnosti. *U makromolekulárních látek s biologickou aktivitou je třeba počítat s jejich nestálostí, proto jsou předem vyloučeny metody, při nichž jsou látky vystaveny vysokým teplotám, organickým rozpouštědlům nebo silně lipofilním a silně adsorbujícím materiálům, které by mohly porušit terciární nebo kvarterní strukturu biomakromolekul. Metody, používané pro separaci biomakromolekul, můžeme rozdělit do dvou základních skupin. Jsou to: a) klasické metody, které většinou závisejí na fázové separaci b) moderní metody, ve většině případů využívající rozdílných rychlostí migrace látek v prostředí Intenzivní výzkum v oblasti přírodních látek, zejména v biochemických aplikacích, vyžaduje nejen dokonalou separaci, ale i identifikaci a stanovení jednotlivých optických izomerů. Ukazuje se totiž, že biologická aktivita, toxicita nebo např. terapeutické účinky jednotlivých optických izomerů se značně liší a jejich aplikace je proto závislá na možnosti jejich separace. V současné době máme k dispozici řadu účinných metod, které značně usnadňují přístup k purifikaci biomakromolekul. To ovšem neznamená, že metody, které můžeme označit jako klasické, jsou zastaralé a málo používané. Řada těchto metod je dosud velice často používaná, a to buď v kombinaci s moderními metodami, nebo jako levné a účinné metody při provozních izolacích, resp. při přípravě technických preparátů. Vlastní separační techniky ovšem nejsou jedinými metodami, se kterými se setkáme při izolaci biologicky aktivních látek z přírodního materiálu. Většina biomakromolekul jsou intracelulární látky, které je při izolaci nutno uvolnit z buňky. V tom případě je nezbytné zvětšit propustnost buněčné stěny, nebo membránu zcela rozbít, vyextrahovat buněčný obsah a oddělit extrakt od buněčných zbytků. Pokud jsou biomolekuly produkovány buňkami do mezibuněčných prostor, ev. v případě mikrobiálních buněk do kultivačního media, dezintegrace buněčné membrány sice odpadá, ale izolované látky zase je potřeba 6

5 zkoncentrovat. Po provedené separaci a purifikaci je obvykle nutno získaný preparát převést do vhodné formy a charakterizovat ho. Izolační a separační techniky se velice rychle vyvíjejí, objevují se stále nové účinnější metody, nebo metody, které při separaci využívají zcela nových principů. Proto předkládané skriptum nemůže zahrnovat všechny historické i dosud používané metody a zaměřuje se pouze na ty, které se v současné době používají nejčastěji. Ani ty však nemohou být probrány do všech podrobností. Doporučujeme všem, kteří se v budoucnu budou izolacemi zabývat, aby pro každou techniku vyhledali příslušnou literaturu. Mohou se setkat i s metodami, které v současné době ještě nejsou známy nebo nejsou dostatečně prostudovány. Toto skriptum slouží jako jakýsi úvod do separačních a izolačních technik a má být i určitým strategickým návodem, jak k izolacím přistupovat. 7

6 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL 2.1 Fázové separace Klasické separační techniky Klasické separační techniky jsou metody, které již po dlouhou dobu účinně pomáhají při dělení směsí biomakromolekul, zejména bílkovinných směsí a nukleových kyselin, a svůj význam mají dodnes. Při provozních purifikacích a při přípravě technických preparátů enzymů a bílkovin obecně se často používají jako jediné izolační metody. Při přípravě vysoce purifikovaných preparátů se obvykle uplatní v počátcích purifikace. Směsi biomakromolekul jsou vždy separovány postupně. V jednotlivých krocích se využívá různých fyzikálně-chemických vlastností separovaných molekul s cílem odstranit v průběhu izolace vybrané biomakromolekuly co nejvíce kontaminujících sloučenin, aby byla izolovaná látka získána v co nejčistším stavu. Charakteristickými vlastnostmi, které se využívají při izolaci biologicky aktivních látek, jsou rozpustnost, disociace, molekulová hmotnost, adsorpční vlastnosti a vazebná afinita k jiným biomolekulám. Frakcionace biomakromolekul na základě rozdílů v rozpustnosti Známe čtyři hlavní faktory, které ovlivňují rozpustnost proteinů, ale i dalších biomolekul, a které proto mohou být použity pro frakcionaci. Je to obsah solí, obsah organických rozpouštědel, vliv ph a vliv teploty. Závislost rozpustnosti bílkovin na těchto faktorech je způsobena přítomností četných acidobazických skupin v molekule proteinu. Obsah solí. Rozpustnost všech bílkovin, ale i dalších biomolekul ve vodných roztocích je závislá na koncentraci rozpuštěných solí, která se vyjadřuje jako iontová síla I: I = 0,5Σ c i z i 2 (1) 8

7 c i = látková koncentrace iontu i z i = náboj iontu i Při nízkých koncentracích elektrolytu se zvyšováním koncentrace solí roste i rozpustnost bílkoviny až do určitého maxima. Po jeho překročení s rostoucí koncentrací solí rozpustnost bílkoviny klesá. Vzestup rozpustnosti bílkoviny při zvyšování koncentrace soli v oblasti nízkých koncentrací se nazývá vsolování. Různé bílkoviny se navzájem liší odezvou na přídavek soli. Vsolování se velice často používá pro frakcionaci globulinů, které jsou ve vodě prakticky nerozpustné a mohou tudíž být frakcionovaně rozpuštěny zvyšováním iontové síly roztoku. Snižování rozpustnosti většiny bílkovin při vysoké koncentraci solí v roztoku se běžně používá pro tzv. vysolování. Hlavní efekt při vysolování má anion přidané soli, přičemž bylo zjištěno, že polyvalentní anionty (fosforečnany, sírany) prokazují vyšší vysolovací účinek než monovalentní anionty (např. chloridy) (obr.2.1). Frakcionace síranem amonným je jednou z nejběžněji užívaných procedur v prvních fázích izolace, zejména pracujeme-li s velkými objemy. Sůl se přidává buď jako nasycený roztok nebo jako pevná látka. Přídavek soli v pevné fázi je výhodnější, neboť nedochází k výrazným objemovým změnám. Frakcionace se pak provádí za účinného míchání a přednostně v chlazených prostorách. Precipitovaná bílkovina se odstraňuje vždy při dosažení určitého stupně koncentrace dané soli, přičemž je zvykem vyjadřovat koncentraci soli jako procenta nasycení. Precipitované bílkovinné frakce jsou pak znovu rozpuštěny a musí být obvykle pro další purifikační procesy zbaveny solí (dialýza, ultrafiltrace apod.). V jednotlivých frakcích se pak zjišťuje přítomnost požadované bílkoviny či aktivita žádaného enzymu a frakce, které tuto aktivitu či bílkovinu obsahují, se spojí. Při experimentálním vsolování i vysolování je třeba věnovat péči tomu, aby sůl byla přidávána zvolna, neboť lokální nadměrné zvýšení koncentrace soli by mohlo vyvolat nežádoucí nevratnou precipitaci. Dále je třeba ponechat dostatek času k tomu, aby došlo k úplné precipitaci. Obvykle postačuje min. za míchání, lepší však je ponechat precipitaci vyvíjet přes noc při teplotě 4 o C. Vysolování jistě nelze považovat za metodu, při níž by došlo k ostrému rozdělení separovaných biomolekul, nicméně je vhodná, jak již bylo řečeno, při práci s velkými objemy roztoků a její výhodou je, že většinou nemá nepříznivý vliv na biologickou aktivitu izolovaných biomolekul. 9

8 Přítomnost organických rozpouštědel. Proteiny i nukleové kyseliny mohou být separovány frakcionací s nepolárními vodou mísitelnými rozpouštědly jako je methanol, propanol a ethanol, používá se však i aceton a diethylether. Principem frakcionace je to, že změny dielektrické konstanty, způsobené organickým rozpouštědlem, mají různý efekt na rozpustnost různých biomakromolekul. Vzhledem k tomu, že bílkoviny mají v přítomnosti organických rozpouštědel tendenci denaturovat, je třeba omezit možnost denaturace na minimum prací při teplotách pod nulou (-5 o C). To je možné, protože přítomnost organického rozpouštědla snižuje bod tuhnutí roztoků. Při izolaci nukleových kyselin je nebezpečí denaturace organickými rozpouštědly minimální. Při precipitaci bílkovin organickými rozpouštědly je třeba počítat i s tím, že přítomnost solí ve vodném roztoku organického rozpouštědla zvyšuje rozpustnost bílkovin. Precipitace bílkovin a nukleových kyselin organickými rozpouštědly se obvykle provádí v rozmezí koncentrace rozpouštědla 0-80 %, po oddělení precipitátu je však nutno odstranit zbytky rozpouštědla, a to buď vakuovým sušením nebo dialýzou. Protože při mísení organického rozpouštědla s vodou není konečný objem aditivní, je třeba po odstranění precipitátu vždy změřit objem zbývající frakce. Obr.2.1 Rozpustnost hemoglobinu v roztocích různých solí při proměnné iontové síle. Vzestupná část křivek odpovídá oblasti vsolování, sestupná vysolování Metoda frakcionace s organickými rozpouštědly byla úspěšně použita např. při frakcionaci enzymů ze svalů, při izolaci α-amylasy ze slin a při frakcionaci bílkovin krevního sera. 10

9 Vliv ph. Rozpustnost bílkovin značně závisí na ph media; nejnižší je v izoelektrickém bodě. V některých případech dojde v izoelektrickém bodě ke spontánní precipitaci bílkoviny (např. kasein), častěji však je nutné po úpravě ph do izoelektrického bodu změnit ještě další faktor, např. koncentraci solí, teplotu, přidat organické rozpouštědlo apod., aby došlo k selektivnímu srážení bílkoviny. Malá změna ph může často mnohonásobně změnit poměr rozpustnosti přítomných bílkovin např. při vysolování (viz obr.2.2). Je třeba počítat i s tím, že některé bílkoviny jsou v izoelektrickém bodě nevratně denaturovány. Toho je možno využít při odstraňování nežádoucích bílkovin. Skutečnost, že bílkoviny se liší navzájem svými izoelektrickými body, se využívá při tzv. izoelektrickém srážení. Při něm se ph roztoku upraví na hodnotu izoelektrického bodu té bílkoviny, kterou chceme z roztoku izolovat. Její rozpustnost se tím podstatně sníží a její precipitace pak už není nesnadná. Postupnou úpravou ph se mohou z roztoku postupně vyloučit bílkoviny podle svých izoelektrických bodů. Vliv teploty. Jako pro většinu látek i pro biomakromolekuly platí, že jejich rozpustnost závisí na teplotě. Je proto třeba počítat s tím, že pro zajištění reprodukovatelnosti frakcionace je třeba dodržovat určitý teplotní režim. Metody frakcionace založené na rozdílné stabilitě biomakromolekul Při frakcionaci biomakromolekul se dá využít i jejich rozdílné stability v určitém prostředí. Nejvýznamnějšími faktory, které ovlivňují stabilitu jsou teplota, ph a přítomnost iontů. Bílkoviny se navzájem značně liší tepelnou stabilitou. Zatímco některé bílkoviny denaturují již při teplotách okolo 25 o C, jiné snesou i var, aniž by došlo k jejich inaktivaci. Při purifikaci tepelně stabilní bílkoviny může být této vlastnosti využito k tepelné denaturaci kontaminujících proteinů. Nejčastěji se tepelná denaturace provádí v rozmezí o C, někdy i za vyšších teplot. Vždy se však doporučuje pracovat za přítomnosti stabilizátoru izolované bílkoviny. Koagulované kontaminující bílkoviny je nutné co nejdříve odstranit, neboť je nebezpečí - i když málo pravděpodobné - jejich renaturace. Příkladem využití 11

10 denaturace pro odstranění kontaminantů může být purifikace α-amylasy z rostlinných a mikrobiálních zdrojů, kdy při teplotě o C za přítomnosti Ca 2+ jsou inaktivovány β- amylasa a proteasy, zatímco aktivita α-amylasy zůstane nedotčena. Obdobně alkoholdehydrogenasu z kvasinek je možno částečně purifikovat zahřátím na 55 o C, mikrobiální glukosaisomerasu zahřátím na 60 o C a ribonukleasa dokonce snese bez inaktivace teplotu 90 o C. Obr.2.2 Rozpustnost β-laktglobulinu jako funkce ph při různých koncentracích NaCl Je třeba si uvědomit, že při tepelné denaturaci kontaminujících biomakromolekul nelze laboratorně získané výsledky převádět beze zbytku do většího měřítka. Jestliže budeme ve vodní lázni např. 70 o C teplé zahřívat 5 ml vzorku, požadované teploty bude dosaženo 12

