Gelová permeační chromatografie

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Gelová permeační chromatografie"

Blažena Konečná
před 7 lety
Počet zobrazení:

zředěny a je nutno je následně zkoncentrovat - vyžaduje běžnou optimalizaci pro dané kombinace

1 Gelová permeační chromatografie (Gel Permeation Chromatography - GPC) - separační a čisticí metoda - umožňuje separaci skupin sloučenin s podobnou molekulovou hmotností (frakcionace) - analyty jsou po separaci zředěny a je nutno je následně zkoncentrovat - vyžaduje běžnou optimalizaci pro dané kombinace analyty/matrice - rychlá a snadno automatizovatelná, robustní a poměrně univerzálně použitelná Jan Poustka - ISM 2007 VŠCHT PRAHA

2 Princip GPC

3 Frakcionace podle MW

4 Pracovní rozsah a vylučovací limit (mrtvý objem) Vylučovací limit Pracovní rozsahy Diol-120 Diol-60

5 Teorie GPC V t = V i + V 0 V t celkový objem eluentu v koloně V i eluent zachycený v pórech gelu (stacionární fáze) V 0 eluent mezi částicemi gelu mrtvý objem kolony (mobilní fáze)

6 1. Vylučovací chromatografie Size Exclusion Chromatography (SEC) Předpokládáme mechanismus separace (zádrže) pouze podle MW K SEC = (C s / C m ) V e = V 0 + K SEC V i V e eluční objem analytu C s koncentrace analytu ve stacionární fázi C m koncentrace analytu v mobilní fázi K SEC = 0 látka je vylučována v mrtvém objemu K SEC = 1 látka je zcela zadržována

7 2. Gelová permeační chromatografie Gel Permeation Chromatography (GPC) Předpokládáme mechanismus separace (zádrže) nejenom podle MW, ale uvažujeme i další mechanismy - např. dělicí a adsorpční K T = K SEC + K P + K AD V e = V 0 + K SEC V i + K P V i + K AD V i K P distribuční konstanta rozdělovacího mechanismu K AD distribuční konstanta adsorpčního mechanismu

8 Teorie rozpustnostních parametrů (podle Hildebranda) Kohezivní energetická hustota - c H vypařovací teplo R univerzální plynová konstanta T teplota c H RT V m V m molární objem Rozpustnostní parametr - Jednotky: cal 1/2 cm -3/2 = 0,48888 MPa 1/2 MPa 1/2 = SI = 2,0455 cal 1/2 cm -3/2 c

9 Nepolární látky - pouze disperzní síly Polární látky - další typy mezimolekulárních interakcí Definujeme celkový rozpustnostní parametr: t 2 t 2 d 2 o 2 2 ind o a b d - disperzní interakce o - dipólové interakce ind - indukované dipólové interakce a - proton donorový charakter b - proton akceptorový charakter

10 Vybrané rozpustnostní parametry (cal 1/2 cm -3/2 ) Kapalina/Gel d o ind a b a t b Hexan 7, ,3 7,3 Cyklohexan 8, ,2 8,2 Ethylacetát 7,0 4,0 1,0-2,7 8,5 8,9 Toluen 8, ,6 8,9 8,9 THF 7,6 3,5 0,8-3,7 8,7 9,1 Benzen 9, ,2 9,2 Chloroform 8,1 3,0 0,5 6,5 0,5 9,3 9,3 Aceton 6,8 5,1 1,5-3,0 9,4 9,6 Dichlormethan 8,9 < 2,8 > < 3,9 > 9,9 9,7 Acetonitril 6,5 8,2 2,8-3,8 12,5 12,7 Methanol 6,2 4,9 0,8 8,3 8,3 14,4 14,5 Voda ,5 Polystyren ,1-9,4 c - Polyakrylamid c - a hodnota vypočtená ze vztahu pro t, b hodnota určená vypařováním, c - odhad

11 Využití rozpustnostních parametrů při optimalizaci GPC separace Odhad R pro směs rozpouštědel: R i i i = zlomek zastoupení rozpouštědla ve směsi Stejné hodnoty...x... různé mezimolekulární interakce Vztah pro kapacitní poměr - K i lnk i V m, i RT ( m s 2 ) ( i m ) s ln n n s m K i n n s m m - rozpustnostní parametr mobilní fáze s - rozpustnostní parametr stacionární fáze n s - látkové množství ve stacionární fázi n m - látkové množství v mobilní fázi

12 Výběr mobilních a stacionárních fází Rozpustnost analytů (polarita) volba rozpouštědla volba gelu GELY HYDROFILNÍ (POLÁRNÍ)...X... HYDROFOBNÍ (NEPOLÁRNÍ) MĚKKÉ (BOBTNAJÍCÍ)...X... RIGIDNÍ (PEVNÉ, NEBOBTNAJÍCÍ)

Měkké gely (SEC, GPC, GF) - pracovní rozsah a vylučovací limit - daný stupněm

- analytik) - stlačitelný sloupec limitní použitelný tlak m.f.

systémy - široké možnosti optimalizace Sephadex: dextranový gel, hydrofilní

13 Měkké gely (SEC, GPC, GF) - pracovní rozsah a vylučovací limit - daný stupněm zesítění (výrobce) a nabobtnání (volba m. f. - analytik) - stlačitelný sloupec limitní použitelný tlak m.f. (nebezpečí zhroucení struktury gelu) - obvykle větší kapacita - méně robustní systémy - široké možnosti optimalizace Sephadex: dextranový gel, hydrofilní Sepharose: agarosový gel, hydrofilní Bio-Gel P: akrylamidový gel hydrofilní Bio-Beads: styren-divinylbenzenový kopolymer, hydrofobní

14 Rigidní gely (HPSEC, HPGPC) - pracovní rozsah a vylučovací limit - prakticky neměnný - možnost změny m.f. bez přeplnění kolony - stabilita - vyšší tlak (vyšší průtok) vyšší rychlost, účinnost - robustní systémy - omezené možnosti optimalizace PL gel: styrenový BioSepra - keramické jádro

15 Měkký gel - agarosa Rigidní gel - BioSepra

16 Klasický systém s ručním nástřikem a jímáním frakcí Moderní systémy s automatickou frakcionací nebo i nástřikem

17 Technické parametry: Kolony: ocelové - nerezové, titanové, skleněné, plastové od 10 x 0,5 cm do 60 x 5 cm Sloupec: pevně definovaný kolonou nastavitelný (pohyblivé koncové frity) Nástřik: 0,1-10 ml Kapacita vzorku: 0,1-10 g Průtok: 0,1-10 ml/min Velikost elučních objemů (frakcí): ml (0,5-50 ml)

18 Modelový příklad GPC frakcionace - grafické znázornění - interpretace Rozmezí frakce: OD DO (hranice v ml nebo v min) NĚKDY: Retenční objem (čas)

19 1. Frakcionace separace Aplikační možnosti GPC - dělení sloučenin do skupin AK, peptidy, bílkoviny, NK, sacharidy 2. Čištění extraktů - odstraňování výšemolekulárních nežádoucích látek (často ve velkém přebytku) od nížemolekulárních analytů - stopová analýza (pesticidy, průmyslové kontaminanty)

Podobné dokumenty

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací