Výroční zpráva o realizaci projektu v prvním roce řešení 2014

Transkript

1 Identifikační kód projektu programu COST: LD Výroční zpráva o realizaci projektu v prvním roce řešení 2014 Příjemce účelové podpory: Ústav experimentální botaniky AV ČR, v.v.i. Další účastník projektu: Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v. v. i. Řešitel projektu: Mgr., Petr Maršík, Ph.D. Další řešitel: Ing. Ludmila Havrdová Název projektu: Metabolické interakce jasanu ztepilého a nového invazního houbového patogenu Hymenoscyphus pseudoalbidus Stručný přehled dílčích cílů projektu plněných v uplynulém období E001 Odběr a charakterizace biologického materiálu a odvození kultur in vitro Datum dosažení dílčího cíle: 31/12/2014 Mapování lokalit a odběr biologického materálu Pro odběr zkoumaného materiálu byly vytipovány lokality s výskytem pravděpodobných senzitivních (napadených) a rezistentních genotypů. Během sezóny byly sbírány a vyhodnocovány údaje o mikroklimatu stanovišť (vlhkost, teplota), stupni napadení, příp. průběhu infekce. Rostlinný materiál (pupeny, semena) pro experimenty in vitro a výhony pro kolekci roubovanců byl sbírán před a na počátku vegetační sezóny. Spolu s nimi byly odebírány i vzorky patogenu Hymenoscyphus pseudoalbidus/chalara fraxinea pro další charakterizaci a kultivaci daných genotypů. Výsledky tohoto dílčího cíle byly prezentovány formou posteru na mezinárodní fytopatologické konferenci v Krakowě (viz seznam výsledků). Optimalizace mikropropagačních postupů

2 Výhonové kultury jasanů byly odvozeny jak z explantátů odvozených z dospělých stromů, tak z in vitro rostlin v juvenilní fázi. Kultury z apikálních pupenů dospělých stromů V iniciační fázi byly experimenty zaměřeny na vhodný sterilizační postup a úpravu primárního explantátu. Pro odvození kultur z dospělých stromů byly odebírány apikální pupeny, ze kterých byly izolovány vzrostné vrcholy, nebo vrchol z částí nodu. Bylo zjištěno, že větší explantát (Obr. 1) má vyšší regenerační potenciál v porovnání s izolovaným vrcholem. Postranní pupeny byly nevhodné, neboť obsahovaly základy květů. Pro potlačení mikrobiální kontaminace byl použit sublimát v různé koncentraci nebo komerčně vyráběný přípravek s antibiotiky (AAS,Sigma-Aldrich) se širokospektrálním účinkem. Experimenty jednoznačně prokázaly nižší kontaminaci při použití sublimátu. Experimenty byly založeny ze čtyř lokalit, na každé lokalitě byl materiál odebrán ze třech typů stromů (zdravý, napadený houbovým patogenem Hymenoscypus fraxineus nebo roztočem). Multiplikující kultury byly založeny ze dvou lokalit (Luž a Vranovice), a to jak ze zdravých stromů, tak ze stromů napadených houbou. Primární kultury z rostlinného materiálu odvozeného ze stromů napadených roztočem neregenerovaly. Důvodem bylo zřejmě poškození meristémů uvnitř pupenů. Pro kultivaci primárních explantátů a multiplikaci výhonů se osvědčilo WPM médium s vitaminy (Duchefa) obohacené o metatopolin nebo benzyladenin. Juvenilní kultury ze zygotických embryí Další způsob, který byl testován byla regenerace celých rostlin nebo výhonových kultur ze semen nebo z izolovaných zygotických embryí. Vzhledem k vysoké kontaminaci semen (nad 90 %) byly další experimenty prováděny s izolovanými embryi. Délka celého sterilizačního procesu u embryí měla vliv nejenom na mikrobiální čistotu in vitro kultury, ale také na kvalitu izolovaného embrya. Sterilizační postup byl optimalizován, kontaminace dosahovala pod 5 %, embrya se lehce uvolňovala ze semen a v průběhu sterilizačního postupu nedošlo k rekontaminaci ani k poškození embryí. Další experimenty byly zaměřeny na stanovení podmínek pro optimální vývoj embrya v rostlinku. Zaměřili jsme se na postavení embryí na médiu, vhodnou dobu přenosu embryí z jednotlivých kultivačních médií (která zajišťovala v první fázi vývoj stonku a pak kořene) a také vlivu úpravy semenáče (redukce děloh) na další vývoj rostlin.