11 rychle; 2 l vzorku se budou zahřívat pomaleji a požadované teploty nemusí být dosaženo ani při skončení zahřívání. Druhým typem diferencované inaktivace bílkovin je využití extrémního ph. Základním předpokladem i v tomto případě zůstává odolnost požadované bílkoviny vůči použitému ph, takže opět dojde k vysrážení méně stabilních kontaminujících biomakromolekul. Ani v těchto případech nelze vyloučit renaturaci. Jako příklad lze i zde uvést izolaci ribonukleasy, kterou je možno extrahovat z pankreatu kyselinou sírovou v koncentraci 0,1 mol/l, aniž dojde k její inaktivaci. Při izolaci bílkovin nebo nukleových kyselin z přírodního materiálu se velice často setkáme s nutností odstranit nežádoucí bílkoviny z roztoku nukleových kyselin nebo naopak nežádoucí nukleové kyseliny z roztoku bílkovin. I při tom se využívá rozdílné stability jednotlivých biomakromolekul. Nukleové kyseliny se obvykle odstraňují z roztoku bílkovin vysrážením s kationaktivními detergenty. V posledních letech se též nukleové kyseliny odstraňují působením nukleas, což je metoda levná, efektivní a nenese sebou nebezpečí koprecipitace přítomných bílkovin. Bílkoviny se z roztoku nukleových kyselin odstraňují srážením fenolem nebo směsí trichlormethanu a isopentylalkoholu, dále srážením s guanidiniumchloridem nebo vysokou koncentrací solí. Bílkoviny je též možno rozložit peptidhydrolasami. Purifikace biomakromolekul interakcí se specifickými srážedly Metody, které využívají interakce iontů těžkých kovů se specifickými skupinami bílkovinné molekuly, se používají v chemii bílkovin již dlouhou dobu. Např. je známo, že rtuťnaté ionty reagují specificky s merkapto skupinami, zinečnaté s imidazolem. Ionty železa, vápníku a barya jsou příkladem dalších ke srážení běžně používaných iontů kovů. Výsledkem interakcí proteinu s iontem kovu je změna v rozpustnosti bílkoviny a tu je pak možno využít při frakcionaci bílkoviny, zejména ve spojení s dalšími faktory jako je iontová síla, ph, organické rozpouštědlo. Tyto metody mají naději na úspěch zejména tehdy, pracuje-li se při ph vyšším než je izoelektrický bod požadované bílkoviny. Přesto je třeba pamatovat na to, že ionty těžkých kovů jsou enzymovými inhibitory, a je tedy nutno se vyvarovat práce s přebytkem těchto iontů v roztoku a po oddělení bílkoviny je co nejdříve odstranit. 13

12 Při frakcionaci bílkovin se používají i další srážecí činidla, např. trichloroctová kyselina a sulfosalicylová kyselina. Ty reagují pouze s proteiny, které jsou ve formě kationtu (tj. při ph nižším než je izoelektrický bod). Některé konjugované proteiny, zejména glykoproteiny, se srážejí těmito činidly velice obtížně, čehož se dá při frakcionaci vhodně využít. Z dalších specifických srážedel jmenujme alespoň kyselinu tannovou, která se užívá při purifikaci glukosaoxidasy, dále nukleové kyseliny, které mohou tvořit nerozpustné komplexy zejména s bazickými proteiny a řada dalších. Precipitace bílkovin vysokomolekulárními polymery K frakcionaci bílkovin lze použít i vysokomolekulární ve vodě rozpustné polymery. Nejčastěji se používá polyethylenglykol o vyšší molekulové hmotnosti. Je netoxický, nehořlavý a nezpůsobuje denaturaci bílkovin, což ho předurčuje i k širokému průmyslovému využití. Precipitace nukleových kyselin kationaktivními sloučeninami Nukleové kyseliny mohou být frakcionovány ev. odstraněny ze směsi bílkovin srážením s různými kationaktivními sloučeninami, jako je cetyltrimethylamoniumbromid, síran streptomycinu, síran protaminu, polyethylenimin, polylysin nebo chlorid manganatý. Purifikace biomakromolekul pomocí adsorbentů Jednou z metod purifikace biomakromolekul je jejich adsorpce na povrch pevných látek, tj. diferencovaná schopnost biomakromolekul vázat se různě pevnými vazbami na povrch adsorbentu (tzv. afinita molekuly k adsorbentu). Nejčastěji používanými adsorbenty jsou oxid hlinitý (gel), fosforečnan vápenatý (gel), silikagel, aktivní uhlí apod. Adsorpční metoda se používala vsádkově již dávno před zavedením kolonových metod. Vsádková metoda má ovšem vedle výhod (jednoduchost provedení) i své nevýhody. 14

13 Hlavní nevýhodou je malá specifita většiny molekul k adsorbentu. Je proto třeba při izolaci určité biomolekuly přidat pouze takové množství adsorbentu, aby se navázala pouze biomolekula s největší afinitou (což by měla být požadovaná biomolekula) a ostatní látky zůstaly v roztoku. Naopak, má-li žádaná biomolekula nízkou afinitu k adsorbentu, přidá se adsorbentu takové množství, aby se adsorbovaly všechny sloučeniny až na požadovanou, která tudíž zůstane v roztoku. Mezi chováním biomakromolekul k jednotlivým adsorbentům jsou výrazné rozdíly a dosud se nepodařilo stanovit zásady, podle nichž se chování biomakromolekul vůči adsorbentu řídí. Výběr vhodného adsorbentu je proto vždy záležitostí empirickou. Afinita biomakromolekul k adsorbentu je ovlivňována různými faktory z prostředí, jako je ph, iontová síla a teplota. Obvykle není jednoduché předpovědět, v jakém směru se změna některého faktoru projeví. Např. zvýšení iontové síly v některých případech zvyšuje, v jiných snižuje schopnost biomakromolekuly vázat se na adsorbent. Eluce biomakromolekul z adsorbentu se nejčastěji uskutečňuje změnou ph nebo iontové síly, ev. specifickými adsorpčními činidly. Výraznou změnu v adsorpční technice znamenalo zavedení adsorpční chromatografie. Pro tuto techniku se nehodily dříve používané adsorpční materiály, které mají ve většině případu špatné průtokové vlastnosti a bylo proto nutno zavést jiné adsorpční materiály (Al 2 O 3, bauxit apod.). Princip adsorpční chromatografie je velmi jednoduchý: směs látek se aplikuje na vrchol kolony adsorbentu a jednotlivé látky jsou postupně vymývány elučními činidly podle jejich afinity k adsorbentu. Tato technika tvoří jakýsi spojovací článek mezi klasickými a moderními purifikačními metodami. Afinitní precipitace Afinitní precipitace, t.j. případ, kdy k dokonalé precipitaci biomakromolekul určitého typu přispívá vazba biomakromolekuly na afinitní ligand, bude popsána v kap Extrakce do dvoufázových vodných systémů Extrakce organickými rozpouštědly je dlouho známá a dobře propracovaná technika izolace molekul, hojně používaná v chemickém a farmaceutickém průmyslu. Většina 15

14 biomakromolekul je však v běžně používaných organických rozpouštědlech nerozpustná a často velice nestabilní, proto je nelze těmito činidly extrahovat. Dvoufázové systémy, které by bylo možno využít pro extrakci biomakromolekul, je však možno připravit i přídavkem dvou hydrofilních polymerů do vodného roztoku, nebo přídavkem jednoho polymeru do vodného roztoku vhodné soli. Při zachování vhodných koncentrací se vytvoří dvě nemísitelné fáze, v nichž voda bude podstatnou složkou, takže vzniklé prostředí bude příznivé pro biologicky aktivní makromolekuly nebo i buněčné organely. Nejčastěji používaným hydrofilním polymerem je polyethylenglykol o různé molekulové hmotnosti (asi od 1400 po 6000), druhým polymerem bývá dextran. Pokud druhý polymer nahradí soli, jsou to obvykle sodné nebo draselné fosforečnany, a to dihydrogenfosforečnan, hydrogenfosforečnan i fosforečnan. Fyzikálně-chemické vlastnosti vodných dvoufázových systémů vyjadřují fázové diagramy (viz obr.2.3). Jestliže se koncentrace jedné nebo obou složek přítomných ve vodném rozpouštědle budou pohybovat pod hranicí danou binodalou, vznikne homogenní roztok. Jestliže však koncentrace obou složek překročí tuto mezní hodnotu (danou binodálou), vytvoří se spontánně dvoufázový systém. Složení horní fáze bohaté polyethylenglykolem (bod T na diagramu) koresponduje se spodní fází určitého složení. Obr.2.3 Fázový diagram systému polyethylengkykol - K 2 HPO 4 při ph 7 a 20 o C Rovnovážná koncentrace polyethylenglykolu (PEG) a soli ve spodní fázi je dána bodem B diagramu. Každá dvojice komponent dvoufázového systému, která leží na spojnici T a B, dá identický fázový systém, který se bude lišit pouze poměrem objemů horní a dolní fáze. Jestliže se pro vytvoření dvoufázového systému použije PEG o vyšší molekulové hmotnosti, binodala se posune směrem k počátku. Obdobný efekt bude mít i zvýšení teploty. 16

15 Příklad: 10% PEG o molekulové hmotnosti 4000, 13% KH 2 PO 4 (ph7,7) a 77% vody vytvoří spontánně dvoufázový systém, jehož horní fáze obsahuje 24% PEG, 6% KH 2 PO 4 a 70% vody, dolní fáze 17% KH 2 PO 4, 1,3% PEG a 81% vody. Poměr objemu horní a dolní fáze je 0,8. dolní fázi. Rozdělovací koeficient K udává váhový poměr extrahovaného biopolymeru v horní a K = c h / c d (2) c h = koncentrace biopolymeru v horní fázi c d = koncentrace biopolymeru v dolní fázi Separace ve dvoufázovém systému je funkcí rozdělovacího koeficientu, ale též poměru objemů obou fází. Tuto skutečnost vyjadřuje tzv. separační faktor G. G = K (V h /V d ) (3) V = objem horní a dolní fáze Hodnota rozdělovacího koeficientu je výsledkem nejrůznějších nevazebných interakcí separovaných molekul s prostředím. Proto je možné jeho hodnotu do jisté míry ovlivňovat. Protože se při rozdělování mezi dvě fáze uplatní zejména hydrofobní interakce a vodíkové nebo iontové vazby, je hodnota rozdělovacího koeficientu silně závislá především na hydrofilicitě a na náboji separovaných systémů. Proto ho nejvíce ovlivní faktory, které rozhodují o těchto vlastnostech. Jsou to především: - typ použitého polymeru - molekulová hmotnost a distribuce polymeru - vzdálenost bodů T a B na fázovém diagramu, neboli koncentrace jednotlivých komponent dvoufázového systému - typ použité soli - ph - teplota 17

16 Prvé dva uvedené faktory ovlivňují hydrofilicitu systému, ostatní náboj a elektrostatický potenciál. Z výše uvedeného plyne, že látky, které obsahují jak polární tak nepolární skupiny, např. proteiny, se mohou podle podmínek extrahovat jak do horní PEG fáze, tak do výrazně hydrofilní dolní fáze, zatímco hydrofilní sloučeniny, např. nukleové kyseliny, přecházejí častěji do fáze dolní. Vhodné podmínky pro tvorbu příznivého rozdělovacího koeficientu pro každou separovanou sloučeninu se musí nalézt experimentálně. Obvykle se postupuje tak, že z výše uvedených faktorů se mění relativní molekulová hmotnost polymeru, typ soli, ph a koncentrace jednotlivých složek směsi. Pro hledání vhodných experimentálních podmínek však neexistuje žádný pevný vzor. Cílem extrakce biomolekul do dvoufázového systému je shromáždit každou ze separovaných látek pouze do jedné fáze (což prakticky nelze stoprocentně splnit) a separované látky od sebe oddělit tak, aby v jedné z fází byl pouze jediný typ biomolekul. To znamená, že separujeme-li dvě látky, snažíme se dostat každou do jiné fáze. Separujeme-li látek více, snažíme se ze směsi oddělit jednu do jedné z fází a v dalších krocích pak pokračujeme se separací fáze, ve které se shromáždilo více typů biomolekul. Rozdělovací koeficient lze velice výrazně ovlivnit připojením specifického ligandu na polymerní část dvoufázového systému. Molekuly, které mají afinitu k ligandu se pak hromadí ve fázi obsahující ligand. Použití specifického ligandu je podrobněji popsáno v kapitole Aplikace dvoufázových systémů při izolaci biomolekul z biomasy Dvoufázové systémy je možno použít při extrakci buněčného obsahu z dezintegrovaných buněk ev. k extrakci biomolekul z libovolné biomasy. Úkolem prvého kroku extrakce do dvoufázového systému je kvantitativní oddělení buněčných zbytků (ev. jiných nerozpustných zbytků) od požadované biomolekuly. Výsledek záleží jednak na 18