3 Pro zdárný průběh dílčího cíle E002 (začátek 1/2015) byly provedeny metodické pokusy v roce 2014, které vyžadovaly soubor in vitro rostlin s dobře vyvinutými kořeny a listy. Proto byly testovány různé kultivační nádoby. Nejvíce se osvědčily plastové nádoby s filtrem (výška 140 mm, Duchefa), kde měly rostliny dostatečný prostor, dobrou ventilaci a přístup světla (Obr. 2). Na základě zjištěných poznatků byla napěstována sada rostlin jasanu v in vitro podmínkách a předána do ÚEB AV pro experimenty zaměřené na indukci metabolické reakce u jasanu. Výsledky kultivace a propagace jasanu in vitro byly prezentovány formou přednášky na vědecké konferenci v Lednici (viz. Obr. 1 Proliferace apikálního pupenu zygotických embryí Obr. 2 Rostliny odvozené ze Vývoj a optimalizace analýzy látek účastných metabolické odezvy jasanu Na základě údajů z literatury bylo v rámci sledování metabolické odpovědi jasanu na napadení houbovými patogeny vybráno pět reprezentativních sekundárních metabolitů, jejichž zvýšená produkce by mohla být potenciální obranou proti houbovým onemocněním. Jako vhodní kandidáti byly vybrány eskuletin, fraxin, oleuropein, syringin a pinoresinol, pro které jsou navíc dostupné komerční analytické standardy, tudíž je možná jejich přesná kvantifikace. Nejprve byla vyvinuta vhodná extrakční metoda, kdy byla časově náročná a poměrně ztrátová extrakce z vodného roztoku diethyletherem nahrazena lépe reprodukovatelnou extrakcí pomocí SPE kolonek OASIS C18 (Waters). Pro kvantitativní Analýzu pomocí UPLC/MS/MS na přístroji Q-Trap 4000 (AB Sciex) byly definovány jednoznačné MRM přechody (2-3) charakteristické pro danou látku, a optimalizovány parametry pro jejich maximální odezvu (ionizační a kolizní energie). Dále pak byly optimalizovány chromatografické podmínky pro

4 koncentrace [ug/g FW] dosažení uspokojivé separace (gradient, průtok, teplota kolony) při zachování dostatečné citlivosti (mobilní fáze voda:acetonitril s přídavkem 0.1% kys. mravenčí a 5 mm mravenčanu amonného). Kromě sekundárních metabolitů byly pro danou matrici (MeOH extrakt listů jasanu) optimalizovány podmínky pro přesnou kvantifikaci vybraných rostlinných hormonů (kys. abscisová, kys. salicylová, kys. jasmonová) na stejné analytické sestavě. Sledování metabolické odezvy na ošetření patogenem Na konci etapy byly provedeny první testovací experimenty zaměřené na sledování odezvy v akumulaci vybraných metabolitů na aplikaci živých mycelií tří houbových patogenů (Alternaria, Fusarium, Chalara) na list jasanů kultivovaných in vitro. Zároveň byl proveden experiment s exogenní aplikací dvou rostlinných signálních látek (methyljasmonát, kys. salicylová) zahrnutých v systémové odpovědi rostlin na atak patogenů s různými strategiemi invaze Esculetin Oleuropein Pinoresinol Syringin Fraxin 20 0 K MJ SA ALT FUS HYM ošetření Obr. 4.: Obsah vybraných sekundárních metabolitů po aplikaci houbových mycelií a exogenních stimulátorech odezvy (pro pinoresinol je kvůli přejhlednému zobrazení uvedena koncentrace 10ug/g FW). K - neošetřená kontrola, MJ methyljasmonát, SA kys. salicylová, ALT Alternaria, FUS Fusarium, HYM - Hymenoscyphus Na grafu č. 3 jsou uvedeny naměřené koncentrace sledovaných metabolitů. Patrná je určitá korelace mezi Pouze v případě pinoresinolu a fraxinu po aplikaci mycelia Alternarie došlo ke statisticky významnému zvýšení jeho koncentrace v pletivech oproti kontrole. U ostatních látek a typů ošetření je sice patrný určitý trend, nicméně výsledky nejsou díky

5 velkým odchylkám mezi jedinci dostatečně průkazné. Jejich opakování a rozšíření je plánováno v průběhu následující etapy. U sledovaných signálních molekul došlo k průkaznému zvýšení kyseliny abscisové a to ve všech případech ošetření houbovými mycelii oproti kontrole a obou testovaným látkám (obr. 4). Zevrubnější analýzy jsou také plánovány v rámci následující etapy. 0,5 0,45 0,4 koncentrace [ mg/g FW] 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 ABA JA SA 0 K MJ SA ALT FUS HYM typ ošetření Obr. 4.: Obsah endogenních signálních látek po aplikaci houbových mycelií a exogenních stimulátorech odezvy. K - neošetřená kontrola, MJ methyljasmonát, SA kys. salicylová, ALT Alternaria, FUS Fusarium, HYM - Hymenoscyphus Seznam konkrétních výsledků a výstupů získaných v rámci realizace projektu (viz příloha 4.2.1): Příspěvek na konferenci: Novotná K., Štochlová P., Havrdová L., Strnadová V., Černý K. (2014): Resistance screening of A. glutinosa and F. excelsior to invasive pathogens P. alni and H. fraxineus. 11th Conference of the European Foundation for Plant Pathology, , Kraków, Poland. Book of Abstracts. 324 p. Šedivá, J., Severa, M. (2014). Propagation of ornamental trees and shrubs using in vitro techniques. Book of abstracts, Horticulture in quality and culture of life, September 23-26, 2014, Lednice, Czech Republic, p. 26.