17 rozdělovacím koeficientu, jednak na poměru horní a dolní fáze. K oddělení buněčných zbytků od separované biomolekuly je třeba podmínky upravit tak, aby buněčné zbytky přešly kvantitativně do opačné fáze než biomolekuly. Při izolaci bílkovin se buněčné zbytky převedou do dolní solné fáze a bílkoviny do horní PEG fáze. V případě nukleových kyselin by tomu bylo naopak, ovšem převést buněčné zbytky do horní fáze je v případě provozního měřítka méně příznivé. Proto se v provozní praxi využívá těchto systémů zejména pro izolace bílkovin. K převedení buněčných zbytků do dolní solné fáze se doporučuje použít dvoufázový systém, jehož složení odpovídá levé horní části příslušného fázového diagramu. Jestliže se do dvoufázového systému přidá větší podíl dezintegrované biomasy, což je samozřejmě z ekonomického hlediska výhodné, je nutné počítat při tvorbě dvoufázového systému s určitými změnami. Binodála bude posunuta směrem k počátku, poměr fázových objemů se posune směrem k hodnotě jedna a pravděpodobně se změní rozdělovací koeficient. Posun binodály směrem k počátku je vítaná změna, neboť umožňuje vytvářet dvoufázové systémy z méně koncentrovaných roztoků, které za normálních okolností leží pod binodálou a neumožňují proto vznik dvou fází. Ke změně rozdělovacího koeficientu dochází až tehdy, je-li přidáno do systému nejméně 20% biomasy. Maximum biomasy, které je možné do systému přidat je 50-60%. S rostoucím přídavkem biomasy stoupá viskozita systému a mění se rheologické vlastnosti disperse. Zkušenosti z extrakce bílkovin z dezintegrovaných buněk pomocí dvoufázových systémů lze shrnout do následujících bodů: - výtěžnost bílkoviny bývá vyšší než 90% - rozdělovací koeficient se pohybuje od 1 do 20 s průměrem vyšším než 3 - optimální přídavek biomasy na 1 kg systému je g - současně s buněčnými zbytky se odstraní i část kontaminujících bílkovin či dalších látek - systém PEG-sůl vykazuje větší specifitu než systém PEG-dextran, zejména je-li použit nepurifikovaný dextran (což je v provozním měřítku běžné) Bílkovina, která se při první extrakci dostala do horní fáze, může být dále purifikována tzv. sekundární extrakcí. V tom případě je nutno obě fáze od sebe oddělit a k horní PEG fázi přidat vhodné množství soli, takže se vytvoří další dvoufázový systém. Celkové složení dvoufázového systému je vhodné při sekundární extrakci změnit, a to změnou koncentrace ev. typu přidané soli, změnou ph a někdy též přídavkem menšího množství polyethylenglykolu o jiné molekulové hmotnosti. Výsledkem sekundární extrakce 19

18 by mělo být odstranění kontaminujících bílkovin, ale též nukleových kyselin, polysacharidů, barevných látek apod. Nukleové kyseliny a polysacharidy vzhledem k svému hydrofilnímu charakteru přecházejí ochotně do dolní solné fáze, naproti tomu většina barevných látek má hydrofobní charakter a přejde proto do horní polyethylenglykolové fáze. Záleží proto hlavně na charakteru kontaminujících příměsí, které chceme odstranit, převedeme-li separovanou bílkovinu při sekundární extrakci do horní či dolní fáze. Jestliže upravíme podmínky tak, aby bílkovina znovu přešla do horní fáze, musíme zařadit ještě terciální extrakci, při níž je nutné uspořádat systém tak, aby izolovaná bílkovina přešla do dolní fáze. Po skončení extrakce je nutné z extraktu bílkoviny odstranit přítomné kontaminující sloučeniny, tedy i soli ev. PEG. Z provozního hlediska je odsolení podstatně jednodušší než odstraňování PEG. Terciární extrakce znamená vždy vyšší stupeň purifikace izolované bílkoviny, ale též snížení výtěžku a zvýšení celkových nákladů. Je proto, zejména v provozním měřítku, nutno uvážit, je-li výhodnější použít dva či tři extrakční stupně. Jak již bylo řečeno výše, bílkoviny, které byly v závěrečné fázi převedeny do dolní solné fáze, je nutno odsolit. Je možno použít libovolný způsob odsolení jak o tom pojednává podrobněji kapitola Extrakci do dvoufázového systému lze s výhodou zařadit jako krok následující po srážení polyethylenglykolem (viz kap ). K odseparované polyethylenglykolové sraženině se přidá příslušné množství vody a soli tak, aby se vytvořil dvoufázový systém. Tím se odseparuje PEG od izolované bílkoviny. Některé bílkoviny se pevně váží na PEG. Tyto bílkoviny nelze uvedeným způsobem purifikovat. Závěrem lze říci, že extrakce dvoufázovým vodným systémem se ukázala být velice šetrnou, pružnou a efektivní metodou pro izolaci biologicky aktivních látek. V případě bílkovin je pak velice snadno převeditelná i do provozního měřítka. 20

19 2.2 Membránové procesy Membránové procesy jsou separační techniky, které využívají k separacím polopropustné membrány. Polopropustné membrány umožní průchod malých molekul, zatímco velké molekuly zůstanou nad membránou. Mezi membránové procesy řadíme dialýzu a elektrodialýzu, reverzní osmózu (hyperfiltraci), ultrafiltraci a mikrofiltraci. Membránové filtry Polopropustné membrány jsou nejdůležitější složkou membránových procesů. Membrány se používají pro speciální případy filtrací již dlouhou dobu (např. pro klarifikace nebo sterilizace ve farmaceutickém průmyslu). Pro tyto účely se používají mikroporézní membrány; jsou to membrány s malými póry, u nichž je definována nejmenší velikost pórů. Průměr pórů se pohybuje od 0,025 μm až po několik mikrometrů. Jsou to obvykle rigidní filtry, tvořené různými polymerními materiály. Zadržují bakterie, koloidy a částice s průměrem větším než 0,1μm. Separace je založena výhradně na velikosti částic s tím, že k zadržení dojde buď na povrchu membrány nebo zachycením uvnitř pórů. V šedesátých letech se na trhu objevil nový typ membrán, tzv. ultrafiltrační membrány (obr.2.4 a obr.2.5). Tyto membrány mají póry řádově menší než mikroporézní membrány a většina z nich se skládá ze dvou odlišných vrstev: z velmi úzké horní vrstvy (0,1-1,5 μm silné) s póry o přesně definovaném průměru ( nm), která je vlastní ultrafiltrační membránou, a z mnohem širší (asi 150 μm) spodní vrstvy s otevřenou houbovitou strukturou, která má převážně podpůrnou funkci. Každá částice, která projde horní vrstvou membrány, prochází pak spodní vrstvou volně a bez zadržení. Takto konstruované membrány se označují jako anizotropní membrány. Mají dvě hlavní výhody: *křehká ultrafiltrační vrstva je posílena silnou spodní podpůrnou vrstvou *vzhledem k tomu, že ultrafiltrační vrstva je velice úzká, nemohou se v ní zachycovat ev. krystalizovat procházející částice a velmi malé póry nedovolí procházet větším částicím, které by pak mohly zanášet spodní vrstvu; tím se vylučuje nebo alespoň omezuje zanášení pórů membrány malými částicemi, které způsobuje výrazné snížení průtočnosti membrány (tzv. fouling). 21

20 Mikroporézní membránový filtr Anizotropní ultrafiltrační membrána Obr.2.4 Schematické znázornění mikroporézní a anizotropní membrány Mikroporézní membrána Částice se zachytí na povrchu nebo ve struktuře membrány Anizotropní membrána Vlastní membrána je téměř nepostřehnutelná vrstva na horním okraji Obr.2.5 Mikroporézní a anizotropní ultrafiltrační membrána na snímku z elektronového mikroskopu Prostup separované částice ultrafiltrační membránou je dán velikostí její molekuly resp. hodnotou její molekulové hmotnosti. Jsou konstruovány membrány umožňující průchod molekul v rozmezí molekulových hmotností 100 Daltonů (reverzní osmóza) až Daltonů (ultrafiltrace). Membrány jsou kategorizovány podle molekulové hmotnosti molekul, které již neprojdou membránou. Taková molekulová hmotnost se označuje jako dělicí rozsah (častěji se používá anglický výraz cut off). Výrobci garantují, že 90 % molekul o molekulové hmotnosti rovnající se dělicímu rozsahu neprojde membránou. Průchod membránou může totiž být ovlivněn též tvarem a nábojem molekuly. Přesné určení dělicího rozsahu je komplikováno i tím, že 22

21 tisícinásobná změna molekulové hmotnosti znamená jen asi desetinásobnou změnu v průměru molekuly (bráno z hlediska ideálního, t.j. kulovitého tvaru molekuly), což v praxi znamená, že změní-li se dělicí rozsah membrány tisíckrát, změní se velikost pórů v membráně pouze desetkrát. Dělicí rozsah pro polynukleotidy (DNA, RNA) je definován odlišně, protože polynukleotidy mají při stejné molekulové hmotnosti ve srovnání s bílkovinami otevřenější terciární strukturu. Retence proto závisí především na počtu nukleotidů v polynukleotidovém řetězci. Dělicí rozsah pro nukleové kyseliny je minimální počet nukleotidů, které musí obsahovat jedno- nebo dvouvláknový řetězec, aby byl membránou zadržen z 90 %. Až donedávna byl převládajícím materiálem k výrobě ultrafiltračních membrán acetát celulózy. Ultrafiltrační membrány z acetátu celulózy sice vykazují dobré separační vlastnosti i průtokové charakteristiky, jejich nevýhodou však je nízká tepelná stabilita (jen o C) a malá stabilita vůči ph (ph 3-6), což omezuje jejich čištění a sanitaci. Dnes jsou vedle celulosy k disposici polymerní materiály s výhodnějšími provozními vlastnostmi. Vyrábějí se membrány polysulfonové, polyvinylidendifluoridové a polyamidové. Nejčastěji se používají polysulfonové materiály, které mají výbornou chemickou kompatibilitu a jsou stálé v široké oblasti ph. Charakteristika membrán zahrnuje tyto údaje: a) Dělicí rozsah - pro ultrafiltraci udává nejmenší molekulovou hmotnost, kterou je membrána schopna zadržet (označuje se NMWL - nominal molecular weight limit - nebo též MWCO -molecular weight cut off). Pro nukleové kyseliny je to počet nukleotidů, který musí obsahovat fragment nukleové kyseliny, aby byl zadržen membránou (označuje se NCO). V případě reverzní osmózy udává dělicí rozsah procenta zadržení NaCl. b) Průtočnost membrány na vodu - objem vody procházející membránou při definované teplotě a tlaku za časovou jednotku. c) Rozsah povolených pracovních teplot, tlaků a ph. d) Odolnost membrán proti sanitárním prostředkům jako je peroxid vodíku, chlornan sodný, formaldehyd. Doporučený čisticí a sanitární postup. e) Odolnost membrán vůči organickým rozpouštědlům, uhlovodíkům, fenolům apod. f) Specifický výkon při zpracování definovaného produktu při určitém stupni zahuštění - udává se jako specifický průtok permeátu při konstantní teplotě, tlaku a průtokové rychlosti na straně koncentrátu. g) Životnost membrán v trvalém provozu - bývá 1-2 roky. 23

22 Dialýza Dialýza je difuzní proces, při němž molekuly z roztoku na jedné straně membrány přecházejí do roztoku, který je na opačné straně membrány (tzv. dialyzát). Složky roztoku jsou navzájem separovány podle schopnosti prostoupit membránou, tedy podle velikosti molekuly. Hnací silou tohoto procesu je rozdíl koncentrací malých molekul na vnitřní a vnější straně membrány. Rychlost průchodu molekul membránou, tj. z původního roztoku do dialyzátu, je přímo úměrná koncentraci a nepřímo úměrná molekulové hmotnosti procházejících molekul. V okamžiku, kdy se koncentrace procházejících molekul na obou stranách membrány vyrovná, průchod membránou se zastaví. Dialýza slouží zejména k odstraňování malých molekul z roztoků makromolekul (např. k odsolování), proto póry v membráně musí být menší než jsou rozměry makromolekul. K dosažení co nejlepšího výsledku je vhodné uspořádat dialýzu tak, aby kapalina na vnější straně membrány proudila. Pak nemůže dojít k ustavení rovnováhy mezi vzorkem a dialyzátem, protože malé molekuly prošlé membránou jsou okamžitě odplavovány a odstraňování molekul z původního roztoku může pokračovat. Je však třeba mít na zřeteli, že některé biomolekuly, např. bílkoviny, jsou při velmi nízkých iontových silách málo stabilní, proto se doporučuje jako dialyzát použít místo pouhé vody tlumivý roztok o nízké iontové síle, jehož výhodou je i definované ph. V laboratorním měřítku se dialýza často provádí v membránových trubicích, které se po naplnění dialyzovaným roztokem na obou stranách uzavřou a vloží do nádoby s promývacím roztokem (dialyzátem) (viz obr.2.6). Promývacím roztokem je třeba míchat, aby nedocházelo ke zpomalování procesu v důsledku místního zvýšení koncentrace malých molekul v dialyzátu. Odstranění malých molekul z roztoku trvá několik hodin; v laboratořích se dialýza provádí obvykle přes noc. Protože molekuly rozpouštědla mají schopnost prostupovat membránu i v opačném směru, tj. z vnější strany na vnitřní, je při dialýze vždy třeba počítat s naředěním. V laboratoři může dialýza sloužit i k zvýšení koncentrace makromolekul v roztoku. Dialyzační trubice se obalí vhodným vysoušedlem, které nemůže proniknout přes membránu dovnitř. Voda difunduje z trubice ven a je absorbována vysoušedlem, takže dochází ke zvýšení koncentrace makromolekul uvnitř dialyzační trubice (viz kap.3.6). 24

23 Obr.2.6 Oddělení malých molekul pomocí dialýzy v dialyzační trubici Elektrodialýza Při elektrodialýze je hnací silou procesu pohyb nabitých iontů v elektrickém poli. Účinkem stejnosměrného proudu jsou z roztoku odděleny molekuly nesoucí náboj, pouze však ty, které jsou schopny projít membránou. Molekuly, které nenesou náboj, se nepohybují, proto neprocházejí membránou i kdyby jim to jejich velikost dovolovala. Elektrody, v jejichž směru se nabité ionty pohybují, jsou umístěny na vnější straně membrány, takže ion musí při elektrokinetickém pohybu membránu překonat. Zařízení pro elektrodialýzu se skládá z dvou typů membrán s rozdílnou selektivitou vzhledem k propustnosti pro kationty a anionty. Kationaktivní iontově selektivní membrána je membrána, propustná pouze pro kationty, anionaktivní iontově selektivní membrána pouze pro anionty. V elektrodialyzéru, kde se elektrodialýza provádí, jsou oba typy membrán řazeny střídavě. Z hlediska hydrodynamického průtoku je uspořádání membránových dvojic paralelní, zatímco elektrické zapojení membránových dvojic je seriové. Membrány jsou odděleny membránovými separátory opatřenými tenkými průtokovými kanálky, které zajišťují turbulentní tok v prostoru mezi membránami, takže dialyzovaný roztok je intenzívně promícháván. Tím je zajištěno, že rychlost elektrodialýzy není omezována difuzí. Sestava 25

24 membrán je konstrukčně uspořádána v nosném rámu. Celkové uspořádání připomíná svým průtokovým systémem kalolis. Obr.2.7 Schéma uspořádání anionaktivních a kationaktivních membrán při elektrodialýze V zařízení pro elektrodialýzu rozlišujeme dva typy prostorů: koncentrační a zřeďovací (viz obr.2.7). V koncentračním prostoru se shromažďují ionty s opačným nábojem. Jejich vstup do tohoto prostoru ve směru migrace iontů ve stejnosměrném elektrickém poli souhlasí s propustností iontově selektivního páru membrán, tj. dvojice kationaktivní - anionaktivní membrána. Další pohyb iontů z koncentračního prostoru je omezen toutéž dvojicí membrán. Kation pohybující se směrem ke katodě prošel kationaktivní membránou, jeho další pohyb je zastaven anionaktivní membránou nepropustnou pro kationty. Anion pohybující se směrem k anodě vstoupil do koncentračního prostoru přes anionaktivní membránu, ale jeho další pohyb ve směru stejnosměrného elektrického pole je zastaven kationaktivní membránou, propustnou pouze pro kationty. V koncentračním prostoru proto vzrůstá koncentrace iontů, které tam přicházejí ze sousedních zřeďovacích prostorů. Koncentrovaný roztok solí nebo jiných nízkomolekulárních látek nesoucích náboj se z koncentračních prostorů kontinuálně vymývá vodou. Likvidace roztoku z koncentračních prostorů může činit problémy z hlediska solnosti odpadních vod. Elektrodialýza se nejčastěji používá pro odsolování a deacidofikaci (odstraňování kyselin) roztoků. Jedním cyklem lze při elektrodialýze dosáhnout odsolení z %. Pro vyšší stupeň odsolení musí odsolovaný roztok v elektrodialyzéru recirkulovat, a to pomocí čerpadla napojeného na recirkulační tank. Prakticky lze při použití elektrodialýzy dosáhnout odsolení až z 99 %. Spotřeba elektrické energie na odstranění 1 kg soli činí obvykle 26

25 0,8-1 kwh. Z hlediska spotřeby elektrické energie je výhodné roztoky před elektrodialýzou koncentrovat, aby se snížil jejich ohmický odpor. Zajímavé je srovnání energetických nákladů při odsolení do různého stupně, které jsou uvedeny v následující tabulce: Odsolení % Náklady 50 0,5 75 1,0 90 2,0 Znamená to, že vezmeme-li jako základ náklady na 75 % odsolení, náklady na 50 % odsolení jsou poloviční, náklady na 90 % odsolení dvojnásobné. Elektrodialýza má poměrně široké využití v praxi. Používá se např. k odsolování mořské vody, k purifikaci aminokyselin, při izolaci enzymů a v nedávné době se začala ve velkém měřítku aplikovat pro odsolování syrovátky pro účely kojenecké a dětské výživy. Reverzní osmóza Reverzní osmóza (hyperfiltrace, RO) a ultrafiltrace (UF) jsou membránové procesy, které používají ultrafiltrační anizotropní membrány. Hnací silou obou těchto procesů je tlakový rozdíl na opačných stranách membrány. Roztok, který při reverzní osmóze a ultrafiltraci zůstane nad membránou, se nazývá retentát (též koncentrát); roztok, který projde na opačnou stranu membrány je permeát (nebo hyperfiltrát pro RO a ultrafiltrát pro UF). Při reverzní osmóze se používají membrány s velice malými póry (maximálně 0,4 nm), kterými procházejí pouze molekuly rozpouštědla. K průchodu rozpouštědla takto malými póry je ovšem třeba relativně vysokých tlaků (2,7-10,4 MPa), které jsou zajišťovány vysokotlakými čerpadly. Vysoký pracovní tlak vyplývá z nutnosti překonat osmotický tlak rozpuštěných složek v roztoku. Jestliže pro osmotický tlak uvažujeme v nejjednodušším případě platnost van't Hoffova zákona π = (RT / M r ) c (4) 27

26 pak osmotický tlak π je přímo úměrný koncentraci rozpuštěné složky c a nepřímo úměrný molekulové hmotnosti M r této složky. Při reverzní osmóze se od molekul rozpouštědla odseparují i malé molekuly a ionty, např. soli. Membrány pro reverzní osmózu jsou schopny zachytit % rozpuštěných látek. Procento zadržení NaCl určuje dělicí rozsah membrány. Účinek reverzní osmózy je blízký odstraňování rozpouštědla odpařováním. Oba procesy bývají často srovnávány z hlediska ekonomiky: reverzní osmóza je ekonomičtější než odpařování jestliže má být dosaženo maximálně % koncentrace sušiny. Při požadavku na vyšší zakoncentrování je ekonomičtější používat odparky. Reverzní osmóza však má oproti odpařování velkou výhodu v tom, že odstranění rozpouštědla probíhá při nízkých teplotách, které mohou být voleny tak, aby nepřesáhly hranici termostability izolovaných složek s biologickou aktivitou. Protože při vysokých tlacích dochází ke zvyšování teploty, doporučuje se zařadit do výrobní linky průtokový chladič. Reverzní osmóza může být za určitých okolností použita i k odsolení resp. odstranění nízkomolekulárních látek, a to tehdy, chceme-li připravit čisté rozpouštědlo. Např. odstraňování solí z mořské vody s cílem získat pitnou vodu může být uskutečněno reverzní osmózou. V tomto případě můžeme reverzní osmózu srovnávat s elektrodialýzou nebo s chromatografií na měničích iontů. Ultrafiltrace Ultrafiltrace je další membránová metoda, která pracuje na obdobném principu jako reverzní osmóza. Hnací silou procesu, jak jsme již uvedli, je tlakový rozdíl na opačných stranách membrány. Na rozdíl od reverzní osmózy pracují ultrafiltrační zařízení při nižšm provozním tlaku (0,1-1 MPa), který je nižší než osmotický tlak. Velikost pórů v ultrafiltrační membráně se pohybuje od 1 do 40 nm, takže tyto membrány jsou propustné i pro nízkomolekulární látky, resp. pro látky s nižší molekulovou hmotností. Ultrafiltraci lze proto použít pro odstranění malých molekul (solí), ale i k částečné separaci ostatních molekul na základě jejich velikosti. Membrány pro ultrafiltraci se vyrábějí s různě velikými póry (vždy přesně definovanými), takže jsou propustné pro různě velké molekuly. Zadržení (retence) ultrafiltrační membránou závisí na poměru molekul, které prostoupí membránou a které jsou membránou zadrženy. Můžeme ji vyjádřit vztahem: 28

27 R = 1 - c p / c r (5) R = retenční koeficient c p = koncentrace molekul v roztoku, který prošel membránou (tzv. permeát) c r = koncentrace roztoku nad membránou (tzv. retentát) Protože membránou procházejí molekuly rozpouštědla, snižuje se objem roztoku nad membránou a koncentrace molekul, které nemohou membránou projít, se zvyšuje. U molekul, jejichž reteční koeficient je roven 1, tj. takových, které membránou vůbec neprocházejí, je koncentrační proces přímo úměrný snižování objemu nad membránou. Tzn. sníží-li se objem nad membránou na 50 % původního objemu, koncentrace zadržených molekul stoupne dvakrát. Jestliže však bude retence určité složky pouze 40 % (R = 0.4), pak dvojnásobné zvýšení koncentrace této složky bude vyžadovat snížení objemu o 82 %. Jestliže se R = 0 (volně průchozí materiál), pak koncentrace tohoto materiálu v permeátu i retentátu bude stejná. c f / c 0 = R (V 0 / V f ) (6) c f = konečná koncentrace složky nad membránou c 0 = počáteční koncentrace složky V 0 = počáteční objem vzorku V f = konečný objem retentátu Je třeba upozornit, že vztah (6) platí jen v ideálním případě. Protože v praxi je třeba počítat s některými nepříznivými vlivy, o nichž bude pojednáno později, je situace v praxi vždy komplikovanější. Z výše uvedeného vztahu je zřejmé, že malé molekuly, které volně procházejí membránou, nemohou být z roztoku úplně odstraněny, ale jejich skutečný obsah se snižuje v poměru ke snížení objemu. Znamená to, že se snížením objemu např. o 90 % projde membránou i 90 % malých molekul, avšak jejich koncentrace v permeátu a retentátu bude stejná. Chceme-li provést další odsolení, musíme retentát naředit, čímž se sníží koncentrace v něm přítomných látek, ale současně se zvětší objem. Následným snížením objemu průchodem membránou pak opustí retentát další malé molekuly. Takto můžeme pokračovat až do požadované koncentrace malých molekul (solí) v retentátu. Tento opakovaný postup se označuje jako diafiltrace. 29

28 Diafiltrace je vzhledem k efektu procesu kombinací ultrafiltrace a dialýzy. Jde o zvláštní uspořádání ultrafiltrace, kdy při určitém stupni koncentrace se k retentátu přidá voda a pokračuje se v další koncentraci. Přídavek vody k retentátu s následnou ultrafiltrací umožňuje snížit koncentraci těch nízkomolekulárních složek roztoku, které procházejí membránou. Dosáhne se tím podobného efektu jako při dialýze s tím rozdílem, že se současně zvýší koncentrace vysokomolekulárních složek. Použití ultrafiltrace ev. diafiltrace umožňuje provádět více operací při izolaci biologicky aktivních látek. Jde především o odstraňování malých molekul z roztoku makromolekul (zejména odsolování), o odstraňování detergentů a kyselin, dále o výměnu pufrů. Pomocí ultrafiltrace je možno provádět částečnou separaci biomakromolekul, pokud se od sebe liší molekulovou hmotností, a je možno zvyšovat koncentraci makromolekul v roztoku (zahušťování). Ultrafiltrace se tak stává užitečným pomocníkem při izolaci bílkovin, enzymů, nukleových kyselin a při pochodech s těmito biomakromolekulami svázanými (např. PCR - polymerasová řetězová reakce). Obr.2.8 Schema enzymového ultrafiltračního reaktoru 1 - cirkulační tank s náplní substrátu a enzymu 2 - ultrafiltrační zařízení Ultrafiltrace se používá i k racionalizaci enzymově katalyzovaných reakcí. K tomu slouží tzv. ultrafiltrační enzymové reaktory (obr.2.8). Základem těchto reaktorů je vsádkově pracující ultrafiltrační zařízení, které je napojené na cirkulační tank. Do prostoru nad membránou se z cirkulačního tanku přetahuje roztok enzymu a substrátu, takže během ultrafiltrace probíhá též enzymová reakce. Produkty této reakce kontinuálně přecházejí do permeátu, čímž se současně posunuje reakční rovnováha ve prospěch tvorby produktů enzymové reakce. Retentát se po určité době vrací do cirkulačního tanku, kde se smísí s novou dávkou enzymu a substrátu a ultrafiltrace může pokračovat. Předpokladem použití 30